Summary
该方法描述了一种可靠且可重复的方法, 用于使用标准化的定量西方印迹法比较不同组织和不同发育时间点的蛋白质水平。
Abstract
西方印迹是一种通常用于检测和量化蛋白质表达的技术。多年来, 这一技术在基础和临床研究方面都取得了许多进展。然而, 与许多类似的实验技术一样, 西方印迹分析的结果很容易受到在实验设计和执行中做出的选择的影响。特定的家政蛋白传统上被用来使蛋白质水平正常化, 以便进行定量, 但是, 这些蛋白质有许多局限性, 因此在过去几年中受到越来越多的批评。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 我们已经开发, 使我们能够进行复杂的比较蛋白质表达的变化, 在不同的组织, 小鼠模型 (包括疾病模型), 和发育时间点。通过使用荧光总蛋白染色并引入内部加载标准, 可以克服现有的限制, 在实验中可以比较的样本数量, 并系统地比较整个的实验条件范围。这种方法扩大了传统西方印迹技术的使用, 从而使研究人员能够更好地探索不同组织和样本中的蛋白质表达。
Introduction
西方印迹是一种技术, 通常用于检测和量化蛋白质表达, 包括在组织同质或提取物。多年来, 这项技术在基础和临床研究方面都取得了许多进展, 可以作为诊断工具来识别疾病 1、2 的存在。西方印迹最早被描述为1979年将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝化纤维素片的一种方法, 然后使用被放射性标记或与荧光素结合的二级抗体对蛋白质进行可视化或过氧化物酶 3。通过开发商业上可获得的套件和设备, 西方的印迹方法多年来日益标准化和简化。事实上, 这项技术现在很容易由具有不同背景和经验水平的科学家来执行。然而, 与许多类似的实验技术一样, 西方印迹分析的结果很容易受到在实验设计和执行中做出的选择的影响。因此, 重要的是, 标准化的西方印迹方法的可获得性并不掩盖仔细进行实验规划和设计的必要性。实验考虑因素包括但不限于样品制备和处理、蛋白质检测抗体的选择和验证, 以及特别小或大的凝膜转移效率 (lt;10 或 gt;140 kDa)蛋白质4,5,6,7,8,9。原始样品的蛋白质质量在确定随后的西方印迹分析结果方面发挥着重要作用。由于蛋白质可以从各种样品和来源中提取, 包括细胞系、动物模型组织和死后人体组织, 因此需要在处理和处理方面保持一致, 以获得可重现的结果。例如, 当需要长期储存用于蛋白质提取的样品时, 必须认识到, 尽管蛋白质在-80°c 时通常是稳定的, 但在-80°c 时, 提取的蛋白质和完整组织之间的蛋白质稳定性存在差异。报告10。此外, 要获得蛋白质数量的可重复估计, 样品的一致同质化也是至关重要的。在开始大规模定量实验之前, 可能需要优化不同的裂解缓冲液和均质方法 (例如, 与自动化方法相比的手动均质化)。
对蛋白质负荷和定量变异性进行归一化的策略对于获得蛋白质表达的稳健、定量结果至关重要。家务蛋白, 如β-肌动蛋白、α-管蛋白、β-管蛋白和甘油-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH), 传统上被用来使蛋白质水平正常化, 以便进行定量。然而, 为量化目的对特定的家政蛋白进行规范化, 在过去几年中, 11,12受到越来越多的批评。例如, 在不同的发育阶段13、14、同一动物4的组织和不同的疾病条件下, 家养蛋白的表达会发生变化 ,16,17。因此, 使用特定的家政蛋白限制了在不同的时间点和不同的实验条件下对不同组织的蛋白质表达进行更复杂比较的可能性。清洁蛋白的另一种方法是使用总蛋白染色 (TPS) 来标记样本中存在的所有蛋白质。TPS 允许根据总蛋白质负载而不是一个特定蛋白质的水平进行信号归一化, 因此, 无论实验条件、样品类型或发展时间点如何, TPS 信号的定量都应具有可比性和可重现性.总蛋白污渍的例子包括 Ponceau S、无污渍凝胶、Coomassie R-350、Sypro-Ruby、Eppicconone、Amydo Black 和 Cy5 (见第18段审查)。这些方法中的每一种都有具体的优势和局限性, 方法的选择取决于可用的时间和工具以及实验设置4、18。
除了使用 TPS 来纠正膜内负荷和定量变化外, 可能还需要比较不同膜之间的样品, 特别是在进行大规模蛋白质表达分析时。然而, 抗体结合效率和总蛋白质染色强度等因素的变化可能会导致蛋白质样本之间的进一步变化, 并在单独的凝胶和膜上进行分析。因此, 为了在这种情况下进行可靠的量化, 有必要引入进一步的归一化步骤, 以考虑膜间的可变性。这可以通过在每个单独分析的膜上加入一个内部加载标准来实现, 该膜在整个实验中保持不变。该标准可以采取任何蛋白质裂解液的形式, 可以获得足够数量的蛋白质裂解物, 用于实验中包括的所有膜。在这里, 我们使用老鼠大脑裂解液 (从5天的对照小鼠获得), 因为大脑很容易同质化, 所获得的蛋白质裂解液在高浓度中含有大量的蛋白质。通过将内部标准加载到一式三份, 可以直接对单独膜上的样品进行归一化和比较。
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 我们已经开发, 使我们能够进行复杂的比较蛋白质表达的变化, 在不同的组织, 小鼠模型 (包括疾病模型), 和发育时间点19。通过将荧光 TPS 与内部加载标准相结合, 我们能够克服现有的样品数量和实验条件方面的限制, 这些限制可以在单个实验中进行比较。这种方法扩大了传统西方印迹技术的使用, 从而使研究人员能够更好地探索不同组织和样本中的蛋白质表达。
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Protocol
这一程序的程序是从爱丁堡大学内部道德委员会批准的动物研究中获得的, 这些研究是根据相关机构和英国内政部的规定进行的。个人和项目许可证。
注: 该协议已使用商业上可用的标准化试剂盒和试剂进行了优化, 以提高重现性 (见材料表)。
1. 样品的制备
-
蛋白质提取
- 在干冰上转移-80°c 的小细胞或组织样本, 在冰上解冻, 并按要求使用冰凉的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 进行清洗 (有关组织和 PBS 清洗的详细信息, 请参见表 1)。避免不必要的冻融循环, 因为这会影响蛋白质质量。
- 添加放射性免疫沉淀法 (RIPA) 缓冲液 (25 mM Tris-HCl (pH 7.6)、150 mM 氯化钠、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS), 每个样品含有1x 蛋白酶抑制剂, 使用每个组织重量的最佳量 (见表 1建议)。
注: 根据应用的不同, 同质化缓冲区的类型和数量可能需要进一步优化。 - 使用带有聚丙烯管的手持电均质机对组织样品进行均质化。在每个样品之间, 用双蒸馏水清洗, 用干净的纸巾干燥。改变不同实验条件和组织之间的。
- 均匀化后, 将样品放在冰上10分钟。在4°c 的温度下 Gt;10,000 x克离心样品10分钟。
- 在不干扰颗粒的情况下, 将上清液转移到冰上的新管上。上清液是蛋白质样本。将提取的蛋白质储存在-80°c 或直接测量蛋白质浓度。
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蛋白质浓度的定量和正常化
- 使用双氯酸 (BCA) 法测定蛋白质浓度。根据制造商的说明, 在96孔光学板上使用每口200Μl 的 BCA 混合物准备 BCA 检测组合。
注: 其他定量方法, 如 Lowry 和 Bradford 检测, 也可以用来确定蛋白质浓度, 只要蛋白质浓度是一致的整个实验。 - 在浓度增加的情况下, 准备牛血清白蛋白 (BSA) 标准, 使其浓度增加到三分法, 并在每个蛋白质样本中添加 1Μl, 重复。如果蛋白质浓度预计较低, 则在60°c 预热热块中将96孔板培养10分钟或更长时间。
- 孵育后, 使用板式读取器测量吸收在560纳米。
- 通过将每个样品的平均吸收值与使用蛋白质标准获得的标准曲线进行比较, 导出板式读取器测量值并计算蛋白质浓度。标准曲线的 r 平方值应大于或等于 0.98, 以准确估计样品蛋白质浓度。
- 通过在样品缓冲液和超纯水中制备蛋白质样品的稀释, 使蛋白质的数量正常化。总体积可以根据使用的凝胶类型进行调整。建议在每车道加载30微克的蛋白质作为起始量。根据需要在每个样品中添加还原剂, 如二硫醇 (DTT; 最终浓度为 5 mm) 或β-硫醇 (最终浓度为 200 mM)。移液器未稀释β-硫醇在烟罩中。
- 在70°c 的热块中将样品加氢 10分钟, 将样品放在冰上, 涡旋, 并短暂旋转以收集。保持冰, 直到加载凝胶。
- 使用双氯酸 (BCA) 法测定蛋白质浓度。根据制造商的说明, 在96孔光学板上使用每口200Μl 的 BCA 混合物准备 BCA 检测组合。
2. 蛋白质样品的凝胶电泳
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设备和凝胶设置
- 在凝胶电泳室系统中设置一个预铸4-12% 的 Bis-Tris 梯度凝胶 (见材料表)。使用前使用双蒸馏水冲洗凝胶。
注: 根据感兴趣的蛋白质的大小、相互作用和丰度, 可以使用具有不同梯度、缓冲剂或井大小和数量的凝胶。 - 加入500毫升的 1x mes SDS 运行缓冲液, 在每个水箱的双蒸馏水中稀释。在添加运行缓冲器后, 小心地将梳子从凝胶中取出, 而不会干扰堆叠凝胶中的井。
- 在凝胶电泳室系统中设置一个预铸4-12% 的 Bis-Tris 梯度凝胶 (见材料表)。使用前使用双蒸馏水冲洗凝胶。
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蛋白质负载
- 将蛋白标准的3.5Μl 加载到井中。根据样品的布局, 在凝胶的两侧加载蛋白质梯子有助于更准确地估计蛋白质大小。使用细尖凝胶加载提示, 以获得更准确的样品加载。
- 当使用内部标准进行膜间正常化时 (请参阅下面的步骤5和讨论), 将等于其他样本的量加载到蛋白质阶梯旁边的前3口井。
- 在剩余的井中装载每个样品的30μg。在所有空井中添加1个样品缓冲区。
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电泳
- 在加载样品后组装凝胶罐。在 80 V 处通过堆叠凝胶运行样品 10分钟, 然后再运行 150 V, 再运行45-60分钟。
3. 蛋白质转移
注: 本协议中的蛋白质转移是使用市售的半干印迹系统 (见材料表) 进行的, 以获得快速和一致的结果。
- 在双蒸馏水中预浸泡滤纸, 准备蛋白质转移, 并确保凝胶刀、塑料巴斯德移液器、印迹辊和钳子即可使用。
- 小心取出所有包装箔, 打开传输堆栈。从底部堆栈中取出顶部, 并将其放在一边。快速润湿膜底部堆栈与几滴电泳运行缓冲液 (2-3 毫升)。一旦传输堆栈打开, 重要的是要防止 PVDF 膜干燥。
- 停止电泳后, 用凝胶刀打开预铸凝胶, 切断堆叠凝胶。在边缘切割凝胶, 使其从塑料铸件中解脱出来。保持凝胶刀湿润, 以防止损坏凝胶。
- 组装从下到上的传输堆栈: 底部堆栈 (包含 PVDF 膜), 蛋白质凝胶, 滤纸。使用印迹辊去除所有气泡。将上面的堆栈放在滤纸的顶部, 然后再次滚动堆栈以去除气泡。不要推得太厉害, 因为这可能会导致凝胶在蛋白质转移过程中变形。
- 将整个堆栈转移到传输装置中, 电极位于设备的左侧, 并将凝胶海绵放置在堆栈顶部, 使其与设备上相应的电气触点对齐。合上盖子, 选择并启动相应的程序 (20 V 7分钟是推荐的起点)。
- 完成后, 将盖子关闭 2分钟, 以便堆栈冷却, 并防止膜干燥。取下转移堆栈, 将膜切割成凝胶大小。用双蒸馏水快速清洗切割膜, 然后继续使用总的蛋白质染色。
4. 总蛋白染色
注: 与传统方法 (如 ECL 检测) 相比, 使用荧光检测可提供显著优势, 因为线性范围和灵敏度可以更好地控制4。因此, 在步骤4和5 中,使用荧光 tps 和荧光二级抗体 (见材料表)。
- 将膜卷成50毫升的管, 蛋白质侧朝内。由于荧光 TPS 和二级抗体的感光度, 随后的所有步骤都是在黑暗中进行的。
- 加入5毫升的蛋白质染色液 (见材料表), 在室温下在辊上孵育5分钟。由于 TPS 和洗涤缓冲液中含有甲醇, 因此请在烟罩中执行这些步骤。
- 用5毫升的洗涤液 (30% 甲醇中的6.3% 醋酸) 丢弃染色液并快速清洗两次。将管子短暂地放在清洗步骤之间的滚子上。用超纯水将膜短暂冲洗, 然后再继续。
5. 阻塞、抗体培养和检测
- 封堵膜: 在含有膜的50毫升管中加入3毫升的封堵缓冲液 (见材料表)。在室温下将膜在辊上加氢30分钟。根据抗体的选择, 所使用的阻断缓冲液的类型可能需要优化。
-
原代抗体培养
- 丢弃阻塞性缓冲液, 并在适当的、优化的浓度下替换为原抗体 (图 1和图 2: 鼠标抗 smn, 在1:1000 处, 在阻塞缓冲液中稀释)。
注: 对初级抗体的充分优化应包括确认抗体检测到的蛋白质产品的大小合适, 同时不显示或最小的结合于其他不具体的蛋白质产品。如果可能的话, 测试和比较多种抗体对感兴趣的蛋白质。 - 在4°C 条件下在滚子上隔夜培育膜。第二天, 取出抗体溶液, 在室温 (RT) 下, 用 1x PBS 在滚子上清洗 6次, 每次5分钟。
- 丢弃阻塞性缓冲液, 并在适当的、优化的浓度下替换为原抗体 (图 1和图 2: 鼠标抗 smn, 在1:1000 处, 在阻塞缓冲液中稀释)。
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二级抗体培养
- 在5毫升阻断缓冲液中, 以1:5000 的速度对原代抗体的宿主制备特定的二级抗体。其他二级抗体可能需要其他稀释或使用替代阻断缓冲液。
- 在 RT 用二次抗体溶液在滚子上培养膜1小时。孵育后, 用 1x PBS 在滚子上清洗膜 3次30分钟。
- 干燥膜, 并保持膜免受光使用铝箔, 直到检测。膜可保存在 4°c, 以便长期储存。
-
图像采集
- 登录到连接到扫描仪的计算机。将蛋白质面朝下的膜放在扫描仪上, 并在软件中选择扫描区域。
- 通过确认不发生饱和, 优化两个通道 (700 纳米和 800 nm) 的激光强度。获取两个通道中的图像并导出图像以进行进一步分析 (步骤 6)。
6. 西方印迹分析和量化
注: 这些建议基于免费提供的图像工作室软件。但是, 也可以使用其他软件包 (如 ImageJ) 进行可比较的分析。
- 导入文件: 在用于分析的计算机上创建本地工作区。这将生成获取的西方印迹的图像文件数据库。导入在扫描仪上获得的文件, 并选择要分析的图像。
-
TPS 分析
- 显示700纳米通道以显示总蛋白染色结果。TPS 映像的一个示例包括在图 1中, 其中直接比较了新生儿 (p5) 和10周大的小鼠 (图 1A-B) 的不同组织。同样,图 2显示了一个例子, 直接比较脑组织的小鼠的不同年龄的小鼠。
- 从右上角选择"分析" 选项卡, 然后选择"添加矩形" 以定义规范化感兴趣的区域 (图 1 b, d)。将第一个矩形区域复制并粘贴到每个单独的示例上, 以确保所有分析道的定义区域大小相同。
- 从软件左下角的"形状"选项卡复制结果。
-
量化
注: 样品的最佳量化方法取决于实验设计。我们将在这里提供一个示例, 说明检测生存运动神经元蛋白 (smn; 一种参与神经肌肉疾病的关键蛋白脊髓肌肉萎缩20,21), 已知这种蛋白质会随着时间的推移而减少19以及 smn 信号强度如何归一化到 tps 提供了蛋白质表达发展的可靠估计。- 图 2显示了随着以 tps 为蛋白质负荷控制的动物年龄的增长, smn 表达的减少。重复步骤 6.2.1-6.2.3 量化蛋白质负载 (图 2b)。重复步骤 6.2.1-6.2.3 在800纳米通道 (图 2a), 以分析感兴趣的蛋白质。
- 将 TPS 和感兴趣的蛋白质的结果复制到电子表格程序中。在电子表格上, 首先通过确定最高 TPS 信号并将每个 TPS 信号值除以此值来归一化蛋白质负载, 以获得归一化的蛋白质负载值。
- 将每个样本的800纳米信号值除以相应的归一化蛋白值, 计算不同样本的相对蛋白质表达率。
- 第一次归一化后, 将不同的时间点或组织与内部标准的平均值进行比较, 以便在不同的膜和实验中进行直接比较。
7. 统计
- 为了确定复杂和大样本组蛋白质表达的任何统计上显著差异, 需要适当的统计方法。虽然对统计背景的详细讨论超出了本文件的范围, 但我们要强调几个考虑因素, 并详细说明我们以前使用的成功方法。
- 对于许多实验, 蛋白质定量测量并不代表完全独立的数据。例如, 在这里, 通常从单个动物那里获得多个组织, 以确定单个实验时间点多个器官的蛋白质水平。因此, 我们使用混合效应模型来分析蛋白质表达随着时间的推移, 以及组织之间的差异。 一般来说, 混合效应模型提供了处理非独立性的有效手段, 从而避免了伪复制 22,23。在本案中, 混合效应模型通过考虑个体内部组织之间的重复测量, 提高了统计能力。我们使用统计软件包 R 来执行这些分析, 因为这是免费提供的, 用途广泛。但是, 其他商业上可获得的软件包可能能够进行类似的分析。
- 目前的实验设计涉及 "分块图" 设计, 因为每只老鼠只属于一个年龄组。因此, 我们将单个鼠标 (鼠标 ID) 建模为具有唯一标识符的随机效应;我们也考虑到组织, 年龄, 和他们的相互作用作为固定的效果。我们使用 R 库中的函数 lmer 对数据进行了建模。作为质量控制步骤, 我们将残差可视化为评估等方差和正态分布的假设, 并在必要时转换数据以满足这些假设。为了测试组织和年龄之间的显著相互作用, 我们建立了一个缺乏这种相互作用的相同模型, 并使用参数引导 (库中的 R 函数 Pbkrtest, pbkrtest) 对模型进行了比较。 在出现重大交互的情况下, 我们使用函数数据 (在 emmeans R 库中) 来确定交互的原因。 例如, 我们比较了每个组织中年龄等级之间的均表达;如果, 比如说, 两个特定的年龄类别对一个组织, 但不是另一个组织, 则年龄和组织之间可能会出现显著的相互作用。总之, 这些方法通过为这些结果提供统计支持, 为扩大西方印迹实验结论的鲁棒性提供了一种方法。
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Representative Results
我们包括使用 TPS 和内部标准的例子, 以促进对组织和时间点之间的蛋白质水平进行比较。图 1显示了西方对从新生儿 (产后第5天) 获得的组织中提取的蛋白质进行印迹的结果, 与成年小鼠 (10周大) 相比。TPS 和 Smn 免疫印迹如图 1a, c所示。通过测量每个车道上矩形框内的荧光强度, 实现了 TPS 荧光强度的定量, 其结果如图 1 b和1 d 所示。请注意, 来自不同组织的样本具有不同 TPS 蛋白带模式的特征, 因此有必要使用整车道进行规范化。事实上, 在分析整个车道时, 样品的荧光强度保持相对相似, 这表明用于归一化的 TPS 适用于此目的。一个内部标准组成的 P5 脑裂解液混合物也包括在内, 以说明如何使用它进一步比较不同的膜。此外, 在图 2中, 我们展示了如何使用荧光 tps 来比较不同发育时间点的蛋白质水平。在这里, 我们显示新生儿 (P5)、断奶年龄 (P20) 和成年 (10W) 小鼠脑裂解液中的 Smn 水平 (图 2a)。虽然 Smn 水平明显随着年龄的变化而下降, 但 TPS 量化保持不变, 如图2b 所示。
图1。在两个不同的年龄, 在小鼠组织中显示 TPS 和 Smn 蛋白水平的西方印迹.P5 (a) 和 10周 (c) 小鼠的 Tps 和 smn 蛋白。(B、D)计算了全车道 TPS 的荧光强度, 并表示 (任意单位)。M: 标记/蛋白标准;kDa: 千吨;a. u.: 任意单位;P5: 产后第5天;10W: 10周。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。不同发育时间点小鼠组织中的 Smn 表达分析.(A) 利用 tps (顶板) 和 smn (下面板) 对 P5、p20 和10周大的小鼠组织中的人才裂解物进行了分析。(B) 计算了 tps 的荧光强度, 并以任意单位表示。M: 标记/蛋白标准;kDa: 千吨;a. u.: 任意单位;P5: 产后第5天;P20: 产后第20天;10W: 10周。请点击这里查看此图的较大版本.
| 组织 | 约重量 * | 1xPBS 清洗 (4°C) | 重复清洗 | 均质缓冲液 * * |
| 脊髓 | 40毫克 | 150毫升 | 3倍 | 100毫升 |
| 肌肉 (GC) | 20毫克 | 150毫升 | 3倍 | 100毫升 |
| 大脑 | 240毫克 | 400毫升 | 4倍 | 400毫升 |
| 心 | 60毫克 | 400毫升 | 4倍 | 200毫升 |
| 肝 | 130毫克 | 400毫升 | 4倍 | 400毫升 |
| 肾 | 45毫克 | 400毫升 | 4倍 | 200毫升 |
| * 这些重量是从 P8 小鼠获得的组织的指示值。 | ||||
| * * 这些体积是适应症, 可以根据组织的重量进一步调整。 | ||||
表1。用于均质化的预期组织重量概述以及 PBS 洗涤和裂解缓冲量的相应建议.重量是从产后第8天 (P8) 小鼠获得的组织的适应症。PBS 和裂解缓冲量可以根据实验需要进行放大和缩小。
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Discussion
通过适当的实验设计、控制措施和统计分析, 西方印迹可以用于对不同范围的生物样本内和之间的蛋白质表达进行可靠的定量估计。我们在目前的手稿中描述的协议旨在为希望利用西方印迹对更大、更复杂的样本组进行定量分析的研究人员提供指导, 方法是使用基于荧光的组合检测方法、总蛋白质负荷归一化和内部标准。虽然这里的重点是确定和比较不同的小鼠组织和不同年龄的蛋白质表达, 这种方法也可以扩展, 以比较蛋白质在其他实验条件下的表达。
在我们目前的协议的一个核心步骤是通过量化荧光总蛋白染色的总蛋白负载感兴趣的蛋白质的正常化。TPS 归一化修正了蛋白质定量方法中样品负荷和误差幅度的变化。然而, 由于可以在单个膜上分析的蛋白质样本数量通常有限, 因此可能需要进一步归一化来比较多个膜。事实上, 蛋白质在不同膜上检测的方式之间的差异 (例如由于抗体培养时间或温度变化) 可能会导致超出通过协议的加载和量化步骤引入的变化。在这里, 我们使用一个内部标准, 其中包括一个单一的蛋白质裂解液混合, 加载在每种凝胶上一式三份, 并允许在 gels/膜之间进行比较和归一化。从理论上讲, 这可以是任何蛋白质样品, 只要它可以在足够的数量, 使相同的样品可以用于所有的实验。在我们的实验中, 我们使用大脑蛋白质裂解物的混合物, 因为大脑同质体含有大量的蛋白质, 通常是在高浓度下获得的。对三份标准的平均量化应进一步提高全膜定量的准确性, 并有助于实验的重现性。
蛋白质水平可以通过许多不同的技术来确定, 首选的方法取决于所分析的样本类型和实验的目标。在实验条件可以很好地控制的情况下, 例如在使用老鼠或其他具有明确遗传背景的动物模型时, 对西方印迹进行可重复量化效果最好。相反, 在许多使用人体病人样本的实验中, 这可能不太可行, 因为年龄、遗传变异和组织取样时间比 (动物) 模型系统更难控制。基于平台的技术, 如 ELISA 可能更适合于这些分析, 虽然仔细验证抗体特异性是至关重要的。例如, 在脆弱的 X 综合征研究中, 抗体已被证明可以检测到不同的异形, 在 ELISA 中使用时, 这将导致对蛋白质总量的高估, 因为 ELISA 确定所有等形式组合24的信号。因此, 确定蛋白质表达的方法的最佳选择取决于上下文、样本类型和正在研究的研究问题。
进行充分的统计分析是从生物数据量化中得出的任何结论的可靠性的先决条件。通过比较不同的组织、时间点或其他实验条件及其组合来统计所产生的复杂数据, 可能需要比具有事后测试的 ANOVA 更先进的统计建模。对于更复杂的统计建模, 如混合效应模型方法, 我们在目前的手稿中描述, 最好寻求生物统计学家的进一步建议。对大规模蛋白表达进行充分的统计分析, 可以大大提高结果的鲁棒性以及结果的可靠性和重现性。
总之, 我们在这里描述的实验方法为研究人员提供了一种可靠和可重复的方法, 他们希望在复杂的样品中使用西方印迹来确定蛋白质表达, 从而回答新的和令人兴奋的研究问题。
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Disclosures
作者没有相互竞争的利益可以披露。
Acknowledgments
E. j. n. g. 得到 Wellcome 信托基金的支持 (赠款 106080/z z z)。其他资金由 SMA 信托基金 (SMA UK 财团) 提供;T. H. G. & Y-T。H.)、SMA Europe (t. h. g.、d. d. h. & e. j. n. g.)、爱丁堡大学精密医学 DTP (t. h. g.、l. l. l. & a. m.) 和 Euan MacDonald 汽车神经疾病研究中心 (t. h. g.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
