Summary
Este método descreve uma abordagem robusta e reprodutível para a comparação dos níveis de proteína nos tecidos diferentes e em diferentes momentos do desenvolvimento, utilizando uma abordagem de mancha ocidental quantitativa padronizada.
Abstract
Mancha ocidental é uma técnica que é comumente usada para detectar e quantificar a expressão da proteína. Ao longo dos anos, esta técnica tem levado a muitos avanços na pesquisa básica e clínica. No entanto, tal como acontece com muitas técnicas experimentais semelhantes, o resultado das análises de Western blot é facilmente influenciado por escolhas feitas na concepção e execução do experimento. As proteínas específicas das tarefas domésticas tem sido tradicionalmente usadas para normalizar os níveis de proteína para quantificação, no entanto, estes têm um número de limitações e, portanto, têm sido cada vez mais criticadas durante os últimos anos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que desenvolvemos para permitir-nos realizar comparações complexas de variação de expressão de proteínas em tecidos diferentes, modelos de rato (incluindo modelos de doença) e momentos do desenvolvimento. Usando uma mancha de proteína total fluorescente e introduzindo o uso de um padrão de carregamento interno, é possível superar as limitações existentes no número de amostras que podem ser comparadas dentro de experiências e comparar sistematicamente os níveis de proteína através de um gama de condições experimentais. Esta abordagem expande o uso de técnicas de borrão ocidental tradicional, permitindo assim que os investigadores para melhor explorar a expressão da proteína através de amostras e tecidos diferentes.
Introduction
Mancha ocidental é uma técnica que é comumente usada para detectar e quantificar a expressão da proteína, inclusive em tecido homogenates ou extratos. Ao longo dos anos, esta técnica tem levado a muitos avanços na pesquisa básica e clínica, onde ele pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para identificar a presença de doença1,2. Mancha ocidental foi descrita primeiramente em 1979 como um método de transferência de proteínas de géis de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose e posteriormente Visualizar proteínas usando anticorpos secundários que foram radioactivamente rotulados ou conjugados com fluoresceína ou peroxidase3. Através do desenvolvimento de kits comercialmente disponíveis e equipamentos, métodos de mancha ocidentais foram cada vez mais padronizados e simplificados ao longo dos anos. Com efeito, a técnica agora é facilmente realizada por cientistas de diferentes origens e níveis de experiência. No entanto, tal como acontece com muitas técnicas experimentais semelhantes, o resultado das análises de Western blot é facilmente influenciado por escolhas feitas na concepção e execução do experimento. É importante, portanto, que a acessibilidade dos métodos padronizados de mancha ocidentais não obscurecer a necessidade de planejamento experimental e design. Considerações experimentais incluem, mas não limitada a, amostra de preparação e manipulação, seleção e validação de anticorpos para a deteção de proteína e eficiência de transferência de gel-para-membrana de particularmente pequenas ou grandes (< 10 ou > 140 kDa) proteínas4,5,6,7,8,9. Qualidade de proteína da amostra original desempenha um papel significativo na determinação do resultado da análise subsequente borrão ocidental. Como a proteína pode ser extraída de uma grande variedade de fontes, incluindo linhas de células, os tecidos de modelos animais e tecidos humanos post-mortem e amostras de consistência na manipulação e processamento é necessário para obter resultados reprodutíveis. Por exemplo, quando é necessário o armazenamento a longo prazo das amostras para a extração da proteína, é importante perceber que, embora a proteína é geralmente estável a-80 ° C, as diferenças na estabilidade da proteína entre proteínas extraídas e tecidos intactos a-80 ° C têm sido relatado em10. Além disso, para obter estimativas reprodutíveis das quantidades de proteína, consistente homogeneização das amostras é crucial. Otimização de buffers de Lise diferentes e métodos de homogeneização (por exemplo, manual homogeneização em comparação com métodos automatizados) pode ser necessária antes de iniciar um experimento em grande escala quantitativo.
Estratégias de normalização para corrigir a variação de carga e quantificação de proteína são essenciais para obter resultados quantitativos, robustos da expressão da proteína. Limpeza de proteínas tais como β-actina, α-tubulina e β-tubulina gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) tem sido tradicionalmente usados para normalizar os níveis de proteína para quantificação. No entanto, normalização para proteínas de limpeza específico para fins de quantificação tem sido cada vez mais criticada sobre o passado poucos anos11,12. Por exemplo, a expressão de proteínas de limpeza pode alterar entre diferentes estádios de desenvolvimento13,14, através de tecidos do mesmo animal4e sob vários doença condições4,15 ,16,17. Portanto, a utilização de proteínas específicas de limpeza limita as possibilidades de fazer comparações mais complexas entre a expressão da proteína de diferentes tecidos, em diferentes momentos e sob diferentes condições experimentais. Uma alternativa às proteínas de limpeza para controle para variação de carga de proteína é o uso de uma mancha de proteína total (TPS) que rotula e visualiza todas as proteínas presentes em uma amostra. TPS permite a normalização do sinal com base na carga de proteína total, ao invés de níveis de uma proteína específica e, portanto, a quantificação do sinal TPS devem ser comparáveis e reprodutíveis, independentemente da condição experimental, tipo de amostra ou Commit do desenvolvimento . Ponceau S, géis mancha-livre, R-350 de Coomassie, Ruby-Sypro, Epicocconone, Amydo Black e Cy5 (revisto em ref. 18) são exemplos de manchas de proteínas totais. Cada um desses métodos tem limitações e vantagens específicas e seleção do método depende do tempo e ferramentas disponíveis, bem como a instalação experimental4,18.
Além de usar um TPS para corrigir a carga dentro da membrana e variabilidade de quantificação, pode ser necessário comparar amostras entre diferentes membranas, particularmente ao realizar a análise de expressão de proteínas em larga escala. No entanto, a variabilidade em fatores como eficiência e total intensidade de coloracao de proteína de ligação de anticorpos pode introduzir mais variabilidade entre amostras de proteínas que são analisadas em separado geles e membranas. Para quantificação robusta nesta situação, portanto, é necessário introduzir um novo passo de normalização para levar em conta a variabilidade between-membrana. Isto pode ser conseguido, incluindo um padrão de carregamento interno em cada uma das membranas que é mantida constante através de experiências analisadas separadamente. Esta norma pode assumir a forma de qualquer proteína lisada que podem ser obtidos em quantidades suficientes para ser usado em todas as membranas incluídas no experimento. Aqui, usamos um lisado de cérebro de rato (obtido de ratos do controle 5 dias de idade), como o cérebro é prontamente homogeneizado e a lisado de proteína obtida contém uma quantidade significativa de proteína em uma concentração elevada. Carregar um padrão interno em triplicado permite amostras em membranas diferentes para ser normalizado e comparado diretamente.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que desenvolvemos para permitir-nos realizar comparações complexas de variação de expressão de proteínas em tecidos diferentes, modelos de rato (incluindo modelos de doença) e momentos do desenvolvimento19. Combinando um fluorescente TPS com o uso de um padrão de carregamento interno, conseguimos superar as limitações existentes no número de amostras e condições experimentais que podem ser comparadas dentro de uma única experiência. Esta abordagem expande o uso de técnicas de borrão ocidental tradicional, permitindo assim que os investigadores para melhor explorar a expressão da proteína através de amostras e tecidos diferentes.
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Protocol
Tecidos para este procedimento foram obtidos em estudos com animais que foram aprovados pelo Comitê de ética interno da Universidade de Edimburgo e realizaram-se em concordância com os institucionais e regulamentares de UK Home Office sob a autoridade dos relevantes pessoais e as licenças do projeto.
Nota: Este protocolo foi otimizado usando padronizados, disponíveis comercialmente kits e reagentes, a fim de aumentar a reprodutibilidade (ver Tabela de materiais).
1. preparação das amostras
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Extração de proteínas
- Célula de transferência snap-congelado ou amostras de tecido de-80 ° C, em gelo seco, descongelar no gelo e lavar, se necessário gelo frio 1 x tampão fosfato salino (PBS) (para obter detalhes sobre os tecidos e lavagens de PBS, ver tabela 1). Evite ciclos de congelamento e descongelamento desnecessário como isso afetará a qualidade de proteína.
- Adicionar radioimmunoprecipitation buffer de ensaio (RIPA) (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1% NP-40, Deoxycholate do 1% de sódio, 0,1% SDS) contendo 1 x inibidor de protease para cada amostra, usando a quantidade ideal por peso do tecido (ver tabela 1 para recomendações).
Nota: Dependendo da aplicação, o tipo e a quantidade de tampão de homogeneização podem precisar de mais otimização. - Use um homogeneizador portátil elétrico com um pilão de polipropileno para homogeneizar as amostras de tecido. Entre cada amostra, lave o pilão em água bidestilada e seque com um tecido limpo. Trocar o pilão entre diferentes condições experimentais e os tecidos.
- Deixe as amostras no gelo por 10 minutos após homogeneização. Centrifugar as amostras em > 10.000 x g a 4 ° C por 10 min.
- Transferi o sobrenadante para um tubo novo no gelo sem perturbar o sedimento. O sobrenadante é a amostra de proteína. Loja da proteína extraída a-80 ° C ou diretamente proceder à medição da concentração de proteína.
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Quantificação e a normalização da concentração de proteína
- Medir a concentração de proteína usando um ensaio de ácido (BCA) bicinchoninic. Prepare uma mistura de ensaio BCA de acordo com as instruções do fabricante em uma placa de 96 poços óptica com 200 µ l do mix BCA por bem.
Nota: Outros métodos de quantificação, tais como ensaios Lowry e Bradford também podem ser usados para determinar a concentração de proteína, enquanto a concentração de proteína é quantificada consistentemente através de experimentos. - Prepare a albumina de soro bovino padrões (BSA) em aumentar as concentrações em triplicado e adicionar 1 µ l de cada amostra de proteína em duplicado. Incube a placa de 96 poços em um bloco de calor pré-aquecido a 60 ° C durante 10 minutos ou mais, se a concentração de proteína deverá ser baixo.
- Após a incubação, medir a absorção em 560 nm, utilizando um leitor de placa.
- As medições de leitor de placa de exportação e calcular a concentração de proteína, comparando os valores de absorvância média de cada amostra para uma curva padrão obtida usando o padrão de proteína. O valor de R-quadrado para a curva padrão deve ser maior ou igual a 0,98 para estimar com precisão a concentração de proteína da amostra.
- Normalize a quantidade de proteína por preparar diluições de amostras da proteína em água ultrapura e amortecedor da amostra. O volume total pode ser ajustado dependendo do tipo de gel utilizado. 30 µ g de proteína por raia como um montante inicial de carregamento é recomendado. Adicionar agente redutor como ditiotreitol (DTT; concentração final 5 mM) ou beta-mercaptoetanol (concentração final 200 mM) para cada amostra, conforme necessário. Pipete beta-Mercaptoetanol diluído em uma coifa.
- Incube as amostras em um bloco de calor a 70 ° C durante 10 min. colocar as amostras no gelo, vórtice e spin-down brevemente para coletar. Manter-se no gelo até carregar o gel.
- Medir a concentração de proteína usando um ensaio de ácido (BCA) bicinchoninic. Prepare uma mistura de ensaio BCA de acordo com as instruções do fabricante em uma placa de 96 poços óptica com 200 µ l do mix BCA por bem.
2. electroforese do gel de amostras da proteína
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Dispositivo e gel configurar
- Instalação de um gradiente de Bis-Tris pré-moldado 4 – 12% gel (ver Tabela de materiais) no sistema de câmara de gel de eletroforese. Lave o gel usando água bidestilada antes do uso.
Nota: Dependendo do tamanho, interações e abundância da proteína de interesse, de gel com um gradiente diferente, buffer agente ou bem tamanho e o número pode ser usado. - Adicione 500 mL de 1 x MES SDS, executando o tampão diluído em água bidestilada por tanque. Retire cuidadosamente o pente dos géis após a adição de buffer de execução sem perturbar os poços no gel de empilhamento.
- Instalação de um gradiente de Bis-Tris pré-moldado 4 – 12% gel (ver Tabela de materiais) no sistema de câmara de gel de eletroforese. Lave o gel usando água bidestilada antes do uso.
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Carregamento de proteína
- Carrega 3,5 µ l de uma proteína padrão dentro do poço. Dependendo do layout da amostra, carregar uma escada de proteína em ambos os lados do gel pode ajudar mais estimar com precisão o tamanho da proteína. Use gel de ponta fina, carregando dicas para carregamento de amostra mais precisa.
- Ao usar um padrão interno para normalização between-membrana (consulte a etapa 5 abaixo e discussão), carregar uma quantidade que é igual a outros exemplos para os 3 primeiros poços ao lado da escada de proteína.
- Carga 30 µ g de cada amostra em poços restantes. Adicione 1 x tampão de amostra para todos os poços vazios.
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Eletroforese
- Monte o tanque gel depois de carregar as amostras. Execute os exemplos através do gel de empilhamento em 80 V por 10 min, seguido por 150 V para um adicional 45-60 min.
3. transferência de proteínas
Nota: Transferência de proteína neste protocolo é executada usando um sistema mancha semi-seca comercialmente disponível (ver Tabela de materiais) para resultados rápidos e consistentes.
- Preparar a proteína de transferência pre-imersão filtro de papel em água bidestilada e assegurando a faca de gel, plástico Pasteur pipeta, mancha rolo e a pinça está pronta para usar.
- Abra a pilha de transferência removendo cuidadosamente o envolvimento de toda a folha. Remover a parte superior da pilha de fundo e reserve. Umedeça rapidamente a membrana na pilha de fundo com algumas gotas de electroforese executando o tampão (2-3 mL). Uma vez que a pilha de transferência está aberta, é importante evitar a membrana PVDF sequem.
- Depois de parar a electroforese, abra o pre-cast gel usando a gel de faca e cortou o gel de empilhamento. Corte o gel em torno de suas bordas para livrá-lo do plástico fundido. Manter a faca de gel molhada para evitar danificar o gel.
- Montar a pilha de transferência de baixo para cima: fundo pilha (contendo a membrana PVDF), gel de proteína, papel de filtro. Use o rolo de mancha para remover todas as bolhas de ar. Coloque a pilha superior sobre o papel de filtro e rolar a pilha novamente para remover as bolhas de ar. Não empurre demasiado fortemente pois isto pode causar o gel a deformar-se durante a proteína de transferência.
- Transferir a pilha inteira para o dispositivo de transferência com o eletrodo no lado esquerdo do aparelho e coloque a gel de esponja no topo da pilha para que ele esteja alinhado com os correspondentes contatos elétricos no dispositivo. Feche a tampa, selecione e iniciar o programa apropriado (20 V para 7 min é um ponto de partida recomendado).
- Quando terminar, deixe a tampa fechada por 2 min permitir que a pilha para refrigerar para baixo e para impedir a membrana desseque. Retire a pilha de transferência e cortar a membrana para o tamanho do gel. Lave a membrana corte rapidamente com água bidestilada antes de continuar com a mancha de proteínas totais.
4. total de proteína coloração
Nota: Usando a deteção fluorescente fornece um benefício substancial sobre as abordagens mais tradicionais (por exemplo, deteção de ECL), como a escala linear e a sensibilidade podem ser muito melhor controlada4. Portanto, nos passos 4 e 5, um TPS fluorescente e fluorescentes anticorpos secundários são utilizados (ver Tabela de materiais).
- Rolo da membrana em um tubo de 50 mL com a virada da proteína para dentro. Por causa da sensibilidade à luz do TPS fluorescente e anticorpos secundários, todas as etapas subsequentes são realizadas no escuro.
- Adicionar 5 mL da solução de mancha de proteína (ver Tabela de materiais) e incubar em um rolo por 5 min à temperatura ambiente. Porque TPS e tampão de lavagem contém metanol, executar estas etapas fora em uma coifa.
- Descartar a solução de coloração e lavar duas vezes rapidamente com os 5 mL da solução de lavagem (6,3% ácido acético em 30% de metanol). Coloca o tubo momentaneamente volta no rolo entre as etapas de lavagem. Lave a membrana brevemente com água ultrapura antes de continuar.
5. bloqueio, incubação do anticorpo e deteção
- Bloqueio da membrana: Adicionar 3 mL de tampão de bloqueio (ver Tabela de materiais) para o tubo de 50 mL contendo a membrana. Incube a membrana em um rolo por 30 min à temperatura ambiente. Dependendo da escolha do anticorpo, o tipo de tampão de bloqueio utilizado pode exigir otimização.
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Incubação do anticorpo primário
- Descarte o bloqueio de buffer e substituir com o anticorpo primário para o adequado, otimizado de concentração (Figura 1 e Figura 2: rato-anti-SMN, em 1:1, 000, diluído em tampão de bloqueio).
Nota: Otimização adequada de anticorpos primários deve incluir a confirmação que o anticorpo detecta um produto de proteína do tamanho certo, enquanto mostrando nenhuma ou mínima obrigatória para produtos de outras proteínas inespecíficas. Se possível, testar e comparar vários anticorpos contra a proteína de interesse. - Incubar a membrana em um rolo durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, retire a solução de anticorpo e lavar 6 vezes por 5 min com 1X PBS em um rolo à temperatura ambiente (RT).
- Descarte o bloqueio de buffer e substituir com o anticorpo primário para o adequado, otimizado de concentração (Figura 1 e Figura 2: rato-anti-SMN, em 1:1, 000, diluído em tampão de bloqueio).
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Incubação do anticorpo secundário
- Prepare o anticorpo secundário específico no 1:5,000 contra o hospedeiro do anticorpo primário em 5 mL de tampão de bloqueio. Outros anticorpos secundários podem exigir outras diluições ou o uso de buffers de bloqueio alternativos.
- Incubar a membrana com a solução de anticorpo secundário em um rolo por 1h no RT Após a incubação, lave a membrana três vezes 30 min com 1X PBS em um rolo.
- Secar a membrana e manter a membrana, protegida da luz, usando papel alumínio até a deteção. Membranas podem ser mantidas a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
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Aquisição de imagem
- Logon para o computador conectado ao scanner. Coloque a membrana sobre o scanner com o lado de proteína virado para baixo e selecione a área de digitalização no software.
- Otimizar a intensidade do laser para ambos (700 nm e 800 nm) canais, confirmando sem saturação ocorre. Adquirir as imagens em ambos os canais e exportar as imagens para posterior análise (etapa 6).
6. quantificação e análise ocidental do borrão
Nota: Estas recomendações baseiam-se no software Studio imagem livremente disponível. No entanto, análises comparáveis também podem ser feitas usando outros pacotes de software, tais como ImageJ.
- Importar o arquivo: criar um espaço de trabalho local no computador usado para análise. Isso gera um banco de dados de arquivos de imagem para borrões ocidentais adquiridos. Importar arquivos obtidos no scanner e selecione a imagem para análise.
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Análise TPS
- Exiba o canal de 700 nm para mostrar a resultado de coloração de proteínas totais. Um exemplo de uma imagem TPS está incluído na Figura 1 , na quais os diferentes tecidos de neonatal (P5) (Figura 1A-B) e 10 semana de idade (Figura 1-C-D) de ratos são comparados diretamente. Da mesma forma, a Figura 2 mostra um exemplo de uma comparação direta do tecido cerebral de ratos de diferentes idades.
- Selecione a guia de análise do canto superior direito e selecione Adicionar retângulo para definir a área de interesse para a normalização (figura 1B, D). Copie e cole a primeira área de retângulo para cada amostra individual para garantir a região definida no mesmo tamanho para todas as faixas analisadas.
- Copie o resultado do guia de formas no canto inferior esquerdo do software.
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Quantificação
Nota: A abordagem ideal para quantificação de amostras varia de acordo com o desenho experimental. Aqui fornecemos um exemplo ilustrativo da detecção de sobrevivência do neurônio motor proteína (Smn; uma proteína-chave envolvidos na doença neuromuscular atrofia muscular espinhal20,21), que é conhecida a diminuir ao longo do tempo 19 e como normalização de intensidade de sinal Smn para TPS fornece estimativas fiáveis de desenvolvimento de expressão de proteínas.- A Figura 2 mostra uma diminuição da expressão de Smn com aumento da idade do animal com TPS como controle de carregamento de proteínas. Repita o passo 6.2.1-6.2.3 para quantificar proteínas carregamento (Figura 2B). Repita a etapa 6.2.1-6.2.3 no canal de 800 nm (Figura 2A) para analisar a proteína de interesse.
- Copie os resultados de ambos os TPS e proteína de interesse para um programa de planilha. Na planilha, primeiro normalizar a proteína carregando, determinando-se o maior sinal TPS e dividindo cada TPS sinal este valor para obter a proteína normalizada valor de carregamento.
- Divida o valor de sinal nm 800 de cada amostra individual pelo seu correspondente valor de proteína normalizado para calcular a proporção de expressão relativa de proteína em amostras diferentes.
- Após a primeira normalização, compare vários pontos de tempo ou tecidos para o valor médio do padrão interno para permitir comparações diretas através de experimentos e membranas diferentes.
7. estatísticas
- Para determinar diferenças estatisticamente significativas na expressão de proteínas através de complexos e grandes grupos de amostras, a metodologia estatística apropriada é necessária. Embora uma discussão detalhada de fundo estatístico vai além do escopo deste trabalho, queremos destacar várias considerações e detalhar uma abordagem bem-sucedida que usamos anteriormente19.
- Quanto a muitos experimentos, medições de quantificação de proteína não representam dados completamente independentes. Aqui, por exemplo, vários tecidos são geralmente provenientes de animais simples para determinar os níveis de proteína através de múltiplos órgãos em um único ponto de tempo experimental. Portanto, usamos um modelos de efeitos mistos para analisar diferenças na expressão de proteínas ao longo do tempo e entre os tecidos. Em geral, os modelos de efeitos mistos oferecem um meio eficaz de lidar com não-independência e, assim, evitar a replicação pseudo22,23. No presente caso, modelos de efeitos mistos aumentam o poder estatístico pela contabilidade para medidas repetidas entre tecidos, dentro de indivíduos. Nós usamos o pacote de software estatístico R para realizar essas análises, como esta é livremente disponível e versátil. No entanto, outros pacotes disponíveis comercialmente podem ser capazes de realizar análises semelhantes.
- O delineamento experimental atual envolve um projeto de "dividir o enredo" porque cada rato pertencia a apenas um grupo de idade. Portanto, nós modelado ratos individuais (rato ID) como um efeito aleatório com um identificador exclusivo; Também consideramos tecido, idade e sua interação como efeitos fixos. Nós modelado os dados usando a função lmer na biblioteca de R, lme4. Como uma etapa de controle de qualidade, nós visualizado residuais para avaliar os pressupostos da variância igual e uma distribuição normal e transformou os dados sempre que necessário para atender a estes pressupostos. Para testar uma interação significativa entre o tecido e idade, nos encaixamos um modelo idêntico que faltava essa interação e comparado os modelos usando inicialização paramétrica (função R PBmodcomp na biblioteca, pbkrtest). Onde surgiram interações significativas, usamos a função emmeans (na biblioteca emmeans R), para determinar a causa da interação. Por exemplo, comparamos a média expressão entre classes de idade dentro de cada tecido; uma interação significativa pode surgir entre idade e tecido, se, digamos, duas classes de idade determinado diferiam significativamente para um tecido mas não outro. Em resumo, estas abordagens fornecem uma maneira de estender a robustez das conclusões das experiências de borrão ocidental, fornecendo suporte estatístico para estes resultados.
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Representative Results
Nós incluímos exemplos do uso da TPS e um padrão interno para facilitar comparações dos níveis de proteína através de tecidos e pontos de tempo. A Figura 1 mostra os resultados da mancha ocidental na proteína extraída de tecidos obtidos de neonatal (pós-parto dia 5) em comparação com ratos adultos (10 - semanas de idade). TPS e Smn immunoblot são mostrados na figura 1A, C. Quantificação da intensidade de fluorescência da TPS foi alcançada através da medição da intensidade de fluorescência dentro da caixa retangular em cada lane e seus resultados são mostrados nas tabelas na figura 1B e 1D. Observe que as amostras de diferentes tecidos são caracterizadas por diferentes padrões de banda de proteína TPS e, portanto, é necessário usar toda a rua para fins de normalização. Com efeito, quando toda pistas são analisadas, a intensidade da fluorescência permanece relativamente semelhante através de amostras, indicando que TPS para normalização é apropriado para esta finalidade. Um padrão interno, constituído por uma mistura de lisado de cérebro P5 também foi incluído para ilustrar como ele pode ser usado para mais comparações entre diferentes membranas. Além disso, na Figura 2, mostramos como um TPS fluorescente pode ser usado para comparar os níveis de proteína em pontos diferentes de tempo no desenvolvimento. Aqui, nós mostramos o Smn os níveis no cérebro lysates de neonatal (P5), desmame idade (P20) e ratos adultos (10W) (Figura 2A). Embora os níveis de Smn claramente diminuem com a idade, quantificação de TPS permanece constante, conforme ilustrado na Figura 2B.
Figura 1. Borrões ocidentais apresentando TPS e Smn níveis de proteína nos tecidos do mouse em duas idades diferentes. Proteína TPS e Smn para P5 (A) e 10 semanas de idade (C) ratos. (B, D) A intensidade da fluorescência do TPS todo-lane foi calculada e é indicada (em unidades arbitrárias). M: marcador/proteína padrão; kDa: kilodalton; u.a.: unidade arbitrária; P5: pós-Natal dia 5; 10W: 10 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise da expressão de Smn em tecidos de rato em pontos diferentes do desenvolvimento tempo. (A) cérebro lysates do tecido obtido a partir de P5, P20 e 10 semanas de ratos foi analisada usando TPS (painel superior) e SMN (painel inferior). (B) a intensidade de fluorescência da TPS foi calculada e é indicada em unidades arbitrárias. M: marcador/proteína padrão; kDa: kilodalton; u.a.: unidade arbitrária; P5: pós-Natal dia 5; P20: pós-Natal dia 20; 10W: 10 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tecido | Peso aprox. * | lavagem de 1xPBS (4 ° C) | Repetir a lavagem | Tampão de homogeneização * * |
| Medula espinhal | 40 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Músculo (GC) | 20 mg | 150 mL | 3 x | 100 mL |
| Cérebro | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Coração | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| Fígado | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Rim | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * Estes pesos são valores indicativos para tecidos obtidos de ratos P8. | ||||
| * * Estes volumes são indicações e podem ser ainda mais ajustadas de acordo com o peso do tecido. | ||||
Tabela 1. Visão geral de pesos de tecidos esperado e correspondentes recomendações para lavagens de PBS e volume de tampão de Lise deve ser usado para homogeneização. Os pesos são indicações de tecidos obtidos de pós-Natal dia 8 (P8) ratos. Volumes de tampão PBS e lise podem ser escalados acima e para baixo, de acordo com necessidades experimentais.
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Discussion
Com o delineamento experimental adequado, medidas de controle e análise estatística, a mancha ocidental pode ser usado para fazer estimativas quantitativas fiáveis da expressão da proteína dentro e entre uma variada gama de amostras biológicas. O protocolo que descrevemos no manuscrito atual pretende servir como uma orientação para os investigadores procuram para usar mancha para realizar a análise quantitativa em grupos maiores e mais complexos de amostras, usando uma combinação de baseada em fluorescência ocidental métodos de deteção, carregamento de proteína total normalização e padrões internos. Embora o foco aqui é sobre determinação e comparando a expressão da proteína dos tecidos de mouse diferente e em diferentes idades, esta abordagem também pode ser estendida para comparar a expressão de proteínas em outras condições experimentais.
Uma etapa central em nosso protocolo atual é a normalização das proteínas de interesse à proteína total carregada através da quantificação de uma mancha de proteína total fluorescente. Normalização de TPS corrige para variação na carga de amostra e margens de erro nos métodos de quantificação de proteínas. No entanto, o número de amostras de proteína que pode ser analisado em uma única membrana é muitas vezes limitado, ainda mais normalização pode ser necessário para comparar várias membranas. Com efeito, a variabilidade entre como as proteínas são detectadas nas membranas diferentes (devido por exemplo anticorpo incubação tempo ou temperatura variação) pode causar variação além disso introduzido através de etapas de carregamento e quantificação do protocolo. Aqui, usamos um padrão interno que consiste de uma mistura de lisado de proteína única que é carregado em triplicado em cada gel e permite a comparação e normalização entre géis/membranas. Teoricamente, isto pode ser qualquer amostra de proteína, enquanto ele pode ser feito em quantidades suficientes para que a mesma amostra pode ser usada para todos os experimentos. Em nossos experimentos, nós usamos uma mistura de lisado de proteína do cérebro, como homogenates do cérebro contêm grandes quantidades de proteína e normalmente são obtidas em uma concentração elevada. Uma média de quantificação do padrão de três vias deve aumentar ainda mais a precisão das quantificações através das membranas e contribuir para a reprodutibilidade do experimento.
Níveis de proteína podem ser determinados por uma série de diferentes técnicas e o método preferido varia de acordo com o tipo de amostra a ser analisada e o objetivo do experimento. Quantificação pode ser reproduzida de Western blot funciona melhor em situações onde as condições experimentais podem ser bem controladas, como quando usando o mouse ou outros modelos animais de um fundo genético definido. Em contraste, em muitos experimentos usando amostras de pacientes humanas, isto pode ser menos viável como idade, variabilidade genética e tempos de amostragem de tecido são muito mais difíceis de controlar do que em sistemas modelo (animal). Placa base técnicas como ELISA podem ser mais adequadas para estas análises, embora a validação cuidadosa da especificidade do anticorpo é crucial. Por exemplo, na frágil X pesquisa de síndrome, anticorpos têm sido mostrados para detectar diferentes isoformas e quando usados em ELISA, isso levaria a superestimação da quantidade total de proteína como ELISA determina um sinal para todas as isoformas combinado24. Escolhas ideais para métodos determinar a expressão de proteínas são, portanto, dependendo do contexto, da amostra tipo e a questão de pesquisa que está sendo investigada.
Realizar análise estatística adequada é um pré-requisito para a confiabilidade das conclusões extraídas da quantificação de dados biológicos. Estatisticamente, pontos de tempo analisando dados complexos como gerado pela comparação de diferentes tecidos, ou outras condições experimentais e suas combinações podem exigir que mais avançados de modelação estatística do que ANOVA com teste post-hoc pode oferecer. Para modelação estatística mais complexos, tais como os efeitos mistos modelo de abordagem, descrevemos no manuscrito atual, pode ser aconselhável procurar aconselhar-se ainda mais de biostatisticians. Análise estatística adequada da expressão da proteína em grande escala pode melhorar consideravelmente a solidez dos resultados e a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados.
Em resumo, a abordagem experimental que descrevemos aqui fornece um método robusto e reprodutível para os investigadores que deseja determinar a expressão de proteínas usando borrão ocidental em amostras complexas, permitindo responder perguntas de pesquisa novo e excitante.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.
Acknowledgments
E.J.N.G. é suportado pelo Wellcome Trust (concessão 106098/Z/14/Z). Outro financiamento foi fornecido pela Trust SMA (SMA UK consórcio; T.H.G. & Y-T. H.), Europa SMA (T.H.G, D.v.D.H. e E.J.N.G.), o DTP da Universidade de Edimburgo em medicina de precisão (T.H.G., L.L. & A.M.M.) e centro de Euan MacDonald para investigação de doença do neurônio Motor (T.H.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
