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Biochemistry

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

doi: 10.3791/59438 Published: April 9, 2019
* These authors contributed equally

Summary

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

Abstract

서 부 럽 감지 하 고 단백질 식 계량 일반적으로 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술은 기초 및 임상 연구에 많은 발전을 주도하 고 있다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그러나 특정 가사 단백질 단백질 수준을 정량화에 대 한 정상화 하는 데 사용 되었습니다 전통적으로,, 이러한 제한 수 있고 따라서 점점 더 지난 몇 년 동안 강평 되었다. 여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints 단백질 표정 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 형광 총 단백질 얼룩을 사용 하 고 내부 로드 표준의 사용을 도입, 가능 하다 실험에서 비교 될 수 있는 고 단백질 수준에 걸쳐 체계적으로 비교 샘플 수에 기존의 한계를 극복 하는 다양 한 실험 조건입니다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.

Introduction

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서 부 럽 일반적으로 감지 단백질 표정, 조직 homogenates 또는 추출 물 등을 계량 하는 데 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술을 주도하 고 있다 기본 및 임상 연구에 많은 발전을 그것은 사용할 수 있는 진단 도구로 질병1,2의 존재를 확인 하. 서 부 럽 처음에 설명 되었다 1979 니트로 시트 polyacrylamide 젤에서 단백질을 전송 후 했다 방사성으로 분류 하거나 fluorescein에 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 단백질을 시각화 하는 방법으로 또는 과산화 효소3. 상용 장비 및 장비 개발을 통해 서쪽 더 럽 히 방법은 점점 표준화 하 고 되었습니다 년간 단순화. 실제로, 기술은 다양 한 배경과 경험의 수준의 과학자 들에 의해 쉽게 수행 이제 됩니다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그것은 중요 한, 그러므로, 표준화 된 서쪽 더 럽 히 메서드의 액세스 가능성 모호한 실험 계획에 대 한 필요성 및 디자인 하지 않습니다. 실험적인 고려 사항 포함, 하지만 제한, 샘플 준비 및 처리, 선택 및 단백질 검출을 위한 항 체의 유효성 검사 및 특히 소형 또는 대형의 젤 막 전송 효율 (< 10 또는 > 140 kDa) 단백질4,,56,7,,89. 원래 샘플의 단백질 품질 후속 서쪽 오 점 분석의 결과 결정에 중요 한 역할을 한다. 단백질 샘플 및 세포, 조직, 동물 모델에서 사후 인간의 조직, 등의 다양 한에서 추출 될 수로 처리 및 처리에 일관성 재현성 결과를 얻이 필요 합니다. 예를 들어 단백질 추출에 대 한 샘플의 장기 보관이 필요한 경우 그것은, 단백질은-80 ° C에 일반적으로 안정, 추출 된 단백질 및-80 ° C에서 그대로 조직 단백질 안정성에 차이 되었다는 것을 실현 하는 것이 중요 보고 된10. 또한, 단백질 양의 재현할 수 견적을 얻으려면, 샘플의 일관 된 균질 결정적 이다. 다른 세포의 용 해 버퍼 및 균질 화 방법 (예를 들어, 수동 균질 자동된 방법에 비해)을 최적화 하는 것은 대규모 양적 실험을 시작 하기 전에 필요할 수 있습니다.

단백질 로드와 부 량 변화에 대 한 해결 하기 위해 정규화 전략 단백질 식의 강력 하 고, 양적 결과 얻기 위해 필수적입니다. 단백질 β-말라 등 내부 관리, α-tubulin, β-tubulin, 및 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 전통적으로 사용 되어 왔습니다 정량화에 대 한 단백질 수준을 정상화 하. 그러나, 정량화 목적을 위해 특정 가사 단백질 정규화 점점 받아왔다 지난 몇 년 동안11,12이상. 예를 들어 가사 단백질의 표현 같은 동물4, 그리고 다양 한 질병 조건4,15 아래 조직에 걸쳐 서로 다른 발달 단계13,14를 변경할 수 있습니다. ,,1617. 따라서, 특정 가사 단백질의 사용 다른 조직, 다른 timepoints와 다양 한 실험 조건 아래에서 단백질 표정 사이 더 복잡 한 비교를 만들기의 가능성을 제한 합니다. 로드 변형 단백질에 대 한 제어를 가사 단백질 대신 총 단백질 얼룩 (TPS)를 사용 하 여 해당 레이블 이며 샘플에 존재 하는 모든 단백질을 시각화. TPS 신호 정규화 총 단백질 부하에 따라 수 보다는 특정 한 단백질의 수준 및 그러므로 TPS 신호의 정량화 해야 한다 비교 실험 조건, 샘플 형식 또는 발달 timepoint에 재현 . 총 단백질 얼룩 포함 됩니다 Ponceau S, 얼룩-무료 젤, Coomassie R-350, Sypro-루비, Epicocconone, Amydo 블랙와 Cy5 (참고 18에서 검토). 이러한 각 메서드는 특정 이점 및 제한 하 고 메서드 선택 실험 설치4,18뿐만 아니라 시간 및 사용할 수 있는 도구에 따라 달라 집니다.

내 막 로드와 부 량 변화에 대 한 수정 하는 TPS를 사용 하 여, 그것을 다른 세포 막, 대규모 단백질 표정 분석을 수행 하는 경우에 특히 사이 샘플을 비교할 필요할 수 있습니다. 그러나, 항 체 바인딩 효율성과 총 단백질 얼룩 강도 같은 요인에서 변화를 소개 추가 별도 젤에 분석 단백질 견본 및 막 사이 변화 합니다. 이 상황에서 강력한 정량화에 대 한 그것은 멤브레인 사이 가변성을 더 정규화 단계를 소개 하는 데 필요한 따라서. 이 실험에서 일정 하 게 유지는 별도로 분석 된 막의 각각에 내부 로드 표준 포함 하 여 달성 될 수 있다. 이 표준은 모든 단백질을 실험에 포함 하는 모든 세포 막에 걸쳐 사용 될 충분 한 수량에 얻어질 수 있다 lysate의 형태를 걸릴 수 있습니다. 여기, 우리 두뇌는 즉시 무 균 하 고 높은 농도에 단백질의 상당한 금액을 포함 하는 취득된 단백질 lysate lysate 쥐의 뇌 (5 일 오래 된 컨트롤 마우스에서 얻은)의 사용 합니다. 3 중에는 내부 표준 로드 정상화 하 고 직접 비교를 별도 세포 막에 샘플 수 있습니다.

여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints19단백질 식 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 결합 하 여 형광 TPS는 내부 로드 표준의 사용과, 우리 수 샘플 및 단일 실험에서 비교 될 수 있는 실험 조건에서에서 기존의 한계를 극복할 수 있었다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.

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Protocol

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이 절차에 대 한 조직 내부 윤리 위원회에 딘 버 러의 대학에 의해 승인 된 기관으로 색인 및 관련 된 권위 아래 영국 홈 오피스 규정에서 동물 연구에서 가져온 개인 라이센스 프로젝트.

참고:이 프로토콜 최적화 된 표준, 상용 장비와 시 약을 사용 하 여 재현성을 증가 하기 위하여 ( 재료의 표참조).

1입니다. 샘플의 준비

  1. 단백질 추출
    1. 스냅-냉동 셀 전송 또는 드라이 아이스에-80 ° C에서 조직 샘플, 얼음에 녹여 고 얼음 감기 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 필요에 따라 세척 (대 한 자세한 내용은 조직 및 PBS 세척, 표 1참조). 이 단백질 품질에 영향을 미칠 것 이다 불필요 한 동결-해 동 주기를 하지 마십시오.
    2. Radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼 (25mm Tris HCl (pH 7.6) 150 mM NaCl, 1 NP-40%, 1% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS) 추가 조직 무게 당 최적의 금액을 사용 하 여 각 샘플 protease 억제제 x 1 ( 표 1 참조 권장 사항)입니다.
      참고: 응용 프로그램에 따라 유형 및 균질 버퍼의 양을 할 수 있습니다 추가 최적화.
    3. 폴 리 프로필 렌 유 봉과 휴대용 전기 균질 화기를 사용 하 여 조직 샘플을 균질. 각 샘플 사이의 이중 증 류 물에서 유 봉 세척 하 고 건조 한 깨끗 한 조직. 다른 실험 조건 및 조직 사이 유 봉을 변경 합니다.
    4. 균질 후 10 분 동안 얼음에 샘플을 둡니다. 원심에서 샘플 > 10 분 동안 4 ° C에서 10000 x g .
    5. 펠 릿을 방해 하지 않고 얼음에 새로운 튜브에는 상쾌한 전송. 상쾌한 단백질 샘플입니다. -80 ° C에서 추출한 단백질을 저장 하거나 직접 단백질 농도 측정을 진행 합니다.
  2. 정량화 및 단백질 농도의 정상화
    1. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 잘 당 BCA 믹스의 200 µ L를 사용 하 여 광학 96 잘 접시에 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석 결과 믹스를 준비 합니다.
      참고:로 리와 Bradford 분석 실험과 같은 다른 정량화 방법 또한 단백질 농도 실험에서 일관 하 게 측정할 단백질 농도 결정을 사용할 수 있습니다.
    2. 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 3 중에 농도 증가 하 고 중복에서 각 단백질 견본의 1 µ L를 추가 합니다. 60 ° C 10 분 이상 단백질 농도 낮을 것으로 예상 하는 경우에 따뜻한 열 블록에 96 잘 접시를 품 어.
    3. 부 화, 후 560에서 흡수 측정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.
    4. 플레이트 리더 측정 내보내고 얻은 단백질 표준을 사용 하 여 표준 곡선을 각 샘플의 평균 흡 광도 값을 비교 하 여 단백질 농도 계산. 표준 곡선의 R-제곱 값은 샘플 단백질 농도 정확 하 게 추정 하는 0.98 보다 크거나 이어야 한다.
    5. 샘플 버퍼 및 초순 단백질 샘플의 희석을 준비 하 여 단백질의 양을 정상화. 총 볼륨 젤 사용의 유형에 따라 조정할 수 있습니다. 시작 금액으로 레인 당 단백질의 30 µ g를 로드 하는 것이 좋습니다. Dithiothreitol와 같은 환 원제를 추가 (DTT; 최종 농도 5 m m) 또는 베타-mercaptoethanol (최종 농도 200 m m)를 필요에 따라 각 샘플. 증기 두건에서 undiluted 베타-mercaptoethanol 플라스틱
    6. 짧게 수집 샘플 얼음과 소용돌이, 다운 스핀에 넣어 10 분 동안 70 ° C에서 열 블록에 샘플을 품 어. 젤 로드까지 얼음에 계속.

2. 젤 전기 이동 법 단백질 샘플의

  1. 장치 및 젤 설정
    1. 부품된 4-12% 두번째-트리 스 그라데이션 젤 ( 재료의 표참조) 젤 전기 이동 법 챔버 시스템에 설치 합니다. 사용 하기 전에 두 번 증 류 물을 사용 하 여 젤 린스.
      참고: 크기, 상호 작용 및 관심, 다른 그라디언트로 젤의 단백질의 풍부에 따라 버퍼링 에이전트 또는 잘 크기와 수 사용할 수 있습니다.
    2. 실행 버퍼 탱크 당 이중 증 류 물에 희석 1 x MES SDS의 500 mL를 추가 합니다. 겹쳐 쌓이는 젤에 우물을 방해 하지 않고 실행 중인 버퍼를 추가한 후 빗은 젤에서 조심 스럽게 제거 합니다.
  2. 단백질 로딩
    1. 우물에 표준 단백질의 3.5 µ L를 로드 합니다. 샘플 레이아웃에 따라 젤에 단백질 사다리를 로드 도움이 더 정확 하 게 단백질 크기를 추정 됩니다. 뾰족한 젤 더 정확한 샘플 로드에 대 한 팁을 로드를 사용 합니다.
    2. 내부 표준 사이 막 표준화에 대 한 사용 하는 경우 (아래의 5 단계 및 토론 참조), 금액은 단백질 사다리 옆 처음 3 우물에 다른 샘플을 로드.
    3. 나머지 우물에 각 샘플의 30 µ g를 로드 합니다. 모든 빈 우물에 샘플 버퍼 x 1을 추가 합니다.
  3. 전기 이동 법
    1. 샘플을 로드 한 후 젤 탱크를 조립. 10 분 뒤에 추가 45-60 분 150 V 80 V에서 겹쳐 쌓이는 젤을 통해 샘플을 실행 합니다.

3. 단백질 전송

참고:이 프로토콜에서 단백질 전송 상용 세미 드라이 더 럽 히 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다 ( 재료의 표참조) 신속 하 고 일관성 있는 결과 대 한.

  1. 사전 필터 종이 이중 증 류 물에 몸을 담글 젤 칼 함으로써 단백질 전송 준비, 플라스틱 파스퇴르 피 펫, 더 럽 히 롤러와 집게를 사용할 준비가.
  2. 신중 하 게 모든 포장 호 일을 제거 하 여 전송 스택을 엽니다. 상단 하단 스택에서 제거 하 고 따로 설정 합니다. 신속 하 게 전기 이동 법 버퍼 (2-3 mL) 실행의 몇 방울과 하단 스택에 막 축. 일단 전송 스택 열리면, PVDF 막 밖으로 건조 로부터 방지 하기 위해 중요 하다.
  3. 중지 한 후에 전기 이동 법, 프리 카스트 젤 젤 칼을 사용 하 여 열고 겹쳐 쌓이는 젤을 잘라. 젤 플라스틱 캐스트에서 그것을 그것의 가장자리를 잘라. 젤 칼 젤에 손상을 방지 하기 위해 젖은 계속.
  4. 맨 아래에서 전송 스택 조립: 스택 (PVDF 막 포함), 단백질 젤, 필터 종이 바닥. 더 럽 히 롤러를 사용 하 여 모든 기포를 제거 하. 필터 종이 위에 최고 스택 배치 하 고 롤 다시 기포 제거를 스택. 밀어 하지 않습니다 전송 너무 강하게 젤 단백질 동안 변형 될 수 있습니다.
  5. 장치의 왼쪽에 전체 스택 전극으로 전송 장치에 전송 하 고 스택 맨 위에 젤 스폰지를 배치 하는 장치에는 해당 전기 접점과 나란히. 뚜껑을 닫고, 선택 하 고 적절 한 프로그램을 시작 (20 V 7 분은 권장된 시작 지점).
  6. 완료 되 면 스택 아래로 냉각 하 고 막 밖으로 건조 하지 않도록 수 있도록 2 분 동안 폐쇄 뚜껑을 둡니다. 전송 스택 제거 하 고 젤 크기를 막 잘라. 총 단백질 얼룩과 계속 하기 전에 두 번 증 류 물으로 신속 하 게 잘라 막 세척.

4. 총 단백질 얼룩

참고: 형광 탐지를 사용 하 여 제공 합니다 실질적인 혜택을 더 전통적인 접근 (예를 들면, ECL 감지), 선형 범위와 감도 훨씬 더 나은 제어4수로. 따라서,에서 단계 4 5, 형광 TPS와 형광등 2 차 항 체는 사용 ( 재료의 표참조).

  1. 롤 단백질 면이 안쪽으로 50 mL 튜브에 막. 2 차 항 체와 형광 TPS의 빛 감도, 때문에 모든 후속 단계 어둠 속에서 수행 됩니다.
  2. 단백질 얼룩 솔루션의 5 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 및 실 온에서 5 분 동안 롤러에 품 어. 때문에 TPS와 워시 버퍼 메탄올을 포함, 밖으로 증기 두건에서 다음이 단계를 수행.
  3. 얼룩 솔루션을 삭제 하 고 신속 하 게 세척 솔루션 (30% 메탄올에서 6.3% 아세트산)의 5 mL로 두 번 씻어. 세척 단계 사이 롤러에 다시 짧게 튜브를 놓습니다. 계속 하기 전에 짧게 초순와 막을 헹 구 십시오.

5. 차단, 항 체 외피 및 탐지

  1. 막 차단: 차단 버퍼의 3 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조) 포함 하는 막 50 mL 튜브에. 실 온에서 30 분 동안 롤러에 막 품 어. 항 체의 선택에 따라 사용 하는 블로킹 버퍼 유형의 최적화를 해야 합니다.
  2. 1 차적인 항 체 외피
    1. 삭제 버퍼는 차단 및 적절 한에 1 차 항 체로 대체 최적화 농도 (그림 1그림 2: 마우스-안티-SMN, 블로킹 버퍼에 희석 1:1, 000에).
      참고: 적절 한 최적화 기본 항 체의 항 체에 적당 한 크기의 단백질 제품 검색을 보여주는 하는 동안 확인 포함 해야 없습니다 또는 불특정, 다른 단백질 제품을 최소한의 바인딩. 가능 하면, 테스트 하 고 관심사의 단백질에 대 한 여러 개의 항 체를 비교.
    2. 4 ° c.에 하룻밤 롤러에 멤브레인을 품 어 다음 날, 항 체 솔루션을 제거 하 고 실내 온도 (RT)에 롤러에 1 x PBS 가진 5 분에 대 한 6 번 씻어.
  3. 이차 항 체 외피
    1. 5 mL 차단 버퍼에 1 차적인 항 체의 호스트에 대 한 1:5,000에서 특정 이차 항 체를 준비 합니다. 다른 이차 항 체는 다른 희석 또는 대체 블로킹 버퍼를 사용 하 여 필요할 수 있습니다.
    2. 실시간에서 1 시간에 대 한 롤러에 이차 항 체 솔루션 멤브레인을 품 어 부 화, 후 롤러에 막 1 x PBS로 3 시간 30 분을 씻어.
    3. 막 건조 하 고 막 탐지까지 알루미늄 호 일을 사용 하 여 빛 으로부터 보호 유지. 막 장기 저장을 위한 4 ° C에서 보관 될 수 있습니다.
  4. 이미지 수집
    1. 스캐너에 연결 된 컴퓨터에 로그인 합니다. 막 스캐너에 단백질 면이 아래로 향하게 놓고 소프트웨어에서 스캔 영역을 선택 합니다.
    2. 모두 레이저 강도 최적화 (700 nm와 800 nm) 채널, 채도 없음 발생을 확인 하 여. 두 채널의 이미지 고 추가 분석 (6 단계)에 대 한 이미지를 내보냅니다.

6. 서쪽 오 점 분석 및 정량화

참고: 이러한 권장 사항은 기반으로 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 스튜디오 소프트웨어 합니다. 그러나, 비교 분석 또한 행 해질 수 있다 ImageJ 등 다른 소프트웨어 패키지를 사용 하 여.

  1. 가져오기 파일: 분석을 위해 사용 하는 컴퓨터에서 로컬 작업 영역을 만듭니다. 이 인수 서쪽 오 점에 대 한 이미지 파일의 데이터베이스를 생성합니다. 가져오기 파일 스캐너에 획득 하 고 분석에 대 한 이미지를 선택 합니다.
  2. TPS 분석
    1. 총 단백질 얼룩 결과 보여 700 nm 채널을 표시 합니다. TPS 이미지의 예를 들어 그림 1 에 신생아 (P5)에서 다른 어떤 조직에 포함 되어 (그림 1A-B) 10 주 오래 된 마우스 (그림 1 C D) 직접 비교 됩니다. 마찬가지로, 그림 2 는 다른 연령대의 쥐에서 뇌 조직의 직접 비교의 예가 나와 있습니다.
    2. 오른쪽 상단 모서리에서 분석 탭을 선택 하 고 정규화 (그림 1B, D)에 대 한 관심의 영역을 정의 하려면 사각형을 추가 선택 합니다. 복사 및 붙여넣기 모든 분석된 차선에 대 한 동일한 크기에 정의 된 영역을 보장 하기 위해 각 개별 샘플에 첫 번째 사각형 영역이입니다.
    3. 소프트웨어의 하단 왼쪽된 모서리에 모양 탭에서 결과 복사 합니다.
  3. 정량화
    참고: 샘플 측정에 대 한 최적의 접근 실험 설계에 따라 달라 집니다. 우리 여기는 생존 모터 신경 단백질 (Smn, 신경 근육 학 질병 척수 근육 위축 증20,21에서 포함 된 주요 단백질), 시간이 지남에 따라 감소 하의 탐지의 설명 예를 제공 합니다. 19 그리고 Smn 신호 강도 TPS에의 단백질 식 개발의 신뢰할 수 있는 예측을 제공 하는 방법.
    1. 그림 2 는 Smn 식 컨트롤을 로드 하는 단백질으로 TPS와 동물의 나이 증가 함께 감소. 반복 단계 6.2.1-6.2.3 단백질 (그림 2B) 로드를 계량 합니다. 800 nm 채널 (그림 2A) 관심사의 단백질 분석 단계 6.2.1-6.2.3를 반복 합니다.
    2. 스프레드시트 프로그램에 TPS와 관심사의 단백질에서 결과 복사 합니다. 스프레드시트에서 먼저 단백질 높은 TPS 신호를 확인 하 여 로드를 정상화 하 고 나누어 각 TPS 신호 값을 로드 하는 정규화 된 단백질을 얻으려면이 값으로 값 합니다.
    3. 다른 샘플에서 상대 단백질 식 비율을 계산 해당 정규화 된 단백질 값으로 각각의 개별 샘플에서 800 nm 신호 값을 나눕니다.
    4. 첫 번째 정규화 후 다양 한 시간 점 또는 조직의 다른 막과 실험을 통해 직접 비교를 허용 하도록 내부 표준의 평균 값을 비교 합니다.

7입니다. 통계

  1. 샘플의 복잡 하 고 큰 그룹에서 단백질 표정에서 통계적으로 유의 한 차이 확인 하려면 적절 한 통계 방법론은 필요 합니다. 통계 배경에 대 한 자세한 내용은이 문서의 범위를 넘어, 비록 우리가 몇 가지 고려 사항을 강조 표시 하 고 성공적인 접근을 우리는 이전에 사용한19세부 싶어요.
  2. 많은 실험을 위한 단백질 부 량 측정은 완전히 독립적인 데이터를 대표 하지 않는다. 여기, 예를 들어 여러 조직 일반적으로 얻을 수 있습니다 단일 점에서 실험 시간-여러 장기에 걸쳐 단백질 수준을 결정 하는 단일 동물에서. 따라서, 우리는 단백질 식 시간이 지남에, 그리고 조직 사이에서 차이 분석 하 혼합된 효과 모델을 사용.  일반적으로, 혼합된 효과 모델 아닌 독립을 다루는 의사 복제22,23그로 인하여 방지 하는 효과적인 수단을 제공 합니다. 현재의 경우에 혼합된 효과 모델 조직, 개인 시간 사이에서 반복된 측정에 대 한 고려 하 여 통계적 인 힘을 증가. 우리는 이것이 자유롭게 사용 가능 하 고 다재 다능 한 이러한 분석을 수행 하기 위해 통계 소프트웨어 패키지 R를 사용 합니다. 그러나, 다른 상용 패키지 유사한 분석을 수행할 수 있습니다.
  3. 현재 실험 설계를 각 마우스 한 연령 그룹에 속한 "분할 음모" 디자인을 포함 한다. 따라서, 우리 고유 식별자; 임의 효과로 개별 마우스 (마우스 ID) 모델링 우리는 또한 조직, 나이, 그리고 그들의 상호 작용 효과 대 한 차지 했다. 우리 연구 도서관, lme4의 함수 lmer를 사용 하 여 데이터 모델링. 품질 관리 단계로 우리 시각 오차 같은 분산 및 정규 분포의 가정을 평가 하 고 필요한 경우 이러한 가정에 맞게 데이터를 변형. 조직과 세 사이의 중요 한 상호 작용을 테스트 하려면 우리는이 상호 작용을 결여 되 고 패라메트릭 부트스트랩 (R 함수 라이브러리, pbkrtest에에서 PBmodcomp)를 사용 하 여 모델을 비교 하는 동일한 모델 적합.  어디 중요 한 상호 작용 발생, 우리 사용 함수 emmeans (emmeans R 도서관) 상호 작용의 원인을 확인 합니다.  예를 들어 우리; 각 조직 내에서 나이 클래스 중 평균 식 비교 중요 한 상호 작용, 2 개의 주어진된 나이 수업 한 조직에 대 한 크게 달랐다 하는 경우 연령과 조직 사이 발생할 수 있지만 또 다른. 요약 하자면, 이러한 접근 이러한 결과 통계 지원을 제공 하 여 서쪽 오 점 실험에서 결론의 견고성을 확장 하는 방법을 제공 합니다.

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Representative Results

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우리는 조직 및 시간 포인트 단백질 레벨의 비교를 용이 하 게 TPS는 내부 표준의 사용의 예제를 포함 합니다. 그림 1 은 신생아 (출생 후 5 일) (10 주 된) 성인 쥐 비교에서 얻은 조직에서 추출 하는 단백질에 서 부 럽에서 결과 보여줍니다. TPS 및 Smn immunoblot 그림 1A, C에에서 나와 있습니다. 각 레인에 사각형 상자 안에 형광 강도 측정 하 여 정량화는 TPS의 형광 강도의 달성 하 고 그 결과 그림 1B1 D에서 테이블에 표시 됩니다. Note 샘플 다른 조직에서 다른 TPS 단백질 밴드 패턴에 의해 특징 및 따라서 그것은 정규화 목적에 대 한 전체 차선을 사용 하는 데 필요한. 실제로, 전체 차선을 분석할 때 형광 강도 남아 상대적으로 비슷한 샘플, 나타내는 정규화에 대 한 TPS는이 목적에 적합에 걸쳐 있습니다. P5 두뇌 lysate 혼합물의 구성 하는 내부 표준도 사용 하 여 추가 다른 막 사이 비교는 방법을 설명 하기 위해 포함 되었다. 또한, 그림 2, 우리 형광 TPS를 사용 하 여 다른 발달 시간 포인트에서 단백질 수준을 비교 하는 방법을 보여줍니다. 여기, 우리 시대 (P20)와 성인 (10W) 마우스 (그림 2A) 이유 신생아 (P5)에서 뇌 lysates Smn 수준을 보여줍니다. Smn 수준을 명확 하 게 나 이와 함께 감소, TPS 정량화 그림 2B에서 볼 수 있듯이 일정 남아 있다.

Figure 1
그림 1입니다. 서 두 개의 서로 다른 연령대에서 보여주는 TPS 및 Smn 단백질 수준 마우스 조직에서 몰아내고. P5에 대 한 TPS 및 Smn 단백질 (A) 및 10 주 오래 된 (C) 마우스. (B, D) 전체 레인 TPS의 형광 강도 계산 하 고 (임의의 단위)에 표시 됩니다. M: 마커/단백질 표준; kDa: kilodalton; 거리: 임의 단위; P5: 출생 후 하루 5; 10W: 10 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 다른 발달 시간 지점에서 마우스 조직에서 Smn 표현의 분석. (A) 두뇌 lysates P5, P20 10 주 된 쥐에서 얻은 조직에서 TPS (상단 패널) 및 SMN (하단 패널)을 사용 하 여 분석 했다. (B)는 TPS의 형광 강도 계산 하 고 임의의 단위로 표시 됩니다. M: 마커/단백질 표준; kDa: kilodalton; 거리: 임의 단위; P5: 출생 후 하루 5; P20: 출생 후 하루 20; 10W: 10 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

조직 약 체중 * 1xPBS 워시 (4 ° C) 반복 세척 균질 화 버퍼 * *
척수 40 mg 150 mL 3 배 100 mL
근육 (GC) 20 mg 150 mL 3 배 100 mL
240 밀리 그램 400 mL 4 x 400 mL
심장 60 밀리 그램 400 mL 4 x 200 mL
130 mg 400 mL 4 x 400 mL
신장 45 밀리 그램 400 mL 4 x 200 mL
* 이러한 가중치는 나타내는 P8 생쥐에서 얻은 조직입니다.
* * 이러한 볼륨 표시 되며 조직의 무게에 따라 추가 조정 될 수 있다.

표 1입니다. 예상된 조직 무게와 균질 화에 사용할 PBS 세척 및 세포의 용 해 버퍼 볼륨에 대 한 해당 권고의 개요. 무게는 쥐 출생 후 주 8 (P8)에서 얻은 조직에 대 한 표시. PBS 및 세포의 용 해 버퍼 볼륨 실험 필요에 따라 아래로 확장할 수 있습니다.

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Discussion

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적절 한 실험 설계, 제어 측정 및 통계 분석, 서쪽 더 럽 히는 단백질 식 및 생물 학적 샘플의 다양 한 범위 사이 신뢰할 수 있는 양적 견적을 사용할 수 있습니다. 우리는 현재 원고에서 설명 하는 프로토콜 형광 기반의 조합을 사용 하 여 샘플, 더 크고 복잡 한 그룹 전체 정량 분석을 수행을 더럽혀 서 사용 하고자 하는 연구자에 대 한 지침 서 역할을 목표로합니다 탐지 방법, 총 단백질 로딩 정규화 및 내부 기준. 여기 초점은에 결정 하 고 비교 단백질 표정 다른 마우스 조직에서 다양 한 연령대에, 비록이 방법은 확장할 수 있습니다 또한 다른 실험 조건에서 단백질 발현을 비교 하.

우리의 현재 프로토콜에서 중앙 단계는 총 단백질 형광 총 단백질 얼룩을 측정 하 여 로드 하는 관심사의 단백질의 정규화 이다. TPS 정규화 샘플 로딩에 변화와 단백질 정량화 방법에 오류 여백에 대 한 해결합니다. 그러나, 단일 막에 분석 될 수 있는 단백질 샘플 수는 종종 제한 됩니다, 때문에 더 정규화 필요할 수 있습니다 여러 막 비교 하. 실제로, 단백질 (예를 들어 항 체 외피 시간 또는 온도 변화) 때문에 다른 막에서 감지 되는 방법 사이 가변성 프로토콜의 로드 및 정량화 단계 도입을 넘어 변화를 일으킬 수 있습니다. 여기, 우리는 단일 단백질 lysate 믹스 비교 및 젤/막 사이의 정규화에 대 한 각 젤에 3 중에 로드를 구성 하는 내부 표준 사용. 이론적으로,이 어떤 단백질 견본 수로 동일한 샘플 모든 실험에 사용할 수 있도록 충분 한 수량에 만들 수 있습니다. 우리의 실험을 사용 하 여 뇌 단백질 lysates의 혼합물 뇌 homogenates 많은 양의 단백질을 포함 하 고 일반적으로 높은 농도에서 얻을 수 있습니다. 정량화 triplicate 표준의 평균 세포 막에 걸쳐 quantifications의 정확도 증가 한 실험의 재현성을 추가 해야 합니다.

단백질 수준이 다른 기술의 숫자에 의해 결정 될 수 있다 고 분석 되 고 샘플 종류와 실험의 목표에 따라 선호 하는 방법. 서쪽의 재현 정량화 되 실험 조건 잘 마우스를 사용 하 여 정의 된 유전 배경의 다른 동물 모델 등 제어 될 수 있는 상황에서 최고의 작품 리. 반면, 인간의 환자 샘플을 사용 하 여 많은 실험에서이 덜 나이, 유전 가변성으로 가능할 수 있으며 조직 샘플링 시간 제어 보다 훨씬 더 (동물) 모델 시스템에. 항 체 특이성의 주의 유효성 검사는 중요 한 접시 기반 기술을 ELISA 등 이러한 분석에 대 한 더 적합 한 수 있습니다. 예를 들어에서 허약한 X 증후군 연구, 항 체 표시 되었습니다 다른 isoforms를 감지 하 고 ELISA ELISA 결정 모든 isoforms에 대 한 신호 단백질의 총 금액의과 이어질 것이24결합에 사용 될 때. 단백질 표정 결정 하는 방법에 대 한 최적의 선택 따라서 문맥에 따라 샘플 형식과 조사 되 고 연구 질문.

적절 한 통계 분석 생물학 데이터의 정량화에서 도출 하는 어떤 결론 든 지의 안정성에 대 한 전제 조건입니다. 통계적으로 비교 하는 다른 조직에 의해 생성 된 복잡 한 데이터 분석, 시간 포인트 또는 다른 실험 조건 및 그 조합 통계 모델링 고급 ANOVA 게시물 임시 테스트를 제공할 수 있는 보다 필요할 수 있습니다. 더 복잡 한 통계적 모델링, 혼합 효과 모델 접근, 우리는 현재 원고에서 설명 같은 수 있습니다 추구 하는 것이 좋습니다 더 biostatisticians에서 조언. 대규모 단백질 식의 적절 한 통계 분석 결과 신뢰성의 견고성과 결과의 재현성 크게 향상 시킬 수 있습니다.

요약 하자면, 우리가 여기 설명 실험적인 접근 서쪽 오 점을 사용 하 여 새롭고 흥미로운 연구 질문에 대답을 허용 하는 복잡 한 견본에서 단백질 식을 결정 하고자 하는 연구자 강력 하 고 재현할 수 방법을 제공 한다.

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Disclosures

저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

Acknowledgments

E.J.N.G.는 Wellcome 트러스트 (그랜트 106098/Z/14/Z)에 의해 지원 됩니다. SMA 신뢰 (SMA 영국 컨소시엄;에 의해 제공 된 다른 자금 T.H.G. & Y-T H.), SMA 유럽 (T.H.G, D.v.D.H. 및 E.J.N.G.), 정밀 의학 (T.H.G., L.L. & A.M.M.)에 딘 버 러의 대학 DTP 및 모터 신경 질병 연구 (T.H.G)에 대 한 이완 맥도날드 센터.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

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References

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단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교
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Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

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