Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

doi: 10.3791/59438 Published: April 9, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Denne metoden beskriver en robust og reproduserbar tilnærming for sammenligning av protein nivå i ulike vev og ulike utviklingsmessige timepoints med en standardisert kvantitative vestlige blotting tilnærming.

Abstract

Vestlige blotting er en teknikk som vanligvis brukes til å oppdage og kvantifisere protein uttrykk. Gjennom årene, har denne teknikken ført til mange fremskritt i både grunnleggende og klinisk forskning. Men som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er utfallet av Western blot analyser lett påvirket av valg i utforming og gjennomføring av eksperimentet. Bestemt housekeeping proteiner har tradisjonelt blitt brukt til å normalisere protein nivå for kvantifisering, men disse har flere begrensninger og har derfor blitt stadig kritisert de siste årene. Her beskriver vi en detaljert protokoll som vi har utviklet for å tillate oss til å gjennomføre komplekse sammenligninger av protein uttrykk variasjon over forskjellige vev, musen modeller (inkludert sykdom modeller) og utviklingsmessige timepoints. Ved å bruke en fluorescerende totale protein flekk og innføre bruk av en intern lasting standard, er det mulig å overvinne eksisterende begrensninger i antall eksempler som kan sammenlignes i eksperimenter og systematisk sammenligne protein nivå over en rekke eksperimentelle forhold. Dette utvider bruken av tradisjonelle western blot teknikker, og dermed slik at forskerne å bedre utforske protein uttrykk på tvers av ulike vev og eksempler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vestlige blotting er en teknikk som vanligvis brukes til å oppdage og kvantifisere protein uttrykk, inkludert i vev homogenates eller ekstrakter. Gjennom årene, har denne teknikken ført til mange fremskritt i både grunnleggende og klinisk forskning, der den kan brukes som et diagnostisk verktøy for å identifisere tilstedeværelsen av sykdommen1,2. Vestlige blotting ble først beskrevet i 1979 som metode for å overføre proteiner fra polyakrylamid gels nitrocellulose ark og deretter visualisere proteiner med sekundær antistoffer som er radioactively merket eller konjugert til fluorescein eller peroxidase3. Gjennom utviklingen av kommersielt tilgjengelig kits og utstyr, er vestlige blotting metoder stadig standardisert og forenklet gjennom årene. Faktisk er teknikken nå lett utført av forskere med ulik bakgrunn og nivåer av erfaring. Men som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er utfallet av Western blot analyser lett påvirket av valg i utforming og gjennomføring av eksperimentet. Det er viktig, derfor, at tilgjengeligheten av standardiserte vestlig blotting metoder ikke skjule behovet for forsiktig eksperimentelle planlegging og utforming. Eksperimentell hensyn inkluderer, men er ikke begrenset til, eksempel forberedelse og håndtering, utvalg og validering av antistoffer for proteinet oppdagelsen og gel-til-membran overføring effektiviteten av spesielt små eller store (< 10 eller > 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvaliteten på den opprinnelige prøven spiller en viktig rolle i å bestemme utfallet av påfølgende Western blot analysen. Som protein kan hentes fra en rekke prøver og kilder, inkludert cellelinjer, vev fra dyremodeller og evaluering av menneskelig vev, er konsistens i håndtering og behandling nødvendig for å oppnå reproduserbar resultater. For eksempel når langtidsoppbevaring av prøver for protein utvinning er nødvendig, er det viktig å innse at det er forskjeller i protein stabilitet mellom utdraget proteiner og intakt vev ved-80 ° C selv om protein er generelt stabile-80 ° c, rapporterte10. Videre for å få reproduserbar estimater av protein mengder, er konsekvent homogenisering av prøver avgjørende. Optimalisere forskjellige lysis buffere og homogenisering metoder (f.eks manuell homogenisering sammenlignet med automatiserte metoder) kan være nødvendig før du starter en storstilt kvantitative eksperiment.

Normalisering strategier for å korrigere protein lasting og kvantifisering variasjon er viktige å få robust, kvantitative resultatene av protein uttrykk. Rengjøring proteiner som β-utgangen, har α-tubulin, β-tubulin og glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) tradisjonelt blitt brukt til å normalisere protein nivå for kvantifisering. Imidlertid har normalisering bestemt housekeeping proteiner for kvantifisering formål blitt stadig kritisert over de siste par år11,12. For eksempel kan uttrykket av housekeeping proteiner endre over forskjellige utviklingsstadier13,14, over vev fra samme dyr4og under ulike sykdom betingelser4,15 ,16,17. Derfor begrenser bruk av bestemte housekeeping proteiner mulighetene for å lage mer komplekse sammenligninger mellom protein uttrykk fra ulike vev, på forskjellige timepoints og under varierende eksperimentelle forhold. Et alternativ til housekeeping proteiner til kontroll for protein lasting variasjon er bruken av en total protein flekk (TPS) at etiketter og visualiserer alle proteiner i et utvalg. TPS lar signal normalisering basert på total protein belastning i stedet for nivåer av en bestemt protein og derfor kvantifisering av TPS signalet skal være sammenlignbare og reproduserbar uavhengig av eksperimentelle tilstand, prøvetype utviklingsmessige timepoint . Ponceau S, stain gratis gels, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black og Cy5 (omtalt i ref. 18) er eksempler på totalt protein flekker. Hver av disse metodene har spesielle fordeler og begrensninger og metoden utvalg avhenger av tiden og verktøyene samt eksperimentelle oppsett4,18.

I tillegg til en TPS korrigere i membranen lasting og kvantifisering variasjon, kan det være nødvendig å sammenligne prøver mellom forskjellige membraner, spesielt når store protein uttrykk analyse. Imidlertid kan variasjon faktorer som antistoff bindende effektivitet og totalt protein flekken intensitet introdusere mer variasjon mellom protein prøver som analyseres på separate gels og membraner. For robust kvantifisering i denne situasjonen er det derfor nødvendig å innføre et normalisering steg videre til mellom membran variasjon. Dette kan oppnås ved å inkludere en intern lasting standard på hver av separat analysert membraner som holdes konstant over eksperimenter. Denne standarden kan ta form av noe protein lysate som fås i tilstrekkelige mengder til å brukes på tvers av alle membraner tas med i eksperimentet. Her bruker vi en lysate av musen hjernen (hentes fra 5 dagers gammel kontroll mus), fordi hjernen er lett homogenisert og fått protein lysate inneholder en betydelig mengde proteiner til høy konsentrasjon. Laster en intern standard i tre eksemplarer kan eksempler på separate membraner normalisert og sammenlignet direkte.

Her beskriver vi en detaljert protokoll som vi har utviklet for å tillate oss til å gjennomføre komplekse sammenligninger av protein uttrykk variasjon over forskjellige vev, musen modeller (inkludert sykdom modeller) og utviklingsmessige timepoints19. Ved å kombinere en fluorescerende TPS med bruk av en intern lasting standard, kunne vi overvinne eksisterende begrensninger i antall prøver og eksperimentelle forhold som kan sammenlignes med innenfor ett enkelt eksperiment. Dette utvider bruken av tradisjonelle Western blot teknikker, og dermed slik at forskerne å bedre utforske protein uttrykk på tvers av ulike vev og eksempler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vev for denne prosedyren ble innhentet fra dyrestudier som ble godkjent av den interne etiske komiteen ved University of Edinburgh og ble utført i samsvar med institusjonelle og UK Home Office forskrifter under myndighet av relevante personlig og lisenser.

Merk: Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av standardiserte, kommersielt tilgjengelig kits og reagenser for å øke reproduserbarhet (se Tabell for materiale).

1. forberedelse av prøver

  1. Protein utvinning
    1. Overføre snapin-frosne celle eller vevsprøver fra-80 ° C på tørris, tine på is og vaskes etter behov med is kaldt 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) (om vev og PBS vasker, se tabell 1). Unngå unødvendige fryse-Tin sykluser som vil påvirke protein kvalitet.
    2. Legge til radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, 0,1% SDS) som inneholder 1 x protease hemmer til hver prøve, bruker den optimale mengden per vev vekt (se tabell 1 for anbefalinger).
      Merk: Avhengig av applikasjonen, typen og mengden homogenisering bufferen må ytterligere optimalisering.
    3. Bruke en håndholdt elektrisk homogenizer med en polypropylen støter til homogenize vevsprøver. Mellom hver prøve, vask pistil i dobbel-destillert vann og tørk med en ren vev. Endre pistil mellom forskjellige eksperimentelle forhold og vev.
    4. La prøvene på is 10 min etter homogenisering. Sentrifuge prøvene på > 10 000 x g ved 4 ° C i 10 min.
    5. Overføre nedbryting til en ny tube på is uten å forstyrre pellet. Nedbryting er protein prøven. Lagre utdraget protein-80 ° c eller direkte fortsette å måle protein konsentrasjonen.
  2. Kvantifisering og normalisering av protein konsentrasjon
    1. Måle protein konsentrasjonen med en bicinchoninic syre (BCA) analysen. Forberede en BCA analysen blanding i henhold til produsentens instruksjoner i en 96-brønns optisk plate med 200 µL av BCA blanding per brønn.
      Merk: Andre kvantifisering metoder som Lowry og Bradford analyser kan også brukes til å bestemme protein konsentrasjon som protein konsentrasjon er kvantifisert konsekvent over eksperimenter.
    2. Forberede bovin serum albumin (BSA) standarder på økende konsentrasjoner i tre eksemplarer og legge til 1 µL av hver protein prøve i duplikat. Inkuber 96-brønns platen i en forvarmet varme blokk på 60 ° C i 10 min eller lenger hvis protein konsentrasjonen er ventet å bli lav.
    3. Etter inkubasjon måle opptaket på 560 nm likner en plate.
    4. Eksportere plate leser målingene og beregne protein konsentrasjonen ved å sammenligne gjennomsnittlig absorbansen verdiene for hvert utvalg til en standard kurve innhentet ved hjelp av protein-standarden. Den R-kvadrerte verdien for standardkurven bør være større enn eller lik 0,98 nøyaktig beregne prøve protein konsentrasjon.
    5. Normalisere mengden av protein ved å forberede fortynninger av protein prøver prøve buffer og ultrapure vann. Det totale volumet kan justeres avhengig av gel brukes. Lasting 30 µg protein per lane som en startbeløpet anbefales. Legge til reduksjonsmiddel som dithiothreitol (DTT; siste konsentrasjon 5 mM) eller beta-mercaptoethanol (siste konsentrasjon 200 mM) til hvert utvalg som kreves. Pipetter ufortynnet beta-mercaptoethanol i avtrekksvifte.
    6. Inkuber prøvene i en varme blokk ved 70 ° C i 10 min. sette prøvene på is, vortex og Nedspinning kort for å samle. Hold på is inntil lasting gel.

2. gel geleelektroforese av protein prøver

  1. Enheten og gel satt opp
    1. Oppsett av precast 4-12% Bis-Tris gradering gel (se Tabell for materiale) i gel geleelektroforese kammeret systemet. Skyll gels med dobbel-destillert vann før bruk.
      Merk: Avhengig av størrelse, samhandlinger og overflod av protein av interesse, gels med forskjellige gradering, bufring agent eller bra størrelse og antall kan brukes.
    2. Legg til 500 mL 1 x MES SDS kjører buffer fortynnet i dobbel-destillert vann per tank. Fjern forsiktig kammen fra geléer etter bufferen som kjører uten å forstyrre brønnene i stabling gel.
  2. Protein lasting
    1. Legg 3,5 µL av et protein som er standard i brønnen. Avhengig av oppsettet eksempel kan lasting et protein stige på begge sider av gel hjelpe i mer nøyaktig beregning protein størrelse. Bruke tynn gel lasting tips for mer nøyaktig utvalg lasting.
    2. Når du bruker en intern standard for mellom membran normalisering (se trinn 5 nedenfor og diskusjon), laste et beløp som tilsvarer de andre prøvene i de første 3 brønnene ved protein stigen.
    3. Laste inn 30 µg av hvert utvalg i gjenværende brønnene. Legge til 1 x prøve buffer alle tomme brønner.
  3. Geleelektroforese
    1. Samle gel tanken etter lasting prøvene. Kjør prøvene gjennom stabling gel på 80 V for 10 min etterfulgt av 150 V for en ekstra 45-60 minutter.

3. protein overføring

Merk: Protein overføring i denne protokollen utføres ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig semi-tørr blotting systemet (se Tabellen for materiale) for rask og konsekvent resultater.

  1. Klargjør protein overføring av soaking pre filter papir i dobbel-destillert vann og sikre gel kniven, plast Pasteur pipette, blotting roller og tang er klar til bruk.
  2. Åpne overføring stakken ved å nøye fjerne alle innpakning folie. Fjerne toppen fra bunnen stabelen og sett det til side. Raskt fukt membranen i bunnen stakken med flere dråper geleelektroforese kjører buffer (2-3 mL). Når overføringen stakken er åpen, er det viktig å unngå PVDF membranen tørker ut.
  3. Etter avsluttet i geleelektroforese, åpne sandsekk gel bruker gel kniven og kuttet av stabling gel. Kuttet gel langs kantene for å frigjøre den fra plast støpt. Holde gel kniven våt for å forhindre skade å gel.
  4. Montere overføring stakken fra bunn til topp: nederste stack (inneholder PVDF membranen), protein gel, filter papir. Bruk blotting valsen for å fjerne alle luftbobler. Plasser øverste stabelen på filter papir og rulle i stabelen igjen for å fjerne luftbobler. Ikke Skyv for sterkt det kan forårsake gel å deformeres under protein overføre.
  5. Overføre hele stabelen i overføringsenheten med elektroden på venstre side av enheten og plassere gel svamp på stakken slik at den justeres tilsvarende elektriske kontakter på enheten. Stenger lokket, velger og starte riktig program (20 V i 7 min er anbefalte utgangspunkt).
  6. Når ferdig, la lokket stengt i 2 minutter slik at stabelen å kjøle og hindre membranen tørker. Fjerne overføre stakken og kuttet membranen gel størrelsen. Vask kutte membranen raskt med dobbel-destillert vann før du fortsetter med totalt protein flekken.

4. totalt protein flekker

Merk: Bruke fluorescerende oppdagelsen gir en betydelig fordel over mer tradisjonelle tilnærminger (f.eks ECL gjenkjenning), som lineær området og følsomheten kan være mye bedre kontrollert4. Derfor, i trinn 4 og 5, et lysstoffrør TPS og fluorescerende sekundære antistoffer brukes (se Tabell for materiale).

  1. Kast membranen i en 50-mL tube med protein vendt innover. På grunn av lysfølsomhet fluorescerende TPS og sekundære antistoffer utføres alle etterfølgende trinnene i mørket.
  2. Legge til 5 mL av protein flekk løsning (se Tabell for materiale) og Inkuber på rull i 5 minutter ved romtemperatur. Fordi TPS og vaskebuffer inneholder metanol, bære følgende ut i avtrekksvifte.
  3. Forkaste flekker løsningen og vask to ganger raskt med de 5 mL vaskeløsning (6,3% eddiksyre i 30% metanol). Sett røret kort på valsen mellom vask trinn. Skyll membranen kort med ultrapure vann før du fortsetter.

5. blokkering, antistoff inkubasjon og oppdagelsen

  1. Blokkerer membranen: legge 3 mL blokkerer buffer (se Tabell of Materials) til 50 mL røret som inneholder membranen. Inkuber membranen på rull i 30 min ved romtemperatur. Avhengig av valget av antistoff, kan typen sperring bufferen kreve optimalisering.
  2. Primære antistoff inkubasjon
    1. Fjerne blokkering buffer og Erstatt med det primære antistoffet på riktig, optimalisert konsentrasjon (figur 1 og figur 2: musen-anti-SMN, på 1:1, 000, fortynnet i blokkering buffer).
      Merk: Tilstrekkelig optimalisering av primære antistoffer bør inkludere bekreftelse at antistoffer oppdager et protein produkt av riktig størrelse mens viser ingen eller minimal binding til andre, uspesifikke protein produkter. Hvis mulig, teste og sammenligne flere antistoffer mot protein av interesse.
    2. Inkuber membranen på rull overnatting på 4 ° C. Neste dag, fjerne antistoff løsningen og vask 6 ganger i 5 min med 1 x PBS på rull ved romtemperatur (RT).
  3. Sekundær antistoff inkubasjon
    1. Forberede bestemt sekundære antistoffer på 1:5,000 mot rekke primære antistoffer i 5 mL blokkerer buffer. Andre sekundære antistoffer kan kreve andre fortynninger eller bruk av alternativ blokkerer buffere.
    2. Inkuber membranen med den sekundære antistoff løsningen på rull 1t på RT. Inkubasjon vaskes membranen tre ganger 30 min med 1 x PBS på rull.
    3. Tørr membranen og holde membranen beskyttet mot lys med aluminiumsfolie til gjenkjenning. Membraner kan holdes på 4 ° C for langtidslagring.
  4. Bildeopptak
    1. Logg på datamaskinen som er koblet til skanneren. Plasser membranen på skanneren med protein siden vendt nedover og velg skanneområdet i programvaren.
    2. Optimalisere laser intensiteten for begge (700 nm og 800 nm) kanaler, ved å bekrefte ingen metning oppstår. Bildene i begge kanaler og eksporter bilder for videre analyse (trinn 6).

6. Western blot analyse og kvantifisering

Merk: Disse anbefalingene er basert på fritt tilgjengelig bilde Studio programvare. Imidlertid sammenlignbare analyser kan også gjøres ved hjelp av andre programvarepakker som ImageJ.

  1. Importer filen: opprette et lokale arbeidsområde på datamaskinen brukes til analyseformål. Dette genererer en database avbildningsfiler for ervervet vestlige blots. Importfilene innhentet på skanneren og velge bildet for analyse.
  2. TPS analyse
    1. Vise 700 nm kanalen for å vise totale protein flekker resultatet. Et eksempel på en TPS bildet er inkludert i figur 1 hvilke ulike vev fra neonatal (P5) (figur 1A-B) og 10 - uke gamle mus (Figur 1 C D) sammenlignes direkte. Tilsvarende viser figur 2 et eksempel på en direkte sammenligning av hjernevevet fra mus i ulike aldre.
    2. Velg analyse kategorien fra øverst til høyre og velg Legg til rektangel definere området av interesse for normalisering (figur 1B, D). Kopier og lim det første området på hver enkelt prøve å sikre definerte regionen er på samme størrelse for alle analysert kjørefelt.
    3. Kopier resultatet fra kategorien figurer i nedre venstre hjørne av programvaren.
  3. Kvantifisering
    Merk: Den optimale tilnærmingen for kvantifisere prøver, avhenger av eksperimentell design. Vi vil her gi et illustrerende eksempel på deteksjon av overlevelse motor neuron protein (Smn, viktige protein er involvert i neuromuscular sykdommen spinal muskel atrofi20,21), som kan redusere over tid 19 og hvordan normalisering av Smn signal intensiteten TPS gir pålitelige beregninger av protein uttrykk utvikling.
    1. Figur 2 viser en reduksjon av Smn uttrykk med økende alder på dyret med TPS som protein laster inn kontroll. Gjenta trinn 6.2.1-6.2.3 å kvantifisere protein lasting (figur 2B). Gjenta trinn 6.2.1-6.2.3 i 800 nm kanalen (figur 2A) til å analysere protein av interesse.
    2. Kopiere resultatene fra både TPS og protein rundt til et regnearkprogram. På regnearket første normalisere protein lasting ved å bestemme høyeste TPS signalet og dele hver TPS signal verdien med dette å få normalisert protein lasting verdi.
    3. Dele 800 nm signal verdien fra hver enkelt prøve med tilsvarende normalisert protein verdi å beregne relative protein uttrykk forholdet i forskjellige prøver.
    4. Etter den første normalisering, kan du sammenligne ulike tidspunkt eller vev til gjennomsnittsverdien av interne standarden å tillate direkte sammenligninger over forskjellige membraner og eksperimenter.

7. statistikk

  1. For å finne noen statistisk signifikante forskjeller i protein uttrykk over komplekse og store grupper av prøver, kreves det passende statistiske metoder. Selv om en detaljert gjennomgang av statistisk bakgrunn går utenfor omfanget av dette papiret, vil vi markere flere hensyn og detaljer en vellykket tilnærming som vi har brukt tidligere19.
  2. Som for mange eksperimenter representerer ikke protein kvantifisering mål helt uavhengige data. Her, for eksempel er flere vev vanligvis Hentet fra eneste dyr å bestemme protein nivå over flere organer på en enkelt eksperimentelle tidspunkt. Derfor brukte vi en blandet effekter modeller for å analysere forskjeller i protein uttrykk over tid, og mellom vev.  Generelt gir blandet effekter modeller en effektiv måte å håndtere ikke-uavhengighet og dermed unngå pseudo replikering22,23. I den foreliggende sak øke blandet effekter modeller statistisk styrke av regnskap for gjentatte målinger blant vev, i individer. Vi bruker statistiske programvarepakken R for å utføre disse analysene, da dette er fritt tilgjengelig og allsidig. Men kunne andre tilsvarede pakker utføre lignende analyser.
  3. Dagens eksperimentelle design innebærer en "split tomten" design fordi hver musen tilhørte bare en aldersgruppe. Derfor modellert vi enkelte mus (mus ID) som en tilfeldig effekt med en unik ID; Vi stod også for vev, alder og deres samspill som fast effekter. Vi modellert dataene med funksjonen lmer i R-biblioteket lme4. Som et kvalitetskontroll skritt, vi visualisert rest å vurdere forutsetningene med lik varians og vanlig fordeling og forvandlet data der det er nødvendig for å møte disse forutsetningene. For å teste for en vesentlig grad av samhandling mellom vev og alder, passer vi en identisk modell som manglet denne interaksjonen, og sammenlignet modeller med parametrisk bootstrapping (R funksjonen PBmodcomp i biblioteket pbkrtest).  Hvor betydelig interaksjon oppsto, brukte vi funksjonen emmeans (i emmeans R biblioteket) å finne årsaken til samhandlingen.  For eksempel sammenlignet vi mener uttrykk blant alder klassene i hvert vev; en vesentlig grad av samhandling kan oppstå mellom alder og vev dersom, si, to gitt alder klasser avvek betydelig for en vev, men ikke en annen. Oppsummert er disse tilnærmingene en måte å utvide robust konklusjoner fra western blot eksperimenter ved å gi statistiske støtte til disse resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har eksempler på bruk av TPS og en intern standard, slik at sammenligninger av protein nivå over vev og tidspunkt. Figur 1 viser resultater fra vestlige blotting på protein utvunnet fra vev fra neonatal (postnatal dag 5) i forhold til voksne mus (10 - uke gamle). TPS og Smn immunoblot er vist i figur 1A, C. Kvantifisering av fluorescens intensiteten av TPS ble oppnådd ved å måle fluorescens intensiteten i boksen rektangel på hver bane, og resultatene vises i tabellene i figur 1B og 1 D. Merk at prøver fra ulike vev er preget av ulike TPS protein bandet mønstre og derfor er det nødvendig å bruke hele kjørefelt for normalisering. Faktisk, når hele baner blir analysert, forblir fluorescens intensiteten relativt lik i et datautvalg, TPS for normalisering er egnet for dette formålet. En intern standard bestående av en P5 hjernen lysate blanding ble også inkludert for å illustrere hvordan den kan brukes for videre sammenligninger mellom forskjellige membraner. Videre i figur 2viser vi hvordan en fluorescerende TPS kan brukes til å sammenligne protein nivå på ulike utviklingsmessige tidspunkt. Her viser vi Smn nivåer i hjernen lysates fra neonatal (P5), avvenning alder (P20) og voksen (10W) mus (figur 2A). Selv om Smn nivåer tydelig reduseres med alderen, forblir TPS kvantifisering konstant som vist i figur 2B.

Figure 1
Figur 1. Western blotter viser TPS og Smn protein nivå i musen vev på to ulike aldersgrupper. TPS og Smn protein for P5 (A) og 10 uke gamle (C) mus. (B, D) Fluorescens intensiteten av hele kjørefelt TPS ble beregnet og er indisert (i vilkårlig enheter). M: markør/protein standard; kDa: kilodalton; a.u.: tilfeldig enhet; P5: postnatal dag 5; 10W: 10 uker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Analyse av Smn uttrykk i mus vev på ulike utviklingsmessige tidspunkt. (A) hjernen lysates fra vev innhentes fra P5, P20 og 10 uke gamle mus ble analysert TPS (topp panel) og SMN (nedre panelet). (B) fluorescens intensiteten av TPS ble beregnet og er angitt i vilkårlig enheter. M: markør/protein standard; kDa: kilodalton; a.u.: tilfeldig enhet; P5: postnatal dag 5; P20: postnatal dag 20; 10W: 10 uker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vev Ca vekt * 1xPBS vask (4 ° C) Gjenta vask Homogenisere buffer **
Ryggmargen 40 mg 150 mL 3 x 100 mL
Muskel (GC) 20 mg 150 mL 3 x 100 mL
Hjernen 240 mg 400 mL 4 x 400 mL
Hjerte 60 mg 400 mL 4 x 200 mL
Leveren 130 mg 400 mL 4 x 400 mL
Nyre 45 mg 400 mL 4 x 200 mL
* Disse vektene er indikativ verdier for vev innhentes fra P8 mus.
** Disse volumene er indikasjoner og kan bli ytterligere justert i henhold til vekten av vev.

Tabell 1. Oversikt over forventede vev vekter og tilsvarende anbefalinger for PBS vasker og lyse buffer volum som skal brukes for homogenisering. Vekter er indikasjoner for vev innhentes fra postnatal dag 8 (P8) mus. PBS og lyseringsbufferen buffer volumer kan skaleres opp og ned eksperimentelle behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med riktig eksperimentell design, kontrolltiltak og statistisk analyse, kan vestlige blotting brukes å gjøre pålitelige kvantitative beregninger av protein uttrykk innenfor og mellom et variert utvalg av biologiske prøver. Protokollen vi beskriver i gjeldende manuskriptet skal fungere som en retningslinje for forskere som ønsker for å bruke Western blotting for å gjennomføre kvantitativ analyse over større og mer komplekse grupper av prøver, ved hjelp av en kombinasjon av fluorescens-basert oppdagingsmetoder, totalt protein lasting normalisering og interne standarder. Selv om Hovedvekten er på fastsettelse og sammenligne protein uttrykk fra annen mus vev og på ulike aldersgrupper, kan denne tilnærmingen også utvides for å sammenligne protein uttrykk i andre eksperimentelle forhold.

En sentral skritt i våre nåværende protokollen er normalisering av proteiner rundt totale protein lastet kvantifisere en fluorescerende totale protein flekk. TPS normalisering korrigerer for variasjon i eksempel lasting og feil marginene i protein kvantifisering metoder. Men fordi antall protein utdrag som kan analyseres på en enkelt membranen er begrenset, må ytterligere normalisering sammenligne flere membraner. Faktisk forårsake variasjon mellom hvordan proteiner er oppdaget på ulike membraner (på grunn av for eksempel antistoff inkubasjon tid eller temperatur variasjon) variasjon enn introdusert gjennom lasting og kvantifisering trinnene av protokollen. Her, bruker vi en intern standard som består av en enkelt protein lysate blanding som er lastet inn i tre eksemplarer på hver gel og tillater sammenligning og normalisering mellom gels/membraner. Teoretisk sett kan dette være noe protein prøve, så lenge det kan gjøres i tilstrekkelig antall slik at det samme eksemplet kan brukes for alle eksperimentene. I vårt forsøk bruker vi en blanding av hjernen protein lysates, som hjernen homogenates inneholder store mengder av protein og hentes vanligvis på en høy konsentrasjon. Snitt kvantifisering av tre eksemplarer skal ytterligere øke nøyaktigheten av quantifications membraner og bidra til reproduserbarhet av eksperimentet.

Protein nivå kan bestemmes av en rekke ulike teknikker og den foretrukne metoden avhenger av hvilken prøven blir analysert og målet med forsøket. Reproduserbar kvantifisering av Western blot fungerer best i situasjoner der eksperimentelle forhold kan være godt kontrollert, som når bruker musen eller andre dyr modeller av definerte genetisk bakgrunn. Derimot mange eksperimenter med menneskelige pasientprøvene, dette kan være mindre mulig som alder, genetisk variasjon og vev samplingstidspunkt er mye vanskeligere å administrere enn i (dyr) modellsystemer. Plate-baserte teknikker som ELISA kan være mer egnet for disse analysene, men forsiktig valideringen av antistoff spesifisitet er avgjørende. For eksempel i skjøre X syndrom forskning, antistoffer har vist seg å oppdage ulike isoformene og i ELISA dette ville føre til overvurdering av den totale mengden protein som ELISA bestemmer et signal for alle isoformene kombinert24. Optimale valg for metoder for å bestemme protein uttrykk er derfor prøve avhengig av konteksten, type og problemstillingen som undersøkes.

Utføre tilstrekkelig statistisk analyse er en forutsetning for påliteligheten i alle konklusjonene fra kvantifisering av biologiske data. Statistisk analysere komplekse data generert ved å sammenligne forskjellige vev, tid peker eller andre eksperimentelle forhold og kombinasjoner av disse krever mer avansert statistisk modellering enn VARIANSANALYSE med post-hoc testing kan levere. For mer komplekse statistiske modellering, som i blandet effekter modell tilnærming, vi beskriver i gjeldende manuskriptet, kan det være lurt å søke ytterligere råd fra biostatisticians. Tilstrekkelig statistisk analyse av store protein uttrykk kan forbedre robust resultatene og pålitelighet og reproduserbarhet resultater.

I sammendraget gir eksperimentelle tilnærmingen vi beskriver her en robust og reproduserbar metode for forskere som vil finne protein uttrykk med western blot i komplekse prøver tillater for å svare på nye og spennende forskning spørsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.

Acknowledgments

E.J.N.G. støttes av Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Annen finansiering er levert av SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T. H.) SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. og E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP i presisjon medisin (T.H.G., ll og A.M.M.) og Euan MacDonald Centre for Motor neuron sykdom Research (T.H.G).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Tipped Gel Loading Tips Alpha Laboratories GL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL ThermoFisher Scientific 78437
Handheld homogeniser  VWR Collection 431-0100
iBlot 2 Gel Transfer Device ThermoFisher Scientific IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size ThermoFisher Scientific IB401031
Image Studio Lite Licor N/A Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW secondary antibodies Licor -- Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) ThermoFisher Scientific NP0001
Odyssey Blocking Buffer Licor 927-40000
Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody BD Transduction Laboratories 610646 Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number
REVERT Total Protein Stain, 250 mL  Licor 926-11021 
REVERT Wash Solution  Licor 926-11012 
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19, (11), 1887-1888 (2012).
  2. Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
  3. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8, (8), e72457 (2013).
  5. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11, (5), 549-560 (2014).
  6. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379, (4), 409-412 (2009).
  7. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379, (4), 389-395 (2009).
  8. Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16, (2), 196-198, 200-192 (1994).
  9. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  10. Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24, (11), 973-977 (2014).
  11. Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290, (50), 29692-29694 (2015).
  12. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55, (3), 217-226 (2013).
  13. Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37, (4), 630-634 (2016).
  14. Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7, (8), e43028 (2012).
  15. Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13, (11), 4546-4557 (2014).
  16. Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
  17. Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23, (12), 1794-1801 (2006).
  18. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17, (20), (2017).
  19. Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27, (16), 2851-2862 (2018).
  20. Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. (2018).
  21. Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14, (4), 214-224 (2018).
  22. Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. Wiley-Interscience. (2004).
  23. Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16, (10), e2007054 (2018).
  24. LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7, (12), (2016).
Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).More

Huang, Y. T., van der Hoorn, D., Ledahawsky, L. M., Motyl, A. A. L., Jordan, C. Y., Gillingwater, T. H., Groen, E. J. N. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J. Vis. Exp. (146), e59438, doi:10.3791/59438 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter