Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59438
Automatic Translation
1,2, *1,2, *1,2, *1,2, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh, 2Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh
* These authors contributed equally

Summary

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

Abstract

סופג המערבי היא טכניקה המשמש בדרך כלל כדי לזהות ולכמת ביטוי חלבון. במהלך השנים, טכניקה זו הובילה רבים ההתקדמות במחקר בסיסי וקליני. עם זאת, כמו עם טכניקות רבות ניסיוני דומה, התוצאה של ניתוח תספיג בקלות מושפעת האפשרויות עיצוב, ביצוע הניסוי. חלבונים ספציפיים משק באופן מסורתי שימש לנרמל את רמות החלבון על כימות, אולם, אלה יש מספר מגבלות, ולכן יותר ויותר ננזף על השנים האחרונות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט פותחו כדי לאפשר לנו לבצע השוואות מורכבות של חלבון ביטוי וריאציה על פני ברקמות שונות, מודלים העכבר (כולל מודלים המחלה) ו- timepoints התפתחותית. על-ידי שימוש כתם חלבון פלואורסצנטי הכולל היכרות עם השימוש טעינת פנימי רגיל, זה אפשרי להתגבר על מגבלות הקיימות במספר הדגימות אשר ניתן להשוות בתוך ניסויים ולהשוות באופן שיטתי את רמות החלבון על פני מגוון של תנאי הניסוי. גישה זו מרחיבה את השימוש בטכניקות מסורתיות תספיג, ובכך לאפשר לחוקרים לחקור יותר חלבון הביטוי על פני ברקמות שונות ודוגמאות.

Introduction

סופג המערבי היא טכניקה המשמשת בדרך כלל כדי לזהות ולכמת ביטוי חלבון, כולל רקמות homogenates או תמציות. במהלך השנים, טכניקה זו הובילה רבים ההתקדמות במחקר בסיסי וקליני, שבו הוא יכול לשמש ככלי אבחוני כדי לזהות הנוכחות של מחלה1,2. סופג המערבי תוארה לראשונה בשנת 1979 כשיטה כדי להעביר חלבונים לזיהוי ג'לים ניטרוצלולוזה גליונות והמחש לאחר מכן חלבונים באמצעות נוגדנים משניים radioactively מתויג או מצומדת כדי fluorescein . או peroxidase3... דרך פיתוח ערכות זמינים מסחרית, ציוד, שיטות סופג המערבי יש יותר ויותר סטנדרטית, פשוטה עם השנים. אכן, הטכניקה עכשיו בקלות מתבצעת על ידי מדענים עם רקעים ורמות שונות של ניסיון. עם זאת, כמו עם טכניקות רבות ניסיוני דומה, התוצאה של ניתוח תספיג בקלות מושפעת האפשרויות עיצוב, ביצוע הניסוי. זה חשוב, לכן, כי הנגישות של מתוקננת שיטות מערביות סופג לא יטשטשו את הצורך תכנון ניסויי זהיר ועיצוב. שיקולים ניסיוני כוללים, אך אינם מוגבלים, לדוגמא, טיפול, בחירה והכנה אימות של נוגדנים לגילוי חלבון ויעילות ג'ל-כדי-הממברנה העברה של קטן או גדול במיוחד (< 10 או > 140 kDa) חלבונים4,5,6,7,8,9. חלבון איכותי של המדגם המקורי ממלאת תפקיד משמעותי בקביעת התוצאה של הניתוח תספיג עוקבות. כמו חלבון יכול להיות מופק מגוון רחב של מקורות, כולל שורות תאים, רקמות חייתיים של פוסט-מורטם ברקמות אנושיות, ודוגמאות עקביות בטיפול ועיבוד נדרש כדי להשיג תוצאות לשחזור. לדוגמה, כאשר נדרש אחסון לטווח ארוך של דגימות לחילוץ חלבון, זה חשוב להבין כי למרות חלבון יציב בדרך כלל ב-80 מעלות צלזיוס, ההבדלים חלבון יציבות בין חלבונים שחולצו ורקמות שלם ב- 80 ° C כבר דווח על10. יתר על כן, כדי לקבל הערכות לשחזור של כמויות חלבון, המגון עקבית של דגימות היא קריטית. אופטימיזציה של מאגרי פירוק שונים ושיטות המגון (למשל, ידני המגון בהשוואה בשיטות אוטומטיות) עשוי להידרש לפני התחלת ניסוי כמותי בקנה מידה גדול.

נורמליזציה אסטרטגיות לתיקון השתנות וטעינה של כימות חלבונים חיוניים כדי להשיג תוצאות חזקות, כמותית של ביטוי חלבון. ניהול משק בית חלבונים כגון β-אקטין, α-טובולין, β-טובולין, גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) מסורתי שימשו לנרמל את רמות החלבון על כימות. עם זאת, נורמליזציה משק מסוים חלבונים למטרות כימות יותר ויותר ביקורת על העבר כמה שנים11,12. לדוגמה, הביטוי של חלבונים משק בית יכול להשתנות על פני שלבים התפתחותיים שונים13,14, מעבר ברקמות של בעלי חיים מאותו4, ותחת שונים המחלה התנאים4,15 16, ,17. לכן, השימוש של חלבונים ספציפיים משק מגביל את האפשרויות של הפיכת מורכבים יותר השוואות בין ביטוי חלבון מ ברקמות שונות, timepoints שונים, תחת משתנה תנאי הניסוי. אלטרנטיבה משק החלבונים כדי לשלוט על חלבון טעינת וריאציה הוא השימוש של כתם חלבון הכולל (TPS) את התוויות, מדמיין כל החלבונים הנוכח במדגם. תוכנית-המיתאר מאפשר נורמליזציה אות המבוסס על עומס חלבון הכולל יותר מאשר רמות של חלבון ספציפי אחד, ולפיכך כימות של תוכנית-המיתאר אות צריך להיות דומים ואף לשחזור ללא תלות במצב ניסיוני, סוג הדגימה או timepoint התפתחותית . דוגמאות חלבון הכולל כתמי צבע מאכל פונסו S העיניינים ג'לים, Coomassie R-350, עברית, Epicocconone, Amydo השחור, Cy5 (שבתוך הפניה למעורר 18). כל השיטות האלה יש יתרונות ספציפיים ומגבלות, שיטת הבחירה תלויה בזמן, כלים זמינים, כמו גם את הגדרת הניסוי4,18.

בנוסף לשימוש תוכנית-מיתאר כדי לתקן בתוך-הממברנה וטעינה של כימות השתנות, ייתכן צורך להשוות בין דגימות בין ממברנות שונות, במיוחד בעת ביצוע ניתוח ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול. עם זאת, השתנות של גורמים כמו הנוגדן מחייב יעילות וסיכום בעוצמה הכתם חלבון יכול להכיר עוד יותר השתנות בין דגימות חלבון זה מנותחים על ג'לים נפרד ממברנות. על כימות חזקים במצב הזה, לכן שצריך להציג צעד נוסף נורמליזציה להביא בחשבון השתנות בין-הממברנה. זו יכולה להיות מושגת על-ידי הכללת תקן הטעינה פנימי בכל אחד הקרומים בנפרד שנותחה נשמר קבוע לאורך ניסויים. תקן זה יכול ללבוש הצורה של כל חלבון lysate זה ניתן להשיג בכמויות מספיקות כדי לשמש מעבר ממברנות כל כלול את הניסוי. כאן, אנו משתמשים lysate של מוח העכבר (המתקבל עכברים פקד בן 5 יום), המוח הוא הומוגני ברצון, החלבון שהושג lysate מכיל כמות משמעותית של חלבון-ריכוז גבוה. טעינת תקן פנימי שהפקידים מאפשר דוגמאות על ממברנות נפרד מנורמל, בהשוואה ישירות.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט פותחו כדי לאפשר לנו לבצע השוואות מורכבות של חלבון ביטוי וריאציה על פני ברקמות שונות, מודלים העכבר (כולל מודלים המחלה), התפתחותיים timepoints19. על ידי שילוב תוכנית-מיתאר פלורסנט עם השימוש טעינת פנימי סטנדרטי, הצלחנו להתגבר על מגבלות הקיימות מספר דוגמאות ומצבים ניסיוני ניתן להשוואה במסגרת ניסוי יחיד. גישה זו מרחיבה את השימוש בטכניקות מסורתיות תספיג, ובכך לאפשר לחוקרים לחקור יותר חלבון הביטוי על פני ברקמות שונות ודוגמאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רקמות עבור הליך זה התקבלו מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה פנימית באוניברסיטת אדינבורו, בוצעו קונקורדנציה עם מוסדיים, תקנות משרד הפנים בבריטניה תחת סמכותו של רלוונטיות אישי פרויקט רשיונות.

הערה: פרוטוקול זה הותאם באמצעות ערכות מתוקננת, זמינים מסחרית, ריאגנטים על מנת להגדיל הפארמצבטית (ראה טבלה של חומרים).

1. הכנת דוגמאות

  1. חלבון החילוץ
    1. העברת snap קפוא בתא או דגימות רקמה מ-80 מעלות צלזיוס על קרח יבש, להפשיר על קרח, ולשטוף כנדרש עם קרח 1 קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) x (לפרטים על רקמות, PBS שוטף, ראה טבלה 1). הימנע מחזורים ההקפאה מיותרים-הפשרה כמו פעולה זו תשפיע על איכות החלבון.
    2. להוסיף radioimmunoprecipitation assay (ריפה) מאגר (25 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 150 מ מ NaCl, 1 NP-40%, 1% נתרן deoxycholate, 0.1% מרחביות) המכיל 1 x מעכב פרוטאז כל דגימה, באמצעות הכמות האופטימלית לכל רקמות משקל (ראה טבלה 1 עבור המלצות).
      הערה: בהתאם ליישום, הסוג והכמות של מאגר המגון עליך בהמשך אופטימיזציה.
    3. השתמש מהמגן חשמליים ידניים כבעלי פוליפרופילן כדי homogenize דגימות רקמה. בין כל דגימה, לשטוף את שהעקב במים מזוקק פעמיים ויבש עם טישו נקי. לשנות את איחדו בין מצבים שונים ניסיוני ורקמות.
    4. להשאיר את הדגימות קרח למשך 10 דקות לאחר המגון. Centrifuge את הדגימות-> 10,000 x g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    5. להעביר את תגובת שיקוע צינור על הקרח מבלי להפריע בגדר. תגובת שיקוע הוא הדוגמה חלבון. חנות החלבון שחולצו ב-80 מעלות צלזיוס או ישירות להמשיך מדידת ריכוז חלבון.
  2. כימות ונורמליזציה של ריכוז חלבון
    1. מודדים את ריכוז חלבון תוך שימוש assay חומצה (BCA) של bicinchoninic. להכין תערובת assay BCA לפי הוראות היצרן בצלחת 96-ובכן אופטי באמצעות µL 200 של BCA לערבב לכל טוב.
      הערה: שיטות כימות אחרות כגון מבחני לאורי, ברדפורד יכול לשמש גם כדי לקבוע ריכוז חלבון כל עוד ריכוז חלבון לכמת באופן עקבי לאורך ניסויים.
    2. להכין שור אלבומין (BSA) סטנדרטים-הגדלת ריכוזים שהפקידים ולהוסיף 1 µL של כל מדגם חלבון ב כפילויות. דגירה לצלחת 96-ובכן בתוך גוש חום טרופה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר אם ריכוז חלבון הוא צפוי להיות נמוך.
    3. לאחר דגירה, למדוד את הספיגה-560 nm שימוש בקורא צלחת.
    4. לייצא את המידות קורא צלחת ולחשב את ריכוז חלבון על-ידי השוואת הערכים ספיגת הממוצע של כל מדגם לעקומה רגיל תוך שימוש בתקן חלבון. ערך R בריבוע עבור העקומה רגיל צריך להיות גדול או שווה ל- 0.98 כדי לאמוד במדויק ריכוז חלבון לדוגמה.
    5. לנרמל את כמות החלבונים על-ידי הכנת דילולים דגימות חלבון לדוגמה מאגר ובמים הנדסה גנטית. יכול להיות מותאם לנפח הכללי בהתאם לסוג של ג'ל בשימוש. טעינת 30 µg של חלבון ליום ליין כסכום התחלתי מומלץ. הוספת סוכן צמצום כגון dithiothreitol (DTT; הריכוז הסופי 5 מ מ) או בטא-mercaptoethanol (ריכוז סופי 200 מ"מ) כל מדגם כנדרש. פיפטה מדולל בטא-mercaptoethanol בשכונה fume.
    6. דגירה בדגימות בתוך גוש חום ב- 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לשים את הדוגמאות על קרח, מערבולת, ספין למטה בקצרה כדי לאסוף. לשמור בקירור עד טעינת הג'ל.

2. של דגימות חלבון בג'ל

  1. המכשיר ואת ג'ל להגדיר
    1. כיוונון הדרגתי Bis-טריס precast 4 – 12% ג'ל (ראה טבלה של חומרים) במערכת ג'ל אלקטרופורזה קאמרית. יש לשטוף את ג'ל באמצעות מים מזוקק פעמיים לפני השימוש.
      הערה: תלוי בגודל, אינטראקציות שפע של החלבון של עניין, ג'לים עם מעבר צבע שונה, אגירה סוכן או מספר וגודל טוב יכול לשמש.
    2. להוסיף 500 מ"ל למען חברה דמוקרטית x MES 1 הפעלת מאגר מדולל במים מזוקק פעמיים לכל טנק. הסר בזהירות את המסרק ג לאחר הוספת המאגר פועל מבלי להפריע הבארות הג'ל הערימה.
  2. חלבון טעינה
    1. לטעון µL 3.5 של חלבון סטנדרטית לתוך הבאר. בהתאם לפריסה לדוגמה, טעינת סולם חלבון משני הצדדים של הג'ל יכול לסייע יותר במדויק הערכת גודל החלבון. השתמש ג'ל שקצהו פיין טוען טיפים לטעינה דגימה מדויקת יותר.
    2. בעת השימוש תקן פנימי עבור נורמליזציה בין-הממברנה (ראה שלב 5 להלן ודיון), טען סכום זה שווה להדגימות אחרים לתוך הבארות הראשון 3 ליד הסולם חלבון.
    3. לטעון µg 30 של כל מדגם בבארות הנותרים. להוסיף 1 x מדגם מאגר כל בארות ריק.
  3. אלקטרופורזה
    1. להרכיב את הטנק ג'ל לאחר טעינת הדגימות. הפעל את הדגימות דרך הג'ל הערימה 80 V 10 דקות ולאחריו 150 V למשך דקות נוספות 45-60.

3. חלבון העברה

הערה: חלבון העברה של פרוטוקול זה מתבצע באמצעות מערכת זמינים מסחרית blotting חצי יבש (ראה טבלה של חומרים) לתוצאות עקבית ומהירה.

  1. להכין את העברת חלבון-השריה נייר סינון במים מזוקק פעמיים ולהבטיח את הסכין ג'ל, פלסטיק פסטר פיפטה, סופג רולר, מלקחיים מוכנים לשימוש.
  2. פתח את המחסנית העברה על-ידי הסרת בקפידה כל נייר עטיפה. הסר העליון מהמחסנית התחתונה והגדר אותה הצידה. במהירות להרטיב את הקרום במחסנית התחתון עם מספר טיפות של אלקטרופורזה הפעלת מאגר (2-3 מ"ל). ברגע הערימה העברה פתוח, חשוב למנוע קרום PVDF ממנו להתייבש.
  3. לאחר שעצרה את אלקטרופורזה, לפתוח את הג'ל טרומי בסכין ג'ל ולנתק את הג'ל הערימה. חותכים את הג'ל בקצוות שלה תשתחרר למשתתפות פלסטיק. להחזיק את הסכין ג'ל רטוב כדי למנוע נזק הג'ל.
  4. להרכיב את המחסנית העברה מלמטה למעלה: בתחתית הערימה (המכיל את הקרום PVDF), חלבון ג'ל, נייר סינון. השתמש את רולר blotting כדי להסיר את כל הבועות אוויר. מקם את המחסנית העליונה על גבי נייר הסינון וגלגלי לערימה שוב כדי להסיר בועות אוויר. אל תדחוף חזק יותר כמו זו עלולה לגרום את הג'ל לעוות במהלך חלבון העברה.
  5. להעביר את כל הערימה לתוך המכשיר העברה עם האלקטרודה על הצד השמאלי של המכשיר, המקום השנורר ג'ל על הערימה, כך שיהיה מיושר עם המגעים החשמליים המתאימים על המכשיר. סגור את המכסה, בחר ולהתחיל את התוכנית המתאימה (20 V עבור 7 דקות הוא נקודת התחלה המומלצת).
  6. בסיום, להשאיר את המכסה סגור למשך 2 דקות לאפשר את המחסנית כדי להתקרר, כדי למנוע הקרום ממנו להתייבש. הסר את המחסנית העברה וחותכים את הקרום לגודל ג'ל. לשטוף את הקרום לחתוך במהירות עם מים מזוקק פעמיים לפני שתמשיך עם הכתם הכולל חלבון.

4. כמות חלבון מכתים

הערה: באמצעות זיהוי פלורסנט מספק יתרון משמעותי על פני הגישות המסורתיות יותר (למשל, זיהוי ECL), כמו טווח ליניארי ורגישות יכול להיות הרבה יותר ונשלט4. לכן, על שלבים 4 ו- 5, תוכנית-מיתאר פלורסנט פלורסנט נוגדנים משניים משמשים (ראה טבלה של חומרים).

  1. לגלגל את הקרום לתוך צינור 50-mL כאשר צד חלבון פונה פנימה. בגלל רגישות לאור של פלורסנט TPS, נוגדנים משניים, כל והשלבים מבוצעים בחושך.
  2. הוסף 5 מ של חלבון הכתם פתרון (ראה טבלה של חומרים) דגירה על גלגלת למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כי תוכנית-המיתאר ומאגר שטיפת מכילים מתנול, לבצע את הפעולות הבאות בחוץ בשכונה fume.
  3. לבטל את הפתרון מכתימים ולשטוף פעמיים במהירות עם mL 5 של שטיפת פתרון (חומצה אצטית 6.3% ב- 30% מתנול). במקום בקצרה את הצינור בחזרה על ה roller בין השלבים לשטוף. יש לשטוף את הקרום בקצרה עם הנדסה גנטית מים לפני שתמשיך.

5. חסימת, דגירה נוגדן וזיהוי

  1. חסימת הקרום: להוסיף 3 מ"ל של מאגר חסימה (ראה טבלה של חומרים) אל הצינור 50 מ ל המכיל את הקרום. דגירה הקרום על גלגלת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בהתאם הבחירה של נוגדנים, הסוג של חסימה מאגר המשמש עשויים לדרוש אופטימיזציה.
  2. נוגדן ראשוני דגירה
    1. ביטול חסימת מאגר ולהחליף עם נוגדן ראשוני ב המתאים, אופטימיזציה ריכוז (איור 1 ו- 2 איור: עכבר-נגד-SMN, ב- 1:1, 000, מדולל במאגר חסימה).
      הערה: אופטימיזציה נאותה של נוגדנים הראשי צריך לכלול אישור כי הנוגדן מזהה מוצר חלבון של הגודל הנכון בזמן מציג אין או איגוד מינימלי למוצרים חלבונים אחרים, לא ספציפי. במידת האפשר, לבדוק ולהשוות מספר נוגדנים נגד החלבון עניין.
    2. דגירה הקרום על גלגלת בן לילה ב 4 º C. למחרת, להסיר את הפתרון נוגדן ולשטוף 6 פעמים במשך חמש דקות עם PBS x 1 על גלגלת בטמפרטורת החדר (RT).
  3. נוגדנים משניים דגירה
    1. להכין נוגדן משני ספציפי ב 1:5,000 נגד המארח של נוגדן ראשוני במאגר חסימה מ. נוגדנים משניים אחרים עשויים לדרוש דילולים אחרים או השימוש במאגרים חסימה חלופי.
    2. דגירה הקרום עם הפתרון נוגדנים משניים על גלגלת עבור h 1-RT. לאחר דגירה, לשטוף את הקרום שלוש פעמים 30 דקות עם 1 x PBS על גלגלת.
    3. לייבש את הקרום ולשמור את הקרום מוגן מפני האור באמצעות נייר אלומיניום עד לזיהוי. ממברנות יכול להישמר ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.
  4. ייבוא תמונות
    1. התחבר למחשב מחובר הסורק. במקום הקרום על הסורק כשהצד חלבון כלפי מטה ובחר את אזור הסריקה התוכנה.
    2. למטב את עוצמת לייזר עבור שניהם (700 nm ו-800 ננומטר) ערוצים, תאשר רוויה לא מתרחשת. לרכוש את התמונות בשני ערוצים ולייצא את התמונות עבור ניתוח נוסף (שלב 6).

6. תספיג ניתוח ו כמת

הערה: ההמלצות מבוססות על התוכנה תמונת סטודיו זמינה בחופשיות. עם זאת, ניתוח דומה ניתן לבצע גם באמצעות חבילות תוכנה אחרות, כגון ImageJ.

  1. ייבוא הקובץ: ליצור סביבת עבודה מקומיים במחשב המשמש לניתוח. זה יוצר מסד נתונים של קבצי תמונה עבור רכשה שהכלים המערבי. ייבוא קבצים שהתקבלו על-גבי הסורק ובחר את התמונה עבור ניתוח.
  2. ניתוח TPS
    1. להציג את הערוץ 700 nm להראות החלבון הכולל צביעת תוצאה. דוגמה של תמונה TPS באיור 1 כלולה אילו רקמות שונות מן neonatal (P5) (איור 1 א'-ב') ו- 10 - בן שבועיים עכברים (איור 1 C-D) מושווים ישירות. באופן דומה, איור 2 מציג דוגמה של השוואה ישירה של רקמת המוח של עכברים בגילאים שונים.
    2. בחר בכרטיסיה ניתוח מתוך הפינה הימנית העליונה שלו ובחר להוסיף מלבן להגדרת האזור של הריבית עבור נרמול (איור 1B, יח). העתק והדבק את האזור המלבן הראשון על גבי כל דגימה בודדת כדי להבטיח האזור המוגדר באותו גודל עבור כל הנתיבים שנותחה.
    3. העתק את התוצאה בכרטיסיה ' צורות ' בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה.
  3. כמת
    הערה: הגישה המיטבית עבור לכימות דגימות תלוי הנבחנים. אנו נספק כאן דוגמה להמחשה של הגילוי של הישרדות מוטור נוירון החלבון (Smn; חלבון מפתח מעורב מחלה התוקפת ניוון שרירי עמוד השדרה20,21), אשר ידוע ירידה לאורך זמן 19 ו איך נורמליזציה של Smn עוצמת אות כדי TPS מספק אמין הערכות של פיתוח ביטוי חלבון.
    1. איור 2 מציג ירידה של Smn ביטוי עם הגיל של החיה עם תוכנית-המיתאר כפרוטאין טעינת פקד. חזור על שלב 6.2.1-6.2.3 לכמת חלבון טעינה (איור 2B). חזור על שלב 6.2.1-6.2.3 הגיעו לתעלה 800 nm (איור 2 א) כדי לנתח את החלבון עניין.
    2. העתק את התוצאות של תוכנית-המיתאר והן חלבון עניין תוכנית גיליון אלקטרוני. על הגיליון, קודם לנרמל את החלבון טעינה על-ידי קביעת האות הגבוה ביותר TPS, חלוקת TPS כל אות ערך לפי ערך זה כדי לקבל את החלבון מנורמל טעינת ערך.
    3. לחלק 800 nm אות הערך של כל דגימה בודדת שלו ערך מנורמל חלבון המתאים כדי לחשב את יחס ביטוי חלבון היחסי בדגימות שונות.
    4. לאחר נירמול הראשון, להשוות בין נקודות זמן או רקמות כדי הערך הממוצע של תקן פנימי כדי לאפשר את ההשוואה הישירה מעבר ממברנות שונים וניסויים שונים.

7. סטטיסטיקה

  1. כדי לקבוע כל הבדלים משמעותיים סטטיסטית בביטוי חלבונים מורכבים וגדולים לקבוצות של דגימות, נדרשת מתודולוגיה סטטיסטית המתאים. למרות דיון מפורט של רקע סטטיסטי הולך מעבר להיקף של העיתון הזה, אנחנו רוצים להאיר את מספר שיקולים, פירוט בגישה מוצלחת לנו להשתמש בעבר19.
  2. לגבי ניסויים רבים, מדידות כימות חלבון אינם מייצגים נתונים באופן עצמאי לחלוטין. הנה, לדוגמה, רקמות מרובים בדרך כלל מתקבלים מחיות יחיד לקביעת רמות החלבון על פני איברים מרובים ניסיוני זמן-לנקודה אחת. לכן, השתמשנו של מודלים מעורבים אפקטים כדי לנתח הבדלים בביטוי חלבונים לאורך זמן, ובין רקמות.  באופן כללי, אפקטים מעורב מודלים מספקים אמצעי יעיל כדי להתמודד עם חוסר עצמאות ובכך למנוע שכפול מדומה22,23. במקרה הנוכחי, אפקטים מעורב מודלים להגביר עוצמה סטטיסטית על ידי הנהלת חשבונות עבור מדידות חוזרות ונשנות בין רקמות, בתוך יחידים. אנו משתמשים חבילת התוכנה הסטטיסטית R כדי לבצע ניתוחים אלה, כמו זה באופן חופשי זמין ופסיביות. עם זאת, חבילות אחרות זמינים מסחרית תוכל לבצע ניתוח דומה.
  3. הנבחנים הנוכחי כרוך בעיצוב "לפצל מגרש" כי כל עכבר שייך לקבוצת גיל אחת בלבד. לכן, אנחנו המודל בודדים עכברים (העכבר ID) כאפקט אקראי עם מזהה ייחודי; אנחנו גם היוו רקמות, גיל ואת האינטראקציה שלהם כמו אפקטים קבועים. המודל שאנחנו נתונים באמצעות lmer את הפונקציה בספריה R, lme4. כצעד בקרת איכות, אנו דמיינו תמלוגים כדי להעריך את ההנחות השונות שווה, בהתפלגות רגילה, הפך את הנתונים במידת הצורך לעמוד בהנחות אלו. כדי לבדוק אינטראקציה משמעותית בין רקמות גיל, אנחנו מתאימים מודל זהה חסרה אינטראקציה זו, לעומת הדגמים באמצעות פרמטרי אתחול (R הפונקציה PBmodcomp בספריה, pbkrtest).  איפה אינטראקציות משמעותית נוספת, השתמשנו את הפונקציה emmeans (בספריה emmeans R) כדי לקבוע את הגורם של האינטראקציה.  לדוגמה, השווינו מתכוון הביטוי בין גיל מחלקות בתוך כל רקמת; אינטראקציה משמעותית שעשויות להתעורר בין גיל לבין רקמת אם אומר, שתי מחלקות גיל נתון שונה משמעותית בשביל לרקמות אחד אבל לא עוד. לסיכום, גישות אלה מספקים דרך להאריך את היציבות של מסקנות תספיג ניסויים על ידי תמיכה סטטיסטי תוצאות אלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נשלב דוגמאות לשימוש של תוכנית-המיתאר של תקן פנימי להקל על השוואות של רמות החלבון על פני רקמות ונקודות זמן. איור 1 מציג תוצאות סופג המערבי על חלבון המופק רקמות המתקבל neonatal (כמחנכת יום 5) לעומת עכברים בוגרים (10 - בן שבועיים). תוכנית-המיתאר Smn immunoblot מוצגים ב- איור 1A, ג. כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית המיתאר הושג על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך תיבת מלבן על כל ליין, ותוצאותיו מוצגות הטבלאות שצוינו באיור 1B ו- 1 D. שימו לב כי דגימות רקמות שונות מאופיינים דפוסים שונים של הלהקה חלבון TPS, ולכן יש צורך להשתמש במסלול כל למטרות נורמליזציה. ואכן, כאשר נתיבים כל מנותחות, עוצמת קרינה פלואורסצנטית נשאר דומה יחסית מדגמים, המציינת את שהמיתאר נורמליזציה מתאים למטרה זו. תקן פנימי המורכב של תערובת lysate של המוח P5 נכללה גם כדי להמחיש כיצד זה יכול לשמש עוד השוואות בין ממברנות שונות. יתר על כן, איור 2, אנו מראים כיצד תוכנית-מיתאר פלורסנט ניתן להשתמש כדי להשוות בין רמות החלבון בנקודות זמן שונות התפתחותית. כאן, אנו מראים רמות Smn המוח lysates מ- neonatal (P5), הגמילה (P20) וגיל מבוגר (10W) עכברים (איור 2 א). למרות רמות Smn בבירור ירידה עם הגיל, כימות TPS נשארת קבועה כמופיע באיור 2B.

Figure 1
איור 1. המערבי לחומה בסה כ מציג תוכנית-המיתאר של Smn רמות החלבון ברקמות העכבר בגילאים שונים שני. חלבון TPS ו- Smn עבור P5 (A) ועכברים 10 בת שבוע (C). (ב, ד) עוצמת קרינה פלואורסצנטית שלם-ליין TPS חושבה ומצוין (ביחידות שרירותית). M: סמן/חלבון תקן; kDa: kilodalton; א א: יחידה שרירותית; P5: יום לאחר הלידה 5; 10W: 10 שבועות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. ניתוח של Smn ביטוי ברקמות העכבר בנקודות זמן שונות התפתחותית- (א) המוח lysates מרקמות המתקבל P5, P20 ועכברים בת שבוע 10 נותחו באמצעות תוכנית-המיתאר (החלונית העליונה) ו- SMN (פאנל התחתונה). (B) עוצמת קרינה פלואורסצנטית המיתאר חושבה ומצוין ביחידות שרירותי. M: סמן/חלבון תקן; kDa: kilodalton; א א: יחידה שרירותית; P5: יום לאחר הלידה 5; P20: יום לאחר הלידה 20; 10W: 10 שבועות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

רקמה משקל * 1xPBS לשטוף (4 ° C) לחזור על השטיפה מאגר homogenizing * *
חוט השדרה 40 מ ג 150 מ 3 x 100 מ
שריר (GC) 20 מ ג 150 מ 3 x 100 מ
המוח 240 מ ג 400 מ 4 x 400 מ
הלב 60 מ ג 400 מ 4 x 200 מ
הכבד 130 מ ג 400 מ 4 x 400 מ
כליה 45 מ ג 400 מ 4 x 200 מ
* המשקולות אלה הם ערכים מעיד בשביל לרקמות המתקבל P8 עכברים.
* * אמצעי אחסון אלה אינדיקציות, יכול להיות מותאם יותר לפי המשקל של הרקמה.

טבלה 1. סקירה של רקמות הצפוי משקולות, המלצות המתאימות PBS שוטף ונפח מאגר פירוק שישמש עבור המגון. המשקלים הם אינדיקציות בשביל לרקמות המתקבל לאחר הלידה יום 8 (P8) עכברים. וניתן לשנותם PBS ומסוג מאגר פירוק למעלה או למטה בהתאם לצרכים ניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם עיצוב ניסיוני המתאים, אמצעי בקרה ניתוח סטטיסטי, סופג המערבי יכול לשמש כדי לבצע הערכות כמותיות אמין של ביטוי חלבונים בתוך ובין מבחר מגוון של דגימות ביולוגיות. פרוטוקול שנתאר בכתב היד הנוכחי נועד לשמש קו מנחה עבור חוקרים המעוניינים להשתמש המערבי סופג לבצע ניתוח כמותי גדול יותר ומורכב יותר קבוצות של דגימות, באמצעות שילוב של מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית שיטות איתור, חלבון הכולל העמסה נורמליזציה ותקני פנימי. למרות במוקד הדיון כאן הוא על קביעת והשוואה ביטוי חלבון מן הרקמות העכבר שונים בגילאים שונים, ניתן להרחיב בגישה זו גם להשוות בין חלבון ביטוי בתנאים אחרים ניסיוני.

צעד מרכזי בפרוטוקול הנוכחי שלנו הוא נירמול של חלבונים לעניין חלבון הכולל על-ידי לכימות כתם חלבון פלואורסצנטי הכולל. תוכנית-המיתאר נורמליזציה מתקנת עבור וריאציה, לדוגמה טוען ושולי שגיאה בשיטות כימות חלבון. עם זאת, כי מספר דגימות חלבון זה יכול להיות מנותח על קרום יחיד הוא מוגבל, נוסף נורמליזציה עשוי להידרש להשוואה בין ממברנות מרובים. אכן, השתנות בין כמה חלבונים מזוהים על ממברנות שונות (עקב למשל נוגדן הדגירה זמן וטמפרטורה וריאציה) עלול לגרום וריאציה מעבר לכך הציג את הצעדים וטעינה של כימות של הפרוטוקול. כאן, אנו משתמשים תקן פנימי המורכב שילוב lysate חלבון יחיד זה נטען דולר על כל ג'ל ומאפשר השוואה ונורמליזציה בין ג'לים/ממברנות. באופן תיאורטי, זו יכולה להיות דוגמה חלבון, כל עוד זה יכול להתבצע בכמויות מספיקות כך באותה דגימת זרע יכול לשמש עבור כל הניסויים. בניסויים שלנו, אנחנו משתמשים בתערובת של המוח חלבון lysates, המוח homogenates מכילים כמויות גדולות של חלבונים, מתקבלים בדרך כלל על ריכוז גבוה. ממוצע של כימות של תקן triplicate עליו נוספת להגביר את הדיוק של quantifications על פני ריריות, לתרום הפארמצבטית של הניסוי.

רמות החלבון יכול להיקבע על ידי מספר טכניקות שונות, השיטה המועדפת תלוי בסוג מדגם שעוברים ניתוח ואת המטרה של הניסוי. כימות לשחזור של ווסטרן כתם עובד בצורה הטובה ביותר במצבים בו תנאי הניסוי ניתן ומבוקרות היטב, כגון כאשר באמצעות העכבר או אחרים מודלים חייתיים של רקע גנטי מוגדר. לעומת זאת, ניסויים רבים באמצעות דגימות חולה אנוש, זה עשוי להיות פחות ריאלי כמו גיל, השתנות גנטי, זמני דגימה רקמה הם הרבה יותר קשה לשלוט יותר במערכות במודל (חיה). טכניקות מבוססות על צלחת כגון אליסה עשוי להיות מתאים יותר ניתוחים אלה, למרות האימות זהיר היחודיות נוגדן הוא קריטי. לדוגמה, בשביר X תסמונת מחקר, נוגדנים הוכחו לזהות איזופורמים שונים, כאשר נעשה שימוש ב- ELISA זה יוביל מופרזת של הסכום הכולל של חלבון כמו אליסה קובע סיגנל איזופורמים כל בשילוב24. אפשרויות האופטימלי עבור שיטות לקבוע ביטוי חלבון ולכן בהתאם להקשר, לטעום סוג ואת שאלת המחקר זה נחקר.

ביצוע ניתוחים סטטיסטיים נאותה היא תנאי הכרחי באמינות מסקנות להסיק כימות של נתונים ביולוגיים. מבחינה סטטיסטית ניתוח נתונים מורכבים כפי שנוצר על-ידי השוואת ברקמות שונות, נקודות זמן או צירופם ותנאים ניסיוני אחרים עשויים לדרוש יותר מתקדם דגמי סטטיסטי ANOVA עם פוסט-הוק הבדיקות יכול לספק. עבור דגמי סטטיסטיים מורכבים יותר, כגון ההשפעות מעורב מודל הגישה, נתאר בכתב היד הנוכחי, זה יכול להיות מומלץ לחפש עוד יותר לייעץ מן biostatisticians. ניתוח סטטיסטי נאותה של חלבון בקנה מידה גדול ביטוי ניתן לשפר במידה רבה את היציבות של התוצאות ואמינות, הפארמצבטית של תוצאות.

לסיכום, הגישה ניסיוני שנתאר כאן מספק שיטה לשחזור ועמיד עבור חוקרים המבקשים לקבוע ביטוי חלבון באמצעות תספיג בדגימות מורכבים מאפשר לענות על שאלות מחקר חדש ומלהיב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.

Acknowledgments

E.J.N.G. נתמך על ידי טרסט (גרנט 106098/ת/14/Z). מימון אחרות סופק על ידי הקרן SMA (SMA בבריטניה קונסורציום; T.H.G. & Y-טי ח'), אירופה SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), ה-DTP אוניברסיטת אדינבורו ברפואה דיוק (T.H.G., שראשי & A.M.M.), ומרכז Euan מקדונלד לחקר מחלת עצבי התנועה המוטורית (T.H.G).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
  2. Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
  3. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
  5. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  6. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  7. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
  8. Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
  9. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  10. Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
  11. Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
  12. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  13. Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
  14. Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
  15. Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
  16. Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
  17. Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
  18. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
  19. Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
  20. Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
  21. Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
  22. Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
  23. Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
  24. LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 146 ווסטרן סופג אנליזת חלבונים זריחה פיתוח רקמות כל ניתוח לביולוגיה כמותית טעינת פקד
השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Y. T., van der Hoorn, D.,… More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter