Summary
Hier beschrijven we twee niet-invasieve methoden om chronisch controle Neuronale activiteit met behulp van chemogenetica in muizen. Oogdruppels werden gebruikt om Clozapine-N-oxide (CNO) dagelijks te leveren. We beschrijven ook twee methoden voor langdurige toediening van CNO in drinkwater. Deze strategieën voor chronische neuronale controle vereisen minimale interventie vermindering van de stress van dieren.
Abstract
Chemogenetische strategieën zijn ontstaan als betrouwbare instrumenten voor de afstandsbediening van neuronale activiteit. Onder deze, Designer receptoren uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) zijn uitgegroeid tot de meest populaire chemogenetische aanpak gebruikt in de moderne neurowetenschappen. De meeste studies leveren de ligand Clozapine-N-oxide (CNO) met behulp van een enkele intraperitoneale injectie, die geschikt is voor de acute activering/remming van de beoogde neuronale populatie. Er zijn echter slechts enkele voorbeelden van strategieën voor chronische modulatie van DREADD-gecontroleerde neuronen, waarvan de meerderheid afhankelijk is van het gebruik van toedieningssystemen die chirurgische interventie vereisen. Hier breiden we uit op twee niet-invasieve strategieën voor het leveren van de ligand CNO om de neurale populatie in muizen chronisch te manipuleren. CNO werd toegediend hetzij door het gebruik van repetitieve (dagelijkse) oogdruppels, of chronisch door het drinkwater van het dier. Deze niet-invasieve paradigma's resulteren in een robuuste activering van de Designer receptoren die persistent gemaakt gedurende de CNO behandelingen. De hier beschreven methoden bieden alternatieven voor de chronische DREADD-gemedieerde controle van neuronale activiteit en kan nuttig zijn voor experimenten ontworpen om gedrag te evalueren in vrij bewegende dieren, gericht op minder invasieve CNO leveringsmethoden.
Introduction
Technische vooruitgang op het gebied van de neurowetenschappen hebben wetenschappers in staat om nauwkeurig identificeren en controleren van de activiteit van bepaalde neuronale populaties1. Dit heeft bijgedragen aan het beter begrijpen van de basis van neuronale circuits en hun invloed op dierlijk gedrag, evenals, herziening van gevestigde dogma's2,3. Onder deze nieuwe instrumenten, optogenetische en chemogenetische strategieën hebben een ingrijpende invloed niet alleen op de kwaliteit van de ontdekkingen, maar ook op de manier waarop experimenten worden bedacht en ontworpen4. In het huidige manuscript richten we ons op chemogenetische strategieën voor het beheersen van de activering van neuronen via engineered receptor-ligand-strategieën. Designer receptoren uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) vertegenwoordigen een van de meest populaire chemogenetische hulpmiddelen voor de afstandsbediening van neuronale activiteit, zoals beoordeeld door Roth 20165. DREADDs maken gebruik van gemodificeerde muscarinische acetylcholine-receptoren die specifiek worden geactiveerd door een inert ligand, Clozapine-N-oxide (CNO)6.
De meeste studies gebruiken CNO toegediend door intraperitoneale (i.p.) injecties, die effectief regelt de dosering en timing van engineered receptoren activering in een acute mode. Echter, wanneer repetitieve of chronische DREADD activering vereist is, het gebruik van meerdere i.p. injecties onhaalbaar worden. Om dit probleem op te lossen, zijn verschillende strategieën voor de chronische CNO-levering gemeld, waaronder geïmplanteerde minipumps7 en intracraniële canules8,9. In verschillende mate veroorzaken al deze strategieën de dieren stress en pijn10, en vereisen een chirurgische ingreep die ook een directe invloed kan hebben op de gedrags responsen die moeten worden getest11. Hier beschrijven we drie niet-invasieve strategieën voor de chronische CNO-levering.
Voor dit doel, muizen werden stereotaxically geïnjecteerd in de Hippocampus met een adeno-geassocieerde virus (Aav) coderen van een Engineered versie van de excitatory M3 muscarinerge receptor (hM3Dq) dat wanneer geactiveerd door de ligand CNO leidt tot de burst-achtige afvuren van neuronen6. Eerder werd aangetoond dat een enkele oogdruppel die CNO bevat, effectief een robuuste activatie van DREADD-uitdrukken van neuronen12kan opwekken. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode voor de repetitieve levering van oogdruppels. Om chronische en aanhoudende controle van de ontwerpers receptoren te bereiken, beschrijven we volgende een niet-invasieve strategie om CNO aan muizen door het drinkwater te leveren. Ten slotte beschrijven we een alternatief paradigma voor het leveren van CNO in drinkwater tijdens een beperkt tijdsvenster. Muizen motorische activiteit, evenals het drinkgedrag en de consumptie van zoete calorie-oplossingen, zijn meestal beperkt tot het donkere gedeelte van de licht/donkere cyclus13,14. Daarom hebben we een protocol aangenomen dat gebaseerd is op de voorkeur van de muis voor sucrose. Door het meten van de inductie van de directe-vroege gen c-fos in Aav-geïnfecteerde cellen, als een uitlezen voor neuronale activering12,15, we vonden dat deze CNO levering strategieën krachtig activeren dreadd-gecontroleerde neuronen over uitgebreide Duur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de commissies voor dierenverzorging en-gebruik van het National Institute of Mental Health (NIMH). Alle inspanningen werden gedaan om de pijn en het aantal gebruikte dieren te minimaliseren.
1. adeno-geassocieerde virus injecties in de hippocampus
Opmerking: Wild type mannelijke muizen met gemengde achtergrond (B6/129 F1 hybride, 3 maanden oud) waren voor stereotaxically geïnjecteerd met een Aav codering van de M3 muscarinerge receptor (hM3Dq) in de hippocampus. Tijdens het hele experiment, muizen waren single-gehuisvest, onder een normale 12 h licht: 12 h Dark (T24) cyclus, met toegang tot voedsel en water ad libitum.
- Voor het uitvoeren van stereotaxic operaties, reinigen en steriliseren de stereotaxic frame en alle benodigde instrumenten.
Opmerking: chirurgische gordijnen kunnen worden gebruikt om een steriel veld te behouden en het warmteverlies van de muis te verminderen. - Anesthetiseer de muis met behulp van isoflurane. Om dit te doen, moet u eerst de zuurstof stroommeter aanpassen tot ongeveer 1,5 L/min, en vervolgens de Isofluraan vaporizer aanpassen tot ongeveer 3-5% voor inductie en ongeveer 1-3% voor onderhoud.
- Om ervoor te zorgen dat het dier is volledig bewusteloos, knijpen de muis poot; het dier is goed verdomd wanneer de te stoppen reactie op knijpen afwezig is.
- Plaats de muis op een verwarmingspad om de stabiliteit van de lichaamstemperatuur van de muis te behouden.
- Scheer de bovenkant van het hoofd en bevestig het hoofd van de muis aan het stereotaxic frame. Breng vervolgens een oculair beschermend smeermiddel aan op de ogen, reinig het oppervlak door te schrobben met Povidon-jodium en 70% ethanol, en stel de schedel bloot met een steriel scalpel.
- Kalibreer het frame naar bregma Point, boor dan op een mediale-laterale coördinaat van 2,9 mm en een anterieure-posterieure coördinaat-2,7 mm om de Hippocampus te targeten.
Opmerking: als een ander hersen doelwit moet worden geïnjecteerd, bepaal dan de gewenste coördinaten voor de injectie met de Paxinos en Franklin Mouse Atlas16. - Nadat de hersenen zijn blootgesteld, injecteert u eenzijdig 90 nL van de AAV op de dorsale-ventrale diepte van-3,0 mm in de Hippocampus met behulp van een micro-injector en getrokken microcapillaire pipetten (Figuur 1a).
Opmerking: Zie de tabel met materialen voor de titer van AAV die in dit experiment wordt gebruikt. Voor andere hersengebieden past u het AAV-volume van de injectie zo nodig aan. - Aan het einde van de chirurgische ingreep, sluit de incisie met nylon hechtingen en breng actuele antibiotica aan op de wond plaats.
- Toediening van analgetica (buprenorfine, 0,1 mg/kg) systemisch onmiddellijk na de operatie, en 4-6 uur na.
- Begin 4 weken na de injectie, onderwerp muizen aan een van de paradigma's beschreven in de volgende sectie chronisch controle neuronen uitdrukken van de ontwerper excitatory receptor.
2. repetitieve CNO-levering met oogdruppels
- Acclimate de dieren tot hantering door elke muis 3 minuten dagelijks te vullen gedurende 3-4 dagen voorafgaand aan de toediening van oogdruppels.
- Los Clozapine-N-oxide (CNO, 5 mg) op in 1 mL steriele 0,9% zoutoplossing (stockoplossing: 5 mg CNO/mL). Houd de oplossing gekoeld bij 4 °C.
- Weeg elke muis af voordat u met het experiment begint om te bepalen hoeveel CNO moet worden afgeleverd. Gebruik 1-3 μL druppel (per oog) om 1,0 mg CNO/kg lichaamsgewicht te bereiken.
Opmerking: een muis van 20 g moet bijvoorbeeld een bilaterale (2 μL) oogdruppels krijgen. - Lever de oogdruppels tijdens de inactieve (lichte) fase van muizen, 2 h voor de lichten uit te schakelen (zeitgeber tijd (ZT) 10). In gevallen waarin CNO moet worden afgeleverd tijdens de actieve (donkere) fase van muizen, zorg ervoor dat de aanwezigheid van Dim rood licht voor een goede behandeling van het dier.
Opmerking: voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om te voorkomen dat de circadiane (en licht/donker) cyclus van proefdieren verstoren.- Gebruik een P10 micropipet om de benodigde hoeveelheid CNO-oplossing (1-3 μL) te laden om 1,0 mg CNO/kg te bereiken.
Opmerking: gebruik voor elke oogdruppel een nieuwe en steriele pipetpunt. In deze reeks experimenten werden bilaterale oogdruppels van CNO uitgevoerd; Als echter een lagere CNO-concentratie nodig is, kunnen eenzijdige oogdruppels ook worden toegepast. - Immobiliseer de muis via Scruff.
- Zet de oplossing langzaam uit totdat er een stabiele druppel op de pipetpunt ontstaat.
- Breng de druppel voorzichtig dicht bij het hoornvlies van het oog van de muis totdat de oplossing wordt afgeleverd. De pipetpunt mag nooit contact opnemen met het oog van de muis.
- Laat de muis los en plaats hem terug in de huis kooi.
- Gebruik een P10 micropipet om de benodigde hoeveelheid CNO-oplossing (1-3 μL) te laden om 1,0 mg CNO/kg te bereiken.
- Herhaal deze procedure elke dag gedurende 5 dagen.
Opmerking: deze duur kan worden aangepast volgens de experimentele vereisten. - Gebruik voor controle-experimenten AAV/DREADD-geïnjecteerde muizen die onderworpen zijn aan schijnbehandeling (oogdruppels die alleen zoutoplossing bevatten) en muizen die worden geïnjecteerd met een lege Vector (bijv. AAV/mCherry) die zijn blootgesteld aan het beschreven CNO Eye-Drops protocol.
3. chronische CNO-behandeling geleverd via drinkwater
- Maak kleine flessen met behulp van 50 mL (plastic) conische buizen en rubberen stop spouts; Bedek met aluminiumfolie om licht gemedieerde effecten op CNO-stabiliteit te voorkomen.
- Drie dagen voordat u begint met de behandeling met CNO, vervangt u normale waterflessen door kleine flessen, die 10 mL regulier water bevatten, zodat muizen hun kunnen acclimeren. Bevestig de flessen aan de kooien met behulp van tape.
- Meet het dagelijkse waterverbruik voor elke muis.
- Weeg elke muis af voordat u met het experiment begint.
- Los Clozapine-N-oxide (CNO, 5 mg) op in 1 mL van 0,9% steriele zoutoplossing. Koel de stockoplossing op 4 °C.
- Gebruik het lichaamsgewicht en de gemiddelde hoeveelheid water verbruikt om de concentratie van CNO oplossing te bereiken 1,0 mg CNO/kg (lichaamsgewicht).
Opmerking: volwassen mannelijke muizen (~ 20 g lichaamsgewicht) verbruiken ~ 5 mL water per dag (Figuur 2a). Daarom moet, om een CNO-concentratie van 1 mg CNO/kg te bereiken, 6,4 μL CNO-stamoplossing worden toegevoegd aan een eindvolume van 8 mL water (eindconcentratie: 4 μg CNO/mL). De dosis van CNO voor een dier van 20 g die 5 mL water per dag drinkt, resulteert dus in 1 mg CNO/kg. - Bepaal de optimale CNO-dosis die de maximale effectiviteit met minimale CNO-concentratie weergeeft door een reeks concentraties te testen. Voer een dosisrespons analyse uit om de optimale CNO-dosis voor de drinkwater methode te bepalen.
Opmerking: voor dit experiment zijn de volgende CNO-doses getest: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL en zoutoplossing. 1,0 mg CNO/kg werd voor het eerst getest op basis van i.p.-en oogdruppels-protocollen. - Op dag 1 vult u de fles met 8 mL regulier water en voegt u de benodigde hoeveelheid CNO toe.
Opmerking: deze hoeveelheid water is voldoende voor 24 h van ad libitum water toegang voor een volwassen mannelijke muis. In het geval dat andere knaagdieren worden gebruikt, meet u eerst de hoeveelheid water die dagelijks wordt verbruikt om het benodigde volume te bepalen. - Toezicht houden op de gezondheid van de dieren in het hele protocol om ervoor te zorgen dat er geen nadelige neveneffecten veroorzaakt door water + CNO consumptie.
- Na 24 uur, vervang de flessen met Fresh water + CNO oplossing. Noteer het volume dat tijdens de vorige dag is verbruikt.
- Gooi de water + CNO oplossing weg die niet in afvalcontainers werd geconsumeerd. Gooi plastic flessen weg en vervang de rubberen stoppen elke dag, na ontsmezing volgens de richtlijnen voor de dieren faciliteit.
NB: Meng geen waterig afval met organische oplosmiddelen. Neem contact op met de chemische verwijderings dienst voor instructies voor opslag en pick-up. - Vervang de flessen elke dag op hetzelfde tijdstip gedurende 5 dagen.
Opmerking: deze duur kan worden aangepast volgens de experimentele vereisten. - Neem controlegroepen op, zoals beschreven in stap 2,6.
4. beperkte behandeling met CNO met de voorkeur van muizen voor sucrose
- 3 dagen voordat u begint met de behandeling met CNO, plaatst u een flesje met 10 mL water + 1% sucrose op de kooi, bij voorkeur weg van de originele waterfles.
Opmerking: gebruik dezelfde kleine flessen als beschreven in stap 3,1. - Dieren blootstellen aan water + 1% sucrose tijdens het laatste deel van hun actieve fase (ZT 18 – 24). Na deze blootstelling, verwijder de fles met water + sucrose uit de kooi.
Opmerking: verschillende tijdvensters van CNO-bezorging kunnen worden gebruikt. Bovendien konden muizen onder een omgekeerde licht/donkere cyclus worden geplaatst, waarbij het begin van het licht in de avonduren plaatsvindt om de CNO-levering te vergemakkelijken. - Meet het dagelijkse water + 1% sucrose verbruik voor elke muis.
- Weeg elke muis af voordat u met het experiment begint.
- Gebruik het lichaamsgewicht en de gemiddelde hoeveelheid water + 1% sacharose verbruikt om de dosis CNO-oplossing te bepalen om 1,0 mg CNO/kg (lichaamsgewicht) te bereiken.
Opmerking: de optimale CNO-dosis die de maximale effectiviteit met minimale CNO-concentratie weergeeft, moet worden getest, zoals uitgelegd in stap 3,6. - Op dag 1 vult u flessen met 5 mL water + 1% sucrose + CNO (1 mg CNO/kg) en plaatst u ze op de kooi (altijd op dezelfde plaats) tijdens het bepaalde tijdvenster.
- Aan het einde van het beperkte tijdvenster verwijdert u de flessen en meet u de hoeveelheid water + sucrose + CNO verbruikt.
Opmerking: materialen en oplossingen worden gezuiverd of verwijderd zoals eerder beschreven in stap 3,11. - Herhaal deze procedure elke dag gedurende 5 dagen.
Opmerking: deze duur kan worden aangepast volgens de experimentele vereisten. - Neem een controlegroep op, zoals beschreven in stap 2,6.
5. gegevensanalyse
- Parfumeer muizen intracardiaal met 4% Paraformaldehyde (PFA) ofwel 2 of 6 h na ontvangst van de laatste repetitieve (5e dag) CNO oogdruppel. Wanneer CNO wordt geleverd via drinkwater, vervang CNO + water met water aan het einde van de actieve fase van de muis, en parfuseer vervolgens de muis na 2 of 6 h post-CNO toegang.
Opmerking: als licht blootstelling de c-fos-inductie in het gebied van belang kan beïnvloeden, houd dan muizen in constante duisternis tijdens de laatste dag van de experimenten, en voor de perfusie. - Zorgvuldig ontleden de hersenen uit en onderdompelen in 4% PFA oplossing voor 9-12h.
- Na PFA fixatie, cryoprotect het hersenweefsel met behulp van een 30% sucrose oplossing (wacht tot de hersenen zinkt), dan sectie de hersenen met behulp van een cryostat.
- Breng de coronale hersen secties (35 μm) over in een oplossing met 1x PBS, 10% boviene serumalbumine en 0,3% Triton X-100 voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Inincuberen de hersen secties met een anti-c-Fos (1:2500) antilichaam oplossing bij 4 °C 's nachts met constante opwinding.
- Na 3 wasjes van 5 min elk met een oplossing die 1x PBS en 0,3% Triton X-100 bevat, inbroed de monsters met een Alexa-geconjugeerde secundaire antilichaam (1:500) oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur, weg van licht en met constante opwinding.
- Verkrijg digitale beelden met behulp van een confocale Microscoop. Verzamel en verwerk vastgelegde beelden met een foto bewerkings-en analyse software (bijvoorbeeld Adobe Photoshop).
- Voor gegevensanalyse, omtrek en meet de AAV-geïnfecteerde gebied (mCherry (+) cellen) met behulp van ImageJ-software, en kwantificeren het aantal c-Fos (+) cellen binnen deze regio om het aantal geactiveerde cellen per gebied te verkrijgen. Combineer de resultaten verkregen uit 3 afzonderlijke delen per dier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We observeerden dat repetitieve CNO-levering met oogdruppels een robuuste inductie van c-fos-expressie in de meeste geïnfecteerde neuronen (figuur 1c) opriep, wat aantoont dat de effectiviteit van CNO-levering tijdens de herhaalde blootstelling wordt gehandhaafd. Bovendien werd een significante inductie van c-fos waargenomen in monsters die 2 uur na CNO-behandeling werden verzameld, in vergelijking met monsters die 6 uur na CNO-blootstelling (figuren 1d-E) werden verkregen, waaruit blijkt dat veranderingen die door CNO worden veroorzaakt, tijd afhankelijk zijn.
Vervolgens hebben we de effectiviteit gemeten van de chronische CNO-behandeling die via drinkwater wordt geleverd. We hebben geconstateerd dat de dagelijkse consumptie van water + CNO niet significant verschilt in vergelijking met het totale volume van regulier water dat wordt verbruikt (Figuur 2a). Evenzo werd de hoeveelheid water + 1% sucrose die tijdens de nacht werd verbruikt (6 uur tijdvenster) niet beïnvloed door de toevoeging van CNO (Figuur 2b). Verder zijn er geen verschillen in de dagelijkse consumptie (5 dagen) van zowel water + CNO (figuur 2c) als water + sucrose + CNO (figuur 2D) gevonden tijdens het experiment voor alle dieren.
Vergelijkbaar met wat we vonden met behulp van CNO oogdruppels, werd de robuuste inductie van c-fos waargenomen na 2 uur, maar niet 6 h bij CNO-toegang (figuren 2e-F).
Tot slot, we gemeten de dosisrespons van CNO toegevoegd aan drinkwater. Om dit te doen, muizen werden blootgesteld aan de volgende CNO doses: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL, zoutoplossing. In alle gevallen, dieren werden geperfundeerd 2 h na CNO blootstelling. We constateerden dat er een duidelijke drempel voor effectiviteit is voor CNO, waarbij een lage CNO-dosis (0,1 mg/mL) de activering van c-fos in vergelijking met fysiologische zout controle niet uitlokken, terwijl hogere doseringen (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL en 1,0 mg/mL) robuuste en vergelijkbare c-fos-inductie ( Figuur 2G).
Figuur 1: repetitieve CNO-levering met oogdruppels. A) Aav/HM3Dq-mcherry werd stereotaxsch geïnjecteerd in de hippocampus van volwassen (3 maanden oude) mannelijke muizen. B) vier weken na de injectie, CNO werd toegediend met oogdruppels eenmaal daags gedurende 5 opeenvolgende dagen. Er werd een dosis van 1,0 mg CNO/kg gebruikt. (C) ten slotte werden muizen geofferd, en hersenweefsel werd getest op C-Fos (groene) immunoreactiviteit in het Aav-geïnfecteerde gebied (mcherry-positieve cellen, rood). Er wordt een representatieve coronale sectie van de injectieplaats en de CNO-gemedieerde c-fos-activering weergegeven. D) het aantal c-fos-positieve cellen in het Aav-geïnfecteerde gebied werd gemeten bij muizen die geperfundeerd 2 of 6 h na de laatste CNO-toediening waren. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. * * * p < 0,001; door de t-toets van de student (n = 2-3 muizen). (E) representatieve afbeeldingen voor de twee groepen worden weergegeven. Schaalbalk: 100 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: chronische CNO behandeling geleverd via drinkwater. A) er zijn geen verschillen in het totale vloeistof verbruik waargenomen tussen controle (water) of behandeld (water + CNO, dosis: 1,0 mg CNO/kg) dieren. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM (n = 13-14 muizen). B) op dezelfde manier werden er geen significante verschillen waargenomen in de hoeveelheid water + 1% sucrose verbruikt (tijdens een tijdvenster van 6 uur), na toevoeging van cno (1,0 mg/kg). Gegevens zijn gemiddelde ± SEM (n = 5 muizen). C) de dagelijkse consumptie van water + cno (1,0 mg/kg) voor individuele muizen wordt getoond. Er werden geen verschillen in de dagelijkse consumptie waargenomen. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM (n = 5 muizen). D) het dagelijkse vloeistof verbruik (gedurende een tijdvenster van 6 uur) van 1% sucrose + cno (1,0 mg/kg) voor individuele muizen wordt weergegeven. Er werden geen verschillen in de dagelijkse consumptie waargenomen. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM (n = 3 muizen). (E) 2 of 6 uur na de laatste CNO-toediening werden muizen geofferd en het aantal c-fos-positieve cellen werd gekwantificeerd in het Aav-geïnfecteerde gebied. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. * * * p < 0,001; door de t-toets van de student (n = 5 muizen). F) hersen coronale secties werden getest op c-Fos (groen) immunoreactiviteit in de Aav-geïnfecteerde (mcherry-positieve cellen, rood) regio. Representatieve afbeeldingen worden weergegeven. G) er werden vier CNO-doses toegediend (0,1, 0,25, 0,5 en 1,0 mg CNO/kg), en de c-fos-inductie werd gemeten. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. * * * p < 0,001; door ANOVA, gevolgd door de test van Tukey (n = 2 muizen). Schaalbalk: 100 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DREADDs zijn ontstaan als een populaire en effectieve aanpak voor het op afstand manipuleren van neuronale activiteit17. Het ontwerp van alternatieve strategieën voor CNO-levering zal in grote lijnen het spectrum van beschikbare opties voor specifieke experimentele instellingen vergroten. Bovendien, niet-invasieve strategieën voor de levering van CNO minimaliseren van eventuele verkeerde interpretatie van de resultaten door het verminderen van nadelige bijwerkingen die rechtstreeks van invloed kunnen zijn op de gezondheid van het dier. Hier beschrijven we twee niet-invasieve strategieën voor CNO-bezorging die een robuuste activatie van DREADDs (hM3Dq) verlenen en een breed spectrum aan mogelijkheden bieden. Verder zijn we van mening dat de hier beschreven protocollen ook nuttig kunnen zijn voor verschillende DREADD-varianten voor neuronale manipulatie, waaronder genetisch gemanipuleerde muscarinische of opioïdreceptoren.
CNO levering met repetitieve oogdruppels vertegenwoordigt een pijnloos alternatief voor herhaalde intraperitoneale CNO injecties met behoud van de kracht om nauwkeurige controle dosering en timing van CNO levering. Daarom raden we aan dit protocol te gebruiken wanneer repetitieve DREADD-activering vereist is. Oogdruppels zijn ook de minst dure optie voor CNO-bezorging, vooral in vergelijking met het protocol met behulp van CNO toegevoegd aan het drinkwater. CNO geleverd via drinkwater, aan de andere kant, verleent een chronische en aanhoudende activering van DREADDS, het vermijden van een muis behandeling. Het is belangrijk om te vermelden dat dit protocol geen precieze controle over de timing van CNO levering mist. Een derde alternatief, tijdbeperkte toegang tot een sacharoseoplossing die CNO bevat, combineert de voordelen van beide protocollen die eerder zijn besproken. Deze strategie is tegelijkertijd niet-invasief, repetitief en gemakkelijk uit te voeren. Daarnaast biedt het een betere controle van de timing van CNO levering in vergelijking met de 24 h toegang tot water met CNO. Een voorbehoud van deze aanpak is dat het alleen kan worden gebruikt tijdens de actieve fase van de dieren. We raden aan om beide strategieën te gebruiken met CNO in drinkwater in combinatie met infraroodcamera's of een Lick-o-meter systeem om precieze temporele informatie over het CNO-verbruik te verkrijgen en daarom DREADD activatie.
De langdurige effecten van CNO die via drinkwater worden geleverd, werden eerder gerapporteerd. We hebben met succes een chronische CNO (5 μg/mL) behandeling toegepast gedurende 14 opeenvolgende dagen15 om de gedrags gevolgen van tonicum activering van een thalamo-corticale schakeling die betrokken zijn bij de controle van de stemming te evalueren. Als alternatief wordt CNO in het drinkwater met een concentratie van 40 mg/L gebruikt om de activiteit van serotonerge neuronen van de dorsale raphe Nucleus18chronisch te moduleren, terwijl de functie van pancreas β-cellen werd gecontroleerd met behulp van CNO bij een concentratie van 0,25 mg/mL water19. Gecombineerd, suggereren deze resultaten dat verschillende CNO concentraties kunnen worden afgestemd om de DREADDs effectief te beheersen. Hier constateerden we dat verschillende doses CNO toegevoegd aan drinkwater vergelijkbare c-fos-activering opwekken, wat suggereert dat een dosis-respons analyse moet worden uitgevoerd om de laagste en effectieve CNO-dosis te definiëren die nodig is. Uit recente studies is gebleken dat CNO niet volledig farmacologisch inert is20; Daarnaast werd ook aangetoond dat de in vivo activering van DREADDs wordt gemedieerd door de CNO metaboliet Clozapine, die verschillende endogene doelen21heeft. Daarom, de auteurs suggereren het gebruik van subdrempelwaarde doses van Clozapine, in plaats van hoge CNO doses. Hoewel we niet de effectiviteit van Clozapine in de beschreven methoden hebben geëvalueerd, we vonden dat CNO concentratie kan worden verminderd zonder aanzienlijk verminderen neuronale activering, en daarom, minimaliseren van bijwerkingen veroorzaakt door de CNO-to-Clozapine Conversie.
Kortom, de hier gepresenteerde strategieën vertegenwoordigen mogelijke regelingen voor CNO-levering die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid aan experimentele ontwerpen. Ze werden opgevat als niet-invasieve strategieën die nuttig kunnen zijn voor herhaalde of chronische CNO-gemedieerde activering van DREADD-gecontroleerde neuronen, het verminderen van de impact van CNO-levering op dierlijk gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma aan het National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). We willen graag de steun van de NIMH IRP rodent Behavioral core (ZIC MH002952) bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
