Summary
このメソッドでは、標準化された定量的西部のしみが付くアプローチを使用して異なる発達縦長で種々 の組織における蛋白質レベルの比較のための堅牢かつ再現可能なアプローチについて説明します。
Abstract
西部にしみが付くことは、検出し、タンパク質の発現を定量化によく使用される手法です。長年にわたってこのテクニックは基礎と臨床の研究には多くの進歩につながっています。ただし、多くの同様の実験的手法と西部のしみの分析の結果簡単に選択して設計と実験の実行にも影響されます。特定ハウスキーピング蛋白質は定量化のための蛋白質のレベルを正規化する伝統的に使用されている、しかし、これらは制限数と過去数年間でますます批判されているため。ここでは、さまざまな組織、マウス モデル (疾患モデルを含む)、および発達縦長でタンパク質発現の多様性の複雑な比較を行うことを許可するように開発した詳細なプロトコルについて述べる。蛍光蛋白汚れを使用し、内部ロードの標準的な使用を導入、実験内で比較することができ、全体蛋白質のレベルを体系的に比較するサンプルの数の既存の制限事項を克服するために不可能だ、実験条件の範囲。このアプローチよりさまざまな組織、サンプル間で発現を探索する研究者、伝統的な西部のしみの技術の使用を拡大します。
Introduction
西部にしみが付くことは、検出し、タンパク質発現、組織ホモジネートまたは抽出物などを定量化に使われている手法です。年間で、この手法は、病1,2の存在を確認する診断ツールとして使用することができます基礎と臨床の研究には多くの進歩につながっています。1979 年に硝酸セルロース シートにポリアクリルアミドのゲルからタンパク質を転送し、その後放射能標識または蛍光標識された二次抗体を用いたタンパク質を視覚化する方法としてまず述べた西部にしみが付くことまたはペルオキシダーゼ3。市販のキットや装置の開発、西部のしみが付く方法がますます標準化し、長年にわたって簡素化します。確かに、手法が今容易にさまざまな背景や経験のレベルで科学者によって実行されます。ただし、多くの同様の実験的手法と西部のしみの分析の結果簡単に選択して設計と実験の実行にも影響されます。したがっては、標準化された西部のしみが付くメソッドへのアクセスはない慎重な実験計画の必要性を隠蔽し、デザインする、それが重要です。実験的考察などに限られた、サンプル準備および処理、選択とタンパク質検出用抗体の検証、特に小規模または大規模のゲル-膜転送効率は (< 10 または > 140 kDa)蛋白質4,5,6,7,8,9。元のサンプルの蛋白質の品質は、その後西部のしみの分析の結果を決定する上で重要な役割を果たしています。さまざまなサンプルとソース、細胞株、動物モデルから組織死後人間組織などからタンパク質を得ることができると再現性のある結果を取得する処理と処理の一貫性が必要です。たとえば、サンプルの蛋白質の抽出のための長期的なストレージが必要な場合、それは、蛋白質は-80 ° C で一般的に安定しているが、抽出されたタンパク質と-80 ° C でそのまま組織の蛋白質の安定性の違いされている実現するために重要です報告された10。さらに、蛋白質量の再現性のある推定値を得るためには、サンプルの一貫した均質化が重要です。異なる換散バッファーと均質化法 (例えば、手動均質化自動化された方法と比べた場合) を最適化することは、大規模な定量実験を開始する前に必要があります。
蛋白質の表現の堅牢な定量的な結果を取得する蛋白質の読み込みと定量化の変動を補正するための正規化戦略が欠かせない。タンパク質 β-アクチンなどのハウスキーピング、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH)、β-チューブリン α-チューブリン伝統的に使用されている定量化のための蛋白質のレベルを正規化します。しかし、過去数年11,12ますます特定のハウスキーピング タンパク質定量用の正規化を批判されています。たとえば、ハウスキーピング タンパクの発現は4の同じ動物と条件病気様々 な4,15 の下の組織にわたって発達段階別13,14, で変化するか ,16,17。したがって、特定のハウスキーピング蛋白質の使用は、異なる縦長で、様々 な実験条件の下で、さまざまな組織からタンパク質発現の間のより複雑な比較を行うの可能性を制限します。ハウスキーピング蛋白質蛋白質の変化の読み込みのコントロールにする代わりに総蛋白汚れ (TPS) の使用は、そのラベルとサンプルで現在のすべての蛋白質を可視化します。1 つの特定の蛋白質のレベルしたがって TPS 信号の定量化され匹敵する、再現可能な実験条件、サンプル タイプまたは発達 timepoint に関係なくするのではなく、TP により総蛋白負荷に基づいて信号の正規化.総蛋白質の汚れには、Ponceau S、ゲルの染色無料、Coomassie R-350、可視ルビー、Epicocconone、Amydo ブラック、Cy5 (文献参考文献 18) があります。これらの各メソッドは、特定の利点と制限、方法の選択は実験のセットアップ4,18と同様、時間と利用可能なツールによって異なります。
膜内で読み込みと数量の変動を補正するため、TPS を使用、に加えて大規模なタンパク質発現解析を実行するときに特に別の膜間のサンプルを比較する必要がある場合があります。ただし、抗体の結合を効率と総蛋白質染色強度などの要因で変動は可能性があります別のゲルの分析は蛋白質のサンプルと膜間のばらつきに導入。このような状況で堅牢な定量化のために膜間の可変性を考慮してさらに正規化ステップを導入する必要です。これは、各実験の間で一定に保たれる個別に分析された膜の内部負荷標準を含めることによって達成することができます。この規格は、あらゆる蛋白質の溶解実験に含まれているすべての膜を渡る使用される十分な量で取得可能の形をとることができます。ここで、脳はすぐに均質化し、ライセート得られたタンパク質は、高濃度の蛋白質の重要な量を含んでいる (生後 5 日のマウスから得られた)、マウス脳のライセート使用します。3 通の内部標準を読み込み正規化し、直接比較する別の膜のサンプルをことができます。
ここでは、さまざまな組織、マウス モデル (疾患モデルを含む)、および発達縦長19間でタンパク質発現の多様性の複雑な比較を行うことを許可するように開発した詳細なプロトコルについて述べる。内部の読み込み標準の使用と蛍光 TPS を組み合わせて、サンプルおよび単一の実験内で比較することができます実験条件の数の既存の制限を克服することができました。このアプローチよりさまざまな組織、サンプル間で発現を探索する研究者、伝統的な西部のしみの技術の使用を拡大します。
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Protocol
このプロシージャのためのティッシュは、エジンバラ大学の内部倫理委員会によって承認された、制度的に見合って、関連の権限の下で英国ホーム オフィスの規制を行った動物の研究から得られました。個人とプロジェクトのライセンス。
注: このプロトコルは再現性を高めるために標準化された、市販のキットおよび試薬の使用を最適化されています (材料の表を参照してください)。
1. 試料の調製
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蛋白質の抽出
- 氷上では、解凍し、氷冷 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x で必要に応じて洗浄転送スナップ凍結細胞または組織サンプル、ドライアイス-80 ° C から (組織と PBS 洗浄の詳細については、表 1を参照してください)。これはタンパク質の品質に影響を与える不要な凍結融解のサイクルを避けてください。
- Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー (25 mM トリス-HCl (pH 7.6) 150 mM 1 NP 40%、0.1 %sds デオキシ コール酸 1% ナトリウム, 塩化ナトリウム) を追加 1 組織重量あたりの最適な量を使用して、各サンプルにプロテアーゼ阻害剤を含む (表 1を参照してください。推奨事項)。
注: アプリケーションによっては、種類と均質化バッファーの量必要がありますさらに最適化。 - ポリプロピレン杵で組織サンプルを均質化するのに手持ち電動ホモジナイザーを使用します。各サンプル間二重蒸留水で杵を洗浄し、きれいなティッシュで乾燥します。異なる実験条件と組織間杵を変更します。
- 均質化後、10 分間氷の上、サンプルを残します。遠心分離機のサンプルで > 10,000 × g 10 分間 4 ° c。
- ペレットを乱すことがなく氷の上新しいチューブに上清を転送します。上澄みは、蛋白質のサンプルです。-80 ° C で抽出されたタンパク質を保存するか、直接タンパク質濃度を測定するのに進みます。
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定量化とタンパク質濃度の正常化
- ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを用いたタンパク質濃度を測定します。ウェルあたり BCA ミックス 200 μ L を使用して光 96 ウェル プレートで製造元の指示に従って BCA アッセイ ミックスを準備します。
注: Lowry、ブラッドフォードの試金など他の定量化方法を限り、蛋白濃度は実験で一貫して定量化タンパク質濃度を測定する使用もできます。 - ウシ血清アルブミン (BSA) 基準濃度 3 通を準備し、重複の各蛋白質のサンプルの 1 μ L を追加します。60 ° C で 10 分間以上タンパク質濃度が低いことが予想される場合に予熱した熱ブロックに 96-well 版を孵化させなさい。
- インキュベーション後、560 で吸収を測定プレート リーダーを使用して nm。
- プレート リーダーの測定をエクスポートし、蛋白質の標準を使用して取得した標準曲線の各サンプルの吸光度の平均値を比較することによってタンパク質濃度を計算します。標準曲線の R 2 乗値は正確にサンプルの蛋白質の集中を推定する 0.98 以上にする必要があります。
- サンプル バッファーと超純水で蛋白質のサンプルの希釈液を準備することによって蛋白質の量を正常化します。総容積は、ゲルの種類に応じて調整できます。開始量としてレーンあたり蛋白質の 30 μ g をロードすることをお勧めします。ジチオトレイトールなどの還元剤を追加 (DTT; 最終濃度 5 mM) または β-メルカプトエタノール (最終濃度 200 mM) 各サンプルを必要とします。ヒューム フードの原液 β-メルカプトエタノールのピペットします。
- 収集する氷、渦、スピン ・ ダウン サンプルを簡単に言えば 10 分 70 ° C で熱ブロックのサンプルをインキュベートします。ゲルのロードまで氷の上を保ちます。
- ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを用いたタンパク質濃度を測定します。ウェルあたり BCA ミックス 200 μ L を使用して光 96 ウェル プレートで製造元の指示に従って BCA アッセイ ミックスを準備します。
2. 蛋白質のサンプルの電気泳動
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デバイスとゲルを設定
- セットアップ プレキャスト 4-12% ビス トリス勾配ゲル ゲル電気泳動チャンバー方式 (材料の表を参照してください)。使用する前に二重蒸留水を使用してジェルを洗い流してください。
注: に応じてサイズ、相互作用および興味、さまざまなグラデーションが付いているゲルの蛋白質の豊富なエージェントまたはよくサイズと番号をバッファリング使用できます。 - タンク 1 基あたり二重蒸留水で希釈バッファーを実行する 1 x MES SDS の 500 mL を追加します。スタッキングのゲルの井戸を乱すことがなく実行しているバッファーを追加した後、ゲルから櫛を慎重に取り外します。
- セットアップ プレキャスト 4-12% ビス トリス勾配ゲル ゲル電気泳動チャンバー方式 (材料の表を参照してください)。使用する前に二重蒸留水を使用してジェルを洗い流してください。
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蛋白質のローディング
- タンパク質標準の 3.5 μ L を井戸に読み込みます。サンプル レイアウトによって蛋白質のサイズを正確に見積もるより助けることができるゲルの両側に蛋白質の梯子を読み込みします。細いゲルより正確なサンプルの読み込みのためのヒントを使用します。
- 膜間の正規化のための内部標準を使用する場合 (下の手順 5. とディスカッションを参照)、蛋白質の梯子の横に最初 3 井戸に他のサンプルに相当する量を読み込みます。
- 残りのウェル内の各サンプルの 30 μ g をロードします。すべての空井戸に 1 x サンプルバッファーを追加します。
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電気泳動
- サンプルをロード後ゲル タンクを組み立てます。80 V 150 V さらに 45-60 分間続く 10 分でスタッキングのゲルをサンプルを実行します。
3. タンパク質の転送
メモ: このプロトコルでタンパク質の転送は市販の半乾燥しみが付くシステムを使用して実行されます (材料の表を参照してください) 高速で一貫性のある結果。
- 二重蒸留水でろ紙を予浸ゲル ナイフを確保することによってタンパク質の転送を準備、パスツールのプラスチック ピペット、しみが付くローラーと鉗子を使用する準備ができています。
- すべての包装箔を慎重に削除して転送スタックを開きます。下部スタックから上部を取り外して、脇に置いておきます。すぐに電気泳動バッファー (2-3 mL) を実行しているを数滴で下部スタック上膜を湿らせます。転送スタックが開いたら、PVDF 膜の乾燥を防ぐために重要です。
- 電気泳動を停止した後ゲルのナイフを使用して既製のゲルを開き、スタッキングのゲルを遮断します。ゲル プラスチック キャストから無料に、その縁の周りをカットします。ゲルに損傷を防ぐために濡れているゲルのナイフを保ちます。
- 下から上へ転送スタックを組み立てる: 下スタック (PVDF 膜を含む)、蛋白質ゲル、フィルター紙。しみのローラーを使用すると、すべての空気の泡を削除できます。フィルター紙の上にトップのスタックを置き、空気の泡を削除するもう一度スタックをロールします。プッシュしない転送余りに強くこれはタンパク質中に変形するゲルを引き起こす可能性があります。
- 電極と転送デバイスにデバイスの左側にあるスタック全体を転送し、デバイスに対応する電気接点に整列するので、スタックの上にゲル スポンジを配置します。ふたを閉じ、選択、適切なプログラムを起動 (推奨される開始点は 20 V は 7 分間)。
- 終わったら、クールダウンして膜の乾燥を防ぐためにスタックできるように 2 分間蓋を残します。転送スタックを削除し、膜のゲルのサイズにカットします。総蛋白汚れを続行する前にすぐにダブル蒸留水カット膜を洗浄します。
4. 総蛋白質染色
注: は蛍光検出を用いた線形範囲と感度は大いによりよい制御4をすることができますより伝統的なアプローチ (例えば、ECL 検出) を実質的な利益を提供します。したがっての手順4および5、蛍光 TPS と蛍光の二次抗体を使用 (材料の表を参照してください)。
- タンパク質面を内側にして 50 mL のチューブに膜をロールバックします。蛍光 TPS と二次抗体の光感度のための以降すべての手順は暗闇の中で実行されます。
- タンパク質染色溶液の 5 mL を追加 (材料の表を参照) し、室温で 5 分間ローラー間加温します。TPS と洗浄バッファー メタノールを含む、ヒューム フードの手順を遂行。
- 染色液を捨て、洗浄溶液 (6.3% 酢酸 30% メタノール溶液) 5 mL ですばやく 2 回洗います。洗浄の手順間のローラーに簡単にチューブを配置します。続行する前に純水で簡単に膜を洗い流してください。
5 ブロック、抗体培養と検出
- 膜をブロック: ブロック バッファーの 3 mL を加える (材料の表を参照してください)、膜を含む 50 mL のチューブに。室温で 30 分間ローラーの膜を孵化させなさい。抗体の選択によって使用されるブロックのバッファーの種類の最適化を必要があります。
-
一次抗体の孵化
- 廃棄ブロック バッファーし、適切なで一次抗体に置き換えます最適化濃度 (図 1および図 2: マウス抗召ブロック バッファーで希釈 1:1, 000 の)。
注: 一次抗体の適切な最適化を交えながら、抗体が右のサイズの蛋白質の製品を検出することの確認を含める必要がありますないまたは他、非特異的タンパク質製品に最小限のバインディング。可能であれば、テストし、興味の蛋白質に対して複数の抗体を比較します。 - 4 ° C で一晩ローラーの膜をインキュベートします。次の日は抗体溶液を削除し、6 回常温 (RT) ローラーの 1x PBS で 5 分間洗浄します。
- 廃棄ブロック バッファーし、適切なで一次抗体に置き換えます最適化濃度 (図 1および図 2: マウス抗召ブロック バッファーで希釈 1:1, 000 の)。
-
二次抗体の孵化
- 5 mL のブロック バッファーの一次抗体のホストに対して 1:5,000 で特定の二次抗体を準備します。その他の二次抗体は他の希釈や代替ブロック バッファーの使用を必要があります。
- 室温 1 時間ローラーの二次抗体溶液を膜をインキュベートします。インキュベーション後、ローラーに 1x PBS で 3 回 30 分の膜を洗浄します。
- 膜を乾燥し、アルミ箔を使用して検出されるまで光から保護膜を維持します。膜は、長期的なストレージ 4 ° C で保存できます。
-
画像の取得
- スキャナーに接続されているコンピューターにログインします。タンパク質面をにしてスキャナーの膜しソフトウェアでスキャンする領域を選択します。
- 両方のレーザー強度を最適化 (700 nm、800 nm) チャンネル、彩度は発生しませんを確認します。両方のチャンネルに画像を取得し、(手順 6) 分析用画像をエクスポートします。
6. 西部のしみの分析と定量化
注: これらの推奨事項は、自由に利用できるイメージ スタジオ ソフトウェアに基づいています。ただし、比較分析を行うことが ImageJ などの他のソフトウェア パッケージを使用します。
- ファイルのインポート: 分析に使用するコンピューター上のローカル ワークスペースを作成します。これは西部のしみを取得するイメージ ファイルをデータベースを生成します。スキャナーで取得したファイルをインポートし、解析のための画像を選択します。
-
TPS の分析
- 総蛋白質染色結果を 700 nm チャネルを表示します。TPS のイメージの例が新生児 (P5) から、さまざまな組織の図 1に含まれる (図 1 a B) と 10 週間の古いマウス (図 1 C D) が直接比較されます。同様に、図 2は、年齢別のマウスの脳組織の直接比較の例を示します。
- 右上から [分析] タブを選択し、(図 1 b、 D) の正規化のための関心領域を定義する四角形を追加します。コピーして分析されたすべてのレーンを同じサイズで定義された領域を確実にそれぞれ独立したサンプルを最初の四角形の領域を貼り付けます。
- ソフトウェアの左下隅の [図形] タブから結果をコピーします。
-
定量化
注: サンプルを定量化するための最適なアプローチは、実験的なデザインによって異なります。我々 はここで時間をかけて減少する知られている生存運動ニューロン蛋白質 (召; 神経筋疾患脊髄性筋萎縮症20,21に関与する重要なタンパク質) の検出の説明例を提供します。19と TPS を召信号強度の正規化がタンパク質式開発の信頼できる推定値を提供する方法。- 図 2は、コントロールを読み込む蛋白質として TPS の動物の年齢の増加とともに召式の低下を示しています。読み込み (図 2 b) タンパク質を定量化するステップ 6.2.1-6.2.3 を繰り返します。800 nm チャンネル (図 2 a) 興味の蛋白質を分析するステップ 6.2.1-6.2.3 を繰り返します。
- TPS と興味の蛋白質の両方から結果をスプレッドシート プログラムにコピーします。配置したスプレッドシートにまず正規化します。 最高の TPS 信号を決定することにより読み込みタンパク質と分割各 TPS 信号の値にこの値を読み込む正規化されたタンパク質を取得します。
- 異なったサンプルの相対的な蛋白質表現の比率を計算する、対応する正規化された蛋白質の値それぞれの個別のサンプルから 800 nm の信号値を分割します。
- 最初の正規化後様々 な時間点、または異なる膜および実験間で直接比較をできるように内部標準の平均値に組織を比較します。
7. 統計
- 複雑で大規模なグループのサンプルの間で蛋白質の表現の任意の有意差を確認、適切な統計的手法が必要です。統計のバック グラウンドの詳細については、このペーパーの範囲を超えて行く、いくつかの考慮事項を強調表示し、たい詳細19を使用したが、成功したアプローチ。
- 多くの実験はタンパク質定量測定は完全に独立してデータを表しません。ここでは、たとえば、複数の組織、通常得られる単一実験の時点で複数の臓器にわたってタンパク質レベルを決定する 1 つの動物から。したがって、蛋白質の表現、時間の経過と共に、組織間の違いを分析するのに混合効果モデルを使用しました。 一般に、混合効果モデルは非独立性に対処し、擬似レプリケーション22,23を未然に防ぐ効果的な手段を提供します。本症例では混合効果モデル個人内の組織の間での繰り返し測定の統計的電力を増加します。これは自由に利用可能な汎用性の高いこれらの解析、統計ソフトウェア パッケージ、R を使用します。ただし、他の市販パッケージは、同様の分析を実行することがあります。
- 各マウスは 1 つの年齢グループに属していたために、現在の実験的なデザインには「分割プロット」のデザインが含まれます。したがって、一意の識別子を持つランダムな効果として個々 のマウス (マウス ID) のモデル化我々 はまた、組織、年齢、固定効果としての相互作用の占めています。Lme4 R ライブラリで関数 lmer を使用してデータをモデル化します。品質コントロールの手順としては、等分散、正規分布の仮定を評価するために残差を可視化し、これらの前提条件を満たすために必要に応じて、データを変換します。組織と年齢との間の重要な相互作用をテストするため我々 は、この相互作用に欠けていた、パラメトリック ブートス トラップ (R 関数ライブラリ、pbkrtest、PBmodcomp) を使用してモデルを比較して同一モデルに適合します。 重要な相互作用が起こった我々 関数 emmeans (ライブラリで使用される、emmeans R) 相互作用の原因を判断します。 たとえば、各組織内の年齢クラスの中で平均の式を比較しました。言う、2 つの指定された年齢クラス異なる大幅 1 つの組織の場合は、年齢や組織間で有意な相互作用が発生はなく、別。要約すると、これらのアプローチは、これらの結果に統計のサポートを提供することによって西部のしみの実験から結論の堅牢性を拡張する方法を提供します。
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Representative Results
組織と時間点にわたってタンパク質レベルの比較を容易にする TPS と内部標準物質の使用の例が含まれます。図 1は、新生児 (生後 5 日目) (週齢 10) 大人のマウスと比較してから得られた組織から抽出したタンパク質のウェスタンブロットの結果を示しています。図 1 aは、Cには TPS と召イムノブロットを示します。各レーンに四角形のボックス内の蛍光強度を測定することによって達成された TPS の蛍光強度の数量化とその結果図 1 bと1 Dのテーブルに表示されます。さまざまな組織からのサンプルは、さまざまな TPS タンパク質バンド パターンによって特徴付けられる、従ってそれは正規化の目的全体のレーンを使用する必要に注意してください。確かに、全車線を分析するとき、蛍光強度は、正規化の TPS がこの用途に適してを示すサンプル間で比較的類似したままです。P5 脳ライセート混合物から成る内部標準は、異なる膜間さらに比較のための使用方法を説明するために含まれていた。また、図 2で蛍光 TPS を使用して、異なる発達時点で蛋白質のレベルを比較する方法を示します。ここでは、離乳年齢 (P20) と大人 (10 w) マウス (図 2 a) 新生児 (P5) から脳 lysates のサンタマリアノヴェッラのレベルを示します。サンタマリアノヴェッラのレベルは明らかに年齢とともに減少、TPS 定量化一定図 2 bに示すようです。
図 1。西部 2 つの異なった年齢でマウス臓器の示す TPS と召タンパク質レベルのしみ。P5 の TPS と召蛋白質 (A) および 10 週齢 (C) マウス。(B、D)全レーン TPS の蛍光強度を計算し、(任意単位) で表されます。M: マーカー/タンパク質標準;kDa: キロダルトン;a.u.: 任意の単位;P5: 生後 5;10 w: 10 週間。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。異なる発達時点でマウス組織における召の発現の解析.(A) 脳 P5、P20 10 週古いマウスから得られた組織からの lysates は TPS (上部パネル) と召 (底板) を用いて解析しました。(B) TPS の蛍光強度を計算し、任意の単位で示されます。M: マーカー/タンパク質標準;kDa: キロダルトン;a.u.: 任意の単位;P5: 生後 5;P20: 生後 20;10 w: 10 週間。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 組織 | 約重量 * | 1xPBS 洗浄 (4 ° C) | 繰り返し洗浄 | 均質化バッファー * * |
| 脊髄 | 40 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| 筋肉 (GC) | 20 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| 脳 | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| 心 | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| 肝臓 | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| 腎臓 | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * これらの重みは、P8 のマウスから得られた組織を示す値です。 | ||||
| * * これらのボリュームは徴候および組織の重量に応じてさらに調整することができます。 | ||||
テーブル 1。予想される組織重量および均質化に使用する PBS の洗浄および換散バッファーのボリュームに対応する推奨事項の概要。重みは、マウス生後 8 (P8) から得られた組織の徴候であります。PBS および換散バッファーのボリュームは、実験のニーズに応じて上下に拡張できます。
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Discussion
適切な実験計画、対策と統計分析、西部にしみが付くことは蛋白質の表現内および多様な生体試料間の信頼性の高い定量的評価をする使用できます。我々 現在の原稿で説明するプロトコル蛍光ベースの組み合わせを使用して、サンプルのより大きくより複雑なグループ間で定量分析を実施するウエスタンブロットを使用している研究者のためのガイドラインとして提供することを目的と検出方法, 総蛋白負荷の正規化と内部基準。ここでは、異なった年齢で決定して別のマウス組織からタンパク質発現を比較することで、他の実験条件でタンパク質の発現を比較するためにこのアプローチを拡張することも。
私たちの現在のプロトコルの中央ステップは、総蛋白蛍光蛋白汚れを定量化することでロードに興味の蛋白質の正規化です。TPS の正規化は、サンプル負荷の変動とタンパク質定量法での誤差を修正します。ただし、単一の膜分析することができます蛋白質のサンプルの数は限られている多くの場合さらに正規化は複数の膜を比較する必要があります。確かに、(たとえば抗体培養時間や温度変化による) 異なる膜タンパク質を検出する方法間のばらつきは、プロトコルの読み込みと定量化手順導入を超えて変動を引き起こす可能性があります。ここでは、我々 は各ゲルの 3 通にロードされてでき、比較やゲル/膜間の正規化、単一蛋白質のライセート組合せから成る内部標準を使用します。理論的には、限り、すべて実験のため同じサンプルを使用できるために、十分な量で行うことが、これは蛋白質のサンプル、かもしれない。実験の結果, 脳ホモジネート タンパク質を大量に含む高濃度は通常取得と脳タンパク質溶解液の混合物を使用します。帳票の標準の定量化を平均必要がありますさらに膜を渡る数量の正確さの向上に貢献し、実験の再現性。
タンパク質レベルは、さまざまなテクニックの数によって定めることが、推奨される方法は分析対象サンプルの種類や実験の目的によって異なります。西部の再現性の定量化実験条件がときにマウスを使用して、定義された遺伝的背景の他の動物のモデルなど、よく管理されたことができる状況で最高の作品をしみ。対照的に、人間の患者サンプルを用いて、多くの実験で、これは年齢、遺伝的多様性としてより少なく可能であることし、組織サンプリング時間は、モデル (動物) システムよりも制御が困難。ELISA などのプレート ベースの技術は、抗体の特定性の慎重の検証は重要なこれらの分析に適してかもしれない。たとえば、脆弱 X 症候群研究抗体示されている異なるアイソ フォームを検出するため、elisa 法 ELISA がすべてアイソ フォームのための信号を判断する、総蛋白質量の過大評価につながる24の組み合わせで使用する場合。タンパク質の発現を確認する方法の最適な選択したがって状況によって、サンプルの種類と、検討されているリサーチ ・ クエスチョン。
生物学的データの定量化から引き出される結論の信頼性のための前提条件は、適切な統計分析を実行します。統計的に時間のポイントのさまざまな組織を比較することによって生成される場合、複雑なデータの分析、またはその他の実験条件及びこれらの組み合わせよりは事後テストと分散分析を提供することができますより統計的モデリング高度な必要があります。複雑な統計モデルの混合効果モデル的アプローチ、現在原稿の述べるようことを求めることをお勧めそれ以上しかしからのアドバイスします。大規模タンパク質の発現について適切な統計分析結果および信頼性の堅牢性と再現性を向上できます。
要約すると、ここで述べる実験的アプローチは新しくて刺激的な研究の質問に答えるように複雑なサンプルで西部のしみを用いたタンパク質の発現を確認する研究者のため堅牢で再現性のある方法を提供します。
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Disclosures
著者は開示する競合する興味を持ってないです。
Acknowledgments
E.J.N.G. は、Wellcome の信頼 (グラント 106098/Z/14/Z) によってサポートされます。SMA 信託 (SMA 英国協会によって提供されているその他の資金T.H.G. & Y TH.)、SMA ヨーロッパ (T.H.G ・ D.v.D.H. ・ E.J.N.G.)、精密医学 (T.H.G., l. l. ・ A.M.M)、エジンバラ大学の DTP、運動ニューロン病の研究 (T.H.G) のユアン ・ マクドナルド センター。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
