Summary
在这里,我们描述了两种非侵入性方法,使用小鼠的化学遗传学来长期控制神经元活动。眼药水用于每天提供氯扎平-N-氧化物(CNO)。我们还描述了在饮用水中长期使用CNO的两种方法。这些慢性神经元控制策略需要最少的干预,以减少动物的压力。
Abstract
化学遗传策略已成为远程控制神经元活动的可靠工具。其中,由设计药物(DREADDs)完全激活的设计师受体已成为现代神经科学中最常用的化学遗传学方法。大多数研究使用单次腹肌注射提供配体氯扎平-N-氧化物(CNO),该注射适用于靶向神经元人群的急性活化/抑制。然而,只有几个例子,长期调制的DREADD控制神经元的策略,其中大多数依赖于使用需要手术干预的交付系统。在这里,我们扩展了两种非侵入性策略,用于提供配体CNO,以长期操纵小鼠的神经群。CNO要么使用重复(每日)眼药水施用,要么通过动物的饮用水长期施用。这些非侵入性范式导致在整个CNO治疗过程中持续不断的设计师受体的强健激活。此处描述的方法为慢性 DREADD 介导的神经元活动控制提供了替代方法,并且对于旨在评估自由移动动物行为的实验非常有用,重点是侵入性较低的 CNO 传递方法。
Introduction
神经科学领域的技术进步使科学家能够精确识别和控制特定神经元群体的活动1。这有助于更好地了解神经元回路的基础及其对动物行为的影响,以及修改既定的教条2,3。在这些新工具中,光遗传学和化学遗传策略不仅对发现的质量产生了深远的影响,而且对实验的构思和设计方式也产生了深远的影响。在本手稿中,我们重点介绍通过工程受体配体策略控制神经元激活的化学遗传学策略。设计师受体完全由设计师药物(DREADDs)激活,是远程控制神经元活动的最流行的化学遗传工具之一,如Roth 20165所回顾。DREADDs利用经修饰的肌血性乙酰胆碱受体,由惰性配体、氯扎平-N-氧化物(CNO)6特别激活。
大多数研究使用由腹内(i.p.)注射管理的CNO,它有效地控制在急性方式工程受体活化的剂量和时间。然而,当需要重复或慢性DREADD激活时,使用多次i.p.注射变得不可行。为了解决这个问题,已经报道了慢性CNO输送的不同策略,包括植入微型泵7和颅内管8,9。在不同程度上,所有这些策略导致动物压力和疼痛10,并要求手术干预,也可以有直接影响的行为反应被测试11。在这里,我们描述了三种用于慢性CNO输送的非侵入性策略。
为此,小鼠在海马区被立体地注入,其与腺相关病毒(AAV)编码了刺激性M3肌肉受体(hM3Dq)的工程版本,当被配体CNO激活时,导致爆发式发射。神经元6.此前已经表明,一个含有CNO的眼滴可以有效地引起DREADD表达神经元12的强健激活。在这里,我们描述了一个改进的方法,重复交付眼药水。为了实现对设计受体的慢性和持续控制,我们接下来将描述一种非侵入性策略,通过饮用水向小鼠提供CNO。最后,我们描述了在有限时间内在饮用水中提供 CNO 的替代范例。老鼠运动活动,以及饮酒行为和甜热溶液的消耗,大多局限于黑暗部分的光明/黑暗周期13,14。因此,我们采用了基于小鼠对蔗糖偏好的协议。通过测量AAV感染细胞中早期基因c-Fos的诱导,作为神经元活化12、15的读出,我们发现这些CNO传递策略在扩展的神经元上强力激活DREADD控制神经元持续时间。
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Protocol
所有动物都按照国家精神卫生研究所(NIMH)动物护理和使用委员会的指导方针处理。已作出一切努力,以尽量减少痛苦和使用的动物数量。
1. 海马中与腺相关病毒注射
注:野生型雄性小鼠混合背景(B6/129 F1杂交,3个月大)用于立体征税注入AAV编码M3肌肉受体(hM3Dq)到海马区。在整个实验中,小鼠在常规的12小时光:12小时暗(T24)周期下,以单一安置,获得食物和水。
- 在进行立体手术之前,清洁和消毒立体器架和所有必要的仪器。
注:手术窗帘可用于维持无菌场并减少小鼠的热损失。 - 使用胶质对小鼠进行深度麻醉。为此,首先将氧气流量计调整到大约 1.5 L/min,然后将离氧蒸发器调整为约 3-5% 的感应和约 1-3% 的维护。
- 为了确保动物完全失去知觉,捏住老鼠的爪子;当对捏合的退缩反应不存在时,动物被适当麻醉。
- 将鼠标放在加热垫上,以保持小鼠体温的稳定性。
- 将鼠标头的头顶下,将鼠标头固定到立体框架上。然后,在眼睛上涂上眼部保护润滑剂,用波维酮碘和70%乙醇擦洗表面,并用无菌手术刀暴露头骨。
- 将框架校准到布雷格玛点,然后以 2.9 mm 的中侧坐标和前后坐标 -2.7 mm 进行钻取,以瞄准海马。
注:如果需要注射其他大脑目标,请使用Paxinos和富兰克林小鼠地图集16确定所需的注射坐标。 - 一旦大脑暴露,使用显微注射器和拉微毛细管移液器在海马区-3.0 mm的背风口深度单方面注射90 nL的AAV(图1A)。
注:参见本实验中使用的 AAV 的点位器的材料表。对于其他大脑区域,根据需要调整AAV注射量。 - 在手术结束时,用尼龙缝合线关闭切口,并在伤口部位应用局部抗生素。
- 手术后立即系统施用镇痛药(丁丙诺啡,0.1毫克/千克),手术后4-6小时。
- 从注射后4周开始,让小鼠接受下一节中描述的任何范式,以慢性控制表达设计兴奋受体的神经元。
2. 使用眼药水重复提供 CNO
- 在给下眼药水之前,每天3分钟,让每只老鼠刮3分钟3-4天,使动物适应处理。
- 在1 mL无菌0.9%盐碱溶液中溶解克洛扎平-N-氧化物(CNO,5mg)。将溶液冷藏在4°C。
- 在开始实验之前对每只鼠标进行称重,以确定要交付的CNO量。使用 1-3 μL 降压(每只眼睛)达到 1.0 毫克 CNO/kg 体重。
注:例如,20 g 鼠标应接收双边(每个 2 μL)眼药水。 - 在小鼠的非活动(光)阶段,在灯关闭前2小时(时间时间(ZT)10)时,提供眼药水。在小鼠的活跃(黑暗)阶段需要交付CNO的情况下,确保存在昏暗的红灯,以便进行适当的动物处理。
注意:应采取预防措施,避免破坏实验动物的昼夜(和光/暗)周期。- 使用P10微移液器,加载所需量(1-3μL)的CNO溶液,达到1.0毫克CNO/kg。
注:为每个滴珠使用新的无菌移液器尖端。在这组实验中,进行了双眼滴CNO;但是,如果需要降低CNO浓度,也可以应用单侧眼滴。 - 通过擦伤固定鼠标。
- 缓慢地排出溶液,直到移液器尖端形成稳定的液滴。
- 小心地将液滴靠近鼠标眼睛的角膜,直到溶液交付。移液器尖端不应接触鼠标的眼睛。
- 放放鼠标,放回家中笼子。
- 使用P10微移液器,加载所需量(1-3μL)的CNO溶液,达到1.0毫克CNO/kg。
- 每天重复此过程 5 天。
注:此持续时间可根据实验要求进行调整。 - 对于对照实验,使用接受假处理的AAV/DREADD注射小鼠(仅含有盐水溶液的眼药水),以及注射空载体(例如AAV/mCherry)的小鼠,暴露于所述的CNO眼滴方案。
3. 通过饮用水提供的慢性CNO治疗
- 使用 50 mL(塑料)锥形管和橡胶塞喷口制作小瓶;盖上铝箔,以避免对CNO稳定性产生任何光线介导的影响。
- 在开始CNO处理前三天,用装有10mL常规水的小瓶代替普通水瓶,让老鼠适应它们。用胶带把瓶子固定到笼子里。
- 测量每只鼠标的每日耗水量。
- 在开始实验之前,称量每只鼠标。
- 在1mL0.9%无菌盐溶液中溶解克洛扎平-N-氧化物(CNO,5mg)。在4°C下冷藏库存溶液。
- 使用体重和平均用水量来定义CNO溶液的浓度,达到1.0毫克CNO/kg(体重)。
注:成年雄性小鼠(体重约20克)每天消耗约5 mL的水(图2A)。因此,为了达到1mg CNO/kg的CNO浓度,应将6.4μL的CNO库存溶液添加到8 mL水的最终体积(最终浓度:4微克CNO/mL)。因此,每天饮用5毫克水的20克动物的CNO剂量为1毫克CNO/kg。 - 通过测试一系列浓度,确定以最小CNO浓度显示最大有效性的最佳CNO剂量。执行剂量反应分析,以确定饮用水方法的最佳CNO剂量。
注:本实验测试了以下CNO剂量:1.0毫克/mL,0.5毫克/mL,0.25毫克/mL,0.1毫克/mL,和盐水。1.0毫克CNO/kg首先根据i.p.和眼滴协议进行测试。 - 第1天,向瓶子中加注8mL的常规水,并加入所需量的CNO。
注:这一水量足以为成年雄性小鼠提供24小时的邻达水。在使用其他啮齿动物物种的情况下,首先测量每天消耗的水量,以确定所需的水量。 - 在整个协议中监测动物的健康,确保水与CNO的消耗不会造成不良副作用。
- 24小时后,用清水+CNO溶液更换瓶子。记录前一天消耗的交易量。
- 处理废物容器中未消耗的水 + CNO 溶液。根据动物设施指南对塑料瓶进行消毒后,每天丢弃塑料瓶并更换橡胶塞。
注意:请勿将水性废物与有机溶剂混合。有关存放和取货的说明,请联系化学品处理服务。 - 每天在同一时间更换瓶子5天。
注:此持续时间可根据实验要求进行调整。 - 包括控制组,如步骤 2.6 中所述。
4. 使用小鼠对蔗糖的偏好进行限制性的CNO治疗
- 在开始CNO处理前3天,将一个装有10mL水+1%蔗糖的小瓶放在笼子里,最好远离原来的水瓶。
注:使用步骤 3.1 中描述的相同小瓶子。 - 在动物活动阶段的最后一部分(ZT 18 = 24),将动物暴露于水中 + 1% 蔗糖。接触后,将装有水和蔗糖的瓶子从笼子里取出。
注:可以使用 CNO 交货的不同时间窗口。此外,小鼠可以置于一个倒光/暗循环下,在夜晚时发生光的照射,以方便CNO的分娩。 - 测量每只小鼠的每日水 = 1% 蔗糖消耗量。
- 在开始实验之前,称量每只鼠标。
- 使用体重和平均水量 + 1% 蔗糖消耗,以确定剂量的CNO溶液达到1.0毫克CNO/kg(体重)。
注: 如步骤 3.6 所述,应测试以最小 CNO 浓度显示最大有效性的最佳 CNO 剂量。 - 在第 1 天,在确定的时间窗口内,向瓶子注满 5 mL 的水 + 1% 蔗糖 + CNO(1 毫克 CNO/Kg),并将其放在笼子上(始终位于同一位置)。
- 在限制时间窗口结束时,取出瓶子并测量水 + 蔗糖 + CNO 消耗量。
注: 材料和溶液已消毒或丢弃,如步骤 3.11 所述。 - 每天重复此过程 5 天。
注:此持续时间可根据实验要求进行调整。 - 包括控制组,如步骤 2.6 中所述。
5. 数据分析
- 在接受最后一次重复(第5天)CNO眼滴后,用4%甲醛(PFA)在心内给小鼠注入2或6小时。当CNO通过饮用水输送时,在小鼠活动阶段结束时用水代替CNO+ 水,然后在2或6小时后进入CNO后给小鼠注入。
注:如果光照可能影响感兴趣区域的c-Fos感应,在实验的最后一天和灌注前,让小鼠处于恒定的黑暗状态。 - 仔细解剖大脑,并浸入4%的PFA溶液9-12小时。
- PFA 固定后,使用 30% 蔗糖溶液保护脑组织(等待大脑下沉),然后使用冷冻器对大脑进行分割。
- 将日冕脑部分(35μm)转移到含有1xPBS、10%牛血清白蛋白和0.3%Triton X-100的溶液中,在室温下1小时。
- 在4°C过夜,通过持续搅拌,用抗c-Fos(1:2500)抗体溶液孵育大脑部分。
- 3次5分钟的处理后,在室温远离光线和持续搅拌的室温下,用Alexa结合的二级抗体(1:500)溶液孵育样品1小时,每次含有1x PBS和0.3%Triton X-100。
- 使用共聚焦显微镜获取数字图像。使用照片编辑和分析软件(例如 Adobe Photoshop)组装和处理捕获的图像。
- 对于数据分析,使用 ImageJ 软件概述和测量 AAV 感染区域 (mCherry(+) 细胞,并量化该区域内的 c-Fos(+) 细胞数量,以获得每个区域的激活细胞数。结合从每只动物3个不同的部分获得的结果。
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Representative Results
我们观察到,使用眼滴的重复性CNO传递在大多数受感染的神经元中引起C-Fos表达的强效诱导(图1C),表明CNO传递的有效性在重复暴露期间得以维持。此外,在CNO处理后2小时采集的样本中观察到c-Fos的显著诱导,而CNO接触后6小时获得的样本(图1D-E)表明,CNO引起的变化与时间相关。
然后,我们测量通过饮用水提供的慢性CNO治疗的有效性。我们观察到,与常规用水总量相比,每日耗水量与CNO没有显著差异(图2A)。同样,夜间(6小时时间窗口)的水量 = 1% 蔗糖不受 CNO 添加的影响(图 2B)。此外,在整个实验中,所有动物的每日耗水量(5天)均无差异,即水与CNO(图2C)和水+蔗糖+CNO(图2D)。
与使用CNO眼药水发现的类似,在2小时后(而不是6小时)在CNO访问后观察到c-Fos的强强感应(图2E-F)。
最后,我们测量了加入饮用水的CNO的剂量反应。为此,小鼠暴露于以下CNO剂量:1.0毫克/mL,0.5毫克/mL,0.25毫克/mL,0.1毫克/mL,盐水。在所有情况下,动物在接触CNO后2小时被注入。我们发现,与盐水对照相比,低CNO剂量(0.1 mg/mL)不会引起C-Fos激活,而高剂量(0.25mg/mL,0.5 mg/mL和1.0 mg/mL)诱导强健和相似的C-Fos诱导(图 2G.
图1:使用眼药水重复提供CNO。(A) AAV/hM3Dq-mCherry在成年(3个月大)雄性小鼠的海马区进行立体注射。(B) 注射后四周,连续5天每天使用眼滴服用一次眼药水。使用1.0毫克CNO/kg的剂量。(C) 最后,小鼠被牺牲,脑组织在AAV感染区(mCherry阳性细胞,红色)中测试c-Fos(绿色)免疫反应。显示了注射部位的代表性日冕部分和CNO介导的C-Fos激活。(D) 在AAV感染区,在上次CNO给予后2或6小时注入的小鼠中测量了C-Fos阳性细胞的数量。数据为均值 = SEM. _p < 0.001;按学生的 t 检验(n = 2-3 个小鼠)。(E) 显示了两个组的代表性图像。比例尺:100 μm请点击这里查看此图的较大版本。
图2:通过饮用水提供的慢性CNO治疗。(A) 对照(水)或处理(水+ CNO,剂量:1.0毫克CNO/kg)动物之间无总液体消耗量的差异。数据为均值 = SEM(n = 13-14 个小鼠)。(B) 同样,在添加CNO(1.0 mg/kg)后,水量+1%蔗糖的消费量(在6小时时间窗口期间)没有显著差异。数据为均值 = SEM(n = 5 个鼠标)。(C) 显示个别小鼠每日耗水量 + CNO (1.0 mg/kg) 。未观察到每日消费差异。数据为均值 = SEM(n = 5 个鼠标)。(D) 显示单个小鼠每日液体消耗量(在 6 小时时间窗口内)为 1% 蔗糖 + CNO (1.0 mg/kg)。未观察到每日消费差异。数据为均值 = SEM(n = 3 个鼠标)。(E) 上次CNO分量后2或6小时,小鼠被牺牲,在AAV感染区对C-Fos阳性细胞的数量进行量化。数据为均值 = SEM. _p < 0.001;按学生的 t 检验(n = 5 个小鼠)。(F) 在AAV感染(mCherry阳性细胞,红色)区域测试脑冠状部分为c-Fos(绿色)免疫反应。将显示具有代表性的图像。(G) 施用四种CNO剂量(0.1、0.25、0.5和1.0毫克CNO/kg),并测量了C-Fos诱导。数据为均值 = SEM. _p < 0.001;由方差分析,然后是图基的测试(n = 2个小鼠)。比例尺:100 μm请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
DREADD已经成为远程操作神经元活动的一种流行和有效的方法17。CNO交付的替代策略的设计将广泛增加可用于特定实验设置的选项范围。此外,通过减少直接影响动物健康的副作用,非侵入性的提供CNO策略最大限度地减少了对结果的任何潜在误解。在这里,我们描述了两种用于 CNO 交付的非侵入性策略,这些策略赋予了 DREADD (hM3Dq) 强大的激活,并提供广泛的可能性。此外,我们认为,此处描述的协议也可能对神经元操作的不同 DREADD 变体有用,包括基因工程肌肉素或阿片受体。
使用重复眼滴进行 CNO 输送是重复性腹内 CNO 注射的无痛替代方案,同时保持精确控制 CNO 输送剂量和时间的能力。因此,我们建议在需要重复的 DREADD 激活时使用此协议。眼药水也是CNO输送最廉价的选择,特别是与在饮用水中添加CNO的协议相比。另一方面,通过饮用水输送的CNO,可以长期持续激活DREADDS,避免任何鼠标处理。必须指出,该协议对CNO交付的时间缺乏精确的控制。第三种替代方法是,对包含 CNO 的蔗糖溶液有时间限制的访问,结合了前面讨论的两种协议的优点。此策略同时是非侵入性、重复性和易于执行的。此外,与使用 CNO 的 24 小时供水相比,它更好地控制了 CNO 输送的时间。这种方法的一个警告是,它只能在动物的活跃阶段使用。我们建议在饮用水中使用两种策略,结合红外摄像机或舔米系统,以获得有关 CNO 消耗的精确时间信息,因此,DREADD 激活。
以前曾报道过,通过饮用水传递的CNO具有长期影响。我们已成功应用慢性CNO(5 μg/mL)治疗,连续14天15评估在情绪控制中涉及的Thalmo-皮质回路的滋补激活的行为后果。或者,饮用水中浓度为40mg/L的CNO用于长期调节背裂核18的血清素神经元的活性,而胰腺β-细胞的功能则使用CNO控制浓度为0.25毫克/毫克水19。结合这些结果表明,不同的CNO浓度可以调整,以有效地控制DREADD。在这里,我们发现,在饮用水中加入不同剂量的CNO引起类似的C-Fos激活,建议进行剂量反应分析,以确定所需的最低和有效的CNO剂量。最近的研究表明,CNO并不完全是药理惰性20;此外,还表明,DREADD的体内活化是由CNO代谢物氯扎平的介导,它有几个内源性目标21。因此,作者建议使用亚阈值剂量的氯扎平,而不是高CNO剂量。尽管我们没有在所述方法中评估氯扎平的有效性,但我们发现,在不显著减少神经元活化的情况下,可降低CNO浓度,从而将CNO对氯扎平引起的副作用降至最低转换。
总之,这里介绍的策略代表了CNO交付的潜在方案,可以很容易地适应各种实验设计。它们被设想为非侵入性策略,可能对重复或慢性CNO介导的DREADD控制神经元的激活有用,减少CNO传递对动物行为的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家精神卫生研究所(ZIA MH002964-02)的校内研究项目的支持。我们要感谢NIMH IRP Rodent行为核心(ZIC MH002952)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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