Summary
В настоящем документе описаны два метода количественной оценки ответов на защиту в Arabidopsis thaliana после воздействия иммунных вырезов: преходящий окислительный всплеск и ингибирование роста рассады.
Abstract
Растения развили надежную иммунную систему, чтобы воспринимать патогенные микроорганизмы и защищать от болезней. В этой статье описаны два анализа, которые могут быть использованы для измерения силы иммунной активации в Arabidopsis thaliana после лечения с молекулами выжидателя. Представленпервый первый метод для захвата быстро индуцированного и динамического окислительного всплеска, который может контролироваться с помощью наблюдения на основе люминола. Представлен второй метод, описывающий, как измерить иммунно-индуцированного ингибирования роста рассады. Эти протоколы являются быстрыми и надежными, не требуют специальной подготовки или оборудования, и широко используются для понимания генетической основы иммунитета растений.
Introduction
Чтобы воспринимать и защищать от патогенных микроорганизмов, растения эволюционировали мембраны связаны рецепторы распознавания образов (PRRs), которые обнаруживают сохраненные молекулы микробов за пределами клетки, известные как микроб связанных молекулярных моделей (MAMPs)1. Привязка MAMPs к их cognate PRRs инициирует протеин киназы-опосредованную иммунную сигнализацию, приводящую к устойчивости болезни широкого спектра2. Одной из самых ранних реакций после активации PRR является фосфорилирование и активация интегральной плазменной мембраны RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) белков, которые катализморают производство внеклеточных реактивных видов кислорода (ROS)3 , 4. ROS играют важную роль в установлении устойчивости к болезням, действуя как вторичные посланники для распространения иммунной сигнализации, а также прямые противомикробные агенты5. Первое наблюдение иммунно-elicited окислительного всплеска был описан с использованием клубней картофеля cv. Rishiri после Phytophthora infestans прививки6. ROS производство было оценено в несколькихвидов растений с использованием листовых дисков 7, клеточной суспензии культур8, и протопласты6. Описанный здесь простой метод для assaying шаблон-спровоцированный производство ROS в листовых дисках Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
В ответ на восприятие MAMP, активированные белки RBOH катализируют производство супероксидных радикалов (O2- ),гидроксиловые радикалы (ЗОХ) и синглетного кислорода (1O2), которые преобразуются в перекись водорода (H2O 2)во внеклеточном пространстве9. H2O2 может быть количественно люминол основе химилюминесценции в присутствии окислительного агента хрен пероксидаза (HRP)10. HRP окисляет H2O2 генерации гидроксидного иона (OH)и кислородного газа (O2), которые реагируют с люминолом для получения нестабильного промежуточного, который выпускает фотон света10. Фотон-излучение может быть количественно оценено как относительные световые единицы (RLUs) с помощью микроплитного считывателя или изображения, способного обнаруживать люминесценцию, которая стала стандартным оборудованием в большинстве молекулярных лабораторий. Путем измерять свет произведенный над интервалом 40-60 минут, преходящий окислительный взрыв можно обнаружить уже через 2-5 минут после обработки вымлитора, достигая пика на 10-20 минутах, и возвращающ к базальным уровням после q60 минут11. Кумулятивный свет, производимый в течение этого времени, может быть использован в качестве меры иммунной силы, соответствующей активации белков RBOH12. Удобно, что этот анализ не требует специализированного оборудования или громоздкой подготовки образца.
Пик вскоре после обнаружения MAMP, окислительный всплеск считается ранним иммунным ответом, наряду с активацией MAPK и производством этилена5. Позже иммунные реакции включают транскрипционного перепрограммирования, стоматальное закрытие, и осаждение клилоза2,5. Длительное воздействие MAMPs постоянно активирует энергично-дорогостоящие иммунные сигнализации в результате ингибирования роста растений, что свидетельствует о компромиссе между развитием и иммунитетом13. Шаблон триггеров роста саженцев (SGI) широко используется для оценки иммунной продукции в Арабидопсис и был неотъемлемой частью выявления нескольких ключевых компонентов иммунной сигнализации, включая PRRs14,15 ,16. Таким образом, в этой статье дополнительно представлена ассс для шаблона срабатывает SGI в Arabidopsis, в котором саженцы выращиваются в нескольких колодцев, содержащих стандартные средства массовой информации или средств массовой информации дополняется иммунной выдыхатель в течение 8-12 дней, а затем весил с помощью аналитической шкалы.
Чтобы продемонстрировать, как ROS и SGI анализы могут быть использованы для мониторинга PRR-опосредованной сигнализации, три генотипа, которые представляют различные иммунные выходы были выбраны: (1) дикий тип Arabidopsis присоединения Колумбии (Col-0), (2) доминирующей отрицательной bak1-5 мутант, в котором многофункциональный PRR ко-рецептор BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-АССОЦИированный КИНАС1 (BAK1) является нефункциональным в иммунной сигнализации17,18,и (3) рецессивный cpk28-1 мутант, который не хватает регуляторный белок CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) и отображает повышенные иммунные реакции19,20. ROS и SGI анализы представлены в ответ на синтетически производства эльф18 пептид эпитоп бактериального фактора удлинения Ту (EF-Tu), признанных в Arabidopsis PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Эти протоколы могут быть использованы с другими иммунными вылиторами, такими как бактериальная мотилизирующая белка flagellin14 или эндогенных растительных белков elicitor (AtPeps)16, однако, следует отметить, что отзывчивость растений отличается в зависимости от элицитор21. Вместе, ROS и SGI анализы могут быть использованы для быстрой и количественной оценки ранних и поздних PRR-опосредованных ответов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Обнаружение ВСПЛЕСКа ROS в дисках листьев Arabidopsis после иммунной выскания
- Рост и техническое обслуживание растений.
- Чтобы синхронизировать прорастание, расслоите семена арабидопсиса, приостановив около 50 семян в 1 мл стерильных 0,1% агара и хранить при 4 градусах Цельсия (без света) в течение 3-4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратить дикий тип фонового контроля (например, Col-0) и генотипов с высоким и низким иммунным выходом (например, cpk28-1 и bak1-5, соответственно), чтобы служить в качестве внутреннего контроля. - Посеять семена на почве и прорастать в стандартных краткосрочных условиях (22 градуса поЦельсию, 10 ч свет, 150 мЭ/м 2/с интенсивность света, и 65-70% относительная влажность).
- Примерно через 7 дней используйте щипцы для пересадки отдельных саженцев в новые горшки, разделенные по крайней мере на 4 см, чтобы обеспечить полноценное развитие розетки. Пересадить 6-12 саженцев на генотип и вернуться к стандартным краткосрочным условиям. Регулярно поливать и удобрять растения (1 г/л 20-20-20 удобрений каждые 2 недели).
- Чтобы синхронизировать прорастание, расслоите семена арабидопсиса, приостановив около 50 семян в 1 мл стерильных 0,1% агара и хранить при 4 градусах Цельсия (без света) в течение 3-4 дней.
- Соберите листовые диски в 96-колодчатые пластины для ночного восстановления.
- В 4-5 недель после прорастания(Рисунок 1A), использовать резкий 4 мм биопсии удар, чтобы удалить один лист диска на растение, избегая середине вены и быть осторожным, чтобы ограничить раны (Рисунок 1B). Поместите диски листьев в неиспользованную 96-ну хорошую пластину светинометра, содержащую 100 зл ddH2O с адаксиальной стороной, обращенной вверх, чтобы предотвратить высыхание22 (рисунок1C). При оценке нескольких вырезов, удалить 1 лист диск а с той же листа для каждого элицитора лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец листьев, которые полностью расширены, с третьего по пятую от верхней части розетки, и примерно того же размера и возраста, чтобы ограничить изменчивость. Если возможно, разрезать диски листьев в два раза с помощью лезвия бритвы до ночного восстановления, так как это увеличивает площадь поверхности подвергаются выжидательного раствора23. - Восстановление на ночь при комнатной температуре, чтобы предотвратить вмешательство ROS производится раны во время сбора листьев диска. Обложка пластин с крышкой, чтобы предотвратить испарение.
- В 4-5 недель после прорастания(Рисунок 1A), использовать резкий 4 мм биопсии удар, чтобы удалить один лист диска на растение, избегая середине вены и быть осторожным, чтобы ограничить раны (Рисунок 1B). Поместите диски листьев в неиспользованную 96-ну хорошую пластину светинометра, содержащую 100 зл ddH2O с адаксиальной стороной, обращенной вверх, чтобы предотвратить высыхание22 (рисунок1C). При оценке нескольких вырезов, удалить 1 лист диск а с той же листа для каждого элицитора лечения.
- Выполните обработку элицитора и измерьте производство ROS.
- Программа пластины читателя до добавления решения реакции, так как это позволит сократить время между ROS взрыв инициации и первые измерения записаны. Используйте коммерческое программное обеспечение, которое подходит для чтения пластин. В нашем случае (см. Таблицу Содержимого),нажмите Настройки, и выберите LUM96 картридж и кинетический тип чтения. Нажмите категорию Read Area и перетащите, чтобы выбрать подмножество колодцев или всю пластину для чтения. Под вкладкой PMT и Optics установите время интеграции до 1000 мс. Под вкладкой Time, установите общее время выполнения до 40-60 мин и Интервал до 2 мин.
- Удалите воду из каждой скважины с помощью многоканальной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прокалывайте диски листьев, так как это может вызвать травму стресса и привести к более переменной выходы ROS. - Подготовьте реакционный раствор, содержащий 100 мкм люминола, 10 мкг/мЛ HrP и нужную концентрацию элицитора (например: elf18 при 1 нм, 10 НМ, 100 нм или 1000 нм) в стерильной ddH2O с использованием 10 мл раствора для одной 96-хорошей пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворите лиофилизированные пептиды в стерильных H2O в низкосвязных трубках, чтобы сделать запас 10 мМ, флэш-заморозку в жидкости N2,и хранить при -80 градусов по Цельсию. Когда готовы к использованию, разбавить запасы в стерильных H2O для создания 100 ММ рабочий запас и хранить при -20 градусов по Цельсию. - Используйте многоканальный пипетка, чтобы обойтись 100 л реакционной смеси к каждой скважине, добавляя раствор на все диски листьев одного и того же лечения в то же время22. Включите контрольную реакцию (без вылитора) для каждого генотипа для оценки базальных уровней ROS при отсутствии выкорчевывания. Немедленно измерьте излучение света для всех длин волн в видимом спектре с помощью микроплитного считывателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте и примените раствор реакции при низкой освещенности, так как люминол и HRP являются светочувствительными реагентами. Храните реагенты на льду или при -20 градусах Цельсия, если они не используются. - Измерьте световое излучение с 1000 мс время интеграции в 2 мин интервалы в течение 40-60 минут в микроплите читателя для того, чтобы захватить динамический окислительный всплеск (Рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более длительное время интеграции, чтобы улучшить чувствительность анализов11, обеспечивая при этом, что все образцы в 96-хорошо пластины могут быть измерены в течение одного интервала.
- Интерпретация данных.
- Для каждого генотипа используйте приложение электронной таблицы для расчета среднего количества фотонов и стандартной ошибки в каждой временной точке и отображения производства ROS в качестве функции времени с помощью участка рассеяния.
Где t - каждый момент времени - Кроме того, сумма фотона рассчитывается для каждого диска листа и представить среднее значение этих значений для каждого генотипа с помощью барграфа со стандартными барами ошибок или поле и усы участка.
- Для каждого генотипа используйте приложение электронной таблицы для расчета среднего количества фотонов и стандартной ошибки в каждой временной точке и отображения производства ROS в качестве функции времени с помощью участка рассеяния.
2. Ассея ингибирования роста рассады рассады
- Стерилизовать семена и посеять на мурашиге и Skoog (MS) пластин.
- Подготовка стерильной полупрочной (0,5x) MS-среды (2,16 г/л), содержащей 0,8% агара (w/v). Налейте носители в тарелки (90 х 15 мм) в ламинарный капот потока.
- Стерилизовать около 100 семян в микроцентрифуговой трубке путем мытья 1 мл 70% этанола в течение 2 мин и удалить путем аспирации. Добавьте 1 мл 40% отбеливателя и аккуратно покачать в течение 17 минут при комнатной температуре. Удалить отбеливатель путем аспирации и промыть три раза в 1 мл стерильной воды в течение 5 мин. Отрежьте в 1 мл стерильных 0,1% агара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте протокол стерилизации семян хлора24. - Посеять около 100 семян на генотип на агарпластинках MS с помощью пипетки и уплотнения с микропорлентой в ламинарном капоте потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения семян в непосредственной близости, как это сделает пересадку саженцев трудно позже. - Стратить семена, поместив пластины при 4 градусах Цельсия (без света) в течение 3-4 дней, чтобы синхронизировать прорастание(рисунок 2A).
- Пересадите саженцы в 48-колодческие пластины, содержащие иммуновыралежья пептиды.
- После расслоения перемещай плиты на свет в коротких дневных условиях (22 градуса по Цельсию, 10 ч свет, 150 мЭ/м 2/с интенсивность света и 65-70% относительная влажность) в течение 3-4 дней, чтобы обеспечить прорастание.
- В ламинарном капоте, подготовить элицитор пептид разбавления (0 нм, 1 нм, 10 нм, 100 нм, и 1000 нм) в стерильных 0,5x MS жидких носителей, содержащих 1% сахарозы ,w / V , используя 25 мл MS для каждой 48-хорошей пластины. Подготовка пластин путем pipetting 500 л ms жидкой среде или MS среды, содержащей пептиды на хорошо. Если таковой имеется, используйте повторный пипеттор для подготовки пластины, чтобы ускорить процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого генотипа, выращивать саженцы в MS без вымлитора для учета каких-либо присущих различий в росте рассады. - С помощью стерильных щипцы тщательно пересадить один саженец к каждому колодцу того же размера и возраста, гарантируя, что нет никакого ущерба для рассады или поломки корня и что корень погружается в средства массовой информации. Для каждого генотипа, пересадка минимум 6-8 саженцев в каждом пептид разбавления(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пересадка саженцев на 4 дня после прорастания, как короткие корни легче манипулировать, и старые саженцы могут дать менее оптимальные результаты. - Уплотнение пластин с микропорлентой и вернуться к свету при стандартных краткосрочных условиях(22 градуса по Цельсию, 10 ч свет, 150 мЭ/м 2/с интенсивность света, и 65-70% относительной влажности). Разрешить рассаду расти в течение 8-12 дней.
- Определить процентное торможение роста.
- Аккуратно снимите саженцы с 48-колодцев и высушите, вытирая на бумажном полотенце. Взвешивание саженцев в аналитическом масштабе и рекордных значениях. При наличии, используйте аналитическую шкалу, оснащенную выходом USB, для записи свежих значений веса в электронной таблице. Перед взвешиванием саженцев, сфотографируйте, чтобы визуально отобразить ингибирование роста(рисунок 2C).
- Определить процент ингибирования роста выдающейся обработанной саженцы по сравнению с саженцами, выращенными в MS только (Рисунок 2D) следующим образом:
- Участок данных с помощью бар диаграммы со стандартными барами ошибок или с помощью коробки и усы участок, чтобы лучше отображать межэкспериментальной дисперсии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мутант cpk28-119,25 и bak1-517,18 растений были использованы для демонстрации ожидаемых результатов для генотипов с высокими и низкими иммунными реакциями, соответственно, при окислительном взрыве и SGI анализы по отношению к фоновой проверке дикого типа (Col-0). Для оценки эффектов, зависящих от дозы, была использована 10-кратная серия пептидного разбавления (1-1000 нм) эльф18. Как и ожидалось, cpk28-1 убыточных линий имеет более высокий кумулятивный(рисунок 3A) и средний (рисунок3B) ROS взрыв по сравнению с Col-0, в то время как bak1-5 отображается снижение производства ROS в концентрациях между 10 нм и 1000 нм(рисунок 3). Ожидаемые различия в SGI можно было различить между всеми генотипами, выращенными в 100 нм и 1000 нМ elf18 (Рисунок 4A), который также может быть визуально наблюдается в 1000 нМ elf18 лечения (Рисунок 4B). Характеристика высокой иммунной сигнализации, cpk28-1 мутантов были заметно меньше, чем Col-0, когда выросли в 1000 нМ эльф18, в то время как bak1-5 мутантов отображается слабый ингибирование роста по отношению к Col-0 из-за нарушенного обнаружения MAMP.
Рисунок 1. Люминол основе окислительного всплеска асссее после иммунной индукции в Арабидопсис. (A) Выращивайте растения на почве в коротких дневных условиях в течение 4-5 недель. (B) Используйте 4 мм биопсии удар для сбора листовых дисков от каждого растения и восстановить на ночь в ddH2O. (C) Добавить раствор реакции (100 мкм люминола, 10 мкг /мЛ HRP, и желаемая концентрация элицитора) и измерения легкого излучения в течение 40-60 мин, в 2 мин интервалы с временем интеграции 1000 мс. (D) Определить средний фотон рассчитывает для каждого генотипа по отношению к Col-0 (показано в зеленом цвете), высокий контроль ROS, такие как cpk28-1 (показано в фиолетовом), и низкий контроль ROS, такие как bak1-5 (показано оранжевым цветом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Элицитор-индуцированной саженца ингибирование роста ингибирования в Arabidopsis. (A) Посеять саженцы на MS агар и расти в течение 3-4 дней в стандартных условиях короткого дня. (B) Пересадка рассады на 48-ну хорошо пластин, содержащих MS среды или MS, содержащих различные концентрации эльф18. (C) После 8-12 дней, визуально оценить размер рассады, а затем измерить свежий вес с помощью аналитической шкалы для определения процентного ингибирования роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Представитель эльф18-индуцированного окислительного всплеска в трех генотипах арабидопсис. Четырехнедельные растения обработали разбавленной серией эльф18 (0 нМ 'mock', 1 нМ, 10 нм, 10 нм, 100 нм и 1000 нм). Col-0 представляет собой фоновый контроль дикого типа, с cpk28-1 и bak1-5, представляющими высокие и низкие фенотипы ROS, соответственно. (A) Общее количество фотонов, представленных в качествеотносительных световых единиц после обработки elf18 (n 6 листовых дисков от независимых растений). Статистические различия представлены буквами нижнего регистра и были рассчитаны с помощью односторонней ANOVAс пост-специальной Tukey's Honest Significant Difference test (p qlt;0.05). (B) Среднее количество фотонов, представленных в качестве относительных единицсвета, более 40 мин после обработки elf18 (n 6 листовых дисков от независимых растений). Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Аналогичные результаты были получены в двух из трех экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Представитель эльф18 индуцированного сдерживания роста рассады в трех генотипах арабидопсис. Дикий тип (Col-0), cpk28-1и бак1-5 саженцы были выращены в 10-кратной серии разбавления (0-1000 нм) эльф18. (A) Процентное ингибирование роста было рассчитано путем сравнения веса отдельных саженцев, выращенных в эльф18(nNo 6 отдельных саженцев) со средним весом саженцев того же генотипа, выращенного только в MS ('mock') (nNo 6 отдельных саженцев) в течение 10-дневного периода. Статистические различия представлены буквами нижнего регистра и были рассчитаны с помощью односторонней ANOVAс пост-специальной Tukey's Честные значительные различия тест (р/л;0.05). (B) Визуальная демонстрация SGI в двух представительных саженцах Col-0, cpk28-1 и bak1-5 в ответ на увеличение концентраций эльф18. Аналогичные результаты были получены в трех из четырех экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем документе описаны два метода для оценки шаблона триггерных иммунных реакций в Arabidopsis, предлагая количественные подходы к оценке иммунной продукции без использования специализированного оборудования. В сочетании, срабатывающие шаблонЫ ROS и SGI могут быть использованы для оценки ранних и поздних реакций на восприятие микробов, соответственно.
Основным ограничением окислительного всплеска является изменчивость. По причинам, которые не до конца поняты, абсолютные RLUs часто отличаются на порядок величины между экспериментами. Поскольку между экспериментом изменчивость высока, желательно включить внутренние контрольные связи с высоким (например,cpk28-1) и низким (например,bak1-5) окислительных всплесков в дополнение к дикому типу контроля (например, Col-0). Однако могут быть приняты меры по повышению воспроизводимости между экспериментами. Условия окружающей среды, такие как температура, влажность, фотопериод и интенсивность света должны быть идентичны между репликациями. Возраст и здоровье растений также следует учитывать при взятии под пробы. Лист диски могут быть собраны из растений, которые в возрасте от 4 до 7 недель, выращенных в коротких условиях день (6-10 часов света). Анекдотически, наиболее последовательные результаты были найдены с растениями старше 6 недель после прорастания, но еще не цветения или сенесации. Важно выращивать растения в чистых экологических камерах, чтобы они не подвергались воздействию обычных вредителей, таких как мучнистая плесень или жевательные насекомые. Поскольку саженцы для SGI выращиваются в стерильных средствах массовой информации MS, и в течение более короткого времени, экологические колебания в значительной степени не вызывает беспокойства. Тем не менее, изменение может произойти, если саженцы повреждены во время трансплантации, если саженцы, отобранные для лечения выражающего различных размеров, или если рост носителя становится загрязненной. Рекомендуется также включить в эксперименты SGI генотипы внутреннего эталонного контроля.
Концентрация элицитора является еще одним важным фактором при проведении иммунных анализов. Элициторы воспринимаются PRRs в результате быстрого и надежного всплеска ROS, достигающего пика через 10-20 минут после лечения элицитором(рисунок 2B). Однако величина всплеска зависит как от выдавшего, так и от генотипа растений. Таким образом, серия дозы элицитора, как это представлено на рисунке 3 и рисунке 4,рекомендуется для того, чтобы определить подходящую концентрацию выражателя. Шаблон-срабатывает ROS также может быть ассирован путем прививки листовых дисков с живыми микробами23,26 или микробных экстрактов26,27,28. Например, преходящие и зависящие доза всплески ROS могут быть обнаружены в Арабидопсисе в ответ на вирулентные пафосы Pseudomonas syringae,достигающие пика в 35-40 минут и достигающие базальных уровней примерно 70 минут после получения 23 , 29. В ответ на avirulent бактерий29 или грибковых патогенов P. infestans30,31, второй более выраженное накопление ROS производится, что может контролироваться 6-10 часов после Прививки. Для более слабых вырезов, таких как грибковый хитин32 или хитозан33,более чувствительные люминесцентные индикаторы могут быть использованы, такие как люминол производной L-012, однако, фоновый сигнал производится часто выше32, 34. Важно, что экотип завода также будет диктовать свою отзывчивость к конкретным высылателям35,36. Например, в то время как бактериальный флагеллин способен вызывать иммунные реакции в нескольких экотипах Arabidopsis, включая Col-0, вассилевский (Ws-0) экотип выражает нефункциональный вариант PRR FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) и является поэтому нечувствительны к flagellin14,37.
Иммунно-индуцированных ROS также можно наблюдать в листовых дисках других дикотипидированных растений, включая Brassica napus38, помидор39, Nicotiana benthamiana22,40,41, и несколько других соланцей видов41. Дополнительные люминол основе ROS обнаружения анализы были разработаны для растенийс использованием тканей экстракты10,клеточной суспензии культур 8,42, и протопласты43, и особенно полезны в системах где протоколы диска листа не эффективны42. Например, вызвать ROS очередей были описаны с использованием клеточной суспензии культур в рисе42,44 и пшеницы45,46, а также gymnosperm Araucaria angustifolia 47 и мох Physcomitrella patens48. SGI не используется в широком смысле для измерения иммунной сигнализации. Тем не менее, ингибирование роста в ответ на вылиторы было продемонстрировано в N. benthamiana41 и B. napus38,49. Быстрый ингибирование роста также было продемонстрировано в P. patens в ответ на грибковые хитин, происходящие в течение 2 минут от воздействия, которые можно наблюдать с помощью замедленной фотографии48.
С модификацией, как SGI и окислительный взрыв анализы могут быть использованы для высокой пропускной энергии экранов для выявления иммунных регуляторов. Например, мутагенизированные популяции арабидопсиса можно выращивать на MS-среде и наводнять элициторами для выявления нечувствительных мутантов15,50,51,52,53. Кроме того, мутагенизированные популяции могут быть оценены для выпуклого триггера ROS, который был успешно выполнен с обоих лист-дисков54 и целые саженцы, выращенные на MS пластин19. Еще одним полезным методом скрининга является переходное выражение белков в N. benthamiana для анализа ROS до разработки трансгенных линий переэкспрессии22,40,55. Тем не менее, внутриэкспериментальные изменения выше, чем в стабильных линиях арабидопсиса из-за дифференциальной экспрессии белка в N. benthamiana листья22, хотя это может быть частично смягчены путем проникновения ссылки контроль на том же листе, что и экспериментальные образцы.
Таким образом, иммунный окислительный всплеск и SGI анализы являются быстрыми и надежными методами для оценки PRR-опосредованного сигнализации в Арабидопсис. Эти методы могут быть распространены на другие системы и использоваться для крупномасштабных экранов, чтобы раскрыть новые иммунные регуляторы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Работа в нашей лаборатории финансируется через Природные ресурсы и инженерные исследования Совета Канады (NSERC) Discovery Program, Канадский фонд инноваций Джон Р. Эванс Лидер фонда, и Королевский университет. KS и IS поддерживаются тандемом Онтарио аспирантские стипендии и NSERC Канада стипендии для студентов магистра (CGS-M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
