Summary
Bu yöntem protein düzeyleri farklı dokular ve standartlaştırılmış bir nicel Batı blotting yaklaşım kullanarak farklı gelişim timepoints karşılaştırılması için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım açıklar.
Abstract
Western Blot algılamak ve protein ifade ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler yol açmıştır. Ancak, birçok benzer deneysel teknikleri olduğu gibi Western blot analizleri sonucu kolayca tasarım ve deney yürütülmesi açısından yapılan seçimler etkilenmiştir. Belirli temizlik proteinler protein düzeyleri için miktar normalleştirmek için geleneksel olarak kullanılmıştır, ancak, bu sınırlamalar bir dizi var ve bu nedenle giderek son birkaç yıl içinde eleştirdi. Burada, biz bize farklı doku, fare modelleri (Hastalık modelleri de dahil olmak üzere) ve gelişimsel timepoints arasında protein ifade varyasyon karmaşık karşılaştırmalar üstlenmek izin vermek için hazırladığımız detaylı bir iletişim kuralı tanımlamak. Bir floresan toplam protein leke kullanarak ve bir iç yükleme standart kullanımı tanıtımı, deneyler içinde karşılaştırılabilir ve sistematik olarak protein düzeyleri arasında karşılaştırma örnekleri sayısı, varolan kısıtlamaları üstesinden gelmek mümkündür bir deneysel koşullar dizi. Bu yaklaşım böylece araştırmacılar protein ifade farklı doku ve örnekleri arasında daha iyi keşfetmek izin veren geleneksel Batı leke tekniklerin kullanılması genişletir.
Introduction
Western Blot algılamak ve doku homogenates veya özleri içeren protein ifadeler ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler bu bir tanı aracı hastalık1,2varlığı tanımlamak için kullanıldığı yerler yol açmıştır. Western Blot ilk 1979 yılında proteinler polyacrylamide jeller nitroselüloz sayfalara aktarmak ve daha sonra proteinler radioactively etiketli ya da floresein için Birleşik ikincil antikorlar kullanarak görselleştirmek için bir yöntem olarak tanımlanmıştır veya peroksidaz3. Piyasada kitleri ve ekipman geliştirilmesi yoluyla, Western Blot yöntemlerinin edilmiş giderek standart ve yıllar içinde Basitleştirilmiş. Gerçekten de, teknik artık kolayca farklı arka plan ve deneyim düzeylerini ile bilim adamları tarafından yapılmaktadır. Ancak, birçok benzer deneysel teknikleri olduğu gibi Western blot analizleri sonucu kolayca tasarım ve deney yürütülmesi açısından yapılan seçimler etkilenmiştir. Bu nedenle, standart Western Blot yöntemlerinin erişilebilirliğini dikkatli deneysel planlama gereğini karanlık değil ve tasarım önemlidir. Deneysel konuları içerir, ancak sınırlı için örnek hazırlama ve işleme, seçim ve antikor protein algılama için doğrulama ve jel membran transfer verimi özellikle küçük veya büyük değildir (< 10 veya > 140 kDa) proteinler4,5,6,7,8,9. Orijinal örnek protein kalitesini sonraki Western blot analizi sonucu belirlemede önemli bir rol oynar. Protein-ebilmek var olmak hulâsa çok çeşitli örnekleri ve hücre hatları, hayvan modelleri dokulardan ve öldükten sonra insan dokular, birçok kaynaktan gibi tutarlılık işleme ve işlem tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Uzun süreli depolama örnekleri protein çıkarılması için gerekli olduğunda, örneğin, protein-80 ° C'de genellikle istikrarlı olmasına rağmen protein istikrar ayıklanan proteinler ve-80 ° C'de sağlam dokular arasındaki farklılıkları olup olmadığını, önemli bildirilen10. Ayrıca, protein miktarları tekrarlanabilir tahminleri elde etmek için tutarlı homojenizasyon örneklerin çok önemlidir. Farklı lizis arabellekleri ve homojenizasyon yöntemleri (otomatik yöntemlerine göre Örneğin, el ile homojenizasyon) en iyi duruma getirme büyük ölçekli bir nicel deney başlamadan önce gerekli.
Normalleştirme stratejileri için protein yükleme ve miktar değişkenlik düzeltmek için sağlam, nicel protein ifadenin sonuçlarını elde etmek için gereklidir. β-aktin gibi proteinler kat Hizmetleri tübülin α, β-tübülin ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) geleneksel olarak protein düzeyleri için miktar normalleştirmek için kullanılmaktadır. Ancak, belirli temizlik proteinlere miktar amaçlar için normalleştirme giderek son birkaç yıl11,12eleştirilmiştir. Ifade temizlik proteinlerin dokuları aynı hayvan4ve çeşitli hastalık koşulları4,15 arasında farklı gelişim aşamalarında13,14arasında Örneğin, değiştirebilirsiniz ,16,17. Bu nedenle, belirli temizlik proteinler arasında farklı dokular, farklı timepoints ve deneysel koşullar değişen altında ifadeden protein daha karmaşık karşılaştırmalar yapma olanaklarını kısıtlar. Temizlik proteinler için protein varyasyon yükleme denetimine alternatif bir toplam protein leke (TPS) bu etiketleri kullanılır ve tüm proteinler bir örnek mevcut görüntüler. Belirli bir protein seviyeleri ve bu nedenle miktar TPS sinyal karşılaştırılabilir ve deneysel durumu, örnek türü veya gelişimsel timepoint bağımsız olarak tekrarlanabilir olmalıdır yerine TPS toplam protein yüküne göre sinyal normalleştirme sağlar . Ponceau S, leke içermeyen jeller, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo siyah ve Cy5 (ref. 18 gözden) toplam protein lekeleri örnekleridir. Bu yöntemlerin her biri belirli avantajları ve sınırlamalar vardır ve deneysel kurulum4,18yanı sıra zaman ve araçlarını yöntemi seçimi bağlıdır.
Membran içinde yükleme ve miktar değişkenliği için düzeltmek için bir TPS kullanmanın yanı sıra, örnekleri arasında özellikle büyük ölçekli protein ifade analizi yaparken farklı membranlar, karşılaştırmak gerekli olabilir. Ancak, verimlilik ve toplam protein leke yoğunluğu bağlama antikor gibi faktörler değişkenliği daha fazla ayrı jeller üzerinde analiz protein örnekleri ve membranlar arasında değişkenlik tanıştırayım. Bu durumda sağlam miktar için bu nedenle membran arasındaki değişkenliği için hesabınıza bir normalleştirme adım tanıtmak gereklidir. Bu bir iç yükleme standart deneyler arasında sabit tutulur ayrı ayrı analiz membranlar tümünde ekleyerek elde edilebilir. Bu standart herhangi bir protein bu denemede dahil tüm membranlar arasında kullanılmak üzere yeterli miktarda elde edilebilir lysate şeklinde alabilir. Burada, bir lysate (5 gün eski kontrol fare elde edilen) fare beynin beyin kolayca homojenize ve lysate elde edilen protein yüksek, protein önemli bir miktarda içerir gibi kullanırız. Nüsha bir iç standart yükleme örnekleri normalleştirilmiş ve doğrudan göre ayrı membranlar sağlar.
Burada, biz bize farklı doku, fare modelleri (Hastalık modelleri de dahil olmak üzere) ve gelişimsel timepoints19arasında protein ifade varyasyon karmaşık karşılaştırmalar üstlenmek izin vermek için hazırladığımız detaylı bir iletişim kuralı tanımlamak. Bir floresan TPS bir iç yükleme standart kullanımı ile birleştirerek, biz örnekleri ve içinde tek bir deney karşılaştırılabilir deneysel koşullar, varolan kısıtlamaları aşmak başardık. Bu yaklaşım böylece araştırmacılar protein ifade farklı doku ve örnekleri arasında daha iyi keşfetmek izin veren geleneksel Western blot tekniklerin kullanılması genişletir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yordam için doku Edinburgh Üniversitesi, iç Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve uyum ile kurumsal ve İngiltere İçişleri Bakanlığı yönetmeliklerine yetkisi altında ilgili gerçekleştirilen hayvan çalışmaları elde Kişisel ve proje lisansları.
Not: Bu protokol tekrarlanabilirlik artırmak için standart, piyasada kitleri ve reaktifler kullanarak optimize edilmiştir ( Tablo malzemelerigörmek).
1. hazırlanması örnekleri
-
Protein çıkarma
- Transfer ek donmuş hücre veya doku örnekleri-80 ° c kuru buz, çözülme buzda ve yıkama buz soğuk 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile gerektiği gibi (doku ve PBS yıkar hakkında daha fazla bilgi için bkz: Tablo 1). Bu protein kalitesini etkileyecek gibi gereksiz donma-çözülme çevrimleri kaçının.
- Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, %1 NP-40, % 1 sodyum deoxycholate, % 0,1 SDS) eklemek 1 proteaz inhibitörü doku kilo başına optimal miktar kullanarak her örnek için x içeren (bkz. Tablo 1 için öneriler).
Not: uygulamaya bağlı olarak, homojenizasyon arabellek miktarını ve türünü daha fazla en iyi duruma getirme gerekebilir. - El elektrikli homogenizer polipropilen bir havaneli ile doku örnekleri homojenize için kullanın. Her örnek arasında havaneli çift distile suda yıkayıp temiz bir mendil ile kurulayın. Farklı deneysel koşullar ve dokular arasında havaneli ile değiştirin.
- Örnekleri 10 dakika buzda homojenizasyon sonra bırakın. Örnekleri, santrifüj kapasitesi > 10.000 x g 10 dk 4 ° C'de.
- Pelet bozmadan süpernatant için yeni bir tüp buza aktarın. Süpernatant protein örnek var. Ayıklanan protein-80 ° C'de depolayın veya doğrudan protein konsantrasyonu ölçme için devam edin.
-
Miktar ve protein konsantrasyonu normalleştirme
- Bicinchoninic asit (BCA) tahlil kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek. BCA tahlil karışımı iyi 200 µL BCA karışımı kullanarak bir 96-şey optik plaka üretici yönergelerine göre hazırlayın.
Not: Lowry ve Bradford deneyleri gibi diğer miktar yöntemleri de protein konsantrasyonu sürekli deneyler arasında sayılabilir sürece protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir. - Sığır serum albümin nüsha konsantrasyonlarda artan, (BSA) standartları hazırlamak ve her protein örneği 1 µL yinelenen ekleyin. 60 ° C'de 10 dakika veya daha uzun protein konsantrasyonu düşük olması bekleniyor Eğer önceden ısıtılmış ısı bloktaki 96-şey plaka kuluçkaya.
- Kuluçka sonra 560 emme ölçmek bir plaka okuyucu kullanarak nm.
- Plaka okuyucu ölçümler verebilir ve her örnek için bir standart eğri protein standardı kullanılarak elde edilen ortalama Absorbans değerleri karşılaştırarak protein konsantrasyonu hesaplayın. Standart eğri için R-kare değerini 0,98 doğru örnek protein konsantrasyonu tahmin ya da daha büyük olmalıdır.
- Protein miktarı dilutions protein örnekleri örnek arabellek ve ultrasaf su hazırlayarak normalleştirmek. Toplam hacim kullanılan jel türüne bağlı olarak ayarlanabilir. Protein lane başlangıç tutarı olarak başına 30 µg yükleme önerilir. İndirgeyici dithiothreitol gibi eklemek (DTT; son konsantrasyonu 5 mM) veya beta-mercaptoethanol (son konsantrasyonu 200 mM) gerektiği gibi her örnek için. Su katılmamış beta-mercaptoethanol bir duman başlıklı pipet.
- 10 dk. örnekleri buz, girdap ve spin aşağı kısaca toplamak için koymak için 70 ° C ısı bloğunda örneklerinde kuluçkaya. Buz üstünde jel yükleme kadar tutun.
- Bicinchoninic asit (BCA) tahlil kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek. BCA tahlil karışımı iyi 200 µL BCA karışımı kullanarak bir 96-şey optik plaka üretici yönergelerine göre hazırlayın.
2. Jel Elektroforez protein örnekleri
-
Aygıt ve kurmak jel
- Prekast 4 – %12 Bis-Tris degrade jel ( Tablo malzemelerigörmek) Jel Elektroforez odası sistemdeki Kur. Çift distile su kullanmadan önce kullanma jelleri durulayın.
Not: Boyutuna, etkileşimleri ve bereket faiz, jellerin farklı bir gradyan ile protein Ajan veya iyi boyutu ve sayısı tampon kullanılabilir. - 1 x MES SDS tank başına çift distile suda seyreltilmiş arabellek çalışan 500 mL ekleyin. Dikkatli bir şekilde tarak jelleri çalışan arabellek yığın jel wells bozmadan ekledikten sonra çıkarın.
- Prekast 4 – %12 Bis-Tris degrade jel ( Tablo malzemelerigörmek) Jel Elektroforez odası sistemdeki Kur. Çift distile su kullanmadan önce kullanma jelleri durulayın.
-
Protein yükleme
- Standart bir proteinin 3,5 µL kuyunun içine yükleyin. Örnek düzenine bağlı olarak, jel her iki tarafında bir protein merdiven yükleme daha doğru bir şekilde protein boyutu tahmin yardımcı olabilir. İnce uçlu jel ipuçları daha doğru örnek yükleme için yükleme kullanın.
- Bir iç standart membran arasındaki normalleştirme için kullanırken (bkz. Adım 5 aşağıda ve tartışma) protein merdiven yanında ilk 3 Kuyu içine diğer örnekleri eşittir bir miktar yük.
- Kalan Wells her örneğinin 30 µg yükleyin. Örnek arabellek x 1 tüm boş wells için ekleyin.
-
Elektroforez
- Jel tankı örnekleri yükledikten sonra topla. Örnekleri adlı 80 V 10 dk 150 V için ek bir 45-60 dk ardından için yığın jel çalıştırın.
3. protein aktarımı
Not: Bu protokol aktarımda Protein piyasada bulunan bir yarı kuru blotting sistemi kullanılarak gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) hızlı ve tutarlı sonuçlar için.
- Önceden filtre kağıdı çift distile su içinde nemlendirici ve jel bıçak sağlanması protein aktarımı hazırlamak, plastik Pasteur pipet, kurutma silindir ve forseps kullanmaya hazırsınız.
- Transfer yığın dikkatle tüm ambalaj folyo kaldırarak açın. Üst alt yığından çıkarın ve bir kenara koyun. Hızlı bir şekilde birkaç damla arabellek (2-3 mL) çalıştıran Elektroforez ile alt yığında membran nemlendirin. Transfer yığın açıldıktan sonra PVDF membran kurumasını önlemek önemlidir.
- Elektroforez durdurmak sonra jel bıçak kullanarak önceden döküm jel açık ve yığın jel kesti. Jel plastik döküm boşaltmak için kenarları etrafında kesmek. Jöleye zarar önlemek için ıslak jel bıçak tutmak.
- Transfer yığın alttan üste monte: alt yığın (PVDF membran içeren), protein jel, filtre kağıdı. Blotting silindir tüm hava kabarcıkları kaldırmak için kullanın. Üst yığını filtre kağıdı üzerine yerleştirin ve tekrar hava kabarcıkları kaldırmak için yığın rulo. Zorla bu protein sırasında deforme jel neden olabilir çok güçlü aktarma.
- Cihazın sol tarafında elektrot transfer aygıtla içine tüm yığın transfer ve karşılık gelen elektrik kontağı üstünde belgili tanımlık aygıt ile uyumlu jel sünger yığının üstüne yerleştirin. Kapağı kapatın, seçin ve uygun programı başlatın (20 V 7 min için önerilen bir başlangıç noktası 's).
- Ne zaman tamamlanmak, yığın soğumasını ve membran kurumasını önlemek için izin vermek 2 dk kapalı kapak bırakın. Transfer yığını kaldır ve membran jel boyutuna kesme. Çift distile su ile hızlı bir şekilde kesilmiş membran ile toplam protein leke devam etmeden önce yıkayın.
4. Toplam protein boyama
Not: doğrusal aralığı ve duyarlılık çok daha iyi kontrollü4olabilir gibi floresan algılama kullanarak önemli bir yarar daha geleneksel yaklaşımlar (örneğin, ECL algılama), sağlar. Bu nedenle, 4 ve 5, floresan bir TPS ve floresan ikincil antikorlar kullanılır adımları ( Tablo malzemelerigörmek).
- Membran protein yüzü içe doğru bakacak şekilde 50 mL tüp içine rulo. Floresan TPS ve ikincil antikorlar ışık duyarlılık nedeniyle, tüm sonraki adımları karanlıkta devam etmektedir.
- 5 mL protein leke çözeltisi ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve oda sıcaklığında 5 min için bir rulo üzerinde kuluçkaya. Çünkü TPS ve metanol içerir, bu adımları dışarı duman mahallede taşımak yıkama tampon.
- Boyama çözüm atın ve 5 mL yıkama çözeltisi (% 6.3 Asetik asit % 30 metanol içinde) ile hızlı bir şekilde iki kez yıkayın. Tüp kısa bir süre geri yıkama adımlar arasında silindir yerleştirin. Devam etmeden önce membran kısaca ultrasaf su ile durulayın.
5. engelleme, antikor kuluçka ve algılama
- Membran engelleme: engelleme arabellek 3 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) membran içeren 50 mL tüp. Membran oda sıcaklığında 30 dakika bir rulo üzerinde kuluçkaya. Antikor seçime bağlı olarak, kullanılan engelleme arabellek türü en iyi duruma getirme gerektirebilir.
-
Birincil antikor kuluçka
- Belgili tanımlık kütük parçası tampon ve eski yerine koymak ile uygun, birincil antikor atma en iyi duruma getirilmiş konsantrasyon (Resim 1 ve Şekil 2: 1:1, 000, engelleme arabellekte seyreltilmiş adlı, fare-anti-SMN).
Not: Yeterli duruma getirilmesi birincil antikor antikor protein ürün doğru boyutta gösterilen iken algılar onay içermelidir yok veya diğer, belirsiz protein ürünleri için en az bağlama. Mümkünse, sınamak ve birden çok antikorlar karşı ilgi protein karşılaştırmak. - Membran gecede 4 ° C'de bir rulo üzerinde kuluçkaya Ertesi gün, antikor çözümü kaldırmak ve bir rulo, oda sıcaklığında (RT) 1 x PBS ile 5 min için 6 kez yıkayın.
- Belgili tanımlık kütük parçası tampon ve eski yerine koymak ile uygun, birincil antikor atma en iyi duruma getirilmiş konsantrasyon (Resim 1 ve Şekil 2: 1:1, 000, engelleme arabellekte seyreltilmiş adlı, fare-anti-SMN).
-
İkincil antikor kuluçka
- 1:5,000 5 mL engelleme arabellekte birincil antikor dizi karşı belirli ikincil antikor hazırlayın. Diğer ikincil antikorlar diğer dilutions veya alternatif engelleme arabellekleri kullanımı gerekebilir.
- Membran ile ikincil antikor çözüm RT. 1 h için bir rulo üzerinde kuluçkaya Kuluçka sonra bir silindir üzerinde membran üç kez 30 dk 1 x PBS ile yıkayın.
- Membran kuru ve alüminyum folyo kadar algılama kullanarak ışık korunuyorsunuz membran tutmak. Membranlar uzun süreli depolama için 4 ° C'de tutulabilir.
-
Resim alma
- Tarayıcıya bağlı olan bilgisayarda oturum açın. Membran protein yüzü aşağı bakacak şekilde tarayıcıya yerleştirin ve yazılım tarama alanını seçin.
- Lazer yoğunluğu her ikisi için en iyi duruma getirme (700 nm ve 800 nm) kanalları yok doygunluk oluşur olup olmadığına bakarak,. Her iki kanal görüntüleri elde etmek ve daha fazla analiz (adım 6) görüntüleri dışa aktar.
6. Western blot analizi ve miktar
Not: Bu öneriler üzerinde serbestçe kullanılabilir görüntü Studio yazılımı temel alır. Ancak, benzer analizler de yapılabilir ImageJ gibi diğer yazılım paketlerini kullanarak.
- Alma dosyası: analiz için kullanılan bilgisayardaki yerel bir çalışma alanı oluşturun. Bu görüntü dosyaları elde edilen Batı lekesi için bir veritabanı oluşturur. Alma dosyaları tarayıcı üzerinde elde edilen ve analiz için resmi seçin.
-
TPS analizi
- Sonuç boyama toplam protein göstermek için 700 nm kanal görüntüleme. TPS görüntü örneği şekil 1 ' de yenidoğan (P5) üzerinden hangi farklı dokularda bulunmaktadır (şekil 1A-B) ve 10 - hafta eski fare (Şekil 1 C-D) doğrudan karşılaştırılır. Benzer şekilde, Resim 2 fareler farklı yaş gelen doğrudan karşılaştırma beyin dokusunun bir örnek gösterir.
- Sağ üst köşeden analiz sekmesini seçin ve normalleştirme (şekil 1B, D) için ilgi alanını tanımlamak için Dikdörtgen eklemek seçin. Kopyalama ve yapıştırma ilk dikdörtgen alanı tanımlanmış bölge tüm analiz yolları için aynı boyutta olduğundan emin olmak için tek tek her örnek üzerine.
- Sonuç yazılım sol alt köşesinde şekiller sekmede kopyalayın.
-
Miktar
Not: deneysel tasarım örnekleri miktarının için en uygun yaklaşım bağlıdır. Biz burada (Smn; anahtar protein nöromüsküler hastalığı spinal kas atrofisi20,21' dahil), protein zaman içinde azaltmak için bilinen hayatta kalma motor nöron tespiti açıklayıcı bir örnektir sağlayacak 19 ve nasıl Smn sinyal şiddeti TPS için normalleştirme protein ifade gelişiminin güvenilir tahminler sağlar.- Şekil 2 , TPS hayvanla yaşın denetim yükleniyor protein artan Smn ifade bir düşüş gösterir. Adım 6.2.1-6.2.3 (şekil 2B) yükleme protein ölçmek için yineleyin. Adım 6.2.1-6.2.3 800 nm kanaldaki (faiz protein analiz etmek içinşekil 2A) yineleyin.
- Sonuçları TPS ve protein ilgi bir elektronik tablo programına kopyalama. Elektronik tablo, ilk yüksek TPS sinyal belirlenerek yükleme protein normal duruma getirmeye ve her TPS bölen sinyal değeri değer yükleme normalleştirilmiş protein elde etmek için bu değerle.
- 800 nm sinyal değeri tek tek her örnek farklı örneklerinde göreli protein ifade oranını hesaplamak için karşılık gelen normalleştirilmiş protein değeri tarafından bölün.
- Sonra ilk normalleştirme, çeşitli zaman puan veya doğrudan karşılaştırmalar farklı membranlar ve deneyler üzerinden izin vermek için iç standart ortalama değeri dokulara karşılaştırın.
7. istatistik
- Örnekleri karmaşık ve büyük gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık protein ifadesindeki belirlemek için uygun istatistiksel metodoloji gereklidir. Her ne kadar bu yazının kapsamı dışındadır istatistiksel arka plan detaylı açıklamaları gider, biz bazı noktaları vurgulamak ve başarılı bir yaklaşım daha önce19kullandığımız detay istiyorum.
- Birçok deney gelince protein miktar ölçümleri tamamen bağımsız veri temsil etmemektedir. Burada, örneğin, birden fazla doku genellikle protein düzeyleri arasında birden çok organları tek bir deneysel zaman-nokta belirlemek için tek hayvanlardan elde edilir. Bu nedenle, bir karışık etkileri modelleri protein ifade zamanla ve dokular arasında farklılıklar analiz etmek için kullanılır. Genel olarak, karışık etkileri modelleri sigara-bağımsızlık ile başa çıkmak ve böylece sözde çoğaltma22,23önlemek için etkili bir yol sağlar. Mevcut durumda, karışık etkileri modelleri arasında dokular, bireylerin içinde tekrarlanan ölçümleri için muhasebe tarafından istatistiksel gücünü arttırın. Bu serbestçe kullanılabilir ve çok yönlü olarak istatistiksel yazılım paketi R bu analizleri gerçekleştirmek için kullanın. Ancak, piyasada bulunan diğer paketleri benzer analizler yapmak mümkün olabilir.
- Çünkü her fare sadece bir yaş grubuna ait geçerli deneysel tasarım "arsa Böl" tasarım içerir. Bu nedenle, bireysel fareler (fare ID) benzersiz bir tanımlayıcı ile rastgele bir etki olarak modellenmiş; Biz doku, yaş ve sabit etkileri olarak onların etkileşim sorumluydu. İşlev olarak lmer R Kütüphane, lme4 kullanarak veri modellenmiştir. Bir kalite kontrol adım olarak eşit varyans ve bir normal dağılım varsayımlarını değerlendirmek için kalanlar görüntülenir ve bu varsayımlar karşılamak gerektiğinde veri dönüştürülmüştür. Doku ve yaş arasında önemli bir etkileşim için test etmek için biz bu etkileşim yoksun ve parametrik (R işlev kitaplığı, pbkrtest'PBmodcomp) önyükleme kullanarak modelleri karşılaştırıldığında özdeş bir modeli uygun. (Nerede önemli etkileşimleri ortaya çıktı, biz işlevi emmeans emmeans R kitaplıkta) etkileşimi nedenini belirlemek için kullanılan. Örneğin, biz her doku içinde yaş sınıfları arasında ortalama ifade göre; Mesela iki belirli yaş sınıfı önemli ölçüde bir doku için farklılık varsa, önemli bir etkileşimde yaş ve doku arasında ortaya çıkabilir ama yine. Özet olarak, bu yaklaşımlar Batı leke deneylerin sonuçları sağlamlık bu sonuçlar için istatistik desteği vererek genişletmek için bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TPS ve dahili bir standart doku ve zaman puan arasında karşılaştırmalar protein düzeyleri kolaylaştırmak için kullanımı örnekleri içerir. Şekil 1 yenidoğan (doğum sonrası 5 gün) Yetişkin fareler (10 - haftalık) ile karşılaştırıldığında elde edilen dokular çıkarılan protein Western Blot sonuçları gösterir. TPS ve Smn immunoblot şekil 1A', Cgösterilir. TPS floresan yoğunluğu miktar floresan yoğunluğu her Lane'de dikdörtgen kutu içinde ölçerek elde edildi ve sonuçları şekil 1B ve 1 Dtablolarda gösterilmektedir. Not farklı doku örneklerinden farklı TPS protein grubu desenleri ile karakterizedir ve bu nedenle tüm lane normalleştirme amacıyla kullanmak gereklidir. Tüm yolları analiz edilir, gerçekten de, floresan yoğunluğu TPS normalleştirme için bu amaç için uygun olduğunu gösteren örnekleri arasında nispeten benzer kalır. P5 beyin lysate karışımından oluşan bir iç standart da nasıl daha fazla farklı membranlar arasında karşılaştırmalar için kullanılabileceğini göstermek için eklenmiştir. Ayrıca, Şekil 2' de, floresan bir TPS protein düzeyleri farklı gelişim zaman noktalarda karşılaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. İşte, beyin lysates yenidoğan (P5), üzerinden seviyelerinde Smn yaş (P20) ve yetişkin (10W) fareler (şekil 2A) Sütten kesme göstermektedir. SMN düzeyleri açıkça yaş ile azaltmak rağmen TPS miktar şekil 2Biçinde gösterildiği gibi sabit kalır.
Şekil 1. Western iki farklı yaş gösteren TPS ve Smn protein düzeyleri fare dokularda engelliyor. TPS ve Smn protein P5 için(a)ve 10 haftalık (C) fareler. (B, D) Bütün şeritli TPS floresan yoğunluğu hesaplanmıştır ve (isteğe bağlı birimlerinde) belirtilir. M: işaretleyici/protein standart; kDa: kilodalton; yapıyordum: rasgele birim; P5: Doğum sonrası 5 gün; 10W: 10 hafta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Smn ifade farklı gelişim zaman noktalarda fare dokularda analizini. (A)beyin dokusundan P5, P20 ve 10 haftalık fareler elde lysates TPS (üst panel) ve SMN (alt paneli) kullanarak analiz. (B) TPS floresan yoğunluğu hesaplanır ve rasgele birimleri cinsinden belirtilir. M: işaretleyici/protein standart; kDa: kilodalton; yapıyordum: rasgele birim; P5: Doğum sonrası 5 gün; P20: Doğum sonrası gün 20; 10W: 10 hafta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Doku | Yaklaşık ağırlık * | 1xPBS yıkama (4 ° C) | Tekrar yıkama | Homojenizasyon arabellek ** |
| Spinal kord | 40 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Kas (GC) | 20 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Beyin | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Kalp | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| Karaciğer | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Böbrek | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * Bu ağırlıklar P8 fareler alınan doku için gösterge değerlerdir. | ||||
| ** Bu birimlere göstergeler vardır ve daha fazla doku ağırlığına göre ayarlanabilir. | ||||
Tablo 1. Beklenen doku ağırlıkları ve PBS yıkar ve lizis arabellek birim için karşılık gelen öneriler homojenizasyon için kullanılacak genel bakış. Ağırlıkları için doğum sonrası gün 8 (P8) farelerde elde edilen doku göstergeleridir. PBS ve lizis arabellek birimleri yukarı ve aşağı deneysel ihtiyaçlarına göre ölçeklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun deneysel tasarım, kontrol tedbirleri ve istatistiksel analizi ile western Blot protein ifade içinde ve biyolojik örnekleri çeşitli bir dizi arasında güvenilir kantitatif tahminler yapmak için kullanılabilir. Biz mevcut el yazması tarif Protokolü Floresans tabanlı bir birleşimini kullanarak daha büyük ve daha karmaşık örnekleri, gruplarında kantitatif analiz üstlenmeyi kurutma Western kullanmak isteyen araştırmacılar için bir kılavuz olarak hizmet amaçlamaktadır algılama yöntemleri, toplam protein yükleme normalleştirme ve kendi standartlarına. Belirleme ve protein ifade farklı fare doku ve karşılaştırma farklı yaş, odak burada olmasına rağmen bu yaklaşım aynı zamanda protein ifade diğer deneysel koşullarda karşılaştırmak için genişletilebilir.
Bizim şu anki protokolü bir merkez normalleştirme ilgi toplam protein flüoresan toplam protein leke miktarının tarafından yüklenen proteinlerin adımdır. TPS normalleştirme varyasyon örnek yükleme ve protein miktar yöntemleri hata kenar boşlukları düzeltir. Tek bir membran üzerinde analiz edilebilir protein örnekleri sayısı genellikle sınırlı olduğundan, ancak, daha fazla normalleştirme birden çok membranlar karşılaştırmak için gerekebilir. Nitekim, proteinler (örneğin antikor kuluçka süresi veya sıcaklık değişimi) nedeniyle farklı membranlar üzerinde nasıl algılanır arasında değişkenlik değişim Protokolü yükleme ve miktar adımlarda size sunulan ötesinde neden olabilir. Burada, her jel üzerinde nüsha olarak yüklenir ve bırakmak için karşılaştırma ve normalleştirme jelleri/membranlar arasında bir tek protein lysate karışımı oluşur bir iç standart kullanırız. Teorik olarak, bu aynı örnek tüm deneyler için kullanılabilir böylece yeterli miktarda yapılabilir sürece herhangi bir protein örnek olabilir. Beyin homogenates bol miktarda protein içeren ve genellikle yüksek bir konsantrasyon elde edilen bizim deneyler, biz beyin protein lysates, karışımı kullanın. İneklemek standart miktar ortalama daha fazla quantifications doğruluğunu membranlar arasında artırır ve deneme tekrarlanabilirlik için neden.
Protein düzeyleri farklı teknikleri bir dizi tarafından belirlenebilir ve tercih edilen yöntem analiz ediliyor örnek türü ve deneme amacı bağlıdır. Batı tekrarlanabilir miktar leke işleri en iyi durumlarda nerede, ne zaman kullanarak fare veya tanımlanmış bir genetik arka plan hayvan diğer modelleri gibi iyi kontrollü deneysel koşullar olabilir. Buna ek olarak, birçok deney, insan hasta numuneleri kullanılarak bu yaş, genetik değişkenliği daha az mümkün olabilir ve doku örnekleme zamanları (hayvan) modeli sistemlerinde daha kontrole daha zordur. Antikor özgüllük dikkatli doğrulama çok önemli olsa da ELISA gibi plaka tabanlı teknikleri bu analizler için daha uygun olabilir. Örneğin, içinde kırılgan X Sendromu araştırma, antikorlar farklı izoformlarının algılamak için gösterilmiştir ve kullanıldığında bir sinyal için tüm izoformlarının ELISA belirler gibi bu proteinin toplam miktarın tahmindi için yol açacak ELISA24kombine. Yöntemleri protein ifade olduğunu belirlemek için en iyi seçenek bu nedenle bağlamda bağlı olarak, örnek türü ve soruşturuluyor araştırma soru.
Yeterli istatistiksel çözümlemesini biyolojik veri miktar çizilmiş bir yargıya güvenilirliği için bir önkoşuldur. İstatistiksel olarak farklı dokuların karşılaştırarak oluşturulan karmaşık veri analiz, puan zaman veya diğer deneysel koşullar ve bunların kombinasyonları ANOVA post-hoc testi ile teslim edebilirsiniz daha daha gelişmiş istatistiksel modelleme gerektiriyor olabilir. Biz mevcut el yazması tarif yaklaşım, karışık etkileri modeli gibi daha karmaşık istatistiksel modelleme için o aramak için tavsiye olabilir daha fazla tavsiye--dan biostatisticians. Büyük ölçekli protein ifadenin yeterli istatistiksel analiz sonuçları ve güvenilirlik sağlamlık ve tekrarlanabilirlik sonuçları büyük ölçüde iyileştirebilir.
Özetle, biz burada tarif deneysel yaklaşım protein ifade western blot karmaşık örnekleri yeni ve heyecan verici araştırma soruları cevaplamak için izin kullanarak belirlemek istediğiniz araştırmacılar için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
E.J.N.G. Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z) tarafından desteklenir. Diğer finansman SMA Trust (SMA İngiltere'de konsorsiyum; tarafından sağlanmıştır T.H.G. & Y-T. H.), SMA Avrupa (T.H.G, D.v.D.H. ve E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP hassas Tıp (T.H.G., L.L. ve A.M.M.) ve Euan MacDonald Merkezi Motor nöron hastalığı Araştırma (T.H.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
