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Biochemistry

Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées

doi: 10.3791/59438 Published: April 9, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Cette méthode décrit une approche fiable et reproductible pour la comparaison des niveaux de protéine dans différents tissus et en différents points du développement en utilisant une approche de buvard ouest quantitative standardisée.

Abstract

Western Blot est une technique qui est couramment utilisée pour détecter et quantifier l’expression de la protéine. Au cours des années, cette technique a abouti à plusieurs avancées en recherche fondamentale et clinique. Cependant, comme avec beaucoup de techniques expérimentales semblables, les résultats des analyses de Western blot sont influençable par les choix opérés dans la conception et la réalisation de l’expérience. Les protéines internes spécifiques ont été utilisées traditionnellement pour normaliser le taux de protéines pour la quantification, cependant, celles-ci ont un certain nombre de limites et ont donc été critiqués de plus en plus au cours des dernières années. Nous décrivons ici un protocole détaillé que nous avons mis au point pour nous permettre d’entreprendre des comparaisons complexes des variations d’expression protéiques dans différents tissus, des modèles de souris (y compris les modèles de maladies) et du développement on. En utilisant un colorant fluorescent de protéines totales et en introduisant l’utilisation d’une charge interne standard, il est possible de surmonter les limites actuelles du nombre d’échantillons qui peuvent être comparés dans les expériences systématiquement comparer les niveaux de la protéine à travers un gamme de conditions expérimentales. Cette approche élargit l’utilisation de techniques traditionnelles de la tache occidentale, permettant ainsi aux chercheurs de mieux explorer l’expression protéique dans l’ensemble des échantillons et les différents tissus.

Introduction

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Western Blot est une technique qui est couramment utilisée pour détecter et quantifier l’expression de la protéine, y compris dans des homogénats de tissu ou des extraits. Au cours des années, cette technique a abouti à plusieurs avancées en recherche fondamentale et clinique, où il peut être utilisé comme un outil de diagnostic pour identifier la présence de la maladie1,2. Western Blot a été décrite en 1979 comme une méthode pour transférer des protéines de gels de polyacrylamide aux feuilles de nitrocellulose et ensuite visualiser les protéines à l’aide d’anticorps secondaires qui ont été étiquetés ou conjugués à la fluorescéine radiologiquement ou3de la peroxydase. Grâce au développement de kits disponibles dans le commerce et équipement, Western Blot méthodes ont été plus en plus standardisés et simplifiés au fil des ans. En effet, la technique est désormais facilement effectuée par des scientifiques avec des arrière-plans et des niveaux d’expérience. Cependant, comme avec beaucoup de techniques expérimentales semblables, les résultats des analyses de Western blot sont influençable par les choix opérés dans la conception et la réalisation de l’expérience. Il est important, par conséquent, que l’accessibilité des méthodes normalisées de buvard occidentales ne pas occulter la nécessité d’une planification minutieuse et expérimentale et de conception. Considérations expérimentales incluent, sans s’y limite, l’échantillon de préparation et manipulation, sélection et validation des anticorps pour la détection de la protéine et l’efficacité de transfert gel-à-membrane de particulièrement petits ou grands (< 10 ou > 140 kDa) protéines4,5,6,7,8,9. La qualité des protéines de l’échantillon original joue un rôle important en déterminant les résultats de l’analyse ultérieure de Western blot. Comme protéine peut être extraites d’une grande variété d’échantillons et de sources, y compris les lignées cellulaires, des tissus de modèles animaux et post-mortem des tissus humains, cohérence dans le traitement et la manipulation est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. Par exemple, lors de l’entreposage à long terme des échantillons pour l’extraction de la protéine est nécessaire, il est important de réaliser que, même si la protéine est généralement stable à-80 ° C, des différences dans la stabilité des protéines entre les protéines extraites et de tissus intacts à-80 ° C ont été déclarés10. En outre, pour obtenir des estimations reproductibles des quantités de protéines, compatible homogénéisation des échantillons est cruciale. Optimisation des mémoires tampons de lysis différents et des méthodes d’homogénéisation (p. ex., manuelle homogénéisation par rapport aux méthodes automatisées) peut être nécessaire avant de commencer une expérience quantitative à grande échelle.

Stratégies de normalisation pour corriger la variabilité de chargement et de quantification de protéines sont essentielles pour obtenir des résultats robustes, quantitatives de l’expression de la protéine. Ménage de protéines comme la β-actine, tubuline α, β-tubuline et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ont traditionnellement servis à normaliser le taux de protéines pour la quantification. Toutefois, normalisation aux protéines internes spécifiques à des fins de quantification a été critiquée de plus en plus sur les dernières quelques années11,12. Par exemple, l’expression des protéines de l’entretien ménager peut changer à travers différentes étapes du développement13,14, à travers les tissus de l' animal même4et en vertu de diverses maladies conditions4,15 ,16,17. Par conséquent, l’utilisation des protéines internes spécifiques limite les possibilités de faire des comparaisons plus complexes entre l’expression de la protéine de différents tissus, à des intervalles différents et dans différentes conditions expérimentales. Une alternative aux protéines internes au contrôle pour protéine variation de chargement est l’utilisation d’une tache de protéines totales (TPS) cette terminologie et visualise toutes les protéines présentes dans un échantillon. TPS permet la normalisation signal selon charge de protéine totale plutôt que de niveaux d’une protéine spécifique et, par conséquent, la quantification du signal de la TPS devraient être comparables et reproductibles, quelles que soient les conditions expérimentales, le type d’échantillon ou validant du développement . Exemples de taches de protéines totales Ponceau S, gels sans tache, R-350 bleu de Coomassie, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black et Cy5 (examinées par réf. 18). Chacune de ces méthodes a des limites et des avantages spécifiques et sélection de la méthode dépend de l’heure et outils disponibles ainsi que le montage expérimental4,18.

En plus d’utiliser un TPS pour corriger la charge au sein de la membrane et de la variabilité de la quantification, il peut être nécessaire de comparer les échantillons entre les différentes membranes, notamment lorsque vous effectuez l’analyse de l’expression des protéines à grande échelle. Cependant, la variabilité des facteurs tels que l’anticorps lie l’intensité de coloration de protéine efficacité et total peut introduire de nouvelles variabilité entre les échantillons de protéines qui sont analysées sur les gels distincts et membranes. Pour la quantification fiable dans cette situation, il est donc nécessaire d’introduire une nouvelle étape de normalisation pour tenir compte de la variabilité entre les membranes. Ceci peut être réalisé en incluant une norme interne chargement sur chacun des membranes qui est maintenue constante à travers des expériences analysées séparément. Cette norme peut prendre la forme d’une protéine qui peut être obtenu en quantité suffisante pour être utilisé dans toutes les membranes comprises dans le test lysate. Ici, nous utilisons un lysat de cerveau de souris (obtenu à partir des souris témoins âgés de 5 jours), comme le cerveau est homogénéisé facilement et la protéine obtenue lysate contient une quantité importante de protéine à une concentration élevée. Chargement d’un étalon interne en triple exemplaire permet échantillons sur membranes distinctes pour être normalisé et comparées directement.

Nous décrivons ici un protocole détaillé que nous avons mis au point pour nous permettre d’entreprendre des comparaisons complexes des variations d’expression protéiques dans différents tissus, des modèles de souris (y compris les modèles de maladies) et développement h19. En combinant un TPS fluorescent avec l’utilisation d’une charge interne standard, nous avons été en mesure de surmonter les limites actuelles du nombre d’échantillons et des conditions expérimentales qui peuvent être comparées au sein d’une seule expérience. Cette approche élargit l’utilisation de techniques traditionnelles de Western blot, permettant ainsi aux chercheurs de mieux explorer l’expression protéique dans l’ensemble des échantillons et les différents tissus.

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Protocol

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Tissus pour cette procédure ont été extraites des études sur les animaux qui ont été approuvées par le Comité d’éthique interne à l’Université d’Edimbourg et ont été réalisées en concordance avec les institutionnels et les règlements de la UK Home Office sous l’autorité des relatifs personnels et licenses du projet.

Remarque : Ce protocole a été optimisé à l’aide de réactifs et trousses normalisées, disponibles dans le commerce afin d’améliorer la reproductibilité (voir Table des matières).

1. préparation des échantillons

  1. Extraction de protéine
    1. Cellule de transfert snap-congelé ou des échantillons de tissus de-80 ° C sur la glace sèche, décongeler sur la glace et laver au besoin avec de la glace froide 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pour plus de détails sur les tissus et les lavages de PBS, voir tableau 1). Éviter les cycles de gel-dégel inutiles que cela aura une incidence sur la qualité des protéines.
    2. Ajouter immunoprécipitation (RIPA) tampon (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 % NP-40, désoxycholate de sodium à 1 %, 0,1 % SDS) contenant 1 x inhibiteur de la protéase à chaque échantillon, en utilisant la quantité optimale par poids de tissu (voir le tableau 1 pour recommandations).
      Remarque : Selon l’application, le type et la quantité de solution tampon homogénéisation peut-être besoin de plus d’optimisation.
    3. Utilisez un homogénéisateur à main électrique avec un pilon en polypropylène pour homogénéiser les échantillons de tissus. Entre chaque échantillon, laver le pilon dans de l’eau bidistillée et essuyer avec un tissu propre. Changer le pilon entre différentes conditions expérimentales et les tissus.
    4. Laisser les échantillons sur glace pendant 10 min après homogénéisation. Centrifuger les échantillons à > 10 000 x g à 4 ° C pendant 10 min.
    5. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sur la glace sans déranger le culot. Le surnageant est l’échantillon de protéine. Stocker les protéines extraites à-80 ° C ou directement passer à mesurer la concentration de la protéine.
  2. Quantification et la normalisation de la concentration de protéines
    1. Mesurer la concentration de protéine à un dosage de l’acide (BCA) de bicinchoninic. Préparer un mélange de dosage BCA selon les instructions du fabricant dans une plaque 96 puits optique à l’aide de 200 µL du mélange BCA / puits.
      Remarque : Autres méthodes de quantification, notamment des essais de Lowry et Bradford peuvent également servir à déterminer la concentration de protéines aussi longtemps que la concentration de protéines est quantifiée constamment à travers des expériences.
    2. Préparer l’albumine sérique bovine normes (BSA) à l’augmentation des concentrations en triple exemplaire et ajouter 1 µL de chaque échantillon de protéine en double exemplaire. Incuber la plaque à 96 puits en un bloc de chaleur préchauffé à 60 ° C pendant 10 min ou plus si la concentration de la protéine devrait être faible.
    3. Après incubation, mesurer l’absorption à 560 nm en utilisant un lecteur de plaque.
    4. Exporter les mesures lecteur de plaque et de calculer la concentration de protéine en comparant les valeurs d’absorbance moyenne de chaque échantillon à une courbe d’étalonnage obtenue à l’aide de la norme de la protéine. La valeur de R2 pour la courbe d’étalonnage doit être supérieure ou égale à 0,98 d’évaluer avec précision la concentration de protéine des échantillons.
    5. Normaliser la quantité de protéines par préparation des dilutions d’échantillons de protéines dans la solution tampon et eau ultrapure. Le volume total est réglable selon le type de gel utilisé. Chargement de 30 µg de protéines par voie comme un montant de départ est recommandé. Ajouter agent réducteur comme le dithiothréitol (DTT ; concentration finale 5 mM) ou bêta-mercaptoéthanol (concentration finale 200 mM) pour chaque échantillon selon les besoins. Pipetter bêta-mercaptoéthanol non dilué dans une hotte de laboratoire.
    6. Incuber les échantillons dans un bloc chauffant à 70 ° C pendant 10 min. mettre les échantillons sur glace, vortex et la centrifuger brièvement à recueillir. Rester sur la glace jusqu’au chargement du gel.

2. électrophorèse des échantillons de protéines

  1. Dispositif et gel mis en place
    1. Programme d’installation un gradient de Bis-Tris préfabriqué 4 – 12 % gel (voir Table des matières) dans le système de chambre de l’électrophorèse sur gel. Rincer les gels à l’aide de l’eau bidistillée avant utilisation.
      Remarque : Selon la taille, l’interaction et l’abondance de la protéine d’intérêt, gels avec une pente différente, mise en mémoire tampon de l’agent ou bien taille et nombre peut être utilisé.
    2. Ajouter 500 mL de 1 SDD x MES tampon dilué dans de l’eau bidistillée par réservoir. Retirer soigneusement le peigne de gels après avoir ajouté de la mémoire tampon en cours d’exécution sans déranger les puits dans le gel de concentration.
  2. Chargement de protéine
    1. Charger 3,5 µL de la protéine étalon dans le puits. Selon le schéma prédéterminé, une échelle de protéines des deux côtés du gel de chargement peut aider à plus précisément estimation de la taille de la protéine. Utiliser un gel à pointe fine chargement conseils pour le chargement d’échantillon plus précis.
    2. Lors de l’utilisation d’un étalon interne pour la normalisation entre les membranes (voir l’étape 5 ci-dessous et discussion), charger un montant égal aux autres échantillons dans les 3 premiers puits à côté de l’échelle de la protéine.
    3. Charge 30 µg de chaque échantillon dans les puits restants. 1 x tampon échantillon s’ajoute tous les puits vides.
  3. Électrophorèse
    1. Assembler le réservoir de gel après le chargement des échantillons. Exécuter les exemples à travers le gel de concentration à 80 V pendant 10 min, suivie de 150 V pour une supplémentaire de 45-60 min.

3. transfert de protéines

NOTE : Transfert de protéines dans le présent protocole est effectuée en utilisant un système de buvard demi-sec disponible dans le commerce (voir Table des matières) pour des résultats rapides et cohérentes.

  1. Préparer le transfert des protéines par trempage pré filtre en papier dans l’eau bidistillée et assurer le couteau de gel, plastique Pasteur pipette, épongeant rouleau et forceps sont prêt à l’emploi.
  2. Ouvrez la pile de transfert en enlevant soigneusement tous les feuille d’emballage. Enlever la partie supérieure de la pile du bas et mettez-le de côté. Rapidement, humidifier la membrane sur la pile du bas avec quelques gouttes de l’électrophorèse tampon (2 à 3 mL). Une fois la pile de transfert est ouverte, il est important de prévenir la membrane PVDF ne se dessèchent pas.
  3. Après l’arrêt de l’électrophorèse, ouvrez le gel préfabriqué à l’aide du couteau de gel et couper le gel de concentration. Couper le gel sur ses bords pour la libérer de la troupe en plastique. Gardez le couteau gel humide pour éviter d’endommager le gel.
  4. Assembler la pile de transfert de bas en haut : bas de pile (contenant les membranes PVDF), gel de protéine, papier filtre. Utilisez le rouleau de transfert pour éliminer toutes les bulles d’air. Placer la pile supérieure sur le papier filtre et faire rouler la pile à nouveau pour enlever les bulles d’air. Ne poussez pas trop fort car cela pourrait provoquer le gel à se déformer au cours de la protéine de transfert.
  5. Transférer la pile entière dans le dispositif de transfert avec l’électrode sur le côté gauche de l’appareil et placez l’éponge de gel sur le dessus de la pile pour qu’il soit aligné avec les contacts électriques correspondants sur l’appareil. Fermer le couvercle, sélectionnez et lancez le programme approprié (20 V 7 mn est un point de départ recommandé).
  6. Lorsque vous avez terminé, laissez le couvercle fermé pendant 2 min permettre à la pile pour refroidir et d’éviter que la membrane se dessèchent. Retirez la pile de transfert et couper la membrane à la dimension de gel. Laver la membrane coupe rapidement avec de l’eau bidistillée avant de continuer avec la tache de protéines totales.

4. total protéines coloration

NOTE : À l’aide de la détection par fluorescence fournit un avantage considérable sur les approches plus traditionnelles (p. ex., détection de ECL), comme la gamme de linéarité et de la sensibilité peuvent être beaucoup mieux contrôlé4. Par conséquent, dans les étapes 4 et 5, un TPS fluorescent et anticorps secondaires fluorescents sont utilisés (voir Table des matières).

  1. Rouler la membrane dans un tube de 50 mL avec le côté de la protéine vers l’intérieur. En raison de la sensibilité à la lumière de la TPS fluorescent et anticorps secondaires, toutes les étapes subséquentes sont effectuées dans l’obscurité.
  2. Ajouter 5 mL de solution de tache de protéine (voir la Table des matières) et incuber sur un rouleau de 5 min à température ambiante. Parce que TPS et tampon de lavage contiennent du méthanol, de porter ces étapes dehors sous une hotte.
  3. Jeter la solution colorante et laver deux fois plus rapidement avec les 5 mL de solution de lavage (6,3 % de l’acide acétique à 30 % de méthanol). Replacez le tube brièvement sur le rouleau entre les lavages. Rincer la membrane brièvement avec eau ultrapure avant de continuer.

5. blocage, incubation d’anticorps et détection

  1. Blocage de la membrane: ajouter 3 mL de tampon de blocage (voir la Table des matières) dans le tube de 50 mL contenant de la membrane. Incuber la membrane sur un rouleau pour 30 min à température ambiante. Selon le choix des anticorps, le type de tampon de blocage utilisé peut exiger optimisation.
  2. Incubation des anticorps primaires
    1. Jeter le blocage de la mémoire tampon et remplacer avec l’anticorps primaire à l’approprié, optimisé concentration (Figure 1 et Figure 2: souris-anti-SMN, à 1:1, 000, dilué dans un tampon de blocage).
      NOTE : Optimisation adéquate des anticorps primaires devrait inclure confirmation que l’anticorps détecte un produit protéique de la bonne taille, tout en montrant aucune ou une liaison minimale aux produits des autres protéines non spécifiques. Si possible, tester et comparer plusieurs anticorps dirigés contre la protéine d’intérêt.
    2. Incuber la membrane sur un rouleau de nuit à 4 ° C. Le lendemain, enlever la solution d’anticorps et laver 6 fois pendant 5 min avec 1 x PBS sur un rouleau à température ambiante (RT).
  3. Incubation de l’anticorps secondaire
    1. Préparer l’anticorps secondaire spécifique à 1:5,000 contre l’hôte de l’anticorps primaire dans 5 mL de tampon de blocage. Autres anticorps secondaires peuvent exiger des autres dilutions ou l’utilisation de tampons blocage alternatifs.
    2. Incuber la membrane avec la solution d’anticorps secondaire sur un rouleau pendant 1 h à température ambiante. Après incubation, laver la membrane trois fois 30 min avec 1 x PBS sur un rouleau.
    3. Sécher la membrane et garder la membrane à l’abri de la lumière à l’aide de papier d’aluminium jusqu'à détection. Membranes peuvent être conservés à 4 ° C pour un stockage prolongé.
  4. Acquisition d’images
    1. Connectez-vous à l’ordinateur relié au scanneur. Placer la membrane sur le scanner la face des protéines vers le bas et sélectionnez la zone de numérisation dans le logiciel.
    2. Optimiser l’intensité du laser pour les deux (700 nm et 800 nm) canaux, en confirmant sans saturation se produit. Acquérir les images dans les deux voies et d’exporter les images pour une analyse ultérieure (étape 6).

6. quantification et analyse Western

Remarque : Ces recommandations sont basées sur le logiciel Image Studio disponible gratuitement. Toutefois, les analyses comparables peuvent également être effectuées à l’aide d’autres logiciels, tels que ImageJ.

  1. Importation du fichier: créer un espace de travail local sur l’ordinateur utilisé pour l’analyse. Cela génère une base de données de fichiers d’images pour des transferts western acquises. Importer des fichiers obtenus sur le scanner, puis sélectionnez l’image pour l’analyse.
  2. Analyse TPS
    1. Afficher le canal de 700 nm pour montrer la protéine totale, résultat de la coloration. Un exemple d’une image de la TPS est inclus dans la Figure 1 dans les différents tissus de néonatale (P5) (Figure 1 a-B) et vieux de 10 semaine, souris (Figure 1C-D) sont comparées directement. De même, la Figure 2 montre un exemple d’une comparaison directe des tissus du cerveau de souris de différents âges.
    2. Sélectionnez l’onglet analyse du coin supérieur droit et sélectionnez Ajouter Rectangle pour définir la zone d’intérêt pour la normalisation (Figure 1 b, D). Copiez et collez la première zone du rectangle sur chaque échantillon individuel pour que la région définie soit à la même taille pour toutes les voies analysées.
    3. Copier le résultat dans l’onglet formes dans le coin inférieur gauche du logiciel.
  3. Quantification
    Remarque : L’approche optimale pour la quantification des échantillons dépend de la conception expérimentale. Nous allons fournir ici un exemple illustrant la détection de la protéine de motoneurones survie (Smn, une protéine clé impliqués dans les maladies neuromusculaires amyotrophie spinale20,21), qui est connue pour diminuer au fil du temps 19 et comment la normalisation de l’intensité du signal Smn à TPS fournit des estimations fiables du développement d’expression protéique.
    1. La figure 2 montre une diminution de l’expression de la Smn avec l’âge de l’animal avec TPS comme protéine contrôle de chargement. Répétez l’étape 6.2.1-6.2.3 afin de quantifier les protéines chargement (Figure 2 b). Répétez l’étape 6.2.1-6.2.3 dans le canal de nm 800 (Figure 2 a) à analyser la protéine d’intérêt.
    2. Copier les résultats de TPS et de protéine d’intérêt dans un tableur. Sur la feuille de calcul, tout d’abord normaliser la protéine chargement en déterminant le plus haut signal TPS et divisant chaque TPS signal valeur par cette valeur pour obtenir la valeur de chargement de la protéine normalisée.
    3. Diviser la valeur du signal 800 nm de chaque échantillon individuel par sa valeur normalisée protéine correspondante pour calculer le ratio d’expression de protéine relative dans les différents échantillons.
    4. Après la première normalisation, comparer différents points dans le temps ou les tissus à la valeur moyenne de l’étalon interne pour permettre des comparaisons directes entre expériences et différentes membranes.

7. les statistiques

  1. Pour déterminer des différences statistiquement significatives dans l’expression de la protéine dans l’ensemble complexes et les grands groupes d’échantillons, méthodologie statistique appropriée est nécessaire. Bien qu’une analyse détaillée du contexte statistique dépasse la portée du présent document, nous voulons mettre en évidence plusieurs facteurs et en détail une approche réussie que nous avons utilisé précédemment,19.
  2. Comme pour nombreuses expériences, mesures de quantification des protéines ne représentent pas de données complètement indépendantes. Ici, par exemple, plusieurs tissus sont généralement obtenus chez des animaux unique pour déterminer les niveaux de la protéine à travers de multiples organes en un seul temps-point expérimental. Par conséquent, nous avons utilisé un modèles à effets mixtes pour analyser les différences dans l’expression de la protéine au fil du temps et entre les tissus.  En général, des modèles à effets mixtes constituent un moyen efficace d’aborder manque d’indépendance et ainsi éviter la pseudo-réplication22,23. En l’espèce, les modèles à effets mixtes augmentent puissance statistique en tenant compte des mesures répétées chez les tissus, les individus. Nous utilisons le progiciel statistique R pour effectuer ces analyses, car c’est librement accessible et polyvalent. Toutefois, les autres paquets disponibles dans le commerce peuvent être capables d’effectuer des analyses similaires.
  3. Le protocole expérimental actuel implique une conception « split plot » parce que chaque souris appartenaient à un seul groupe d’âge. Par conséquent, nous avons modélisé les souris (souris ID) comme un effet aléatoire avec un identificateur unique ; nous représentait également les tissus, l’âge et leur interaction en tant qu’effets fixes. Nous avons modélisé les données en utilisant la fonction lmer dans la bibliothèque de R, lme4. Comme une étape de contrôle de qualité, nous visualisé pour évaluer les hypothèses de variance égale et une distribution normale des résidus et transformer les données si nécessaire pour répondre à ces hypothèses. Pour tester une interaction significative entre le tissu et l’âge, nous ajustons un modèle identique qui manquait de cette interaction et comparé les modèles paramétriques système (fonction PBmodcomp dans la bibliothèque, pbkrtest de R).  Où est née des interactions significatives, nous avons utilisé la fonction emmeans (dans la bibliothèque d’emmeans R) pour déterminer la cause de l’interaction.  Par exemple, nous avons comparé les moyennes d’expression parmi les classes d’âge au sein de chacun des tissus ; une interaction significative peut-être survenir entre l’âge et le tissu si, disons, deux classes d’âge donné diffèrent significativement d’un tissu, mais pas un autre. En résumé, ces approches permettent de prolonger la robustesse des conclusions tirées des expériences de la tache occidentale en apportant un soutien statistique de ces résultats.

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Representative Results

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Nous incluons des exemples d’utilisation de TPS et d’un étalon interne pour faciliter les comparaisons des niveaux de protéines dans les tissus et les points dans le temps. La figure 1 montre les résultats d’éponger occidental sur les protéines extraites des tissus prélevés néonatale (postnatal J5) par rapport à des souris adultes (10 - semaine vieux). TPS et immunoblot Smn sont indiquées dans la Figure 1 a, C. Quantification de l’intensité de la fluorescence de la TPS a été obtenue en mesurant l’intensité de fluorescence à l’intérieur de la zone du rectangle sur chaque voie, et ses résultats sont présentés dans les tableaux de la Figure 1 b et 1D. Notez que les échantillons de différents tissus sont caractérisés par différents profils de bandes de protéines TPS et c’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser la voie entière à des fins de normalisation. En effet, si les voies entières sont analysées, l’intensité de la fluorescence reste relativement similaire dans les trois échantillons, indiquant le que TPS pour la normalisation est adapté à cet effet. Un étalon interne consistant en un mélange de lysat cerveau P5 figurait aussi pour illustrer comment il peut être utilisé pour plus de comparaisons entre les différentes membranes. De plus, dans la Figure 2, nous montrons comment un TPS fluorescent peut être utilisé pour comparer les niveaux de la protéine à différents moments du développement. Ici, nous montrons des niveaux de Smn dans les lysats de cerveau de néonatale (P5), sevrage âge (P20) et souris adulte (10W) (Figure 2 a). Bien que les niveaux de Smn clairement diminuent avec l’âge, quantification de TPS reste constante, comme illustré dans la Figure 2 b.

Figure 1
Figure 1. Western blots montrant TPS et Smn taux de protéines dans les tissus de souris à deux époques différentes. TPS et Smn de protéine pour P5 (A) et de 10 semaines (C) souris. (B, D) L’intensité de la fluorescence de TPS ensemble-lane a été calculée et est indiquée (en unités arbitraires). M:/protéine marqueur standard ; kDa : kilodaltons ; UA : unité arbitraire ; P5 : jour après la naissance 5 ; 10W : 10 semaines. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Analyse de l’expression de la Smn dans les tissus des souris à différents moments du développement. (A) cerveau lysats de tissus obtenus au P5, P20 et 10 souris week-old a été analysée à l’aide de TPS (panneau supérieur) et SMN (panneau inférieur). (B) l’intensité de la fluorescence de la TPS a été calculée et est indiquée en unités arbitraires. M:/protéine marqueur standard ; kDa : kilodaltons ; UA : unité arbitraire ; P5 : jour après la naissance 5 ; P20 : jour après la naissance 20 ; 10W : 10 semaines. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tissu Poids env. * 1xPBS de lavage (4 ° C) Répéter le lavage Tampon de l’homogénéisation culturelle **
La moelle épinière 40 mg 150 mL x 3 100 mL
Muscle (GC) 20 mg 150 mL x 3 100 mL
Cerveau 240 mg 400 mL 4 x 400 mL
Coeur 60 mg 400 mL 4 x 200 mL
Foie 130 mg 400 mL 4 x 400 mL
Rein 45 mg 400 mL 4 x 200 mL
* Ces poids sont des valeurs indicatives pour les tissus provenant de souris P8.
** Ces volumes sont des indications et peuvent être également ajustées selon le poids du tissu.

Tableau 1. Vue d’ensemble de poids attendue des tissus et des recommandations correspondantes pour les lavages de PBS et volume de tampon de lyse à utiliser pour l’homogénéisation. Les poids sont des indications pour les tissus prélevés postnatal jour 8 (P8) de souris. Volumes de tampon PBS et lyse peuvent être redimensionnées en haut et en bas selon les besoins expérimentaux.

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Discussion

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Avec le protocole expérimental approprié, les mesures de contrôle et analyse statistique, les éponger occidental peut servir à effectuer des estimations quantitatives fiables d’expression de la protéine au sein et entre une gamme variée d’échantillons biologiques. Le protocole que nous décrivons dans le manuscrit actuel vise à servir de modèle pour les chercheurs cherchent à utiliser Western Blot pour procéder à l’analyse quantitative au groupes plus importants et plus complexes des échantillons, en utilisant une combinaison de fluorescence méthodes de détection, chargement de protéine totale normalisation et des normes internes. Bien que l’accent est mis sur la détermination et en comparant l’expression de la protéine provenant de tissus de souris différents et à des âges différents, cette approche peut également être étendue pour comparer l’expression des protéines dans d’autres conditions expérimentales.

Une étape centrale dans notre protocole actuel est la normalisation des protéines d’intérêt pour les protéines totales, chargé par la quantification d’un colorant fluorescent protéine totale. Normalisation de TPS corrige la variation dans le chargement de l’échantillon et les marges d’erreur dans les méthodes de quantification des protéines. Toutefois, le nombre d’échantillons de protéines qui peut être analysé sur une membrane unique étant souvent limité, outre normalisation devrez peut-être comparer plusieurs membranes. En effet, variabilité entre comment les protéines sont détectés sur différentes membranes (en raison par exemple anticorps incubation temps ou température variation) peut provoquer des variations en outre introduit par étapes de chargement et de la quantification du protocole. Ici, nous utilisons un étalon interne qui consiste en un mélange de lysat protéique unique qui est chargé en triple exemplaire sur chaque gel et permettant la comparaison et la normalisation entre les gels/membranes. Théoriquement, cela pourrait être n’importe quel échantillon de protéines, tant qu’il peut être fait en quantité suffisante pour que le même échantillon peut être utilisé pour toutes les expériences. Dans nos expériences, nous utilisons un mélange de lysats de protéines cérébrales, comme des homogénats de cerveau contiennent de grandes quantités de protéines et sont généralement obtenus à une concentration élevée. Avec une moyenne de quantification de la norme en triple devrait encore augmenter la précision des analyses quantitatives à travers les membranes et contribuer à la reproductibilité de l’expérience.

Taux de protéines peuvent être déterminées par un certain nombre de techniques différentes et la méthode recommandée dépend du type d’échantillon analysée et le but de l’expérience. Quantification reproductible de Western blot fonctionne mieux dans des situations où les conditions expérimentales peuvent être bien contrôlées, par exemple quand à l’aide de la souris ou d’autres modèles animaux d’un patrimoine génétique défini. En revanche, de nombreuses expériences en utilisant des échantillons de patients humains, cela peut être moins faisable comme l’âge, la variabilité génétique et temps d’échantillonnage de tissus sont beaucoup plus difficiles à contrôler que dans des systèmes modèles (animaux). Techniques axées sur la plaque comme ELISA pourraient être plus appropriés pour ces analyses, bien que la validation minutieuse de la spécificité de l’anticorps est cruciale. Par exemple, la recherche, le syndrome de le X fragile anticorps ont dû être divulgués afin de détecter différentes isoformes et lorsqu’il est utilisé dans ELISA, cela conduira à une surestimation de la quantité totale de protéines car ELISA détermine un signal pour toutes les isoformes combiné24. Les choix optimaux pour les méthodes déterminer l’expression de la protéine sont donc selon le contexte, échantillon type et la question de recherche qui est à l’étude.

Effectuer une analyse statistique appropriée est une condition sine qua non pour la fiabilité de toute conclusion tirée de la quantification des données biologiques. Statistiquement, analyse de données complexes tel que généré en comparant les différents tissus, des points de temps ou autres conditions expérimentales et leurs combinaisons peuvent exiger que plus avancées de modélisation statistique que ANOVA avec tests post hoc peut livrer. Pour la modélisation statistique plus complexes, tels que les effets mixtes modèle approche, nous décrivons dans le manuscrit actuel, il peut être souhaitable de demander plus amples conseils des biostatisticiens. Analyse statistique adéquate d’expression de la protéine à grande échelle peut grandement améliorer la robustesse des résultats et de la fiabilité et la reproductibilité des résultats.

En résumé, l’approche expérimentale, que nous décrivons ici fournit une méthode fiable et reproductible pour les chercheurs qui veulent déterminer l’expression de la protéine à l’aide de la tache occidentale dans des échantillons complexes permettant de répondre aux questions de recherche nouvelles et passionnantes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.

Acknowledgments

E.J.N.G. est pris en charge par le Wellcome Trust (subvention 106098/Z/14/Z). Autres fonds ont été fournis par le SMA Trust (SMA UK Consortium ; T.H.G. & Y-T. H.), SMA en Europe (tacheraft, D.v.D.H. et E.J.N.G.), le DTP de l’Université d’Édimbourg en médecine Precision (T.H.G., L.L. et a.m.M.) et Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research (tacheraft).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

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References

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Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées
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Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

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