Summary
Dette papir beskriver to metoder til at kvantificere forsvars respons i Arabidopsis thaliana efter udsættelse for immun elicitorer: den forbigående oxidativ burst, og hæmning af frøning vækst.
Abstract
Planter har udviklet sig et robust immunsystem til at opfatte patogener og beskytte mod sygdom. Dette papir beskriver to assays, der kan bruges til at måle styrken af immun aktivering i Arabidopsis thaliana efter behandling med elicitor molekyler. Præsenteret først er en metode til at opfange den hurtigt induceret og dynamisk oxidativ burst, som kan overvåges ved hjælp af en luminol-baseret analyse. Præsenteret anden er en metode, der beskriver, hvordan man måler immun-induceret hæmning af frøning vækst. Disse protokoller er hurtige og pålidelige, kræver ikke specialiseret uddannelse eller udstyr, og er almindeligt anvendt til at forstå det genetiske grundlag for plante immunitet.
Introduction
For at opfatte og forsvare sig mod patogener har planter udviklet membranbundne mønster genkendelses receptorer (PRRs), som detekterer tolererer mikrobielle molekyler uden for cellen, der er kendt som Microbe-associerede molekylære mønstre (MAMPs)1. Binding af MAMPs til deres cognate PRRs initierer protein kinase-medieret immun signalering resulterer i bredspektret sygdomsresistens2. En af de tidligste svar efter PRR-aktivering er fosforylering og aktivering af Integral plasma membran RESPIRATORISKE BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) proteiner, der katalyserer produktionen af ekstracellulære reaktive oxygenarter (ROS)3 , 4. ros spiller en vigtig rolle i at etablere sygdomsresistens, der virker både som sekundære budbringere til at udbrede immun signalering samt direkte antimikrobielle stoffer5. Den første observation af en immun-fremkaldt oxidativ burst blev beskrevet ved hjælp af kartoffelknolde af CV. Rishiri efter Phytophthora infestans inokulering6. ROS produktion er blevet evalueret i flere plantearter ved hjælp af blade skiver7, cellesuspension kulturer8, og protoplasts6. Beskrevet her er en simpel metode til bestemmelse mønster-udløst ros produktion i blade skiver Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som et svar på MAMP perception katalyserer aktiverede rboh-proteiner produktionen af superoxid radikaler (O2-), hydroxylradikaler (• Oh) og singlet oxygen (1O2), der omdannes til hydrogenperoxid (H2o 2) i det ekstracellulære rum9. H2O2 kan kvantificeres ved luminol-baseret chemiluminescens i nærværelse af det oxidationsmiddel peberrod PEROXIDASE (HRP)10. HRP oxiderer H2O2 genererer en hydroxid ion (Oh−) og oxygen gas (O2), som reagerer med i til at producere en ustabil mellemprodukt, der frigiver en photon af lys10. Foton emission kan kvantificeres som relative lysenheder (RLUs) ved hjælp af en mikropladen læser eller Imager stand til at detektere luminescens, som er blevet standard stykker af udstyr i de fleste molekylære laboratorier. Ved at måle lyset produceret over en 40-60-minutters interval, en forbigående oxidativ burst kan påvises så tidligt som 2-5 minutter efter elicitor behandling, toppede på 10-20 minutter, og vender tilbage til basal niveauer efter ~ 60 minutter11. Det kumulative lys, der produceres over dette tidsforløb, kan anvendes som et mål for immun styrken, svarende til aktivering af RBOH-proteiner12. Bekvemt, denne analyse kræver ikke specialiseret udstyr eller besværlige prøveforberedelse.
Toppede kort efter MAMP detektion, den oxidativ burst betragtes som en tidlig immunrespons, sammen med MAPK aktivering og ethylenproduktion5. Senere immunrespons omfatter transkriptional omprogrammering, tyde lukning, og callose deposition2,5. Langvarig udsættelse for MAMPs konstant aktiverer energisk-bekostelig immun signalering resulterer i hæmning af plantevækst, der indikerer en trade-off mellem udvikling og immunitet13. Mønster udløst væksthæmning (SGI) anvendes i vid udstrækning til at vurdere immun produktionen i Arabidopsis og har været en integreret del af identifikationen af flere nøglekomponenter i immun signalering, herunder PRRS14,15 ,16. Derfor præsenterer dette papir desuden en analyse for mønster udløst SGI i Arabidopsis, hvorved frøplanter dyrkes i multi-brønd plader, der indeholder standard medier eller medier suppleret med en immun elicitor i 8-12 dage og derefter vejes ved hjælp af en analytisk skala.
For at demonstrere, hvordan ROS og SGI-assays kan anvendes til at overvåge PRR-medieret signalering, blev tre genotyper, der repræsenterer varierende immun output, valgt: (1) Wild type Arabidopsis tiltrædelsen Columbia (Col-0), (2) den dominerende-negative bak1-5 mutant, hvor den multi-funktionelle PRR Co-receptor brassinosteroid ufølsom 1-associeret kinase 1 (BAK1) er ikke-funktionel i immun signalering17,18og (3) den recessiv cpk28-1 mutant, som mangler den regulatoriske protein calcium-afhængig protein kinase 28 (CPK28) og viser forhøjet immun-udløste respons19,20. ROS og SGI assays er præsenteret som reaktion på en syntetisk produceret elf18 peptid epitop af bakteriel forlængelse faktor Tu (EF-Tu), anerkendt i Arabidopsis af PRR EF-Tu receptor (EFR)15. Disse protokoller kan anvendes med andre immun elicitorer såsom bakteriel motilitet protein flagellin14 eller endogene plante Elicitor proteiner (AtPeps)16, dog skal det bemærkes, at anlæggets reaktionsevne varierer afhængigt af elicitor21. I fællesskab kan ROS og SGI-assays anvendes til hurtig og kvantitativ vurdering af tidlige og sene PRR-medierede responser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. påvisning af ros burst i Arabidopsis blade skiver efter immun udløsning
- Plantevækst og vedligeholdelse.
- For at synkronisere spiring, stratificere Arabidopsis frø ved at suspendere ca 50 frø i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] og opbevares ved 4 °c (ingen lys) for 3-4 dage.
Bemærk: stratificere en vildtype baggrundskontrol (f. eks. Col-0) og genotyper med høje og lave immun udgange (for eksempel cpk28-1 og bak1-5 ) for at fungere som interne kontroller. - Sår frø på jord og spire under normale betingelser for korte dage (22 °C, 10 h lys, 150 mE/m2/s lysintensitet og 65-70% relativ luftfugtighed).
- Efter ca. 7 dage skal du bruge pincet til at Trans planere individuelle frøplanter til nye Potter, adskilt af mindst 4 cm for at tillade fuld Rosette udvikling. Transplantation 6-12 frøplanter pr. genotype og vende tilbage til standardbetingelser for korte dage. Regelmæssigt vand og befrugte planter (1 g/L af 20-20-20 gødning hver 2 uger).
- For at synkronisere spiring, stratificere Arabidopsis frø ved at suspendere ca 50 frø i 1 mL steril 0,1% agar [w/v] og opbevares ved 4 °c (ingen lys) for 3-4 dage.
- Saml blade skiver i 96-brønd plader til natten opsving.
- Ved 4-5 uger efter spiring (figur 1a), brug en skarp 4 mm biopsi punch at fjerne en blad skive pr plante, undgå Mid-vene og være omhyggelig med at begrænse såret (figur 1b). Anbring blad skiver i en ubrugt 96-brønd luminometer plade, der indeholder 100 μL ddH2O med den adaksiale side opad for at forhindre udtørring22 (figur 1c). Ved vurdering af flere elicitorer fjernes 1 blad skive fra samme blad for hver elicitor-behandling.
Bemærk: prøve blade, der er fuldt udbygget, tredje til femte fra toppen af rosette, og omtrent samme størrelse og alder for at begrænse variabilitet. Hvis det er muligt, skæres blad skiver i halve ved hjælp af en barberkniv før natten opsving, da dette øger overfladearealet udsat for elicitor løsning23. - Restituere natten over ved stuetemperatur for at forhindre interferens fra ros produceret af såret under Leaf Disc Collection. Dækplader med låg for at forhindre fordampning.
- Ved 4-5 uger efter spiring (figur 1a), brug en skarp 4 mm biopsi punch at fjerne en blad skive pr plante, undgå Mid-vene og være omhyggelig med at begrænse såret (figur 1b). Anbring blad skiver i en ubrugt 96-brønd luminometer plade, der indeholder 100 μL ddH2O med den adaksiale side opad for at forhindre udtørring22 (figur 1c). Ved vurdering af flere elicitorer fjernes 1 blad skive fra samme blad for hver elicitor-behandling.
- Udfør elicitor-behandlingen, og mål ROS-produktionen.
- Program plade læseren før tilsætning af reaktions opløsningen, da dette vil reducere tiden mellem ROS burst initiering og de første målinger registreres. Brug en kommerciel software, der passer til plade læseren. I vores tilfælde (Se indholdsfortegnelse) skal du klikke på Indstillingerog vælge LUM96 -patronen og den kinetiske læse type. Klik på kategorien læseområde , og træk for at vælge et undersæt af brønde eller hele pladen, der skal læses. Under fanen ydelse og optik skal du indstille integrationstiden til 1.000 MS. under fanen timing skal du indstille den samlede kørselstid til 40-60 min og intervallet til 2 min.
- Fjern vand fra hver brønd ved hjælp af en multikanalpipette.
Bemærk: Undlad at punktere blad skiver, da dette kan forårsage spændings stress og resultere i mere variable ROS-udgange. - Der fremstilles en reaktions opløsning med 100 μM luminol, 10 μg/mL HRP og den ønskede koncentration af elicitor (f. eks.: elf18 ved 1 nM, 10 nM, 100 nM eller 1.000 nM) i steril ddH2O med 10 ml opløsning til 1 96-brønd plade.
Bemærk: frysetørrede peptider opløses i sterile H2O i lavbindings rør for at gøre en 10 mm bestand, flash-fryse i væske N2, og opbevares ved-80 °c. Når de er klar til brug, fortyndes lagrene i steril H2O for at generere et 100 μM arbejdslager og opbevares ved-20 °c. - Brug en multikanalpipette til at dispensere 100 μL af reaktionsblandingen til hver brønd, og tilsæt opløsningen til alle blad skiver af samme behandling på samme tid22. Inkluder en kontrol reaktion (ingen elicitor) for hver genotype for at vurdere basal ROS-niveauerne i fravær af elicitation. Mål straks lysemission for alle bølgelængder i det synlige spektrum ved hjælp af en mikroplade læser.
Bemærk: Forbered og Anvend reaktions opløsningen under svagt lys, da i og HRP er lysfølsomme reagenser. Reagenserne skal holdes på is eller ved-20 °C, medmindre de er i brug. - Mål lysemission med en 1.000 MS integrations tidspunkt i 2 min. intervaller over en 40-60 min periode i en mikroplade læser for at fange den dynamiske oxidativ burst (figur 1d).
Bemærk: Brug en længere integrations tid til at forbedre assay følsomhed11, samtidig med at det sikres, at alle prøver i en 96-brønd plade kan måles inden for et interval.
- Data fortolkning.
- For hver genotype skal du bruge et regnearksprogram til at beregne den gennemsnitlige photon Count og standardfejl ved hvert tidspunkt og vise ROS-produktion som en funktion af tid ved hjælp af et scatter plot.
Hvor t = hvert tidspunkt - Alternativt summen af foton tæller for hver blad skive og præsentere gennemsnittet af disse værdier for hver genotype ved hjælp af en søjlegraf med standardfejl stænger eller en boks og hale-plot.
- For hver genotype skal du bruge et regnearksprogram til at beregne den gennemsnitlige photon Count og standardfejl ved hvert tidspunkt og vise ROS-produktion som en funktion af tid ved hjælp af et scatter plot.
2. test af frøplante væksthæmning
- Steriliser frø og sår på Murashige og Skoog (MS) plader.
- Forbered steril halv styrke (0,5 x) MS medium (2,16 g/L) indeholdende 0,8% agar [w/v]. Hæld mediet i plader (90 x 15 mm) i en laminar flow hætte.
- Steriliser ca. 100 frø i et mikrocentrifuge glas ved at vaske med 1 mL 70% ethanol i 2 min. og fjern ved aspiration. Tilsæt 1 mL 40% blegemiddel og forsigtigt klippe i 17 minutter ved stuetemperatur. Fjern blegemiddel ved aspiration og vask tre gange i 1 mL sterilt vand i 5 min. resuspension i 1 mL steril 0,1% agar.
Bemærk: Brug alternativt en chlorgasfrøsteriliserings protokol24. - Der sås ca. 100 frø pr. genotype på MS agar-plader ved hjælp af en pipette og forsegling med mikropore tape i en laminar flow hætte.
Bemærk: undgå at placere frø i umiddelbar nærhed, da dette vil gøre transplanterende frøplanter vanskelige senere. - Stratificere frø ved at placere plader ved 4 °C (intet lys) i 3-4 dage for at synkronisere spiring (figur 2a).
- Transplantations frøplanter i 48-brønd plader indeholdende immun elicitor peptider.
- Efter stratificering flyttes plader til lys under korte dags forhold (22 °C, 10 h lys, 150 mE/m2/s lysintensitet og 65-70% relativ luftfugtighed) i 3-4 dage for at muliggøre spiring.
- I en laminar flow hætte, forberede elicitor peptid fortyndinger (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, og 1.000 nM) i sterile 0,5 x MS flydende medier indeholdende 1% saccharose [w/v], ved hjælp af 25 mL MS for hver 48-brønd plade. Forbered pladerne ved pipettering 500 μL MS flydende medium eller MS medium indeholdende peptider per brønd. Hvis det er muligt, skal du bruge en Gentag pipette til plade klargøring for at fremskynde processen.
Bemærk: for hver genotype, dyrke frøplanter i MS uden elicitor at højde for eventuelle iboende forskelle i frøning vækst. - Ved hjælp af sterile pincet omhyggeligt transplantation en frøning til hver brønd af samme størrelse og alder, at sikre, at der ikke er nogen skade på frøene eller brud til roden, og at roden er nedsænket i medierne. For hver genotype, transplantation et minimum af 6-8 frøplanter i hver peptid fortynding (figur 2b).
Bemærk: transplantations frøplanter på 4 dage efter spiring, som korte rødder er lettere at manipulere, og ældre frøplanter kan give mindre optimale resultater. - Forsegl plader med mikropore tape og Flyt tilbage til lys under normale kort-dag forhold (22 °C, 10 h lys, 150 mE/m2/s lysintensitet og 65-70% relativ luftfugtighed). Lad frøplanter til at vokse i 8-12 dage.
- Bestemme procent væksthæmning.
- Fjern forsigtigt frøplanter fra 48-brønd plader og tør ved at dabbing på papirhåndklæde. Veje frøplanter på en analytisk skala og rekord værdier. Hvis det er muligt, skal du bruge en analytisk skala udstyret med USB-udgang til at registrere nye vægtværdier på et regneark. Før vejning af frøplanter tages et foto for visuelt at vise væksthæmning (figur 2c).
- Bestem procent væksthæmning af elicitor-behandlede frøplanter sammenlignet med frøplanter dyrket i MS kun (figur 2D) som følger:
- Afbilde data ved hjælp af et søjlediagram med standardfejl linjer eller ved hjælp af en boks og hale-plot for bedre at vise Inter-eksperimentel varians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutant cpk28-119,25 og bak1-517,18 planter blev brugt til at påvise forventede udfald for genotyper med henholdsvis høj og lav immunrespons, i oxidativ Burst og SGI analyser i forhold til en Wild-type baggrundskontrol (Col-0). For at vurdere dosisafhængige effekter blev der anvendt en 10-fold peptidfortyndingsserie (1-1000 nM) af elf18. Som forventet havde cpk28-1 -tab af funktions linjer en højere kumulativ (figur 3a) og gennemsnit (figur 3b) ros i forhold til Col-0, mens bak1-5 viste reduceret ros-produktion ved koncentrationer på mellem 10 nm og 1.000 nM (figur 3). Forventede forskelle i SGI kunne ses mellem alle genotyper dyrket i 100 nM og 1.000 nM elf18 (figur 4a), som også kunne observeres visuelt ved 1.000 Nm elf18 behandlingen (figur 4b). Karakteristisk for høj immun signalering var cpk28-1 mutanter markant mindre end Col-0, når de blev dyrket i 1.000 Nm elf18, mens bak1-5 mutanter viste svag væksthæmning i forhold til Col-0 på grund af forstyrret MAMP-detektion.
Figur 1. Luminol-baseret oxidativ burst-analyse efter immun induktion i Arabidopsis. A) dyrke planter på jord på kort dags betingelser i 4-5 uger. (B) Brug en 4 mm biopsi punch til at indsamle blade skiver fra hver plante og inddrive natten i ddH2O. C) Tilsæt reaktions opløsning (100 μM luminol, 10 μg/ml HRP og den ønskede koncentration af elicitor) og mål lysemission over 40-60 min, i 2 min. intervaller med en integrations tidspunkt på 1.000 MS. (D) bestemme gennemsnitlige foton tæller for hver genotype i forhold til Col-0 (vist med grønt), en høj ROS kontrol såsom cpk28-1 (vist i lilla), og en lav ros kontrol som bak1-5 (vist i orange). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Elicitor-induceret frøning væksthæmning analyse i Arabidopsis. A) plante frøplanter på MS agar og vokse i 3-4 dage under normale betingelser for kort tid. B) transplantations frøplanter til 48-brønd plader, der indeholder MS-medium eller MS, og som indeholder forskellige koncentrationer af elf18. (C) efter 8-12 dage skal du visuelt vurdere frøkingens størrelse og derefter måle frisk vægt ved hjælp af en analytisk skala for at bestemme procent væksthæmning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentativ elf18-induceret oxidativ eksplosion i tre Arabidopsis genotyper. Fire uger gamle planter blev behandlet med en fortyndings serie på elf18 (0 nM ' mock ', 1 nM, 10 nM, 100 nM og 1.000 nM). Col-0 repræsenterer den Wild-type baggrundskontrol, med cpk28-1 og bak1-5 , der repræsenterer henholdsvis høje og lave ros-fænotyper. A) samlet antal foton repræsenteret som relative lysenheder efter elf18 behandling (n= 6 blad skiver fra uafhængige planter). Statistiske forskelle er repræsenteret ved små bogstaver og blev beregnet ved hjælp af en envejs ANOVA med en post-hoc Tukey's ærlige signifikant forskel test (p< 0,05). B) gennemsnitlig foton tælling, repræsenteret som relative lysenheder, over 40 min efter elf18 behandling (n= 6 blad skiver fra uafhængige planter). Fejllinjer repræsenterer standardfejl af middelværdien. Lignende resultater blev opnået i to af tre eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentativ elf18-induceret frøvækst hæmning i tre Arabidopsis genotyper. Vildtype (Col-0), cpk28-1og bak1-5 frøplanter blev dyrket i en 10-fold fortyndings serie (0-1000 nm) af elf18. (A) procentvis væksthæmning blev beregnet ved at sammenligne vægten af individuelle frøplanter dyrket i elf18 (n= 6 individuelle frøplanter) til den gennemsnitlige vægt af frøplanter af samme genotype dyrket i MS only ("mock") (n= 6 individuelle frøplanter) over en periode på 10 dage. Statistiske forskelle repræsenteres af små bogstaver og blev beregnet ved hjælp af en envejs-ANOVA med en post-hoc Tukey's ærlige signifikante forskelle test (p< 0,05). B) visuel demonstration af SGI i to repræsentative frøplanter af Col-0, cpk28-1 og bak1-5 som reaktion på stigende koncentrationer af elf18. Lignende resultater blev opnået i tre ud af fire eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver to metoder til bestemmelse mønster-udløst immunrespons i Arabidopsis, der tilbyder kvantitative tilgange til evaluering af immun produktionen uden brug af specialiseret udstyr. I kombination, mønster-udløst ros og SGI kan bruges til at vurdere tidlige og sene svar på mikrobe perception, hhv.
Den største begrænsning af den oxidativ burst-analyse er variabilitet. Af grunde, der ikke er helt forstået, absolutte RLUs ofte afviger med en størrelsesorden mellem eksperimenter. Da variabiliteten mellem forsøg er høj, tilrådes det at inkludere interne reference Kontroller med høj (f. eks. cpk28-1) og lav (f. eks. bak1-5) oxidativ brister ud over en vildtype kontrol (f. eks. Col-0). Der kan dog træffes foranstaltninger til at øge reproducerbarhed mellem eksperimenter. Miljøforhold såsom temperatur, fugtighed, fotoperiode og lysintensitet skal være identiske mellem replikater. Der bør også tages hensyn til planternes alder og helbred ved prøvetagning. Blad skiver kan opsamles fra planter, der er mellem 4 og 7 ugers alderen dyrket under korte dag betingelser (6-10 timers lys). Anekdostisk, de mest konsekvente resultater blev fundet med planter ældre end 6 uger efter spiring, men endnu ikke blomstring eller senescing. Det er vigtigt at dyrke planter i rene miljøkamre, så de ikke udsættes for almindeligt vækskthus skadedyr såsom meldug eller gnavende insekter. Da frøplanter til SGI dyrkes i sterile MS-medier, og i en kortere tid, er miljømæssige udsving stort set ikke et problem. Men, variation kan forekomme, hvis frøplanter bliver beskadiget under Trans plantering, hvis frøplanter udvalgt til elicitor behandlinger er forskellige størrelser, eller hvis vækstmediet bliver forurenet. Det anbefales også at inkludere de interne referencekontrol genotyper, der er beskrevet ovenfor, i SGI-eksperimenter.
Elicitor koncentration er en anden vigtig overvejelse, når der udføres immunanalyser. Elicitorer opfattes af PRRs, hvilket resulterer i en hurtig og robust ROS burst toppede 10-20 minutter efter elicitor behandling (figur 2b). Men størrelsen af burst er afhængig af både elicitor samt plante genotype. Derfor anbefales en elicitor-dosis serie, som vist i figur 3 og figur 4, for at identificere en passende elicitor-koncentration. Mønster udløste ros kan også blive analyseret ved at inokulere blad skiver med levende mikrober23,26 eller mikrobielle ekstrakter26,27,28. For eksempel kan forbigående og dosisafhængige ros-udbrud påvises i Arabidopsis som respons på virulente patogener af Pseudomonas syringae, der toppede ved 35-40 minutter og nåede basal niveauer ca. 70 minutter efter udløsning 23 , 29. som reaktion på Avirulente bakterier29 eller svampe patogenet P. infestans30,31, en anden mere udtalt ophobning af ros er produceret, der kan overvåges 6-10 timer efter Podning. For svagere elicitorer, såsom svampe chitin32 eller chitosan33, kan der anvendes mere følsomme luminescerende indikatorer, såsom i-derivatet L-012, men baggrunds signalet, der produceres, er ofte højere32, 34. vigtigt, plante økotypen vil også diktere sin reaktionsevne til specifikke elicitors35,36. For eksempel, mens bakteriel flagellin er i stand til at fremkalde immunrespons i flere Arabidopsis økotyper, herunder Col-0, den wassilewskija (ws-0) økotypen udtrykker en ikke-funktionel variant af PRR flagellin-SENSING 2 (FLS2) og er Derfor ufølsom over for flagellin14,37.
Immun-induceret ros kan også observeres i blade skiver af andre dicotyledonøse planter, herunder Brassica napus38, tomat39, Nicotiana benthamiana22,40,41, og flere andre Solanacholdige arter41. Yderligere luminol-baserede ros-detektionsassays er udviklet til anlæg, der anvender vævs ekstrakter10, celle suspensions kulturer8,42og protoplasts43, og er særligt nyttige i systemer hvor Leaf Disc protokoller ikke er effektive42. For eksempel, elicitor-induceret ros brister er blevet beskrevet ved hjælp af cellesuspension kulturer i Rice42,44 og hvede45,46, samt nøgenfrøede Araucaria angustifolia 47 og Moss physcomitrella kalke48. SGI har ikke været anvendt så bredt til at måle immun signalering. Men, væksthæmning som reaktion på elicitorer er blevet påvist i N. benthamiana41 og B. napus38,49. Hurtig væksthæmning er også blevet påvist i P. kalke som reaktion på svampe chitin forekommer inden for 2 minutters eksponering, som kan observeres ved hjælp af time-lapse fotografering48.
Med modifikation kan både SGI-og oxidativ burst-assays bruges til skærme med høj dataoverførselshastighed for at identificere immunregulerende myndigheder. For eksempel kan mutagenicerede populationer af Arabidopsis dyrkes på MS medium og oversvømmet med elicitorer til at identificere ufølsomme mutanter15,50,51,52,53. Alternativt kan mutagenicserede populationer vurderes for elicitor-udløste ROS, som er blevet udført med succes med både blad skiver54 og hele frøplanter dyrket på MS-plader19. En anden nyttig screeningsmetode er forbigående ekspression af proteiner i N. benthamiana for ros-analyse forud for udviklingen af transgene overekspressions linjer22,40,55. Den intra-eksperimentelle variation er imidlertid højere end i stabile arabidopsiblinjer på grund af differentialprotein ekspression i N. benthamiana efterlader22, selv om dette delvist kan afhjælpes ved at infiltrere reference kontrol på samme blad som eksperimentelle prøver.
Sammenfattende er immun induceret oxidativ Burst og SGI-assays hurtige og pålidelige metoder til vurdering af PRR-medieret signalering i Arabidopsis. Disse metoder kan udvides til andre systemer og anvendes til stor skala skærme til at afdække nye immunregulerende myndigheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Arbejde i vores laboratorium er finansieret gennem Natural Resources og Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery program, det canadiske fundament for innovation John R. Evans Leaders fund, og Queen's University. KS og IS er understøttet af tandem Ontario Graduate stipendier og NSERC Canada Graduate stipendier til master's Students (CGS-M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
| 4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
| 48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
| BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
| Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
| SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
| White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |
References
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
- Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
- Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
- Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
- Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
- Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
- Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
- Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
- Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
- Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
- Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
- Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
- Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
- Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
- Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
- Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
- Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
- Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
- Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
- Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
- Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
- Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
- Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
- Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
- El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
- Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
- Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
- Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
- Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
- Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
- Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
- Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
- Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
- Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
- Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
- Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
- Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
- Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
- Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
- Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
- Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
- Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
- Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
- Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
- Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
- Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
- Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).
