Summary
Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.
Abstract
Planten hebben een robuust immuunsysteem ontwikkeld om pathogenen te zien en te beschermen tegen ziekte. Dit artikel beschrijft twee testen die kunnen worden gebruikt voor het meten van de sterkte van de immuunactivering in Arabidopsis thaliana na behandeling met elicitor moleculen. Gepresenteerd eerst is een methode voor het vastleggen van de snel geïnduceerde en dynamische oxidatieve burst, die kan worden bewaakt met behulp van een Luminol gebaseerde assay. De tweede is een methode die beschrijft hoe de door immuungeïnduceerde remming van zaailing te meten. Deze protocollen zijn snel en betrouwbaar, vereisen geen gespecialiseerde training of apparatuur, en worden op grote schaal gebruikt om de genetische basis van de immuniteit van de plant te begrijpen.
Introduction
Om te waarnemen en te verdedigen tegen pathogenen, planten hebben geëvolueerd membraan-gebonden patroon erkenning receptoren (PRRs) dat geconmaald microbiële moleculen buiten de cel bekend als microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs)1detecteren. De binding van mamps aan hun verwant PRRS initieert eiwit kinase-gemedieerde immuun signalering resulterend in breedspectrum ziekte resistentie2. Een van de vroegste reacties na activering van PRR is de fosforylering en activering van integraal plasma membraan respiratoire BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) eiwitten die de productie van extracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) katalyseren3 , 4. Ros spelen een belangrijke rol bij het vaststellen van de ziekte resistentie, fungeert als secundaire boodschappers te propageren immuun signalering evenals directe antimicrobiële middelen5. De eerste observatie van een immuun-opgewekt oxidatieve uitbarsting werd beschreven met behulp van aardappelknollen van CV. Rishiri na Phytophthora infestans inoculatie6. ROS productie is geëvalueerd in verschillende plantensoorten met behulp van Leaf discs7, cel suspensie culturen8, en protoplasten6. Hier beschreven is een eenvoudige methode voor het aszeggen van patroon-geactiveerde ROS productie in blad schijven van Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als reactie op MAMP-waarneming katalyseert de geactiveerde rboh-eiwitten de productie van superoxide-radicalen (O2-), hydroxylradicalen (• Oh) en singlet-zuurstof (1O2) die worden omgezet in waterstofperoxide (H2O 2) in de extracellulaire ruimte9. H2O2 kan worden gekwantificeerd met chemiluminescentie op basis van Luminol in aanwezigheid van de oxiderende agent mierikswortelperoxidase (HRP)10. HRP oxiseert H2O2 en genereert een HYDROXIDE-Ion (Oh−) en zuurstof gas (O2) dat reageert met Luminol om een instabiel intermediair te produceren dat een foon van licht10vrijgeeft. De emissie van photon kan worden gekwantificeerd als relatieve licht eenheden (RLUs) met behulp van een microplaat lezer of Imager die luminescentie detecteert, die standaard uitrustingsstukken zijn geworden in de meeste moleculaire laboratoria. Door het meten van het licht dat wordt geproduceerd over een interval van 40-60 minuten, kan een voorbijgaande oxidatieve uitbarsting al 2-5 minuten na de behandeling van de elicitor worden gedetecteerd, een piek van 10-20 minuten en terugkeren naar de basale niveaus na ~ 60 minuten11. Het cumulatieve licht dat over deze tijdsduur wordt geproduceerd, kan worden gebruikt als een maatstaf voor de immuunsterkte die overeenkomt met de activering van RBOH-eiwitten12. Handig is deze bepaling niet vereist gespecialiseerde apparatuur of omslachtige monstervoorbereiding.
Peaking kort na MAMP detectie, de oxidatieve uitbarsting wordt beschouwd als een vroege immuunrespons, samen met MAPK activering en ethyleenproductie5. Latere immuunresponsen omvatten transcriptionele herprogrammering, stomatale afsluiting en callose afzetting2,5. Langdurige blootstelling aan MAMPs activeert voortdurend energetisch-kostbare immuunsigna lering, resulterend in remming van de plantengroei, indicatief voor een trade-off tussen ontwikkeling en immuniteit13. Patroon-geactiveerde zaailing groeiremming (SGI) wordt veel gebruikt om de immuunoutput in Arabidopsis te beoordelen en is integraal onderdeel geweest van de identificatie van verschillende belangrijke componenten van immuunsigna lering, waaronder PRRS14,15 ,16. Daarom presenteert dit papier ook een test voor het patroon getriggerd SGI in Arabidopsis, waarbij zaailingen worden geteeld in multi-well platen met standaard media of media aangevuld met een immuunloïde gedurende 8-12 dagen en vervolgens gewogen met behulp van een analytische schaal.
Om aan te tonen hoe Ros en SGI assays kunnen worden gebruikt om PRR-gemedieerde signalering te bewaken, zijn drie genotypen gekozen die verschillende immuunoutputs vertegenwoordigen: (1) het wild type Arabidopsis toetredings Columbia (Col-0), (2) de dominante-negatieve bak1-5 Mutant waarin de multi-functionele PRR co-receptor brassinosteroid ongevoelig 1-geassocieerde KINASE 1 (BAK1) is niet-functioneel in immuun signalering17,18, en (3) het recessieve cpk28-1 Mutant, die mist de regulerend eiwit calcium-afhankelijke proteïne KINASE 28 (CPK28) en vertoont verhoogde immuungeactiveerde responsen19,20. Ros en SGI assays worden gepresenteerd in reactie op een synthetisch geproduceerde elf18 peptide epitoop van bacteriële rek factor TU (EF-TU), erkend in Arabidopsis door de PRR EF-TU receptor (EFR)15. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met andere immuun uitlokken, zoals de bacteriële motiliteit proteïne flagellin14 of endogene plant lokaas eiwitten (AtPeps)16, echter, opgemerkt moet worden dat de reactie van de plant verschilt afhankelijk van de elicitor21. Samen kunnen ROS en SGI assays worden gebruikt voor de snelle en kwantitatieve beoordeling van vroegtijdige en late PRR-gemedieerde reacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. detectie van ROS burst in Arabidopsis Leaf discs na immuun elicitatie
- Plantengroei en-onderhoud.
- Voor het synchroniseren van de kiemkracht, van Arabidopsis zaden door ongeveer 50 zaden op te schorten in 1 ml steriele 0,1% agar [w/v] en op te slaan bij 4 °c (geen licht) gedurende 3-4 dagen.
Opmerking: Stratify een wild type achtergrond besturingselement (bijvoorbeeld, Col-0) en genotypen met hoge en lage immuunoutputs (bijvoorbeeld cpk28-1 en bak1-5, respectievelijk) om te dienen als interne controles. - Zaaizaden op de bodem en ontkieren onder standaard kortdurende condities (22 °C, 10 uur licht, 150 mE/m2/s lichtintensiteit en 65-70% relatieve vochtigheid).
- Na ongeveer 7 dagen, gebruik de tang om individuele zaailingen te transplantaties naar nieuwe potten, gescheiden door ten minste 4 cm om volledige rozet ontwikkeling toe te staan. Transplantatie 6-12 zaailingen per genotype en terug naar standaard kortdurende condities. Regelmatig water en bevruchten planten (1 g/L van 20-20-20 meststof elke 2 weken).
- Voor het synchroniseren van de kiemkracht, van Arabidopsis zaden door ongeveer 50 zaden op te schorten in 1 ml steriele 0,1% agar [w/v] en op te slaan bij 4 °c (geen licht) gedurende 3-4 dagen.
- Verzamel blad schijven in 96-well platen voor 's nachts herstel.
- Bij 4-5 weken na het ontkiemen (Figuur 1a), gebruik een scherpe 4 mm biopsie punch om één bladschijf per plant te verwijderen, de middenader te vermijden en voorzichtig te zijn om verwonden te beperken (Figuur 1b). Plaats blad schijven in een ongebruikte 96-well luminometer plaat met 100 μL ddH2O met de adaxial zijde naar boven om uitdroging te voorkomen22 (figuur 1c). Als u meerdere ontlokken beoordeelt, verwijder dan 1 bladschijf uit hetzelfde blad voor elke elicitor-behandeling.
Opmerking: monster bladeren die volledig zijn uitgevouwen, derde tot vijfde vanaf de bovenkant van de rozet, en ongeveer dezelfde grootte en leeftijd om de variabiliteit te beperken. Indien mogelijk, snijd blad schijven in tweeën met behulp van een scheermesje voorafgaand aan de nachtelijke terugwinning, omdat dit het oppervlak dat wordt blootgesteld aan de elicitor Solution23verhoogt. - Herstel 's nachts op kamertemperatuur om de interferentie van Ros geproduceerd door verwonden tijdens Leaf disc collectie te voorkomen. Afdekplaten met deksel om verdamping te voorkomen.
- Bij 4-5 weken na het ontkiemen (Figuur 1a), gebruik een scherpe 4 mm biopsie punch om één bladschijf per plant te verwijderen, de middenader te vermijden en voorzichtig te zijn om verwonden te beperken (Figuur 1b). Plaats blad schijven in een ongebruikte 96-well luminometer plaat met 100 μL ddH2O met de adaxial zijde naar boven om uitdroging te voorkomen22 (figuur 1c). Als u meerdere ontlokken beoordeelt, verwijder dan 1 bladschijf uit hetzelfde blad voor elke elicitor-behandeling.
- Voer de elicitor-behandeling uit en meet de ROS-productie.
- Program meer de plaat lezer voorafgaand aan het toevoegen van de reactie oplossing, omdat dit de tijd tussen de ROS burst initiatie en de eerste metingen zal verkorten. Gebruik een commerciële software die geschikt is voor de plaat lezer. Klik in ons geval (Zie Inhoudsopgave) op instellingenen selecteer de LUM96 cartridge en het kinetische Lees type. Klik op de categorie leesgebied en sleep om een subset van putjes of de gehele te lezen plaat te selecteren. Stel onder het tabblad Pmt en optica de integratie tijd in op 1.000 MS. Stel onder het tabblad timing de totale uitvoeringstijd in op 40-60 min en het interval op 2 min.
- Verwijder water uit elke put met behulp van een meerkanaals pipet.
Opmerking: Steek geen blad schijven, omdat dit kan leiden tot verwde stress en resulteren in meer variabele ROS-uitgangen. - Bereid een reactie oplossing met 100 μM Luminol, 10 μg/mL HRP en de gewenste concentratie van elicitor (bijvoorbeeld: elf18 bij 1 nM, 10 nM, 100 nM of 1.000 nM) in steriele ddH2O met 10 ml oplossing voor 1 96-goed plaat.
NB: Los gevriesdroogde peptiden op in steriele H2O in laagbindende buizen om een kolf van 10 mm te maken, in vloeistof N2te bevriezen en op-80 °c te bewaren. Als u klaar bent voor gebruik, Verdun u de voorraden in steriele H2O om een 100 μM werkende voorraad te genereren en bij-20 °c op te slaan. - Gebruik een meerkanaals pipet om 100 μL van het reactiemengsel aan elk goed te doseren, waarbij de oplossing tegelijkertijd wordt toegevoegd aan alle blad schijven van dezelfde behandeling22. Neem een controle reactie (geen elicitor) voor elk genotype op om basale ROS-niveaus te beoordelen bij afwezigheid van uitlokken. Meet onmiddellijk de licht emissie voor alle golflengten in het zichtbare spectrum met behulp van een microplaat lezer.
Opmerking: bereid de reactie oplossing voor en pas deze toe bij weinig licht, aangezien Luminol en HRP lichtgevoelige reagentia zijn. Bewaar reagentia op ijs of bij-20 °C, tenzij in gebruik. - Meet de licht emissie met een 1.000 MS integratie tijd in 2 min intervallen gedurende een periode van 40-60 minuten in een microplaat lezer om de dynamische oxidatieve burst vast te leggen (figuur 1d).
Opmerking: gebruik een langere integratie tijd om de gevoeligheid van de assay11te verbeteren, terwijl u ervoor zorgt dat alle monsters in een 96-put-plaat binnen één interval kunnen worden gemeten.
- Interpretatie van gegevens.
- Gebruik voor elk genotype een spreadsheettoepassing om het gemiddelde aantal fotonen en de standaardfout op elk tijdstip te berekenen en ROS-productie weer te geven als functie van de tijd met behulp van een spreidingsdiagram.
Waarbij t = elk tijdpunt - U ook het aantal fotonen voor elke bladschijf optellen en het gemiddelde van deze waarden voor elk genotype presenteren met behulp van een staafdiagram met standaardfout balken of een doos en whisker-plot.
- Gebruik voor elk genotype een spreadsheettoepassing om het gemiddelde aantal fotonen en de standaardfout op elk tijdstip te berekenen en ROS-productie weer te geven als functie van de tijd met behulp van een spreidingsdiagram.
2. inhibitie van kiem groei
- Steriliseren zaden en zaaien op Murashige en Skoog (MS) platen.
- Bereid steriele halfsterkte (0,5 x) MS medium (2,16 g/L) met 0,8% agar [w/v]. Giet de media in platen (90 x 15 mm) in een laminaire stroom afzuigkap.
- Steriliseren ongeveer 100 zaden in een microcentrifuge buis door te wassen met 1 mL 70% ethanol gedurende 2 min en verwijderen door aspiratie. Voeg 1 mL 40% bleekwater toe en steen 17 minuten zachtjes op kamertemperatuur. Verwijder bleekmiddel door aspiratie en was drie keer in 1 mL steriel water gedurende 5 minuten. Respenderen in 1 mL steriele 0,1% agar.
Opmerking: u ook een chloor gaszaad sterilisatie protocol24gebruiken. - Zaai ongeveer 100 zaden per genotype op MS agar-platen met behulp van een pipet en afdichting met microporie tape in een laminaire stroom afzuigkap.
Opmerking: Vermijd het plaatsen van zaden in de nabijheid, omdat dit het verplanten van zaailingen later moeilijk zal maken. - Stratify zaden door platen te plaatsen bij 4 °C (geen licht) gedurende 3-4 dagen om de kiemkracht te synchroniseren (Figuur 2a).
- Transplantatie zaailingen in 48-goed platen met immuun elicitor peptiden.
- Na stratificatie, verplaats platen naar licht onder korte dagcondities (22 °C, 10 uur licht, 150 mE/m2/s lichtintensiteit en 65-70% relatieve vochtigheid) gedurende 3-4 dagen om kieming mogelijk te maken.
- Bereid in een laminaire stroom afzuigkap de ontvloeiingen van de elicitor peptide (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM en 1.000 nM) in steriele 0,5 x MS vloeibare media met 1% sucrose [w/v], met 25 mL MS voor elke 48-goed plaat. Bereid de platen voor door pipetteren van 500 μL MS vloeibaar medium of MS medium dat peptiden per put bevat. Gebruik, indien beschikbaar, een herhaalde pipet voorplaat voorbereiding om het proces te versnellen.
Let op: voor elk genotype groeien zaailingen in MS zonder elicitor om rekening te kunnen maken met eventuele inherente verschillen in zaailing groei. - Gebruik de steriele Tang zorgvuldig om een zaailing te transplanteren naar elk goed van dezelfde grootte en leeftijd, zodat er geen schade aan de zaailing of breuk aan de wortel wordt toegebracht en de wortel in de media wordt ondergedompeld. Voor elk genotype wordt ten minste 6-8 zaailingen in elke peptide verdunning (Figuur 2b) getransplanteerd.
Let op: transplantatie zaailingen op 4 dagen na kieming, als korte wortels zijn gemakkelijker te manipuleren, en oudere zaailingen kunnen minder optimale resultaten opleveren. - Afdichtings platen met microporie tape en ga terug naar het licht onder standaard kortdurende condities (22 °C, 10 uur licht, 150 mE/m2/s lichtintensiteit en 65-70% relatieve vochtigheid). Laat zaailingen groeien voor 8-12 dagen.
- Percentage groeiremming bepalen.
- Verwijder de zaailingen voorzichtig van 48-well Plates en droog door te deppen op een papieren handdoek. Weeg zaailingen op een analytische schaal en noteer waarden. Gebruik, indien beschikbaar, een analytische schaal die is uitgerust met een USB-uitgang om nieuwe gewichtswaarden op te nemen in een spreadsheet. Voordat u zaailingen gaat wegen, moet u een foto maken om de remming van de groei visueel weer te geven (figuur 2c).
- Bepaal als volgt percentage groeiremming van met ontlokken behandelde zaailingen in vergelijking met uitsluitend in MS gekweekte zaailingen (figuur 2D):
- Plot gegevens met behulp van een staafdiagram met standaardfout balken of met behulp van een doos en whisker-plot om de Inter-experimentele variantie beter weer te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutant cpk28-119,25 en bak1-517,18 planten werden gebruikt om de verwachte resultaten voor genotypen met hoge en lage immuunresponsen aan te tonen, respectievelijk in oxidatieve burst en SGI assays ten opzichte van een wild-type achtergrond besturingselement (Col-0). Om de dosisafhankelijke effecten te beoordelen, werd een 10-voudige peptide verdunningsreeks (1-1000 nM) van elf18 gebruikt. Zoals verwacht hadden cpk28-1 -verlies-van-functielijnen een hogere cumulatieve (Figuur 3a) en gemiddelde (Figuur 3b) Ros-burst in vergelijking met Col-0, terwijl bak1-5 verlaagde Ros-productie weergegeven bij concentraties tussen 10 nm en 1.000 nM (Figuur 3). Verwachte verschillen in SGI kunnen worden onderscheiden tussen alle genotypen die zijn geteeld in 100 nM en 1.000 nM elf18 (Fig. 4a), die ook visueel kunnen worden waargenomen bij de 1.000 nm elf18 behandeling (figuur 4b). Kenmerkend voor hoge immuun signalering, cpk28-1 mutanten waren duidelijk kleiner dan Col-0 wanneer geteeld in 1.000 nm elf18, terwijl bak1-5 mutanten zwakke groeiremming ten opzichte van Col-0 weergegeven als gevolg van verstoorde MAMP detectie.
Figuur 1. Op Luminol gebaseerde oxidatieve burst-assay na immuuninductie in Arabidopsis. A) kweek planten op de bodem in korte dagomstandigheden gedurende 4-5 weken. (B) gebruik een 4 mm biopsie punch om blad schijven van elke plant te verzamelen en 's nachts te herstellen in ddH2O. (C) Voeg een reactie oplossing toe (100 μM Luminol, 10 μg/ml HRP en de gewenste concentratie van elicitor) en meet de licht emissie over 40-60 min, in 2 min intervallen met een integratie tijd van 1.000 MS. (D) bepalen de gemiddelde fotonen aantallen voor elk genotype ten opzichte van Col-0 (weergegeven in groen), een hoge ROS -controle zoals cpk28-1 (weergegeven in paars) en een lage Ros -controle zoals bak1-5 (weergegeven in oranje). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Elicitor-geïnduceerde zaailing groeiremming assay in Arabidopsis. A) zaai zaailingen op agar en groei gedurende 3-4 dagen onder standaardomstandigheden voor de korte dag. B) zaailingen worden getransplanteerd in 48-put-platen die MS-medium of MS bevatten met verschillende concentraties van elf18. (C) na 8-12 dagen de zaailing visueel beoordelen en vervolgens het verse gewicht meten met behulp van een analytische schaal om percentage groeiremming te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Representatieve elf18-geïnduceerde oxidatieve uitbarsting in drie Arabidopsis genotypes. Vier weken oude planten werden behandeld met een verdunningsreeks van elf18 (0 nM ' mock ', 1 nM, 10 nM, 100 nM en 1.000 nM). Col-0 staat voor het wild-type achtergrond besturingselement, met respectievelijk cpk28-1 en bak1-5 dat hoge en lage Ros fenotypes vertegenwoordigt. A) het totale aantal foor wordt weergegeven als relatieve licht eenheden na elf18 behandeling (n= 6 blad schijven van onafhankelijke planten). Statistische verschillen worden vertegenwoordigd door kleine letters en werden berekend met behulp van een one-way ANOVA met een post-hoc Tukey's eerlijke significante verschil test (p< 0.05). B) gemiddeld aantal foor, weergegeven als relatieve licht eenheden, meer dan 40 min na elf18 behandeling (n= 6 blad schijven van onafhankelijke planten). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Vergelijkbare resultaten werden behaald in twee van de drie experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Representatieve elf18-geïnduceerde zaailing groeiremming in drie Arabidopsis genotypes. Wild type (Col-0), cpk28-1en bak1-5 zaailingen werden gekweekt in een 10-voudige verdunningsreeks (0-1000 Nm) van elf18. A) de procentuele remming van de groei werd berekend door het gewicht van individuele zaailingen in elf18 (n= 6 individuele zaailingen) te vergelijken met het gemiddelde gewicht van zaailingen van hetzelfde genotype dat alleen in MS is geteeld ("mock") (n= 6 individuele zaailingen) over een periode van 10 dagen. Statistische verschillen worden vertegenwoordigd door kleine letters en werden berekend met behulp van een one-way ANOVA met een post-hoc Tukey's eerlijke significante verschillen test (p< 0.05). B) visuele demonstratie van SGI in twee representatieve zaailingen van de Col-0, cpk28-1 en bak1-5 in reactie op de toenemende concentraties van elf18. Vergelijkbare resultaten werden behaald in drie van de vier experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft twee methoden voor het aszeggen van patroon-geactiveerde immuunresponsen in Arabidopsis, het aanbieden van kwantitatieve benaderingen voor het evalueren van immune output zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. In combinatie, patroon-geactiveerde ROS en SGI kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van vroege en late reacties op microbe perceptie, respectievelijk.
De belangrijkste beperking van de oxidatieve burst-assay is variabiliteit. Om redenen die niet volledig begrepen worden, verschilt absolute RLUs vaak door een orde van grootte tussen experimenten. Omdat tussen-experiment variabiliteit hoog is, is het raadzaam om interne referentiecontroles met hoge (bijvoorbeeld cpk28-1) en lage (bijvoorbeeld bak1-5) oxidatieve uitbarstingen naast een wild-type controle (bijvoorbeeld Col-0) op te nemen. Er kunnen echter maatregelen worden genomen om de reproduceerbaarheid tussen experimenten te verhogen. Omgevingscondities zoals temperatuur, vochtigheid, fotomoperiod en lichtintensiteit moeten identiek zijn tussen replicaten. De leeftijd en de gezondheid van planten moeten ook worden overwogen bij de bemonstering. Leaf-schijven kunnen worden verzameld van planten die tussen de 4 en 7 weken oud zijn gegroeid onder korte dag omstandigheden (6-10 uur licht). Anekdotische, de meest consistente resultaten werden gevonden met planten ouder dan 6 weken na kieming, maar nog niet bloeien of senescing. Het is belangrijk om planten in schone milieu kamers te kweken, zodat ze niet worden blootgesteld aan gemeenschappelijke Glasshouse plagen zoals meeldauw of vretende insecten. Aangezien zaailingen voor SGI worden gekweekt in steriele MS-Media, en voor een kortere tijd, zijn milieu schommelingen grotendeels geen probleem. Er kan echter variatie optreden als zaailingen beschadigd raken tijdens het verplanten, als zaailingen die zijn geselecteerd voor elicitor behandelingen verschillend zijn, of als de groeimedia vervuild zijn. Het wordt aanbevolen om ook de hieronder beschreven interne referentie controle genotypen in SGI-experimenten op te nemen.
Elicitor concentratie is een andere belangrijke overweging bij het uitvoeren van immuun testen. Uitlokken worden waargenomen door PRRs resulterend in een snelle en robuuste ROS burst piek 10-20 minuten na behandeling van de elicitor (Figuur 2b). De grootte van de burst is echter afhankelijk van zowel de elicitor als het genotype van de plant. Daarom wordt een reeks elicitor-doses aanbevolen, zoals weergegeven in Figuur 3 en Figuur 4, om een geschikte elicitor-concentratie te identificeren. Door patronen geactiveerde Ros kan ook worden getest door het inoculeren van blad schijven met levende microben23,26 of microbiële extracten26,27,28. Bijvoorbeeld, voorbijgaande en dosisafhankelijke ROS uitbarstingen kunnen worden gedetecteerd in Arabidopsis in reactie op virulente pathovars van Pseudomonas syringae, piek op 35-40 minuten en het bereiken van basale niveaus ongeveer 70 minuten na uitlokken 23 , 29. in reactie op Avirulentebacteriën 29 of de schimmel pathogeen P. infestans30,31, een tweede meer uitgesproken accumulatie van Ros wordt geproduceerd die kan worden bewaakt 6-10 uur na inoculatie. Voor zwakkere ontlokken, zoals schimmel chitine32 of Chitosan33, kunnen meer gevoelige lichtgevende indicatoren worden gebruikt, zoals de Luminol afgeleide L-012, maar het geproduceerde achtergrond signaal is vaak hoger32, 34. belangrijk is dat het bestond van de plant ook zijn responsiviteit dicteert op specifieke uitlokken35,36. Bijvoorbeeld, terwijl bacteriële flagellin in staat is om immuunresponsen op te wekken in verschillende Arabidopsis ecotypen, waaronder Col-0, geeft het wassilewskija (WS-0) bestond een niet-functionele variant van de PRR flagellin-sensing 2 (FLS2) en is Daarom ongevoelig voor flagellin14,37.
Immuun-geïnduceerde Ros kan ook worden waargenomen in blad schijven van andere dicotyledoneuze planten, met inbegrip van Brassica napus38, tomaat39, Nicotiana benthamiana22,40,41, en verschillende andere soorten Solanaceous41. Extra Luminol gebaseerde Ros detectie testen zijn ontwikkeld voor planten met behulp van weefsel extracten10, cel suspensie culturen8,42, en protoplasten43, en zijn vooral nuttig in systemen waar Leaf disc-protocollen niet effectief zijn42. Bijvoorbeeld, ontlokken-geïnduceerde Ros uitbarstingen zijn beschreven met behulp van celsuspensie culturen inrijst 42,44 entarwe 45,46, evenals de naaktzadigen Araucaria angustifolia 47 en het mos Physcomitrella patens48. SGI is niet zo breed gebruikt om immuun signalering te meten. Echter, groeiremming in reactie op uitlokken is aangetoond in N. benthamiana41 en B. napus38,49. Snelle remming van de groei is ook aangetoond in P. patens in reactie op schimmel chitine optredend binnen 2 minuten blootstelling, die kan worden waargenomen met behulp van timelapse-fotografie48.
Met modificatie kunnen zowel SGI-als oxidatieve burst-testen worden gebruikt voor schermen met hoge doorvoer om immuunregulatoren te identificeren. Zo kunnen gemutageniseerde populaties van Arabidopsis worden gekweekt op MS medium en overspoeld worden met uitlokken om ongevoelige mutanten te identificeren15,50,51,52,53. Als alternatief kunnen gemutageniseerde populaties worden beoordeeld op door elicitor geactiveerde ROS, die met succes is uitgevoerd met zowel Leaf-discs54 als hele zaailingen GETEELD op MS-platen19. Een andere nuttige screeningsmethode is de voorbijgaande uitdrukking van eiwitten in N. benthamiana voor Ros analyse voorafgaand aan de ontwikkeling van transgene overexpressielijnen 22,40,55. Intra-experimentele variatie is echter hoger dan in stabiele Arabidopsis -lijnen als gevolg van differentiële eiwit expressie in N. benthamiana verlaat22, hoewel dit gedeeltelijk kan worden verzacht door het infiltreren van referentie besturingselementen op hetzelfde blad als experimentele monsters.
Samenvattend, immuun-geïnduceerde oxidatieve burst en SGI assays zijn snelle en betrouwbare methoden voor het beoordelen van PRR-gemedieerde signalering in Arabidopsis. Deze methoden kunnen worden uitgebreid naar andere systemen en gebruikt voor grootschalige schermen om nieuwe immuun regulatoren te ontdekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Het werk in ons lab wordt gefinancierd door de Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, de Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader ' Fund en Queen's University. KS en wordt ondersteund door tandem Ontario Graduate beurzen en NSERC Canada Graduate beurzen voor master's Students (CGS-M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
