Summary
Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.
Abstract
Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression. Im Laufe der Jahre führte diese Technik zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Spezifische Zimmermädchen Proteine traditionell verwendet wurden, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren, aber diese haben eine Reihe von Einschränkungen und sind daher in den letzten Jahren zunehmend kritisiert worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Gesamtprotein Fleckes und Einführung in die Verwendung von einem internen standard laden, es ist möglich, bestehende Einschränkungen in der Anzahl der Stichproben zu überwinden, die in Experimenten verglichen werden können und systematisch vergleichen Proteingehalte in eine Reihe von experimentellen Bedingungen. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.
Introduction
Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression, einschließlich Gewebe Homogenates oder Extrakte. Im Laufe der Jahre hat diese Technik führte zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung, wo es als diagnostisches Werkzeug lässt sich das Vorhandensein der Krankheit1,2identifizieren. Westliche Beflecken wurde erstmals im Jahr 1979 als eine Methode, um Proteine von Polyacrylamid-Gele auf Nitrozellulose Blätter übertragen und anschließend visualisieren Proteine mit sekundären Antikörpern, die waren entweder radioaktiv gekennzeichnet oder konjugiert zu Fluorescein beschrieben oder Peroxidase-3. Durch die Entwicklung von kommerziell erhältlichen Kits und Ausrüstung wurden westliche befleckende Methoden zunehmend standardisiert und vereinfacht im Laufe der Jahre. Die Technik ist in der Tat, jetzt leicht von Wissenschaftlern mit unterschiedlichen Hintergründen und Ebenen der Erfahrung durchgeführt. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Es ist wichtig, daher, dass die Zugänglichkeit von standardisierten westliche befleckende Methoden nicht die Notwendigkeit sorgfältiger experimentelle Planung verdecken und design. Experimentelle Überlegungen gehören, jedoch nicht beschränkt auf, Probe Vorbereitung und Handhabung, Auswahl und Validierung von Antikörpern für die Proteindetektion und Gel-Membran Auftragswirkungsgrad von besonders klein oder groß (< 10 oder > 140 kDa) Proteine4,5,6,7,8,9. Protein-Qualität der ursprünglichen Probe spielt eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung, des Ergebnis der anschließenden Western-Blot Analyse. Wie Protein aus einer Vielzahl von Proben und Quellen, einschließlich die Zelllinien, Gewebe aus Tiermodellen und Post-Mortem-menschlichen Geweben, extrahiert werden kann ist Konsistenz in Handhabung und Verarbeitung erforderlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Zum Beispiel, wenn langfristige Lagerung von Proben zur Proteingewinnung erforderlich ist, ist es wichtig zu erkennen, dass obwohl Protein in der Regel stabil bei-80 ° C ist, Unterschiede in Proteinstabilität extrahierten Proteine und intakten Gewebe bei-80 ° C gewesen sein gemeldeten10. Darüber hinaus ist konsequente Homogenisierung der Proben um reproduzierbare Schätzungen der Proteinmengen zu erhalten, entscheidend. Optimierung der verschiedenen Lyse Puffer und Homogenisierung Methoden (z. B. manuelle Homogenisierung im Vergleich zu automatisierten Methoden) kann erforderlich sein, vor Beginn der quantitativen Großversuch.
Normalisierung Strategien für Protein be- und Quantifizierung Variabilität zu korrigieren sind wichtig, robuste, quantitative Ergebnisse der Proteinexpression erhalten. Housekeeping Proteine wie β-Aktin, haben α-Tubulin, β-Tubulin und Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) traditionell verwendet, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren. Normierung auf spezifische Zimmermädchen Proteine Quantifizierung Zwecken wurde jedoch zunehmend über die letzten paar Jahre11,12kritisiert. Beispielsweise kann der Ausdruck Hauswirtschaft Proteine in unterschiedlichen Entwicklungsstadien13,14, über Gewebe aus dem gleichen Tier4und unter verschiedenen Krankheiten Bedingungen4,15 ändern. ,16,17. Daher schränkt die Verwendung von bestimmten Haushalt Proteine die Möglichkeiten der komplexere Vergleiche zwischen Proteinexpression aus verschiedenen Geweben, an verschiedenen Zeitpunkten und unter verschiedenen experimentelle Bedingungen. Eine Alternative zum Haushalt Proteine Steuern für Protein laden Variante ist die Verwendung des Fleckes Gesamt-Protein (TPS), Etiketten und visualisiert alle Proteine in einer Probe vorhanden. TPS ermöglicht Signal Normalisierung anhand der Gesamt-Protein Last anstatt ein spezifisches Protein und somit Quantifizierung der TPS Signal sollte vergleichbar und reproduzierbar unabhängig von Versuchsbedingung, Probentyp oder Entwicklungsstörungen timepoint . Beispiele für Gesamtprotein Flecken Ponceau S, fleckenfreie Gele Coomassie R-350, Sypro-Rubin, Epicocconone, Amydo Black und Cy5 (überarbeitet in Nr. 18). Jede dieser Methoden hat spezifische Vorteile und Beschränkungen und Auswahl richtet sich nach der Zeit und Werkzeuge zur Verfügung, sowie der Versuchsaufbau4,18.
Zusätzlich zur Verwendung einer TPS, um innerhalb der Membran be- und Quantifizierung Variabilität zu korrigieren, kann es notwendig, Proben zwischen verschiedenen Membranen, besonders bei großflächigen Proteinanalytik Ausdruck zu vergleichen sein. Variabilität in Faktoren wie Antikörper binden Effizienz und Total Protein Fleck Intensität kann jedoch weitere Variabilität zwischen Proteinproben, die analysiert werden auf separaten Gele und Membranen einführen. Für robuste Quantifizierung in dieser Situation ist es daher notwendig, einen weiteren Normalisierung Schritt um Variabilität zwischen Membran zu berücksichtigen. Dies kann erreicht werden durch die Einbeziehung eines internen laden Standards auf jedem der separat analysierten Membranen, die über Experimente konstant gehalten wird. Dieser Standard kann haben die Form von jedem Protein lysate, in ausreichenden Mengen verwendet werden, über alle Membranen enthalten im Experiment gewonnen werden können. Hier verwenden wir ein lysate Gehirn der Maus (5 Tage alten Kontroll-Mäusen entnommen), Gehirn wird leicht homogenisiert und das gewonnene lysate Protein enthält eine erhebliche Menge an Protein in einer hohen Konzentration. Laden eines internen Standards in dreifacher Ausfertigung kann Proben auf separaten Membranen normalisiert und direkt verglichen werden.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte19auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Kombination einer fluoreszierenden TPS mit dem Einsatz von einem internen standard laden, konnten wir zur Überwindung bestehender Einschränkungen in der Anzahl der Proben und experimentellen Bedingungen, die in einem einzigen Experiment verglichen werden kann. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen Western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gewebe für dieses Verfahren stammen aus tierexperimentellen Studien, die von der internen Ethikkommission an der Universität von Edinburgh genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit institutionellen und UK Home Office Regelungen unter der Aufsicht der zuständigen persönliche und Projekt-Lizenzen.
Hinweis: Dieses Protokoll optimiert mit standardisierten, im Handel erhältlichen Kits und Reagenzien um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen (siehe Tabelle der Materialien).
1. Vorbereitung der Proben
-
Proteingewinnung
- Transfer Snap eingefroren Zelle oder Gewebeproben von-80 ° C auf Trockeneis, tauen auf Eis, und je nach Bedarf mit Eis kalt 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen (für Details über Gewebe und PBS Waschungen, siehe Tabelle 1). Vermeiden Sie unnötige Frost-Tau-wechseln, da das Proteinqualität beeinträchtigt wird.
- Fügen Sie Tests (RIPA) Testpuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 NP-40 %, 1 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS) mit 1 x Protease-Inhibitor zu jeder Probe, mit der optimalen Menge pro Gewebe Gewicht (siehe Tabelle 1 für Empfehlungen).
Hinweis: Je nach Anwendung, die Art und Menge der Homogenisierung Puffer Optimierung benötigen eventuell. - Verwenden Sie eine tragbare elektrische Homogenisator Polypropylen zerstoßen, um Gewebeproben zu homogenisieren. Zwischen jeder Probe den Stößel in bidestilliertem Wasser waschen und trocknen mit einem sauberen Tuch. Ändern Sie den Stößel zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen und Gewebe.
- Verlassen Sie die Proben für 10 min auf Eis nach Homogenisierung. Zentrifugieren Sie die Proben bei > 10.000 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
- Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch auf Eis ohne zu stören das Pellet. Der Überstand wird die Protein-Probe. Speichern Sie die extrahierten Proteine bei-80 ° C oder gehen Sie direkt zur Messung der Konzentration des Proteins.
-
Quantifizierung und Normalisierung der Proteinkonzentration
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninic Säure (BCA) Assay. Bereiten Sie einen BCA Assay Mix entsprechend den Anweisungen des Herstellers in einer 96-Well optische Platte mit 200 µL des BCA-Mix pro Bohrloch.
Hinweis: Andere Quantifizierungsmethoden wie Lowry und Bradford Assays auch lässt sich Proteinkonzentration zu bestimmen, solange Proteinkonzentration konsequent über Experimente quantifiziert ist. - Bereiten Sie Rinderserumalbumin zu (BSA) Standards bei steigenden Konzentrationen in dreifacher Ausfertigung und 1 µL jedes Protein Sample in zweifacher Ausfertigung. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte in einen vorgeheizten Heizblock bei 60 ° C für 10 Minuten oder länger, wenn die Proteinkonzentration, gering sein soll.
- Nach der Inkubation messen die Absorption bei 560 nm mit einem Teller-Reader.
- Exportieren Sie die Platte Leser Messungen und berechnen Sie Konzentration des Proteins durch den Vergleich der durchschnittlichen Absorption Werte jeder Probe zu einer Standardkurve erhalten mit dem Protein-Standard zu. Das Bestimmtheitsmaß für die Standardkurve sollte größer oder gleich 0.98, Probe Proteinkonzentration genau zu schätzen.
- Die Menge an Protein durch die Ausarbeitung von Verdünnungen von Proteinproben im Probenpuffer und Reinstwasser zu normalisieren. Das Gesamtvolumen einstellbar je nach Gel verwendet. Laden 30 µg Protein pro Lane als einen Ausgangsbetrag wird empfohlen. Fügen Sie Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT; Endkonzentration 5 mM) oder Beta-Mercaptoethanol (Endkonzentration 200 mM) für jede Probe je nach Bedarf. Pipette unverdünnt Beta-Mercaptoethanol in einer Dampfhaube.
- Inkubieren Sie die Proben in einem Heizblock bei 70 ° C für 10 Minuten kurz die Proben auf Eis, Strudel und Spin-down um zu sammeln. Halten Sie auf dem Eis bis laden das Gel.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninic Säure (BCA) Assay. Bereiten Sie einen BCA Assay Mix entsprechend den Anweisungen des Herstellers in einer 96-Well optische Platte mit 200 µL des BCA-Mix pro Bohrloch.
(2) Gelelektrophorese von Proteinproben
-
Gerät und Gel einrichten
- Einrichtung eine vorgefertigten 4 – 12 % Bis-Tris Steigung gel (siehe Tabelle der Materialien), in der Gel-Elektrophorese-Kammer-System. Spülen Sie die Gele mit bidestilliertem Wasser vor Gebrauch.
Hinweis: Je nach Größe, Interaktionen und Fülle des Proteins des Interesses, Gele mit unterschiedlicher Steigung, Pufferung, Agent oder auch Größe und Anzahl einsetzbar. - Hinzugeben Sie 500 mL 1 X MES SDS Puffer verdünnt in bidestilliertem Wasser pro Tank läuft. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm aus die Gele nach dem Hinzufügen des laufenden Puffers ohne zu stören die Brunnen in den Stapeln Gel.
- Einrichtung eine vorgefertigten 4 – 12 % Bis-Tris Steigung gel (siehe Tabelle der Materialien), in der Gel-Elektrophorese-Kammer-System. Spülen Sie die Gele mit bidestilliertem Wasser vor Gebrauch.
-
Protein-laden
- Laden Sie 3,5 µL eines Proteins standard in den Brunnen. Abhängig von der Beispielanlage kann beim Laden einer Protein-Leiter auf beiden Seiten des Gels mehr genaue Schätzung Proteingröße unterstützen. Verwenden Sie feine Spitze Gel Tipps für genauere Probenbeladung laden.
- Bei Verwendung eines internen Standards für zwischen-Membran-Normalisierung (siehe Schritt 5 unten und Diskussion), einen Betrag, den die anderen Proben in den ersten 3 Brunnen neben der Protein-Leiter entspricht zu laden.
- Last 30 µg jeder Probe in den verbleibenden Brunnen. Alle leeren Brunnen 1 x Probenpuffer hinzufügen.
-
Elektrophorese
- Montieren Sie den Gel-Tank nach dem Laden der Proben. Laufen Sie die Proben durch das Stapeln Gel bei 80 V für 10 min, gefolgt von 150 V für eine zusätzliche 45-60 min.
(3) Protein transfer
Hinweis: Protein Transfer in diesem Protokoll erfolgt über einen handelsüblichen halbtrocken befleckende System (siehe Tabelle der Materialien) für schnelle und konsistente Ergebnisse.
- Bereiten Sie die Protein-Übertragung durch Pre-Filterpapier in bidestilliertem Wasser einweichen und die Gewährleistung der Gel-Messer, Kunststoff Pasteur Pipette, befleckende Walze und Zange sind gebrauchsfertig.
- Öffnen Sie den Transfer-Stapel durch sorgfältig entfernen alle Wickelfolie. Entfernen Sie die obere von der unteren Stapel und legen Sie sie beiseite. Befeuchten Sie schnell die Membran auf den unteren Stapel mit einigen Tropfen von Elektrophorese Puffer (2-3 mL) ausgeführt. Sobald die Übertragung Stack geöffnet ist, ist es wichtig, die PVDF-Membran Austrocknen verhindert wird.
- Nach dem Absetzen der Elektrophorese, die vorgegossenen Gel mit dem Gel-Messer öffnen und das Stapeln Gel abgeschnitten. Schneiden Sie das Gel um die Kanten von der Kunststoff-Besetzung zu befreien. Halten Sie das Gel Messer nass das Gel beschädigt.
- Montieren Sie den Transfer-Stapel von unten nach oben: unten Bildstapels (mit der PVDF-Membran), Protein Gel, Filterpapier. Verwenden Sie die befleckende Walze, um alle Luftblasen zu entfernen. Legen Sie den oberen Stapel auf dem Filterpapier und Rollen Sie den Stapel erneut, um Luftblasen zu entfernen. Drücken Sie nicht zu stark dadurch möglicherweise das Gel zu verformen während Protein übertragen.
- Übertragen Sie den gesamten Stack in die Umsetzeinrichtung mit der Elektrode auf der linken Seite des Gerätes und platzieren Sie den Gel-Schwamm auf dem Stapel zu, so dass sie mit den entsprechenden elektrischen Kontakten auf dem Gerät ausgerichtet ist. Schließen Sie den Deckel, auswählen und starten Sie das entsprechende Programm (20 V 7 min ist eine empfohlene Ausgangspunkt).
- Wenn Sie fertig sind, lassen Sie den Deckel geschlossen für 2 min auf den Stapel abkühlen lassen und zu verhindern, dass die Membran austrocknen lassen. Nehmen Sie den Papierstapel Transfer und schneiden Sie die Membran auf die Gel-Größe. Waschen Sie die geschnittenen Membran schnell mit bidestilliertem Wasser bevor Sie mit der Gesamt-Protein-Fleck.
4. Gesamt-Protein Färbung
Hinweis: Mit Fluoreszenz-Detektion bietet einen erheblichen Nutzen gegenüber traditionelleren Ansätzen (z. B. ECL-Erkennung), die linearen Bereich und Empfindlichkeit viel besser kontrollierte4sein können. Daher in die Schritte 4 und 5, eine fluoreszierende TPS und fluoreszierende Sekundärantikörper verwendet (siehe Tabelle der Materialien).
- Rollen Sie die Membran in einen 50-mL-Tube mit der Protein-Seite nach innen. Wegen der Lichtempfindlichkeit der fluoreszierenden TPS und sekundäre Antikörper werden alle weiteren Schritte in der Dunkelheit durchgeführt.
- Geben Sie 5 mL Proteinlösung Fleck (siehe Tabelle der Materialien) und auf einer Walze für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Da TPS und Waschpuffer Methanol enthalten, tragen diese Schritte heraus in einer Dampfhaube.
- Verwerfen Sie die Färbelösung zu und waschen Sie zweimal schnell mit 5 mL Waschlösung (6,3 % Essigsäure in 30 % Methanol). Setzen Sie das Rohr kurz wieder auf die Walze Schrittes, waschen. Spülen Sie die Membran mit Reinstwasser kurz, bevor Sie fortfahren.
5. Sperrung, Antikörper Inkubationszeit und Erkennung
- Blockierung der Membran: Fügen Sie 3 mL des blockierenden Puffer (siehe Tabelle der Materialien), die 50 mL-Tube mit der Membran. Inkubieren Sie die Membran auf einer Walze für 30 min bei Raumtemperatur. Abhängig von der Wahl des Antikörpers die blockierende Puffer verwendet Optimierung benötigen möglicherweise.
-
Primärantikörper Inkubation
- Verwerfen der Sperrung Puffern und ersetzen Sie durch den primären Antikörper an den entsprechenden optimiert Konzentration (Abbildung 1 und Abbildung 2: Maus-Anti-SMN, bei 1: 1.000, in blocking-Puffer verdünnt).
Hinweis: Angemessene Optimierung der primären Antikörper gehören Bestätigung, dass der Antikörper ein Proteinprodukt die richtige Größe, erkennt während zeigt keine oder nur minimale Bindung an andere, unspezifische Protein-Produkte. Wenn möglich, testen Sie und vergleichen Sie mehrere Antikörper gegen das Protein des Interesses. - Inkubieren Sie die Membran auf einer Walze über Nacht bei 4 ° c Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie 6 Mal für 5 min mit 1 X PBS auf einer Walze bei Raumtemperatur (RT).
- Verwerfen der Sperrung Puffern und ersetzen Sie durch den primären Antikörper an den entsprechenden optimiert Konzentration (Abbildung 1 und Abbildung 2: Maus-Anti-SMN, bei 1: 1.000, in blocking-Puffer verdünnt).
-
Sekundärantikörper Inkubation
- Bereiten Sie die spezifischen Sekundärantikörper bei 1:5,000 gegen die Gastgeber des primären Antikörpers in 5 mL blockierende Puffer. Andere sekundäre Antikörper erfordern andere Verdünnungen oder die Verwendung von alternativen blockierende Puffern.
- Inkubieren Sie die Membran mit der Sekundärantikörper Lösung auf einer Walze für 1 h bei RT Waschen Sie nach der Inkubation die Membran dreimal 30 min mit 1 X PBS auf einer Walze.
- Trocknen Sie die Membran und halten Sie die Membran lichtgeschützt mit Alu-Folie bis Erkennung. Membranen können bei 4 ° C für langfristige Lagerung gehalten werden.
-
Bildaufnahme
- Anmeldung auf dem Computer, an den Scanner angeschlossen. Legen Sie die Membran auf den Scanner mit der Protein-Seite nach unten und wählen Sie den Scanbereich in der Software.
- Optimieren Sie die Laserstärke für beide (700 nm und 800 nm) Kanäle, durch die Bestätigung keine Übersättigung Eintritt. Erwerben Sie die Bilder in beiden Kanälen zu und exportieren Sie die Bilder für weitere Analysen (Schritt 6).
6. Western-Blot Analyse und Quantifizierung
Hinweis: Diese Empfehlungen beruhen auf den frei verfügbaren Image Studio-Software. Vergleichbare Analysen können jedoch auch getan mit anderen Software-Paketen, wie ImageJ.
- Import der Datei: Erstellen Sie einen lokalen Arbeitsbereich auf dem Computer für die Analyse verwendet. Dies erzeugt eine Datenbank von Image-Dateien für erworbene western Blots. Importieren Sie Dateien, die auf den Scanner und wählen Sie das Bild für die Analyse.
-
TPS-Analyse
- Anzeige der 700 nm Kanal, der gesamte-Protein Färbung Ergebnis zu zeigen. Ein Beispiel für eine TPS-Bild ist in Abbildung 1 in welchen verschiedenen Geweben von Neugeborenen (P5) enthalten (Abbildung 1A-B) und 10 - Wochen alten Mäusen (Abbildung 1 C-D) sind direkt gegenüber. In ähnlicher Weise, Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für einen direkten Vergleich von Hirngewebe von Mäusen verschiedener Altersstufen.
- Wählen Sie Registerkarte Analyse von rechts oben und wählen Sie Hinzufügen Rechteck um den gewünschten Bereich für die Normalisierung (Abbildung 1 b, D) zu definieren. Kopieren Sie und fügen Sie der ersten Rechteck auf jeder einzelnen Probe um sicherzustellen, dass die definierte Region in der gleichen Größe für alle analysierten Bahnen ist ein.
- Kopieren Sie das Ergebnis aus der Registerkarte " Formen " in der unteren linken Ecke der Software.
-
Quantifizierung
Hinweis: Der optimale Ansatz zur Quantifizierung der Proben richtet sich nach der Versuchsanordnung. Wir bieten hier ein anschauliches Beispiel für die Erkennung des Survival Motor Neuron Proteins (Smn, einem wichtigen Protein beteiligt die neuromuskuläre Erkrankung spinale Muskelatrophie20,21), die bekannt ist, im Laufe der Zeit abnehmen 19 und wie Normalisierung der Smn Signalintensität, TPS zuverlässige Schätzungen der Protein-Expression-Entwicklung bietet.- Abbildung 2 zeigt einen Rückgang der Smn Ausdruck mit zunehmendem Alter des Tieres mit TPS als Protein Ladekontrolle. Wiederholen Sie Schritt 6.2.1-6.2.3 Quantifizierung Protein geladen (Abb. 2 b). Wiederholen Sie Schritt 6.2.1-6.2.3 in den 800 nm-Kanal (Abb. 2A), das Protein des Interesses zu analysieren.
- Kopieren Sie die Ergebnisse von TPS und Protein des Interesses an ein Tabellenkalkulationsprogramm. Auf dem Arbeitsblatt das Protein durch die Bestimmung der höchsten TPS Signals laden zuerst zu normalisieren und teilt jedem TPS signal Wert durch diesen Wert um das normalisierte Protein laden Wert zu erhalten.
- Teilen Sie die 800 nm Signalwert von jeder einzelnen Probe durch den entsprechenden normalisierten Proteinwert, die relative Protein Ausdruck Verhältnis in verschiedenen Proben zu berechnen.
- Vergleichen Sie nach der ersten Normalisierung verschiedene Zeitpunkte oder Gewebe auf den durchschnittlichen Wert des internen Standards um direkte Vergleiche über verschiedene Membranen und Experimente zu ermöglichen.
7. Statistik
- Um statistisch signifikante Unterschiede in Protein-Expression auf komplexe und große Gruppen von Proben zu bestimmen, ist geeignete statistische Methode erforderlich. Obwohl eine ausführliche Diskussion der statistischen Hintergrund über den Rahmen dieses Dokuments hinausgeht, möchten wir markieren Sie mehrere Überlegungen und detail einen erfolgreichen Ansatz, den wir bereits19verwendet haben.
- Wie bei vielen Experimenten repräsentieren Protein Quantifizierung Messungen nicht völlig unabhängige Daten. Hier werden beispielsweise mehrere Gewebe in der Regel Einzeltiere Proteinmengen über mehrere Organe zu einem einzigen experimentellen Zeitpunkt bestimmen entnommen. Daher haben wir eine gemischte Effekte Modellen um Unterschiede in der Protein-Expression im Laufe der Zeit und zwischen Geweben zu analysieren. Im Allgemeinen bieten gemischte Effekte Modelle ein wirksames Mittel zur Bewältigung-Unabhängigkeit und damit Vermeidung von Pseudo-Replikation22,23. Im vorliegenden Fall erhöhen gemischte Effekte Modelle statistische Aussagekraft von Buchhaltung für wiederholte Messungen unter Gewebe innerhalb von Individuen. Wir verwenden Statistiksoftware R diese Analysen durchführen, da dies frei verfügbar und vielseitig ist. Jedoch möglicherweise andere kommerziell verfügbaren Pakete in der Lage, ähnliche Analysen durchzuführen.
- Das aktuelle experimentelle Design beinhaltet eine "geteiltes Grundstück" Design, weil jede Maus nur eine Altersgruppe angehörten. Daher modelliert wir individuelle Mäuse (Maus-ID) als ein zufälliger Effekt mit einer eindeutigen Kennung; Wir machten auch Gewebe, Alter und ihre Interaktion als fixierte Effekte. Wir modelliert die Daten mithilfe der Funktion Lmer in der R-Bibliothek, lme4. Als Qualitätskontrolle Schritt wir visualisiert Residuen zu die Annahmen der gleicher Varianz und einer Normalverteilung zu beurteilen und die Daten umgewandelt, wo notwendig, diese Annahmen zu treffen. Um eine signifikante Wechselwirkung zwischen Gewebe und Alter testen, passen wir ein baugleiches Modell, das diese Interaktion fehlte, und die Modelle mit parametrischen bootstrapping (R-Funktion PBmodcomp in der Bibliothek, Pbkrtest) verglichen. Wo signifikante Wechselwirkungen entstanden, haben wir die Funktion Emmeans (in der Emmeans R-Bibliothek) die Ursache der Interaktion zu ermitteln. Zum Beispiel vergleichen wir mittlere Ausdruck unter Altersklassen innerhalb jedes Gewebe; eine signifikante Wechselwirkung zwischen Alter und Gewebe entstehen, wenn, sagen wir, zwei bestimmten Altersklassen deutlich für ein Gewebe unterschieden sich aber nicht eine andere. Zusammenfassend lässt sich sagen bieten diese Ansätze eine Möglichkeit, die Robustheit der Schlussfolgerungen aus western-Blot-Experimente zu verlängern, indem Sie statistische Unterstützung zu diesen Ergebnissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir sind Beispiele für die Verwendung von TPS und internem Standard Vergleiche von Protein-Ebene über Gewebe und Zeitpunkte zu erleichtern. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse von Western blotting auf Protein extrahiert aus dem Gewebe von Neugeborenen (postnatale 5.Tag) im Vergleich zu Erwachsenen Mäusen (10 - Wochen alten) erhalten. TPS und Smn Immunoblot sind in Figur 1A, Cdargestellt. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der TPS wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität innerhalb der Rechteck-Box auf jeder Bahn erreicht und die Ergebnisse sind in den Tabellen in Abbildung 1 b und 1Dgezeigt. Beachten Sie, dass Proben aus verschiedenen Geweben sich durch unterschiedliche TPS Band Proteinmuster zeichnen und daher es notwendig ist, die gesamte Spur für Normalisierung zu verwenden. In der Tat, wenn ganze Gassen analysiert werden, bleibt der Fluoreszenzintensität über Proben, darauf hinweist, dass TPS für die Normalisierung für diesen Zweck geeignet ist relativ ähnlich. Interner Standard aus einem P5 Gehirn lysate Gemisch wurde auch aufgenommen, um zu veranschaulichen, wie es für weitere Vergleiche zwischen verschiedenen Membranen verwendet werden kann. Darüber hinaus in Abbildung 2zeigen wir, wie eine fluoreszierende TPS Proteingehalt zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten vergleichen verwendet werden kann. Hier zeigen wir Smn Niveaus im Gehirn Lysates von Neugeborenen (P5), Alter (P20) und Erwachsene (10W) Mäuse (Abbildung 2A) absetzen. Obwohl Smn Niveaus mit dem Alter deutlich zu verringern, bleibt TPS Quantifizierung konstant, wie in Abbildung 2 bdargestellt.
Abbildung 1: Western blots zeigen TPS und Smn-Protein-Ebene in Maus-Gewebe in zwei verschiedenen Altersstufen. TPS und Smn-Protein für P5 (A) und 10 Wochen altes Baby (C) Mäuse. (B, D) Der Fluoreszenzintensität der gesamten-spurige TPS berechnet wurde und wird (in beliebigen Einheiten) angegeben. M: Marker/Protein standard; kDa: Kilodalton; AE: willkürliche Einheit; P5: postnatale 5.Tag; 10W: 10 Wochen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Analyse der Smn Ausdruck in Maus-Geweben zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten. (A) Gehirn Lysates aus Gewebe aus P5, P20 und 10 Wochen alten Mäusen gewonnen wurde mit TPS (Oberseite) und SMN (Bodenplatte) analysiert. (B) der Fluoreszenzintensität der TPS wurde berechnet und ist in beliebigen Einheiten angegeben. M: Marker/Protein standard; kDa: Kilodalton; AE: willkürliche Einheit; P5: postnatale 5.Tag; P20: postnatale 20.Tag; 10W: 10 Wochen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Gewebe | Ca. Gewicht * | 1xPBS waschen (4 ° C) | Wiederholen Sie waschen | Homogenisierende Puffer ** |
| Rückenmark | 40 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Muskel (GC) | 20 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Gehirn | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Herz | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| Leber | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Niere | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * Diese Gewichte sind Richtwerte für Gewebe aus P8 Mäusen gewonnen. | ||||
| ** Diese Bände sind Indikationen und können weiter angepasst werden, je nach Gewicht des Gewebes. | ||||
Tabelle 1. Überblick über die erwarteten Gewebe Gewichte und entsprechende Empfehlungen für PBS Waschungen und Lyse Puffervolumen für Homogenisierung zu verwendende. Die Gewichte sind Indikationen für Gewebe gewonnenen postnatale Tag 8 (P8) Mäuse. PBS und Lyse-Puffer-Volumen können hoch und runter nach experimentellen Anforderungen skaliert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mit der geeigneten Versuchsdesign, Kontrollmaßnahmen und statistische Analyse westliche Beflecken lässt sich verlässliche quantitative Schätzungen der Proteinexpression innerhalb und zwischen ein vielfältiges Angebot an biologischen Proben vornehmen. Das Protokoll, die, das wir im aktuellen Manuskript beschreiben, soll dienen als Richtlinien für Forscher auf der Suche nach Western blotting um Quantitative Analyse auf größeren und komplexeren Gruppen von Proben, verpflichten sich, durch eine Kombination von Fluoreszenz-basierten verwenden Nachweisverfahren, Gesamt-Protein laden Normalisierung und internen Standards. Obwohl hier konzentriert sich auf die Ermittlung und Vergleich von Protein-Expression von verschiedenen Maus Gewebe und in den verschiedenen Altersstufen, kann dieser Ansatz auch erweitert werden, um Protein-Expression in anderen experimentellen Bedingungen zu vergleichen.
Ein zentraler Schritt in unserer aktuellen Protokoll ist die Normalisierung der Proteine von Interesse für Gesamt-Protein durch Quantifizierung eines fluoreszierenden Gesamtprotein Fleckes geladen. TPS-Normalisierung korrigiert für Variation in Probenbeladung und Fehler Margen im Protein Quantifizierungsmethoden. Jedoch da die Anzahl der Proteinproben, die auf einer einzigen Membran analysiert werden können oft begrenzt ist, kann weitere Normalisierung erforderlich, um mehrere Membranen zu vergleichen. Variabilität zwischen wie Proteine auf verschiedenen Membranen (wegen z. B. Antikörper Inkubationszeit Zeit oder Temperatur Variation) erkannt werden kann in der Tat Variation darüber hinaus eingeführt durch Be- und Quantifizierung Schritte des Protokolls führen. Hier verwenden wir einen internen Standard mit ein einziges Protein lysate Mix, die ist in dreifacher Ausfertigung auf jedes Gel geladen und zum Vergleich und zur Normalisierung zwischen Gele/Membranen ermöglicht. Dies könnte theoretisch jedes Protein Sample, solange es in ausreichenden Mengen erfolgen kann, so dass die gleiche Probe für alle Experimente verwendet werden kann. In unseren Experimenten verwenden wir eine Mischung aus Gehirn Protein Lysates, Gehirn Homogenates enthalten große Mengen an Protein und sind in der Regel mit einer hohen Konzentration erhalten. Quantifizierung von dreifacher Standard mit durchschnittlich sollte weiter die Genauigkeit von Quantifizierungen über Membranen zu erhöhen und dazu beitragen, die Reproduzierbarkeit des Experiments.
Protein-Ebene ermittelt werden, durch eine Reihe von verschiedenen Techniken und die bevorzugte Methode hängt von der Probenart analysiert wird und das Ziel des Experiments. Reproduzierbaren Quantifizierung der Western blot funktioniert am besten in Situationen, wo experimentelle Bedingungen gut unter Kontrolle, z. B. wenn die Verwendung von Maus oder anderen Tiermodellen von einem definierten genetischen Hintergrund sein können. Im Gegensatz dazu in vielen Experimenten mit menschlichen Patientenproben möglicherweise weniger praktikabel als Alter, genetische Variabilität und Gewebe Abtastzeiten sind viel schwerer zu kontrollieren als in (Tiermodell) Systeme. Platte-basierte Techniken wie ELISA möglicherweise besser geeignet für diese Analysen, obwohl die sorgfältige Validierung der Antikörperbesonderheit entscheidend ist. Zum Beispiel in Fragiles-X Syndrom Forschung Antikörper haben gezeigt, dass verschiedene Isoformen erkennen und im ELISA dies zu Überschätzung des Gesamtbetrages des Proteins führen würde, da ELISA bestimmt, ein Signal für alle Isoformen wird kombiniert24. Optimale Möglichkeiten für Methoden zur Bestimmung der Protein-Expression sind probieren daher je nach Kontext, Typ und die Forschungsfrage, die untersucht wird.
Ausreichende statistische Analyse ist eine Voraussetzung für die Zuverlässigkeit der Schlussfolgerungen aus der Quantifizierung der biologischen Daten. Statistisch analysieren komplexe Daten, wie erzeugt durch den Vergleich von verschiedener Gewebes, Zeit verweist oder anderen Versuchsbedingungen und Kombinationen davon können verlangen, dass fortgeschrittene statistische Modellierung als ANOVA mit Post-hoc-Tests liefern kann. Für komplexere statistische Modellierung, wie z. B. die gemischt-Effekte Ansatz, Modell beschreiben wir im aktuellen Manuskript, kann es ratsam sein, suchen von Biostatistiker weiter beraten. Ausreichende statistische Analyse der groß angelegten Proteinexpression kann die Robustheit der Ergebnisse sowie die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erheblich verbessern.
Zusammenfassend lässt sich sagen bietet der experimentelle Ansatz, die, den wir hier beschreiben, eine stabile und reproduzierbare Methode für Forscher, die Protein-Expression mit western-Blot in komplexen Proben erlauben, um neue und spannende Forschungsfragen zu beantworten ermitteln möchten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
E.J.N.G. wird vom Wellcome Trust (Grant 106098/Z/14/Z) unterstützt. Sonstige Finanzierung wurde durch den Trust SMA (SMA UK Konsortium; vorgesehen T.H.G. & Y-T. (H.) SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), der University of Edinburgh DTP in Präzision Medizin (T.H.G., l.l. & U.V.M.) und Europa Euan MacDonald Zentrum zur Erforschung von Motoneuronen Krankheiten (T.H.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
