Summary
Questo metodo viene descritto un approccio affidabile e riproducibile per il confronto dei livelli della proteina in tessuti differenti e timepoints inerente allo sviluppo diversi utilizzando un approccio macchiante occidentale quantitativo standardizzato.
Abstract
Macchiarsi occidentale è una tecnica comunemente utilizzata per rilevare e quantificare l'espressione della proteina. Nel corso degli anni, questa tecnica ha portato a molti progressi nella ricerca clinica e di base. Tuttavia, come con molte tecniche sperimentali simili, l'esito delle analisi Western blot è facilmente influenzato dalla scelte operate nella progettazione e nell'esecuzione dell'esperimento. Proteine specifiche delle pulizie sono stati tradizionalmente usati per normalizzare i livelli di proteina per la quantificazione, tuttavia, questi hanno una serie di limitazioni e di conseguenza sono stati criticati sempre più negli ultimi anni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che abbiamo sviluppato ci permettono di intraprendere confronti complessi della variazione di espressione di proteine in tessuti differenti, modelli murini (inclusi modelli di malattia) e punti temporali inerente allo sviluppo. Usando una macchia fluorescente della proteina totale e introducendo l'uso di un carico interno standard, è possibile superare le attuali limitazioni del numero di campioni che possono essere paragonati all'interno di esperimenti e confrontare sistematicamente i livelli della proteina attraverso un gamma di condizioni sperimentali. Questo approccio consente di espandere l'uso di tecniche tradizionali occidentali della macchia, consentendo ai ricercatori di esplorare meglio l'espressione della proteina attraverso campioni e tessuti differenti.
Introduction
Macchiarsi occidentale è una tecnica comunemente utilizzata per rilevare e quantificare l'espressione della proteina, compreso in omogenati o estratti. Nel corso degli anni, questa tecnica ha portato a molti progressi nella ricerca clinica e di base, dove può essere utilizzato come strumento diagnostico per identificare la presenza di malattia1,2. Macchiarsi occidentale in primo luogo è stato descritto nel 1979 come un metodo per trasferire proteine dal gel di poliacrilammide ai fogli di nitrocellulosa e successivamente visualizzare proteine usando anticorpi secondari che sono stati etichettati radioattivo o coniugati con fluoresceina o perossidasi3. Attraverso lo sviluppo di kit commercialmente disponibili e attrezzature, metodi macchiantesi occidentali sono stati sempre più standardizzati e semplificati nel corso degli anni. Infatti, la tecnica viene eseguita prontamente dagli scienziati con diversi sfondi e livelli di esperienza. Tuttavia, come con molte tecniche sperimentali simili, l'esito delle analisi Western blot è facilmente influenzato dalla scelte operate nella progettazione e nell'esecuzione dell'esperimento. È importante, pertanto, che l'accessibilità dei metodi standardizzati di macchiantesi occidentali non oscurare la necessità di un'attenta pianificazione sperimentale e il design. Considerazioni sperimentali includono, ma non sono limitata a, campione di preparazione e movimentazione, selezione e convalida degli anticorpi per la rilevazione di proteine ed efficienza del trasferimento di gel alla membrana di particolarmente piccole o grandi (< 10 o > 140 kDa) proteine4,5,6,7,8,9. Qualità delle proteine del campione originale svolge un ruolo significativo nel determinare l'esito dell'analisi Western blot successivi. Come la proteina può essere estratta da una vasta gamma di campioni e fonti, tra cui linee cellulari, tessuti dai modelli animali e tessuti umani post mortem, coerenza nel trattamento e l'elaborazione è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ad esempio, quando a lungo termine conservazione dei campioni per l'estrazione proteica è necessaria, è importante rendersi conto che, anche se la proteina è generalmente stabile a-80 ° C, sono state differenze nella stabilità proteica proteine estratte e tessuti intatti a-80 ° C riferito10. Inoltre, per ottenere preventivi riproducibile di quantità di proteina, coerente omogeneizzazione dei campioni è fondamentale. Ottimizzazione del buffer di lisi diverse e metodi di omogeneizzazione (ad es., manuale omogeneizzazione rispetto ai metodi automatizzati) può essere richiesto prima di iniziare un esperimento su larga scala quantitativo.
Strategie di normalizzazione per correggere la variabilità di caricamento e quantificazione di proteine sono essenziali per ottenere risultati quantitativi, robusti dell'espressione della proteina. Servizio pulizie proteine come β-actina, α-tubulina e β-tubulina gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati tradizionalmente utilizzati per normalizzare i livelli di proteina per la quantificazione. Tuttavia, normalizzazione alle proteine di pulizia specifico per scopi di quantificazione è stato sempre più criticato negli ultimi pochi anni11,12. Ad esempio, l'espressione di proteine le pulizie può cambiare nei diversi stadi di sviluppo13,14, attraverso i tessuti da stesso animale4e sotto varie malattia condizioni4,15 ,16,17. Pertanto, l'uso di proteine specifiche delle pulizie limita le possibilità di fare confronti più complessi tra l'espressione della proteina dai tessuti differenti, timepoints diversi e in diverse condizioni sperimentali. Un'alternativa alle proteine di pulizia al controllo per proteina variazione di carico è l'uso di una macchia di proteine totali (TPS) che le etichette e Visualizza tutte le proteine presenti in un campione. TPS permette la normalizzazione del segnale basato su carico proteico totale, piuttosto che i livelli di una proteina specifica e pertanto la quantificazione del segnale TPS dovrebbero essere comparabili e riproducibile indipendentemente dalla condizione sperimentale, tipo di campione o timepoint inerente allo sviluppo . Sono esempi di proteine totali macchie Ponceau S, gel senza macchia, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black e Cy5 (rivisto in rif. 18). Ciascuno di questi metodi presenta specifici vantaggi e limitazioni e selezione del metodo dipende il tempo e gli strumenti disponibili, nonché la messa a punto sperimentale4,18.
Oltre a utilizzare un TPS per correggere per il carico all'interno della membrana e variabilità di quantificazione, può essere necessario confrontare campioni tra diverse membrane, in particolare quando si eseguono analisi di espressione di proteine su larga scala. Tuttavia, variabilità in fattori come anticorpo associazione efficienza e totale intensità di colorazione di proteina possono introdurre ulteriori variabilità tra i campioni della proteina che sono analizzati su gel separati e membrane. Per quantificazione solida in questa situazione, è pertanto necessario introdurre un ulteriore passo di normalizzazione per rappresentare la variabilità tra membrana. Ciò può essere ottenuto includendo uno standard interno carico su ciascuna delle membrane separatamente analizzate che viene mantenuta costante attraverso esperimenti. Questo standard può assumere la forma di qualsiasi proteina lisata che possono essere ottenuti in quantità sufficienti per essere utilizzati in tutte le membrane incluse nell'esperimento. Qui, usiamo un lisato di cervello di topo (ottenuto da topi di controllo 5 giorno vecchio), come cervello prontamente è omogeneizzato e il lisato proteico ottenuta contiene una notevole quantità di proteina ad un'alta concentrazione. Caricamento di uno standard interno in triplice copia permette campioni su membrane separate essere normalizzato e confrontato direttamente.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che abbiamo sviluppato ci permettono di intraprendere confronti complessi della variazione di espressione di proteine in tessuti differenti, modelli murini (inclusi modelli di malattia) e punti temporali dello sviluppo19. Combinando un TPS fluorescente con l'utilizzo di un carico interno standard, siamo stati in grado di superare i limiti esistenti il numero di campioni e condizioni sperimentali che possono essere paragonate all'interno di un singolo esperimento. Questo approccio consente di espandere l'uso di tecniche tradizionali Western blot, consentendo ai ricercatori di esplorare meglio l'espressione della proteina attraverso campioni e tessuti differenti.
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Protocol
Tessuti per questa procedura sono stati ottenuti dagli studi sugli animali che sono stati approvati dal comitato etico interno all'Università di Edimburgo e sono stati eseguiti in concordanza con istituzionali e normative UK Home Office sotto l'autorità dei pertinenti personali e licenze di progetto.
Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando standardizzati, disponibili in commercio kit e reagenti per incrementare la riproducibilità (Vedi Tabella materiali).
1. preparazione dei campioni
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Estrazione della proteina
- Trasferimento snap-congelato cella o campioni di tessuto da-80 ° C il ghiaccio secco, scongelare su ghiaccio e lavare come richiesto con ghiaccio freddo 1 x tampone fosfato salino (PBS) (per informazioni dettagliate sui tessuti e lavaggi di PBS, Vedi tabella 1). Evitare cicli di gelo-disgelo inutili come questo influenzerà la qualità proteica.
- Aggiungere tampone del saggio (RIPA) radioimmunoprecipitation (25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato, 0,1% SDS) contenente l'inibitore della proteasi per ogni campione, utilizzando la quantità ottimale al peso del tessuto: 1x (Vedi tabella 1 per consigli).
Nota: A seconda dell'applicazione, il tipo e la quantità di omogeneizzazione buffer potrebbe essere necessario ulteriore ottimizzazione. - Utilizzare un omogeneizzatore elettrico tenuto in mano con un pestello in polipropilene per omogeneizzare campioni di tessuto. Tra ogni campione, lavare il pestello in acqua bidistillata e asciugare con un panno pulito. Cambiare il pestello tra diverse condizioni sperimentali e tessuti.
- Lasciare i campioni in ghiaccio per 10 min dopo omogeneizzazione. Centrifugare i campioni a > 10.000 x g a 4 ° C per 10 min.
- Trasferire il surnatante in una provetta di nuova sul ghiaccio senza disturbare il pellet. Il supernatante è il campione della proteina. Memorizzare la proteina estratta a-80 ° C oppure procedere direttamente per misurare la concentrazione di proteina.
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Quantificazione e normalizzazione di concentrazione nella proteina
- Misurare la concentrazione di proteina usando un'analisi di acido (BCA) bicinconinico. Preparare una miscela di dosaggio BCA secondo le istruzioni del produttore in una piastra 96 pozzetti ottica utilizzando 200 µ l di miscela BCA per pozzetto.
Nota: Altri metodi di quantificazione come analisi di Lowry e Bradford possono anche essere utilizzati per determinare la concentrazione di proteina, purché la concentrazione nella proteina è quantificata in modo coerente attraverso esperimenti. - Preparare l'albumina di siero bovino (BSA) gli standard all'aumento della concentrazione in triplice copia e aggiungere 1 µ l di ciascun campione di proteina in duplice copia. Incubare la piastra a 96 pozzetti in un blocco di calore preriscaldato a 60 ° C per 10 minuti o più a lungo se la concentrazione nella proteina è dovrebbe essere basso.
- Dopo l'incubazione, misurare l'assorbimento a 560 nm utilizzando un lettore di piastra.
- Esportare le misurazioni di lettore di piastra e calcolare la concentrazione di proteina confrontando i valori di assorbanza media di ciascun campione di una curva standard ottenuta utilizzando lo standard di proteina. Il valore R al quadrato per la curva standard deve essere maggiore o uguale a 0,98 per stimare con precisione la concentrazione di proteine del campione.
- Normalizzare la quantità di proteine da preparare diluizioni dei campioni di proteina nel tampone del campione e acqua ultrapura. Il volume totale può essere regolato a seconda del tipo di gel utilizzato. 30 µ g di proteina per corsia come un importo iniziale di caricamento è raccomandato. Aggiungere riducente ad esempio ditiotreitolo (DTT; concentrazione finale 5 mM) o beta-mercaptoetanolo (concentrazione finale 200 mM) per ogni campione come richiesto. Pipettare beta-mercaptoetanolo non diluito in una cappa aspirante.
- Incubare i campioni in un blocco di calore a 70 ° C per 10 min. mettere i campioni su ghiaccio, vortex e centrifugare brevemente per raccogliere. Tenere il ghiaccio fino al caricamento del gel.
- Misurare la concentrazione di proteina usando un'analisi di acido (BCA) bicinconinico. Preparare una miscela di dosaggio BCA secondo le istruzioni del produttore in una piastra 96 pozzetti ottica utilizzando 200 µ l di miscela BCA per pozzetto.
2. elettroforesi di campioni proteici
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Dispositivo e gel istituito
- Installazione di un gradiente di Bis-Tris di prefabbricati 4 – 12% gel (Vedi Tabella materiali) nel sistema camerale gel elettroforesi. Risciacquare il gel utilizzando acqua bidistillata prima dell'uso.
Nota: A seconda della dimensione, interazioni e abbondanza della proteina di interesse, gel con una sfumatura diversa, buffering agente o ben dimensioni e il numero può essere utilizzato. - Aggiungere 500 mL di 1 x MES SDS, diluito in acqua bidistillata per serbatoio tampone di corsa. Rimuovere delicatamente il pettine dal gel dopo aver aggiunto il buffer in esecuzione senza disturbare i pozzi in gel d'impilamento.
- Installazione di un gradiente di Bis-Tris di prefabbricati 4 – 12% gel (Vedi Tabella materiali) nel sistema camerale gel elettroforesi. Risciacquare il gel utilizzando acqua bidistillata prima dell'uso.
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Caricamento di proteina
- Caricare 3,5 µ l di una proteina standard nel pozzo. A seconda del layout di esempio, una scala di proteine su entrambi i lati del gel di caricamento può aiutare nella più accurata stima della proteina dimensioni. Utilizzare suggerimenti per caricamento del campione più accurato di caricamento del gel punta fine.
- Quando si utilizza uno standard interno per la normalizzazione tra membrana (vedi passaggio 5 qui sotto e discussione), caricare un importo che è uguale agli altri esempi nei primi 3 pozzetti accanto alla scala di proteine.
- Carico 30 µ g di ogni campione in pozzetti rimanenti. Aggiungere 1 x campione tampone ai pozzetti vuoti.
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Elettroforesi
- Assemblare il carro armato del gel dopo aver caricato i campioni. Eseguire gli esempi attraverso il gel d'impilamento a 80 V per 10 min seguita da 150 V per altri 45-60 min.
3. trasferimento proteina
Nota: Trasferimento di proteine in questo protocollo viene eseguita utilizzando un sistema macchiante semi-secco commercialmente disponibile (Vedi Tabella materiali) per i risultati veloci e costanti.
- Preparare il trasferimento di proteine pre-ammollo carta da filtro in acqua bidistillata e garantendo il coltello di gel, plastica pipetta Pasteur, rullo macchiante e forcipe sono pronto all'uso.
- Aprire lo stack di trasferimento rimuovendo accuratamente tutti i foglio di avvolgimento. Rimuovere la parte superiore dallo stack inferiore e metterlo da parte. Inumidire velocemente la membrana sullo stack inferiore con alcune gocce di elettroforesi (2-3 mL) di tampone di corsa. Una volta aperto lo stack di trasferimento, è importante impedire la membrana PVDF asciugarsi.
- Dopo l'arresto l'elettroforesi, aprire il gel pre-cast utilizzando il coltello di gel e tagliato fuori il gel d'impilamento. Tagliare il gel lungo i margini per liberarlo dal calco in plastica. Tenere il coltello di gel bagnato per evitare danni al gel.
- Montare lo stack di trasferimento dal basso verso l'alto: bottom pila (contenente la membrana PVDF), gel di proteina, carta da filtro. Usare la manopola macchiante per eliminare tutte le bolle d'aria. Inserire la pila superiore sopra la carta da filtro e rotolare lo stack di nuovo per rimuovere le bolle d'aria. Non spingere troppo fortemente, poiché ciò può causare il gel deformare durante la proteina di trasferimento.
- Trasferire l'intero stack nel dispositivo di travaso con l'elettrodo sul lato sinistro del dispositivo e posizionare la spugna di gel all'inizio dello stack in modo che sia allineato con i corrispondenti contatti elettrici sul dispositivo. Chiudere il coperchio, selezionare e avviare il programma appropriato (20 V per 7 min è un punto di partenza consigliato).
- Al termine, lasciare il coperchio chiuso per 2 min consentire lo stack per rinfrescarsi e per impedire la membrana dall'asciugarsi. Rimuovere la risma di trasferimento e tagliate la membrana per la dimensione di gel. Lavare la membrana tagliata rapidamente con acqua bidistillata prima di continuare con la macchia di proteine totali.
4. macchiatura della proteina totale
Nota: Utilizzando la rilevazione fluorescente fornisce un beneficio sostanziale negli approcci più tradizionali (ad es., rilevamento di ECL), come l'intervallo lineare e la sensibilità può essere molto meglio controllati4. Pertanto, in passaggi 4 e 5, un TPS fluorescente e fluorescenti anticorpi secondari sono utilizzati (Vedi Tabella materiali).
- Rotoli la membrana in una provetta da 50 mL con il lato di proteina verso l'interno. A causa della sensibilità alla luce del TPS fluorescente e anticorpi secondari, tutti i passaggi successivi sono effettuati al buio.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di macchia proteica (Vedi Tabella materiali) e incubare su un rullo per 5 min a temperatura ambiente. Perché TPS e tampone di lavaggio contiene metanolo, svolgere questi passaggi in una cappa aspirante.
- Scartare la soluzione colorante e lavare due volte velocemente con i 5 mL di soluzione di lavaggio (6,3% acido acetico in 30% metanolo). Posizionare il tubo brevemente indietro sul rullo tra fasi di lavaggio. Risciacquare la membrana brevemente con acqua ultrapura prima di continuare.
5. blocco, incubazione dell'anticorpo e rilevamento
- Bloccando la membrana: aggiungere 3 mL di tampone bloccante (Vedi Tabella materiali) per il tubo da 50 mL contenente la membrana. Incubare la membrana su un rullo per 30 min a temperatura ambiente. A seconda della scelta dell'anticorpo, il tipo di tampone bloccante utilizzato può richiedere ottimizzazione.
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Incubazione dell'anticorpo primario
- Scartare il blocco buffer e sostituire con l'anticorpo primario presso l'appropriato, ottimizzato concentrazione (Figura 1 e Figura 2: mouse-anti-SMN, 1:1, 000, diluito in tampone bloccante).
Nota: Ottimizzazione adeguata di anticorpi primari dovrebbe includere conferma che l'anticorpo rileva un prodotto proteico della giusta dimensione, mentre risultati nessuna o minima associazione ai prodotti di altri, non specifico della proteina. Se possibile, provare e confrontare più anticorpi contro la proteina di interesse. - Incubare la membrana su un rullo durante la notte a 4 ° C. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpo e lavare 6 volte per 5 min con 1x PBS su un rullo a temperatura ambiente (TA).
- Scartare il blocco buffer e sostituire con l'anticorpo primario presso l'appropriato, ottimizzato concentrazione (Figura 1 e Figura 2: mouse-anti-SMN, 1:1, 000, diluito in tampone bloccante).
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Incubazione dell'anticorpo secondario
- Preparare l'anticorpo secondario specifico a 1:5,000 contro l'ospite dell'anticorpo primario in 5 mL di tampone bloccante. Altri anticorpi secondari possono richiedere altre diluizioni o l'uso di buffer blocco alternativo.
- Incubare la membrana con la soluzione di anticorpo secondario su un rullo per 1 h a TA. Dopo l'incubazione, lavare la membrana tre volte 30 min con 1x PBS su un rullo.
- Asciugare la membrana e mantenere la membrana al riparo dalla luce utilizzando il foglio di alluminio fino al rilevamento. Membrane possono essere conservate a 4 ° C per conservazione a lungo termine.
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Acquisizione di immagini
- Login al computer collegato allo scanner. Posizionare la membrana dello scanner con il lato di proteina rivolto verso il basso e selezionare l'area di scansione nel software.
- Ottimizzare l'intensità del laser per entrambi (700 nm e 800 nm) canali, confermando si verifica nessuna saturazione. Acquisire le immagini in entrambi i canali ed esportare le immagini per ulteriori analisi (passaggio 6).
6. Western blot analisi e quantificazione
Nota: Queste raccomandazioni sono basate sul software Image Studio liberamente disponibile. Tuttavia, analisi paragonabile possono essere effettuate anche utilizzando altri pacchetti software, ad esempio ImageJ.
- Il file di importazione: creare un'area di lavoro locale sul computer utilizzato per l'analisi. Questo genera un database di file di immagine per le macchie occidentali acquisiti. Importare file ottenuti sullo scanner e selezionare l'immagine per l'analisi.
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Analisi TPS
- Visualizzare il canale 700 nm per mostrare la proteina totale risultato di colorazione. Un esempio di un'immagine TPS è incluso nella Figura 1 in cui tessuti differenti da neonatale (P5) (Figura 1A-B) e 10 - settimana-vecchi topi (Figura 1 C-D) vengono confrontati direttamente. Allo stesso modo, la Figura 2 Mostra un esempio di un confronto diretto del tessuto cerebrale da topi di età diverse.
- Selezionare la scheda analisi dall'angolo superiore destro e selezionare Aggiungi rettangolo per definire l'area di interesse per la normalizzazione (Figura 1B, D). Copiare e incollare la prima area del rettangolo su ogni singolo campione affinché che la regione definita è la stessa dimensione per tutte le corsie analizzate.
- Copiare il risultato dalla scheda forme in basso a sinistra del software.
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Quantificazione
Nota: L'approccio ottimale per quantificare i campioni dipende dal disegno sperimentale. Qui forniamo un esempio illustrativo della rilevazione della proteina survival motor neuron (Smn; una proteina chiave coinvolti nella malattia neuromuscolare atrofia muscolare spinale20,21), che è noto per diminuire nel tempo 19 e come normalizzazione dell'intensità del segnale Smn a TPS fornisce stime affidabili della sviluppo di espressione della proteina.- La figura 2 Mostra una diminuzione dell'espressione di Smn con aumento dell'età dell'animale con TPS come proteina di controllo di carico. Ripetere il passaggio 6.2.1-6.2.3 per quantificare proteina caricamento (Figura 2B). Ripetere il passaggio 6.2.1-6.2.3 nel canale 800 nm (Figura 2A) per analizzare la proteina di interesse.
- Copiare i risultati da TPS e la proteina di interesse in un foglio di calcolo. Nel foglio di calcolo, in primo luogo normalizzare la proteina caricamento determinando il più alto segnale TPS e dividendo ogni TPS segnale dal valore per ottenere la proteina normalizzata valore di carico.
- Dividere il valore del segnale nm 800 da ogni singolo campione di valore normalizzato della proteina corrispondente per calcolare il rapporto di espressione della proteina relativa a diversi campioni.
- Dopo la prima normalizzazione, confronta i vari intervalli di tempo o tessuti per il valore medio dello standard interno per consentire confronti diretti tra esperimenti e diverse membrane.
7. statistiche
- Per determinare eventuali differenze statisticamente significative nell'espressione della proteina attraverso complesse e grandi gruppi di campioni, metodologia statistica adeguata è necessaria. Anche se una trattazione dettagliata di sfondo statistica va oltre la portata di questa carta, vogliamo evidenziare alcune considerazioni e un approccio di successo che abbiamo usato in precedenza19in dettaglio.
- Per quanto riguarda molti esperimenti, misurazioni di quantificazione della proteina non rappresentano dati completamente indipendenti. Qui, ad esempio, tessuti multipli vengono in genere ottenuti dai singoli animali per determinare i livelli della proteina attraverso gli organi multipli in un singolo punto di tempo sperimentale. Di conseguenza, abbiamo usato un modelli misti effetti per analizzare le differenze nell'espressione della proteina nel corso del tempo e tra i tessuti. In generale, modelli misti effetti costituiscono un mezzo efficace per trattare con non-indipendenza e quindi evitare di pseudo-replica22,23. Nel caso di specie, modelli misti effetti aumentano potenza statistica di contabilità per misurazioni ripetute tra tessuti, all'interno di individui. Usiamo il pacchetto software statistico R per eseguire queste analisi, come questo è liberamente disponibile e versatile. Tuttavia, altri pacchetti disponibili in commercio possono essere in grado di eseguire analisi simili.
- L'attuale disegno sperimentale prevede una progettazione "split plot" perché ogni mouse apparteneva a un solo gruppo di età. Di conseguenza, abbiamo modellato individuali topi (mouse ID) come effetto casuale con un identificatore univoco; Abbiamo anche rappresentato per tessuto, età e della loro interazione come effetti fissi. Abbiamo modellato i dati utilizzando la funzione lmer nella libreria R, lme4. Come un passaggio di controllo di qualità, abbiamo visualizzato residui per valutare l'ipotesi di uguale varianza e una distribuzione normale e trasformato i dati dove necessario soddisfare queste ipotesi. Per testare un'interazione significativa fra tessuto ed età, allestiamo un modello identico che mancavano di questa interazione e confrontato i modelli utilizzando parametrico di avvio automatico (funzione R PBmodcomp nella libreria, pbkrtest). Dove ha presentato interazioni significative, abbiamo usato la funzione emmeans (nella libreria emmeans R) per determinare la causa dell'interazione. Ad esempio, abbiamo confrontato l'espressione media tra classi di età all'interno di ogni tessuto; un'interazione significativa può sorgere tra età e tessuto se, diciamo, due classi di età determinato differivano significativamente per un tessuto, ma non un altro. In sintesi, questi approcci forniscono un modo per estendere la robustezza delle conclusioni da esperimenti di western blot, fornendo supporto statistico per questi risultati.
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Representative Results
Ci sono esempi dell'uso di TPS e uno standard interno per facilitare i confronti dei livelli della proteina attraverso tessuti e intervalli di tempo. Figura 1 Mostra i risultati da Western blotting su proteine estratte da tessuti ottenuti da neonatale (postnatale giorno 5) rispetto ai topi adulti (10 - settimana vecchi). TPS e immunoblot Smn sono mostrati in Figura 1A, C. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza del TPS è stata realizzata misurando l'intensità della fluorescenza all'interno della scatola di rettangolo su ogni corsia e i risultati sono riportati nelle tabelle in Figura 1B e 1D. Si noti che campioni da diversi tessuti sono caratterizzati da differenti modelli di fascia della proteina TPS e pertanto è necessario utilizzare la corsia tutta per scopi di normalizzazione. Infatti, quando tutta corsie sono analizzate, l'intensità di fluorescenza rimane relativamente simile attraverso campioni, che indica che TPS per la normalizzazione è adatto allo scopo. Standard interno costituito da una miscela di lisato cervello P5 è stato anche incluso per illustrare come può essere utilizzato per ulteriori confronti tra diverse membrane. Inoltre, in Figura 2, indichiamo come un TPS fluorescente può essere utilizzato per confrontare i livelli della proteina in diversi momenti dello sviluppo. Qui, ci mostrano livelli di Smn nei lisati di cervello da neonatale (P5), svezzamento età (P20) e topi di adulto (10W) (Figura 2A). Anche se i livelli di Smn chiaramente diminuiscono con l'età, la quantificazione di TPS rimane costante come illustrato nella Figura 2B.
Figura 1. Macchie occidentali visualizzando TPS e Smn livelli della proteina in tessuti di topo in due epoche differenti. TPS e Smn proteina per P5 (A) e topi (C) di 10 settimane. (B, D) L'intensità della fluorescenza di TPS tutta la corsia è stato calcolato ed è indicato (in unità arbitrarie). M: / proteina marker standard; kDa: kilodalton; a.u.: unità arbitrarie; P5: postnatale giorno 5; 10W: 10 settimane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi dell'espressione di Smn nei tessuti di topo in diversi momenti dello sviluppo. (A) cervello lisati dal tessuto ottenuto da P5, P20 e 10 settimana-vecchi topi è stato analizzato utilizzando TPS (pannello superiore) e SMN (pannello inferiore). (B) l'intensità di fluorescenza del TPS è stato calcolato ed è indicata in unità arbitrarie. M: / proteina marker standard; kDa: kilodalton; a.u.: unità arbitrarie; P5: postnatale giorno 5; P20: postnatale giorno 20; 10W: 10 settimane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| fazzoletto | Peso circa * | 1xPBS lavare (4 ° C) | Ripetere il lavaggio | Buffer di omogeneizzazione * * |
| Midollo spinale | 40 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Muscolare (GC) | 20 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Cervello | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Cuore | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| Fegato | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Rene | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * Questi pesi sono valori indicativi per il tessuto ottenuto dai topi P8. | ||||
| * * Questi volumi sono indicazioni e possono essere ulteriormente registrati secondo il peso del tessuto. | ||||
Tabella 1. Panoramica di tessuti previsto pesi e corrispondenti raccomandazioni per lavaggi di PBS e volume di tampone di lisi per essere utilizzato per omogeneizzazione. I pesi sono indicazioni per tessuto ottenuto da postnatale giorno 8 (P8) topi. Volumi di tampone PBS e Lisi possono essere scalate su e giù in base alle esigenze sperimentali.
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Discussion
Con il disegno sperimentale appropriato, misure di controllo e analisi statistica, macchiarsi occidentale può essere utilizzato per rendere affidabili stime quantitative dell'espressione della proteina all'interno e tra una vasta gamma di campioni biologici. Il protocollo che descriviamo nel manoscritto attuale mira a servire come una guida per i ricercatori cercano di utilizzare Western blotting per intraprendere analisi quantitativa tra i più grandi e complessi gruppi di campioni, utilizzando una combinazione di fluorescenza-basata metodi di rilevamento, caricamento di proteina totale normalizzazione e standard interni. Nonostante il fuoco qui è sulla determinazione e confrontando l'espressione della proteina dai tessuti del mouse differenti e a diverse età, questo approccio può essere esteso anche per confrontare l'espressione della proteina in altre condizioni sperimentali.
Un passaggio centrale nel nostro protocollo attuale è la normalizzazione delle proteine di interesse per proteine totali caricate da quantificare una macchia fluorescente della proteina totale. Normalizzazione di TPS corregge per variazione di caricamento del campione e i margini di errore in metodi di quantificazione della proteina. Tuttavia, poiché il numero di campioni di proteine che può essere analizzato su una singola membrana è spesso limitato, ulteriore normalizzazione potrebbe essere necessario confrontare più membrane. Infatti, la variabilità tra come le proteine vengono rilevate sulle diverse membrane (dovuto ad esempio anticorpo incubazione tempo o temperatura variazione) può causare la variazione oltre che presentare attraverso fasi di caricamento e quantificazione del protocollo. Qui, usiamo uno standard interno costituito da un mix di lisato di singola proteina che viene caricato in triplice copia su ogni gel e permette per il confronto e la normalizzazione tra gel/membrane. Teoricamente, questo potrebbe essere qualsiasi campione della proteina, come può essere fatto in quantità sufficiente affinché lo stesso campione può essere utilizzato per tutti gli esperimenti. Nei nostri esperimenti, usiamo una miscela di lisati di proteina del cervello, come omogeneati del cervello contengono grandi quantità di proteine e sono in genere ottenuti ad un'alta concentrazione. Quantificazione di triplice copia standard in media dovrebbe ulteriormente aumentare l'accuratezza delle quantificazioni attraverso le membrane e contribuire alla riproducibilità dell'esperimento.
I livelli della proteina possono essere determinati da una serie di diverse tecniche e il metodo preferito dipende il tipo di campione analizzato e l'obiettivo dell'esperimento. Riproducibile quantificazione di Western blot opere migliori in situazioni in cui le condizioni sperimentali possono essere ben controllate, ad esempio quando utilizzando il mouse o altri modelli animali di un background genetico definito. Al contrario, in molti esperimenti utilizzando campioni di pazienti umani, questo può essere meno fattibile come età, variabilità genetica e tempi di campionamento del tessuto sono molto più difficili da controllare rispetto a sistemi di modello (animale). Tecniche basate sulla piastra come ELISA potrebbero essere più adatti per queste analisi, anche se la convalida attenta della specificità dell'anticorpo è cruciale. Ad esempio, nella ricerca di sindrome del X fragile gli anticorpi sono stati indicati per rilevare diverse isoforme e quando utilizzato in ELISA questo porterebbe alla sopravvalutazione della quantità totale di proteina come ELISA determina un segnale per tutte le isoforme combinato24. Le scelte ottimali per i metodi determinare l'espressione della proteina sono pertanto a seconda del contesto, del campione tipo e la domanda di ricerca che sta studianda.
Esecuzione di analisi statistiche adeguata è un prerequisito per l'affidabilità di qualsiasi conclusioni tracciato dalla quantificazione dei dati biologici. Statisticamente analizzando dati complessi come generato confrontando diversi tessuti, tempo punti o altre condizioni sperimentali e le relative combinazioni possono richiedere che più avanzato modelli statistici di ANOVA con test post-hoc in grado di fornire. Per modelli statistici più complessi, come i misto-effetti model approccio, descriviamo nel manoscritto attuale, può essere consigliabile chiedere maggiori consigli da biostatistici. Un'adeguata analisi statistica dell'espressione della proteina su larga scala possono notevolmente migliorare la robustezza dei risultati e dell'affidabilità e riproducibilità dei risultati.
In sintesi, l'approccio sperimentale che descriviamo qui fornisce un metodo robusto e riproducibile per i ricercatori che si desidera determinare l'espressione della proteina usando la macchia occidentale in campioni complessi, permettendo di rispondere alle domande di ricerca di nuovi ed entusiasmanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Acknowledgments
E.J.N.G. è supportato dal Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Altri finanziamenti è stato fornito dal Trust SMA (SMA UK Consorzio; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (Tarantino, D.v.D.H. ed E.J.N.G.), il DTP di Università di Edimburgo in precisione medicina (T.H.G., L.L. & A.M.M.) e il centro di Euan MacDonald per ricerca di malattia del motoneurone (Tarantino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
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