Summary
ويصف هذا الأسلوب نهجاً قويا واستنساخه لمقارنة مستويات البروتين في الأنسجة المختلفة وفي تيميبوينتس التنموية المختلفة باستخدام نهج blotting غربية كمية موحدة.
Abstract
النشاف الغربية هو أسلوب الذي يستخدم عادة لكشف وتحديد التعبير البروتين. على مر السنين، أدى هذا الأسلوب إلى العديد من التطورات في مجال البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من تقنيات تجريبية مماثلة، نتائج التحليلات الغربية وصمة عار بسهولة يتأثر بالاختيارات في تصميم وتنفيذ التجربة. البروتينات التدبير المنزلي محددة استخدمت تقليديا لتطبيع مستويات البروتين للقياس الكمي، ومع ذلك، هذه عددا من القيود ولذلك انتقادات متزايدة خلال السنوات القليلة الماضية. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصلة التي قمنا بتطوير للسماح لنا بإجراء مقارنات معقدة من البروتين التعبير التباين عبر الأنسجة المختلفة، ونماذج الماوس (بما في ذلك نماذج المرض)، وتيميبوينتس التنموية. باستخدام وصمة فلورسنت مجموع بروتين والاستعانة تحميل الداخلية القياسية، فمن الممكن للتغلب على القيود القائمة في عدد العينات التي يمكن مقارنتها في التجارب ومنهجية مقارنة مستويات البروتين عبر مجموعة من الظروف التجريبية. يوسع هذا النهج استخدام التقنيات التقليدية لطخة غربية، مما يسمح للباحثين استكشاف أفضل تعبير البروتين عبر مختلف الأنسجة والعينات.
Introduction
النشاف الغربية هو أسلوب الذي يستخدم عادة لكشف وتحديد التعبير البروتين، بما في ذلك في هوموجيناتيس الأنسجة أو مقتطفات. على مر السنين، أدى هذا الأسلوب إلى العديد من التطورات في مجال البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء، حيث يمكن استخدامه كأداة تشخيصية لتحديد وجود المرض1،2. النشاف الغربية وصفت أول مرة في عام 1979 كوسيلة لنقل البروتينات من المواد الهلامية polyacrylamide لأوراق النيتروسليلوز وبعد ذلك وضع تصور البروتينات باستخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تم بالاشعاع المسمى أو مترافق ب fluorescein أو البيروكسيديز3. من خلال تطوير أدوات متوفرة تجارياً ومعدات، تم الطرق الغربية النشاف متزايدة موحدة ومبسطة على مر السنين. والواقع أن التقنية الآن سهولة يؤديها العلماء مع تباين الخلفيات والمستويات من الخبرة. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من تقنيات تجريبية مماثلة، نتائج التحليلات الغربية وصمة عار بسهولة يتأثر بالاختيارات في تصميم وتنفيذ التجربة. ولذلك، من المهم أن إمكانية الحصول على أساليب موحدة النشاف الغربية لا تحجب الحاجة إلى تخطيط دقيق التجريبي وتصميم. اعتبارات تجريبية تشمل، ولكن ليست إعداد محدودة إلى، عينة والمناولة والتحديد والتحقق من الأجسام المضادة للكشف عن البروتين وكفاءة نقل جل لغشاء خاصة صغيرة أو كبيرة (< 10 أو > كاتشين 140) بروتينات4،5،،من67،،من89. جودة البروتين من العينة الأصلية تلعب دوراً هاما في تحديد نتائج تحليل لطخة غربية اللاحقة. كما يمكن استخراج البروتين من مجموعة متنوعة واسعة من عينات والمصادر، بما في ذلك خطوط الخلايا والأنسجة من النماذج الحيوانية والأنسجة البشرية بعد الوفاة، مطلوب الاتساق في المناولة والتجهيز للحصول على النتائج استنساخه. على سبيل المثال، عند التخزين على المدى الطويل من عينات لاستخراج البروتين المطلوب، من المهم أن ندرك أنه على الرغم من أن البروتين مستقرة بصفة عامة في-80 درجة مئوية، كانت الاختلافات في الاستقرار البروتين بين البروتينات المستخرجة وأنسجة سليمة في-80 درجة مئوية 10من المبلغ عنها. وعلاوة على ذلك، للحصول على تقديرات استنساخه من كميات البروتين، يتفق تجانس العينات أمر حاسم. قد يكون مطلوباً الاستفادة المثلى من تحلل مختلف المخازن المؤقتة وتجانس أساليب (مثل دليل التجانس مقارنة بأساليب مؤتمتة) قبل البدء في تجربة كمية على نطاق واسع.
استراتيجيات التطبيع لتصحيح لتقلب تحميل وتقدير كمية البروتين ضرورية للحصول على نتائج قوية وكمية البروتين التعبير. التدبير المنزلي البروتينات مثل β-أكتين، α-tubulin، β-tubulin ونازعه جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات (جابده) تقليديا قد استخدمت لتطبيع مستويات البروتين للقياس الكمي. ومع ذلك، تطبيع للبروتينات التدبير المنزلي محددة لأغراض القياس الكمي قد انتقدت متزايدة على مدى السنوات القليلة الماضية11،12. على سبيل المثال، يمكنك تغيير التعبير عن التدبير المنزلي البروتينات عبر مراحل تنموية مختلفة13،14، عبر أنسجة من نفس الحيوان4، وفي إطار مختلف الأمراض الشروط4،15 ،،من1617. ولذلك، استخدام البروتينات التدبير المنزلي محددة يحد من الإمكانيات لإجراء مقارنات أكثر تعقيداً بين التعبير البروتين من أنسجة مختلفة، في تيميبوينتس مختلفة وفي ظل مختلف الظروف التجريبية. كبديل للبروتينات التدبير المنزلي لعنصر التحكم للبروتين تحميل الاختلاف هو استخدام وصمة مجموع البروتين (TPS) تلك التسميات ويتصور جميع البروتينات الموجودة في عينة. يسمح TPS تطبيع إشارة استناداً إلى تحميل مجموع البروتين بدلاً من مستويات البروتين محددة واحدة والتحديد الكمي لإشارة النقاط التجارية ولذلك ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة واستنساخه بغض النظر عن حالة تجريبية، ونوع العينة أو تيميبوينت الإنمائية . أمثلة من البقع مجموع البروتين S بونسو، الهلام خالية من وصمة عار وأخذ R-350، سيبرو-روبي، ابيكوككونوني، الأسود أميدو و Cy5 (إعادة النظر في الرقم 18). كل من هذه الأساليب مزايا محددة وقيود واختيار أسلوب يعتمد على الوقت والأدوات المتاحة، فضلا عن الإعداد التجريبية4،18.
بالإضافة إلى استخدام النقاط التجارية تصحيح لتحميل داخل الغشاء والتغير الكمي، فإنه قد يكون من الضروري على مقارنة العينات بين الأغشية المختلفة، لا سيما عند إجراء تحليل التعبير البروتين على نطاق واسع. ومع ذلك، قد إدخال التغير في عوامل مثل جسم ملزمة الكفاءة ومجموع البروتين وصمة عار كثافة المزيد من تقلب بين بروتين العينات التي يتم تحليلها في المواد الهلامية منفصلة والأغشية. التقدير الكمي قوية في هذه الحالة، من الضروري لذلك إدخال خطوة تطبيع أخرى تستأثر بتباين بين الغشاء. هذا يمكن أن يتحقق بها بما في ذلك معيار تحميل داخلية في كل من الأغشية التي تم تحليلها بشكل منفصل أن تظل ثابتة عبر التجارب. هذا المعيار يمكن أن تتخذ شكل أي بروتين ليساتي التي يمكن الحصول عليها بكميات كافية لاستخدامها عبر جميع الأغشية المدرجة في هذه التجربة. هنا، نحن نستخدم الدماغ الماوس (التي تم الحصول عليها من 5 يوم من العمر مكافحة الفئران)، كما هو سهولة تجانس المخ والبروتين التي تم الحصول عليها ليستي يحتوي على كمية كبيرة من البروتين بتركيز عال. تحميل معياراً داخلية في ثلاث نسخ يسمح عينات في الأغشية منفصلة إلى تطبيع ومقارنة مباشرة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة التي قمنا بتطوير للسماح لنا بإجراء مقارنات معقدة من البروتين التعبير التباين عبر الأنسجة المختلفة، ونماذج الماوس (بما في ذلك نماذج المرض)، وتيميبوينتس الإنمائية19. عن طريق الجمع بين TPS فلورسنت باستخدام التحميل الداخلية القياسية، كنا قادرين على التغلب على القيود القائمة في عدد العينات والظروف التجريبية التي يمكن مقارنتها في تجربة واحدة. يوسع هذا النهج استخدام التقنيات التقليدية لطخة غربية، مما يسمح للباحثين استكشاف أفضل تعبير البروتين عبر مختلف الأنسجة والعينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأنسجة لهذا الإجراء تم الحصول عليها من دراسات أجريت على الحيوانات التي أقرتها لجنة الأخلاقيات الداخلية في جامعة أدنبرة، وأجريت في التوافق مع المؤسسية ولوائح "وزارة الداخلية في المملكة المتحدة" تحت السلطة ذات الصلة الشخصية وتراخيص للمشاريع.
ملاحظة: هذا البروتوكول قد تم تحسين استخدام مجموعات موحدة، المتاحة تجارياً، والكاشفات بغية زيادة إمكانية تكرار نتائج (انظر الجدول للمواد).
1-إعداد العينات
-
استخراج البروتين
- نقل الخلية مجمدة في الأداة الإضافية أو عينات الأنسجة من-80 درجة مئوية في الثلج الجاف، ذوبان الجليد على الجليد، وتغسل حسب الاقتضاء مع الجليد الباردة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) (للحصول على مزيد من التفاصيل في الأنسجة ويغسل PBS، انظر الجدول 1). تجنب دورات تجميد أذاب لا لزوم لها وهذا سيؤثر على نوعية البروتين.
- إضافة المخزن المؤقت للمقايسة (RIPA) راديويمونوبريسيبيتيشن (25 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.6)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% التي أرستها-40، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 1%، 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي) الذي يحتوي على 1 × مثبطات البروتياز لكل عينة، استخدام الكمية المثلى كل وزن الأنسجة (انظر الجدول 1 ل التوصيات).
ملاحظة: اعتماداً على التطبيق، نوع وحجم المخزن المؤقت التجانس قد تحتاج إلى مزيد من التحسين. - استخدام الخالطون كهربائية المحمولة باليد مع مدقة البوليبروبيلين لمجانسة عينات الأنسجة. بين كل عينة، غسل المدقة في الماء المقطر مزدوجة وتجفيف مع أنسجة نظيفة. تغيير المدقة بين ظروف تجريبية مختلفة والأنسجة.
- ترك العينات في الثلج لمدة 10 دقائق بعد التجانس. الطرد المركزي في العينات > 10,000 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد على الجليد دون إزعاج بيليه. المادة طافية من العينة البروتين. تخزين البروتين المستخرج في-80 درجة مئوية، أو الانتقال مباشرة إلى قياس تركيز البروتين.
-
التقدير الكمي والتطبيع لتركيز البروتين
- قياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك. إعداد مزيج مقايسة اتفاق التعاون الأساسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في صفيحة ضوئية 96-كذلك استخدام 200 ميليلتر من مزيج اتفاق التعاون الأساسي لكل بئر.
ملاحظة: أساليب القياس الكمي أخرى مثل فحوصات لوري وبرادفورد يمكن أيضا استخدام لتحديد تركيز البروتين طالما هو كمية تركيز البروتين دائماً عبر التجارب. - ألبومين المصل البقري بإعداد معايير (BSA) في زيادة تركيزات في ثلاث نسخ وإضافة 1 ميليلتر من كل عينة البروتين في مكررة. احتضان لوحة 96-جيدا في كتلة حرارة مسخن عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو لفترة أطول إذا كان تركيز البروتين ومن المتوقع أن تكون منخفضة.
- بعد الحضانة، قياس الامتصاص في 560 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
- تصدير القياسات قارئ اللوحة وحساب تركيز البروتين بمقارنة قيم امتصاص متوسط كل عينة لمنحنى قياسية التي تم الحصول عليها باستخدام معيار البروتين. يجب أن تكون قيمة التربيعي المنحنى القياسي أكبر من أو يساوي 0.98 لدقة تقدير تركيز البروتين في عينة.
- تطبيع كمية البروتين عن طريق إعداد تخفيف عينات البروتين في عينة المخزن المؤقت والماء عالي النقاوة. يمكن ضبط الحجم الإجمالي تبعاً لنوع جل المستخدمة. ينصح بتحميل 30 ميكروغرام من البروتين للين كمبلغ بداية. إضافة الفلزي مثل ديثيوثريتول (DTT؛ التركيز النهائي 5 مم) أو بيتا-mercaptoethanol (تركيز نهائي 200 ملم) لكل عينة كما هو مطلوب. "الماصة؛" بيتا-mercaptoethanol غير مخفف في غطاء دخان.
- احتضان في كتلة حرارة عند 70 درجة مئوية للحد الأدنى 10 وضع العينات في الثلج، ودوامه، وتدور إلى أسفل بإيجاز لجمع العينات. الحفاظ على الجليد حتى تحميل الجل.
- قياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك. إعداد مزيج مقايسة اتفاق التعاون الأساسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في صفيحة ضوئية 96-كذلك استخدام 200 ميليلتر من مزيج اتفاق التعاون الأساسي لكل بئر.
2-جل التفريد عينات البروتين
-
الجهاز وجل إعداد
- إعداد تدرج مكررا-تريس الخرسانة الجاهزة 4 – 12% هلام (انظر الجدول للمواد) في نظام الدائرة التفريد هلام. شطف الجل استخدام الماء المقطر مزدوجة قبل الاستخدام.
ملاحظة: اعتماداً على حجم والتفاعلات ووفرة من البروتين ذات الاهتمام، والمواد الهلامية بتدرج مختلف، التخزين المؤقت عامل أو جيدا حجم وعدد يمكن استخدامها. - إضافة 500 مل من تشغيل المخزن المؤقت المخفف في الماء المقطر مزدوجة كل خزان الحزب الديمقراطي الصربي x MES 1. بعناية إزالة المشط من المواد الهلامية بعد إضافة المخزن المؤقت قيد التشغيل دون إزعاج الآبار في جل التراص.
- إعداد تدرج مكررا-تريس الخرسانة الجاهزة 4 – 12% هلام (انظر الجدول للمواد) في نظام الدائرة التفريد هلام. شطف الجل استخدام الماء المقطر مزدوجة قبل الاستخدام.
-
تحميل البروتين
- تحميل 3.5 ميليلتر من البروتين القياسية في البئر. اعتماداً على تخطيط العينة، يمكن أن تساعد تحميل سلم بروتين على كلا الجانبين من الجل في أكثر دقة تقدير حجم البروتين. استخدم جل مقلوب غرامة تحميل نصائح لتحميل عينة أكثر دقة.
- عند استخدام معيار داخلية للتطبيع بين غشاء (راجع الخطوة 5 أدناه والمناقشة)، تحميل مبلغ مساو لعينات أخرى في الآبار الأولى 3 بجوار سلم البروتين.
- تحميل 30 ميكروغرام لكل عينة في الآبار المتبقية. أضف 1 × عينة المخزن المؤقت لجميع الآبار فارغة.
-
التفريد
- قم بتجميع الدبابة جل بعد تحميل العينات. تشغيل العينات عن طريق الجل التراص في 80 الخامس لمدة 10 دقيقة تليها 150 الخامس 45-60 دقيقة إضافية.
3-بروتين النقل
ملاحظة: يتم نقل البروتين في هذا البروتوكول باستخدام نظام blotting شبه جافة متاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) لتحقيق نتائج سريعة ومتسقة.
- إعداد نقل البروتين مغطس قبل تصفية الورق في الماء المقطر المزدوجة وضمان السكين جل والبلاستيك باستور ماصة، النشاف الاسطوانة والملقط جاهز للاستخدام.
- افتح المكدس نقل عن طريق إزالة بعناية جميع التفاف إحباط. إزالة الجزء العلوي من المكدس السفلي ووضعه جانبا. بسرعة ترطيب الغشاء على المكدس السفلي مع عدة قطرات من التفريد تشغيل المخزن المؤقت (2-3 مل). بمجرد فتح المكدس نقل، من المهم أن تمنع جفاف الغشاء PVDF.
- بعد التوقف التفريد، فتح جل مسبقة الصب باستخدام السكين جل وقطع جل التراص. قص الجل حول حوافها تحريرها من البلاستيك المدلى بها. الاحتفاظ بالسكين جل الرطب لمنع الأضرار بالجل.
- تجميع مكدس نقل من أسفل إلى أعلى: أسفل المكدس (تحتوي على الغشاء PVDF)، وجل البروتين، وورق الترشيح. استخدام الرول blotting لإزالة جميع فقاعات الهواء. وضع المكدس الأعلى فوق ورق الترشيح ولفه المكدس مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء. لا يدفع نقل أيضا بشدة بأن هذا قد يسبب هلام لتشوه خلال البروتين.
- تحويل المكدس كله إلى نقل الجهاز مع الكهربائي على الجانب الأيسر من الجهاز ومكان الأسفنج هلام أعلى المكدس بحيث أنها تتماشى مع اتصالات كهربائية المقابلة على الجهاز. إغلاق الغطاء وحدد بدء تشغيل البرنامج المناسب (20 الخامس لدقيقة 7 نقطة انطلاق الموصى بها).
- عند الانتهاء، ترك غطاء مغلق لمدة 2 دقيقة للسماح للمكدس لتهدئة ومنع الغشاء من الجفاف. إزالة المكدس نقل وقطع الغشاء إلى الحجم هلام. يغسل الغشاء قطع بسرعة مع الماء المقطر مزدوجة قبل المتابعة مع مجموع البروتين وصمة عار.
4-مجموع البروتين تلطيخ
ملاحظة: استخدام كشف فلوري يوفر فائدة كبيرة على الأساليب التقليدية (مثل الكشف عن القامة)، مجموعة الخطي والحساسية يمكن أن يكون كثير الخاضعة للرقابة أفضل4. ولذلك، في الخطوات 4 و 5، TPS فلورسنت والأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت تستخدم (انظر الجدول للمواد).
- لفة الغشاء في أنبوب 50 مل مع الجانب البروتين التي يواجهها في الداخل. وبسبب حساسية الضوء الفلورسنت TPS والأجسام المضادة الثانوية، تنفذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام.
- إضافة 5 مل من محلول وصمة عار البروتين (انظر الجدول للمواد)، واحتضان على اسطوانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لأن النقاط التجارية وغسل العازلة تحتوي على الميثانول، تحمل هذه الخطوات إلى في غطاء دخان.
- تجاهل الحل المصبوغة ويغسل مرتين بسرعة مع 5 مل الحل أغسل (6.3% حمض الخليك في الميثانول 30%). ضع الأنبوب بإيجاز مرة أخرى على الاسطوانة بين خطوات الغسيل. شطف الغشاء بإيجاز مع الماء عالي النقاوة قبل المتابعة.
5-حظر، جسم الاحتضان والكشف
- حظر الغشاء: أضف 3 مل من المخزن المؤقت حظر (انظر الجدول للمواد) إلى أنبوب 50 مل تحتوي على الغشاء. احتضان الغشاء في اسطوانة مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اعتماداً على اختيار الأجسام المضادة، قد تتطلب نوع المخزن المؤقت حظر استخدامها الأمثل.
-
الاحتضان الابتدائي جسم
- تجاهل حجب المخزن المؤقت واستبدل بجسم الأساسي في المناسبة، تحسين تركيز (الشكل 1 و الشكل 2: الماوس-مكافحة-الجالي، في 1:1، 000، تضعف في المخزن المؤقت لحظر).
ملاحظة: ينبغي أن تشمل الأمثل لأجسام الأساسي تأكيد أن الجسم بالكشف عن منتج بروتين من الحجم الصحيح حين عرض لا أو ربط الحد الأدنى لمنتجات البروتين الأخرى، غير محدد. إذا كان ذلك ممكناً، اختبار ومقارنة متعددة أضداد بروتين الفائدة. - احتضان الغشاء في اسطوانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وفي اليوم التالي إزالة الحل جسم وتغسل 6 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني x 1 على اسطوانة حرارة الغرفة (RT).
- تجاهل حجب المخزن المؤقت واستبدل بجسم الأساسي في المناسبة، تحسين تركيز (الشكل 1 و الشكل 2: الماوس-مكافحة-الجالي، في 1:1، 000، تضعف في المخزن المؤقت لحظر).
-
حضانة جسم الثانوية
- إعداد جسم الثانوية المحددة في 1:5,000 ضد البلد المضيف لجسم الأولية في المخزن المؤقت لحظر 5 مل. قد تتطلب سائر الأجسام المضادة الثانوية الأخرى تخفيف أو استخدام المخازن المؤقتة حظر البديلة.
- احتضان الغشاء مع الحل جسم الثانوية على اسطوانة أجل ح 1 في الرايت بعد الحضانة، يغسل الغشاء ثلاث مرات و 30 دقيقة مع برنامج تلفزيوني x 1 على اسطوانة.
- الجاف للغشاء والحفاظ على الغشاء الذي يحمي من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم حتى الكشف. يمكن الاحتفاظ بالأغشية عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
-
الحصول على الصور
- تسجيل الدخول إلى الكمبيوتر يعلق على الماسح الضوئي. مكان الغشاء على الماسح الضوئي مع الجانب البروتين إلى الأسفل وقم بتحديد منطقة المسح الضوئي في البرنامج.
- تحسين كثافة الليزر على حد سواء (700 نانومتر و 800 nm) قنوات، بالتأكيد لا تشبع يحدث. الحصول على الصور في كل القنوات وتصدير الصور لمزيد من التحليل (الخطوة 6).
6-الغربية وصمة عار التحليل والقياس الكمي
ملاحظة: تستند هذه التوصيات إلى برنامج "استوديو الصور" متاحة بحرية. ومع ذلك، يمكن أيضا إجراء تحليلات مقارنة باستخدام حزم البرامج الأخرى، مثل إيماجيج.
- استيراد الملف: إنشاء مساحة عمل محلية على الكمبيوتر المستخدم للتحليل. يقوم هذا بإنشاء قاعدة بيانات من ملفات الصور للبقع الغربية المكتسبة. استيراد الملفات التي تم الحصول عليها على الماسح الضوئي، وحدد الصورة للتحليل.
-
تحليل النقاط التجارية
- عرض قناة nm 700 لإظهار مجموع البروتين تلطيخ النتيجة. مثال لصورة TPS يرد في الشكل 1 في أي أنسجة مختلفة من الأطفال حديثي الولادة (P5) (الشكل 1A-ب) 10-الأسبوع القديمة وهي مقارنة الفئران (الشكل 1 ج-د) مباشرة. وبالمثل، ويبين الشكل 2 مثالاً للمقارنة المباشرة لانسجة المخ من الفئران من مختلف الإعمار.
- حدد علامة التبويب تحليل من الزاوية العلوية اليمنى وحدد إضافة مستطيل لتحديد مجال اهتمام للتطبيع (الشكل 1، د). نسخ ولصق منطقة المستطيل الأول على كل عينة الفردية للتأكد من منطقة محددة في نفس الحجم لجميع الممرات تم تحليلها.
- نسخ النتيجة من علامة التبويب الأشكال في الركن الأيسر السفلي من البرنامج.
-
القياس الكمي
ملاحظة: يعتمد النهج الأمثل للتحديد الكمي لعينات على التصميم التجريبي. وسوف نقدم هنا مثال توضيحي للكشف عن البروتين الحركية البقاء على قيد الحياة (الجالي؛ بروتين رئيسية مشاركة في20،ضمور العضلات الشوكي الأمراض العصبية العضلية21)، أن من المعروف أن تنخفض مع مرور الوقت 19 وكيف يوفر تطبيع الجالي كثافة إشارة إلى TPS تقديرات موثوق بها لتنمية التعبير البروتين.- ويبين الشكل 2 انخفاضا قدرة التعبير الجالي مع زيادة العمر للحيوان مع TPS كالبروتين تحميل عنصر التحكم. كرر الخطوة 6.2.1-6.2.3 تحديد كمية البروتين تحميل (الشكل 2). كرر الخطوة 6.2.1-6.2.3 في قناة 800 نانومتر (الشكل 2A) لتحليل بروتين الفائدة.
- نسخ النتائج من النقاط التجارية والبروتين من الفائدة إلى برنامج جدول بيانات. في جدول البيانات، أولاً تطبيع البروتين تحميل بواسطة تحديد إشارة TPS أعلى وتقسيم كل النقاط إشارة قيمة بهذه القيمة للحصول على البروتين طبيعية تحميل قيمة.
- تقسيم قيمة إشارة شمال البحر الأبيض المتوسط 800 من كل عينة الفردية بقيمة البروتين تطبيع المقابلة لحساب نسبة البروتين النسبية التعبير في عينات مختلفة.
- بعد تطبيع الأولى، المقارنة بين مختلف النقاط الزمنية أو أنسجة لمتوسط قيمة المعايير الداخلية تسمح بإجراء مقارنات مباشرة عبر الأغشية المختلفة والتجارب.
7-الإحصاءات
- لتحديد أي فروق معتد بها إحصائيا في التعبير البروتين عبر مجموعات معقدة وكبيرة من العينات، مطلوب المنهجية الإحصائية المناسبة. على الرغم من أن إجراء مناقشة مفصلة للخلفية الإحصائية يتجاوز نطاق هذه الورقة، نريد أن تسلط الضوء على عدة اعتبارات والتفصيل نهجاً ناجحاً وقد استخدمنا سابقا19.
- أما بالنسبة للعديد من التجارب، لا تمثل قياسات تحديد مقدار البروتين بيانات مستقلة تماما. هنا، على سبيل المثال، الأنسجة المتعددة هي عموما الحصول عليها من الحيوانات وحيدة لتحديد مستويات البروتين عبر أجهزة متعددة في نقطة وقت تجريبية واحدة. ولذلك، كنا نماذج تأثيرات مختلطة لتحليل الاختلافات في التعبير البروتين على مر الزمن، وبين الأنسجة. وبصفة عامة، نماذج التأثيرات المختلطة توفر وسيلة فعالة التعامل مع عدم الاستقلال، وبالتالي تجنب تكرار الزائفة22،23. في هذه الحالة، زيادة نماذج التأثيرات المختلطة قوة إحصائية بالمحاسبة للقياسات المتكررة بين الأنسجة، وداخل الأفراد. نحن نستخدم حزمة البرنامج الإحصائي R لإجراء هذه التحاليل، حيث أن هذا متاح بحرية وتنوعاً. ومع ذلك، الأخرى الحزم المتوفرة تجارياً قد تكون قادراً على إجراء تحليلات مماثلة.
- التصميم التجريبي الحالي ينطوي على تصميم "تقسيم الأرض" لكل الماوس ينتمون إلى الفئة العمرية واحد فقط. ولذلك، نحن على غرار الفئران الفردية (معرف الماوس) كأثر عشوائي مع معرف فريد؛ واستأثرت نحن أيضا الأنسجة، والعمر، وتفاعلها كالآثار الثابتة. ونحن على غرار البيانات باستخدام lmer الدالة في مكتبة R، lme4. كخطوة في مجال مراقبة الجودة، ونحن تصور البواقي لتقييم الافتراضات الفرق المتساوية وتوزيع الطبيعي وتحويل البيانات حيثما كان ذلك ضروريا لتلبية هذه الافتراضات. لاختبار وجود تفاعل كبير بين الأنسجة، والعمر، ونحن تناسب نموذج مطابقة الذي يفتقر إلى هذا التفاعل، ومقارنة النماذج باستخدام بارامتريه ألباس الحذاء (وظيفة البحث والتطوير ببمودكومب في المكتبة، ببكرتيست). حيث تنشأ تفاعلات هامة، استخدمنا امينس الدالة (في مكتبة امينس R) تحديد سبب التفاعل. على سبيل المثال، يمكننا مقارنة التعبير يعني بين الفئات العمرية داخل كل الأنسجة؛ قد تنشأ هناك تفاعل كبير بين العمر والأنسجة إذا، نقول، فئتين سن معين اختلافاً كبيرا لنسيج واحد ولكن لا آخر. باختصار، توفر هذه النهج وسيلة لتوسيع مدى متانة الاستنتاجات المستخلصة من التجارب الغربية وصمة عار بتوفير الدعم الإحصائي لهذه النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تشمل أمثلة على استخدام النقاط التجارية ومعيار داخلية تيسير إجراء المقارنات لمستويات البروتين عبر الأنسجة والنقاط الزمنية. ويبين الشكل 1 النتائج من النشاف الغربية في البروتينات المستخرجة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة (بعد الولادة يوم 5) بالمقارنة مع الفئران الكبار (10-أسبوع من العمر). كما يرد في الشكل 1 أ، جالنقاط التجارية و immunoblot الجالي. التحديد الكمي لشدة الأسفار للنقاط التجارية قد تحقق بقياس كثافة الأسفار داخل مربع مستطيل في كل حارة، وتظهر نتائجه في الجداول الواردة في الشكل 1 باء و دال 1. لاحظ أن عينات من أنسجة مختلفة تتسم بأنماط الفرقة البروتين TPS مختلفة ولذلك من الضروري استخدام الممر كله لأغراض التطبيع. في الواقع، عندما يتم تحليل الممرات كلها، تظل كثافة fluorescence مماثلة نسبيا من عبر العينات، التي تشير إلى النقاط التجارية للتطبيع مناسبة لهذا الغرض. وأدرج أيضا معياراً داخلية المكونة من خليط ليستي الدماغ P5 لتوضيح كيف يمكن استخدامه لمزيد من المقارنات بين الأغشية المختلفة. وعلاوة على ذلك، نعرض في الشكل 2، كيف يمكن استخدام TPS فلورسنت مقارنة مستويات البروتين في نقطة زمنية إنمائية مختلفة. وهنا نعرض المستويات العليا في ليساتيس المخ من حديثي الولادة (P5)، الفطام العمرية (P20) والفئران الكبار (10W) (الشكل 2A). على الرغم من وضوح انخفاض المستويات العليا مع التقدم في السن، التحديد الكمي TPS يظل ثابتاً كما هو موضح في الشكل 2.
رقم 1. اسطوانات الغربية يقوم إظهار النقاط التجارية وبين مستويات البروتين في الأنسجة الماوس في إعمار مختلفة اثنين. البروتين TPS وناشط ل P5 (A) وعمره أسبوع 10 (ج) الفئران. (ب، د) حسبت كثافة fluorescence TPS كل حارة ويرد (بوحدات التعسفي). م: علامة/البروتين القياسية؛ كاتشين: كيلودالتون؛ a.u.: وحدة التعسفي؛ P5: يوم الولادة 5؛ 10W: 10 أسابيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تحليل التعبير الجالي في الأنسجة الماوس عند نقطة زمنية إنمائية مختلفة. (أ) الدماغ ليساتيس من الأنسجة التي تم الحصول عليها من P5، P20 والفئران الأسبوع عمره 10 تم تحليلها باستخدام النقاط التجارية (اللوحة العلوية) والعليا (أسفل اللوحة). (ب) شدة الأسفار للنقاط التجارية وحسب، وهو المشار إليه في وحدات التعسفي. م: علامة/البروتين القياسية؛ كاتشين: كيلودالتون؛ a.u.: وحدة التعسفي؛ P5: يوم الولادة 5؛ P20: يوم الولادة 20؛ 10W: 10 أسابيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الأنسجة | * الوزن تقريبا. | أغسل 1xPBS (4 درجة مئوية) | تكرار الغسيل | المخزن المؤقت للتماثل * * |
| الحبل الشوكي | 40 ملغ | 150 مل | 3 x | 100 مل |
| عضلة (GC) | 20 ملغ | 150 مل | 3 x | 100 مل |
| الدماغ | 240 ملغ | 400 مل | 4 x | 400 مل |
| قلب | 60 ملغ | 400 مل | 4 x | 200 مل |
| الكبد | 130 ملغ | 400 مل | 4 x | 400 مل |
| الكلي | 45 ملغ | 400 مل | 4 x | 200 مل |
| * هذه الأوزان هي القيم الإرشادية للأنسجة التي تم الحصول عليها من الفئران P8. | ||||
| * * هذه المجلدات دلائل ويمكن تعديلها كذلك وفقا لوزن الأنسجة. | ||||
الجدول 1. نظرة عامة حول أوزان الأنسجة المتوقعة والتوصيات المقابلة ليغسل برنامج تلفزيوني وتحلل حجم المخزن المؤقت لاستخدامها لتحقيق التجانس. الأوزان دلائل للأنسجة التي تم الحصول عليها من يوم الولادة 8 (P8) الفئران. يمكن تغيير حجم المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني وتحلل صعودا وهبوطاً وفقا للاحتياجات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع التصميم التجريبي المناسب وتدابير المراقبة والتحليل الإحصائي، يمكن استخدام النشاف الغربية لتقديم تقديرات كمية موثوقة للتعبير البروتين داخل وفيما بين مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. ويهدف البروتوكول يصف لنا في المخطوطة الحالية كمبدأ توجيهي للباحثين يبحث استخدام الغربية النشاف لإجراء التحليل الكمي عبر مجموعات أكبر حجماً وأكثر تعقيداً من العينات، باستخدام مزيج من القائم على الأسفار أساليب الكشف والتطبيع تحميل مجموع البروتين والمعايير الداخلية. على الرغم من أن التركيز هنا ينصب على تحديد ومقارنة التعبير البروتين من أنسجة ماوس مختلفة وفي مختلف الإعمار، كما يمكن توسيع هذا النهج لمقارنة التعبير البروتين في ظروف تجريبية أخرى.
خطوة مركزية في البروتوكول الحالي لدينا هو تطبيع البروتينات التي تهم مجموع البروتين محملة بالتحديد الكمي لوصمة عار فلورسنت مجموع بروتين. تطبيع TPS تصحيح التباين في تحميل عينة وهوامش الخطأ في أساليب القياس الكمي البروتين. ومع ذلك، لأنه غالباً ما يقتصر عدد العينات البروتين التي يمكن تحليلها في غشاء واحد، كذلك التطبيع قد تلزم لمقارنة الأغشية متعددة. في الواقع، قد تسبب تقلب بين كيفية الكشف عن البروتينات في أغشية مختلفة (بسبب مثلاً جسم حضانة الوقت أو درجة الحرارة الاختلاف) الاختلاف إلى ما بعد أن أدخلت من خلال خطوات التحميل والتقدير الكمي للبروتوكول. وهنا نستخدم معيار داخلية التي تتكون من خليط البروتين وحيد ليساتي التي يتم تحميلها في ثلاث نسخ في كل جيل، ويسمح للمقارنة، وتطبيع العلاقات بين المواد الهلامية/الأغشية. نظرياً، هذا يمكن أن يكون أي نموذج البروتين، طالما أنه يمكن إجراؤها في كميات كافية حتى أنه يمكن استخدام نفس العينة لكل التجارب. في تجاربنا، ونحن استخدام خليط ليساتيس بروتين الدماغ، كما هوموجيناتيس الدماغ تحتوي على كميات كبيرة من البروتين ويتم الحصول عليها عادة بتركيز عال. متوسط التقدير الكمي لمستوى ثلاث ينبغي زيادة دقة كوانتيفيكيشنز عبر الأغشية وتسهم في إمكانية تكرار نتائج التجربة.
يمكن تحديد مستويات البروتين بواسطة عدد من التقنيات المختلفة والأسلوب المفضل يعتمد على نوع العينة التي تم تحليلها، والهدف من هذه التجربة. قابل لإعادة الإنتاج الكمي للغربية لطخة يعمل أفضل في الحالات التي يمكن فيها الظروف التجريبية التي تسيطر عليها جيدا، مثل عند استخدام الماوس أو غيرها نماذج حيوانية لخلفية وراثية محددة. على النقيض من ذلك، في العديد من التجارب باستخدام عينات المرضى البشر، وهذا قد يكون ممكناً أقل كالعمر والتنوع الجيني ومرات أخذ عينات الأنسجة أصعب بكثير للسيطرة مما في نظم نموذجية (الحيوانية). الأساليب المستندة إلى لوحة مثل أليسا قد يكون أكثر ملاءمة لهذه التحليلات، على الرغم من أن التحقق الدقيق من خصوصية جسم أمر حاسم. على سبيل المثال، في هشاشة X بحوث متلازمة، الأجسام المضادة قد ثبت أن الكشف عن isoforms مختلفة وعند استخدامها في أليسا هذا يؤدي إلى المبالغة في تقدير المبلغ الإجمالي للبروتين كما يحدد أليسا بإشارة isoforms جميع مجتمعة24. الخيارات المثلى لأساليب لتحديد تعبير البروتين ولذلك تبعاً للسياق، عينة من نوع ومسألة البحوث التي يجري التحقيق فيها.
إجراء تحليلات إحصائية كافية شرط أساسي لمصداقية أي الاستنتاجات المستخلصة من التحديد الكمي للبيانات البيولوجية. إحصائيا تحليل البيانات المعقدة يتم إنشاؤها من خلال مقارنة مختلف الأنسجة، يشير الوقت أو مزيج منها وظروف تجريبية أخرى قد تتطلب أكثر تقدما النمذجة الإحصائية مما يمكن تسليم ANOVA مع اختبار وظيفة مخصصة. للنماذج الإحصائية أكثر تعقيداً، مثل نموذج المختلط-الآثار النهج، يصف لنا في المخطوطة الحالية، قد يكون من المستصوب أن يلتمس المشورة المزيد من بيوستاتيستيسيانس. تحليل إحصائي الكافية للتعبير البروتين على نطاق واسع يمكن أن تحسن كثيرا على متانة من النتائج، والموثوقية وإمكانية تكرار نتائج النتائج.
وباختصار، يوفر النهج التجريبي الذي يصف لنا هنا أسلوب قوي واستنساخه للباحثين التي تريد تحديد التعبير البروتين باستخدام لطخة غربية في العينات المعقدة التي تسمح للإجابة على أسئلة بحثية جديدة ومثيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.
Acknowledgments
E.J.N.G. معتمد من قبل ويلكوم ترست (منحة 106098/Z/14/Z). وقدمت مصادر التمويل الأخرى بثقة SMA (SMA اتحاد المملكة المتحدة؛ T.H.G. & Y-t. حاء) وأوروبا SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.) وفي جامعة أدنبرة النشر المكتبي في الطب الدقة (T.H.G.، ول & A.M.M.) ومركز ماكدونالد Euan للبحوث في مجال الأمراض العصبية الحركية (T.H.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
