Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

توليف، الروغان، وتوصيف جسيمات نانوية مسامية السليكون فوسوجينيك لإيصال اليغنوكليوتيد

doi: 10.3791/59440 Published: April 16, 2019

Summary

علينا أن نظهر توليف فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية لتسليم اليغنوكليوتيد في المختبر والمجراه في فعالية. جسيمات نانوية مسامية السليكون هي محملة siRNA النموذج الأساسية، التي هي مغلفة بالدهون فوسوجينيك عن طريق البثق لتشكيل shell. يتم تضمين استهداف مجموعة الروغان وتوصيف الجسيمات.

Abstract

ومع ظهور العلاج الجيني، أصبح تطوير نظام التسليم الفعال المجراة في النوكليوتيدات-حمولة الاستيراد الموازي. مؤخرا أظهرت فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) عالية الجيني المجراة في إسكات فعاليتها بسبب ما اليغنوكليوتيد عالية تحميل القدرات ومسار امتصاص الخلوية الفريدة التي تتجنب الالتقام. توليف بسينبس و هو عملية متعددة الخطوات تتضمن: (1) تحميل وختم حمولات اليغنوكليوتيد في المسام السليكون؛ (2) المتزامنة طلاء والتحجيم من الدهون فوسوجينيك حول النوى سليكون المليئة بالثغرات؛ والتصريف (3) استهداف الببتيدات والغسيل لإزالة اليغنوكليوتيد الزائدة والحطام السليكون الببتيد. التوحيد حجم الجسيمات تتسم بالديناميكية ونثر الضوء، ومن الممكن التحقق من بنيتها الأساسية-شل مجهر إلكتروني. يتم التحقق من امتصاص فوسوجينيك بتحميل محبتين صبغ، 1, 1 '-ديوكتاديسيل-3,3، 3', بيركلورات 3 '--تيتراميثيليندوكاربوسيانيني (دي)، إلى بلير دهن فوسوجينيك وعلاجها بالخلايا في المختبر لمراقبة لغشاء البلازما تلطيخ مقابل تعريب اندوسيتيك. تم قياس كمية بلغت إسكات الجينات الاستهداف والمجراه في سابقا في نموذج ماوس للالتهاب الرئوي من المكوّرات العنقودية الذهبية ، التي يتوقع الببتيد الاستهداف للمساعدة وبسينبس للصفحة الرئيسية لموقع الإصابة. بعد تطبيقه في المذهبة س. العدوى، يمكن استخدام النظام و بسينب لتسليم أي اليغنوكليوتيد للعلاج الجيني لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العلاج الجيني ينظم التعبير الجيني محددة الحصول على نتيجة العلاج. تم اكتشاف العديد من أدوات للتحوير الجيني ودراستها، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) باستخدام النوكليوتيد (مثلاً، قصيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)1،2، ميكرورنا (ميرنا)3،4 )، الحمض النووي والبلازميدات5،6، نوكليسيس (مثلاً، إصبع الزنك، تالينس)7،8، ونظم كريسبر/Cas99،10. بينما يختلف إليه كل أداة عمل، جميع الأدوات يجب أن تصل إلى السيتوبلازم للخلية أو النواة تكون نشطة. على هذا النحو، بينما أثبتت هذه الأدوات للحث على تأثير كبير على تحوير الجينات في المختبر، ونجاعة المجراة في تعاني من عقبات خارج الخلية وداخل الخلية. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الأدوات التي من أصل بيولوجي، العديد من الإنزيمات ونظم إزالة الألغام موجودة في الجسم التي لها القدرة على تخفيض أو إزالة الجزيئات الأجنبية11. حتى في الحالة أن الأدوات التي تصل إلى الخلية المستهدفة، وأنهم يعانون من الالتقام؛ طريقة لامتصاص الخلوية التي تقوم بتغليف والفخاخ الأدوات الموجودة في حويصلات تشبه المعدة الحمضية التي تتحلل أو طرد أدوات الخروج من الزنزانة. في الواقع، لقد أظهرت الدراسات أن الدهون جسيمات نانوية المبتلعة عن طريق ماكروبينوسيتوسيس، التي هي اكسوسيتوسيد حوالي 70% من siRNA من الخلايا ضمن ح 24 لاستيعاب12،13. غالبية siRNA المتبقية هي المتدهورة من خلال المسار الليزوزومية، وفي نهاية المطاف تحقيق فقط 1-2% من siRNA في البداية يدخل الخلية التي تحتوي جسيمات نانوية الهروب اندوسومال الخضوع يحتمل أن تكون [رني]13،14 .

وقد وضعنا مؤخرا فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) التي أساسية محملة siRNA تتألف من جسيمات نانوية السيليكون المليئة بالثغرات، و شل دهن فوسوجينيك15. واو-بسينبس يقدم ثلاث مزايا رئيسية على أنظمة إيصال اليغنوكليوتيد التقليدية الأخرى: (1) دهن فوسوجينيك الطلاء التي تمكن الجسيمات تجاوز الالتقام وتسليم الحمولة كاملة مباشرة في السيتوبلازم الخلية (مقابل % 1-2 يتحقق بالجسيمات المبتلعة13،14) (الشكل 1)؛ (2) تحميل siRNA في بسينبس أسلحة عالية (> 20 و % مقارنة بوزن 1-15% من النظم التقليدية)15، والتي تتحلل سريعاً في السيتوبلازم (بمجرد إلقاء الجسيمات الأساسية للطلاء الدهني عن طريق امتصاص فوسوجينيك) لإطلاق سراح siRNA؛ و (3) استهداف تصريف الببتيد لاستضافة أكثر انتقائية للمطلوب أنواع الخلايا الحية في.

وقد أثبت نظام بسينب و الجينات كبيرة إسكات فعالية (> 95% في المختبر؛ > 80% المجراة في) وتأثير العلاجية اللاحقة في طراز ماوس قاتلة من الالتهاب الرئوي في المذهبة س. ؛ النتائج التي تم نشرها سابقا15. ومع ذلك، يتطلب البنية المعقدة للنظام و بسينب معالجة دقيقة وصقل الأمثل لتوليد جسيمات نانوية موحدة ومستقرة. وهكذا، والغرض من هذا العمل تقديم بروتوكول شامل، فضلا عن استراتيجيات التحسين للتوليف والروغان، ووصف واو-بسينبس لاستخدامها في إيصال المستهدفة من سيرناس لتأثير إسكات الجينات القوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-تجميع جسيمات نانوية مسامية السيليكون (بسينبس)

تنبيه: كن حذراً دائماً عند العمل مع حمض الهيدروفلوريك (HF). اتبع جميع أدلة الأمان وفقا لورقة بيانات السلامة به (SDS) والتعامل مع أي المواد الكيميائية التي تحتوي على التردد في غطاء دخان، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية؛ وقفازات مزدوج مع قفازات بوتيل في الخارج، ساحة بوتيل مع معطف مختبر تحتها، الوجه درع مع نظارات واقية تحت). جميع جامعات ومختبرات البحث والتطوير يتطلب تدريب خاص على السلامة HF قبل الاستخدام. لا تحاول أن تعمل مع التردد دون الموافقة المسبقة الخاصة بك منسق سلامة المختبرات المحلية، التي تلزم بتدابير إضافية للسلامة لا الموصوفة هنا.

  1. إعداد الحلول النقش
    1. لجعل الحل HF 3:1 للنقش (المستخدمة في خطوات 1.3 و 1.4)، تعبئة من بلاستيك تخرج الاسطوانة مع 30 مل من مائي 48% التردد و 10 مل من الإيثانول المطلق (EtOH). الحل يجب أن تكون مضمنة في المواد البلاستيكية عالية الكثافة (مثل، الكثافة)، كما يذوب HF الزجاج.
    2. جعل 01:29 تخرج الحل التردد لانطلاقة (المستخدمة في الخطوة 1، 5)، تعبئة البلاستيك اسطوانة مع 1 مل من مائي 48% HF ومل 29 من الإيثانول المطلقة. الحل يجب أن تكون مضمنة في المواد البلاستيكية عالية الكثافة (مثل، الكثافة)، كما يذوب HF الزجاج.
    3. جعل الحل كوه م 1 في 10% EtOH لانحلال هذه المبادرة الزائدة (المستخدمة في "الخطوات 1-3" و 1، 5).
  2. إعداد الخلية أحفر
    1. في تفلون أحفر الخلية مع سم 8.62 أحفر جيدا (منطقة يتم حسابه بقياس قطر سطح السليكون المتوفرة للحفر داخل يا الدائري، وحساب المجال بألف = πr2)، وضع بترتيب تنازلي (الشكل 2a): (1) تفلون الخلية أعلى؛ (2) الدائري؛ (3) قطعة ربع من بلورة أحادية (1 0 0)-توجه ف + +-نوع السيليكون رقاقة مقطعة أرباع (باستخدام قاطع الماس)؛ (4) رقائق الألومنيوم؛ و (5) تفلون الخلية الأساسية مع مسامير بلطف تشديد الإجراءات لمنع التسرب.
    2. سد البئر مع EtOH. مسح وإدراج في الشق بين أعلى الخلية تفلون وقاعدة. إذا كان المسح الجاف عند إزالة، الخلية أحفر مختومة. إذا تسرب الرطب، الخلية، وتشديد الخناق كذلك حتى مختومة.
  3. اليكتروبوليشينج رقاقة السيليكون
    1. جلب الخلية أحفر المجتمعون في غطاء دخان.
    2. سد البئر مع 10 مل من محلول HF 3:1.
    3. الاتصال زمام المبادرة الإيجابية لرقائق الألومنيوم (الكهربائي) من الخلية أحفر والاتصال تؤدي سلبية اللولب البلاتين (مكافحة القطب) منغمسين في حل الخلية أحفر لإكمال الدائرة (الشكل 2) HF 3:1.
    4. تشغيل ثابت الحالية في mA 50 سم-2 ل 60 ثانية. مرة أحفر انتهى، إزالة الخلية من الدارة، وشطف خارج التردد 3:1 بعناية باستخدام المحاقن. شطف مع EtOH ثلاث مرات.
    5. حل بعيداً من طبقة محفوراً بسد البئر ببطء مع 10 مل من 1 م كوه. انتظر حتى تهدأ السطح.
    6. شطف من كوه بالماء ثلاث مرات، ومن ثم مع EtOH ثلاث مرات.
  4. اليكتروتشيميكالي النقش طبقات مسامية في رقاقة السيليكون
    1. تشغيل تيار المتردد من الموجي مربعة، مع current density أقل من 50 mA/سم2 ل 0.6 s وعالية الكثافة الحالية من 400 mA/سم2 ل 0.36 s متكررة لدورات 500.
    2. مرة أحفر انتهى، إزالة الخلية من الدارة، وشطف خارج التردد 3:1 بعناية باستخدام المحاقن. شطف مع EtOH ثلاث مرات.
  5. رفع قبالة الطبقة المسامية من رقاقة السيليكون
    1. سد البئر مع 10 مل من 01:29 الحل التردد.
    2. تشغيل ثابت من 3.7 mA/سم2 250 s. مرة أحفر انتهى، إزالة الخلية من الدائرة. الطبقة هذه المبادرة قد تظهر تموجات تشير إلى مفرزة من رقاقة السيليكون البللوري. بلطف تغسل 01:29 الحل التردد وشطف مع EtOH ثلاث مرات، ثم مع الماء ثلاث مرات.
    3. استخدام تلميح ماصة، إيمانا راسخا صدع محيط الطبقة هذه المبادرة لمفرزة كاملة. استخدام EtOH، جمع شظايا هذه المبادرة (رقائق) من تفلون أحفر الخلية في قارب وزنها. نقل الرقائق لقنينة زجاج. يمكن الإبقاء على الرقائق هذه المبادرة في درجة حرارة الغرفة في EtOH لأكثر من 6 أشهر للتخزين.
    4. حل أي السيليكون المليئة بالثغرات المتبقية في يفر بعيداً عن طريق ملء البئر ببطء مع 10 مل من 1 م كوه. انتظر حتى تهدأ السطح.
    5. شطف من كوه بالماء ثلاث مرات، ومن ثم مع EtOH ثلاث مرات.
    6. كرر الخطوات من 1.3-1.5 حتى سمك يفر كاملة قد تم محفوراً.
  6. سونيكاتينج طبقات مسامية لتشكيل نانوحبيبات
    1. استبدال المذيبات القنينة الزجاجية التي تحتوي على رقائق هذه المبادرة من EtOH إلى 2 مل مياه دي.
    2. بشدة إغلاق الغطاء، وختم باستخدام بارافيلم.
    3. مكان الزجاج فيال في حمام سونيكاتور وعلقت أن حجم رقائق هذه المبادرة هو تماما المغمورة تحت سطح الأرض.
    4. Sonicate على ح 12 35 كيلو هرتز وطاقة الترددات اللاسلكية من 48W. لمنع فقدان الماء كبيرة أثناء سونيكيشن، ضع قارورة حجمي مملوءة بالمياه، مقلوب حيث أن فتح قارورة يمس سطح حمام الماء.
    5. ضع قنينة الزجاج على سطح مستو ح 1 للسماح للجسيمات الأكبر حجماً لتسوية في الجزء السفلي. جمع المادة طافية ماصة؛ باستخدام ويتضمن التعليق بسينبس sub-100 نانومتر.

2-إعداد فيلم الدهن فوسوجينيك

  1. إعداد الحلول الدهن المخزون
    1. في غطاء دخان، جعل الأرصدة 10 ملغ/مل من الدهون بترطيب دمبك، دسب-شماعة-القانون النموذجي للتحكيم والدهون دوتاب في كلوروفورم. يمكن الإبقاء على هذه الحلول الأسهم في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر تحت ختم بارافيلم ضيق.
  2. جعل الفيلم الدهن فوسوجينيك
    ملاحظة: تكوين فوسوجينيك مصنوع من الدهون، دمبك، دسب-الوتد، ودوتاب، في نسبة المولى 76.2:3.8:20 و 96.2:3.8:0، على التوالي.
    1. في قنينة زجاجية، مزيج ميكروليتر 72.55 دمبك وقدرة 15.16 ميكروليتر من شماعة دسب 19.63 ميكروليتر من دوتاب من بيبيتينج.
    2. اختياري: لوضع العلامات الفلورية الطلاء الدهن، بالإضافة إلى ذلك إضافة 20 ميليلتر من دي حله في EtOH بتركيز 1 ملغ/مل.
    3. مكان القنينة في غطاء دخان مع غطاء فضفاض للسماح كلوروفورم تتبخر بين ليلة وضحاها. وسيكون الفيلم المجففة مادة هلام مثل الصلب غائم في أسفل القنينة.

3-تحميل وختم من siRNA في بسينبس

  1. إعداد كلوريد الكالسيوم تحميل المخزون
    1. حل ز 1.11 من كاكل2 في 10 مل مياه خالية من رناسي لجعل حل2 كاكل م 2.
    2. الطرد المركزي الحل > 10 آلاف س ز لمدة 1 دقيقة لتسوية المجاميع وجمع المادة طافية باستخدام ماصة. بدلاً من ذلك، قم بتصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  2. إعداد siRNA تحميل المخزون
    1. هيدرات أو تمييع siRNA إلى 150 ميكرومتر في المياه خالية من رناسي. قد يكون اليكووتيد هذا الحل الأسهم وتبقى مجمدة في-20 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل نظراً لأن فإنه لا تخضع لدورات تجميد أذاب متكررة.
  3. تحميل siRNA في بسينبس مع كلوريد الكالسيوم
    1. إعداد حمام سونيكيشن مثلج.
    2. تحت 15 دقيقة ultrasonication ولطف ماصة 150 ميليلتر من siRNA وميليلتر 700 م 2 كاكل2 إلى 150 ميليلتر من بسينب. تأكد من ترك غطاء أنبوب ميكروسينتريفوجي مفتوحة لتوليد الغاز.
    3. إزالة أنبوب يحتوي على 1 مل بسينبس الكالسيوم محملة siRNA المغلفة من سونيكاتور.

4-طلاء بسينبس siRNA المحملة بالدهون فوسوجينيك

  1. إعداد مواد البثق الحويصلية
    1. ملء كوب واسعة مع المياه دي. غشاء البولي 1 النقع (200 نانومتر المسام)، ويدعم تصفية 4 التي تطفو بها على سطح الماء. تجميع عدة البثق الحويصلية باتباع إرشادات الشركة المصنعة
  2. ترطيب الفيلم الدهن مع تحميل siRNA بسينبس
    1. هيدرات الدهن المجففة الفيلم في القنينة الزجاج مع 1 مل من بسينبس الكالسيوم محملة siRNA المغلفة التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.3.3. "الماصة؛" حتى جميع الدهون الفيلم قد رفع من أسفل القنينة ومختلطة في حل متجانسة الملبدة بالغيوم.
    2. وضع شريط إثارة مغناطيسية في قنينة الزجاج ثم ضع القنينة على لوحة الساخن لتسخين الجسيمات إلى 40 درجة مئوية (أو مرتفع ما يكفي أعلاه المرحلة درجة حرارة الدهون التحول الاحتفاظ الدهون في مرحلة فلويديك أكثر البلورات السائلة) بينما مغناطيسيا إثارة الحل لمدة 20 دقيقة.
  3. البثق بسينبس المغلفة بالدهن للتحكم في حجم
    1. نضح 1 مل الحل المغلفة بدهن بسينب-siRNA في المحاقن النتوء. إدراج المحاقن فارغة على أحد جانبي الطارد، والمحاقن شغلها على الطرف الآخر.
    2. يبدأ قذف بدفع المكبس ببطء لدفع الجسيمات من حقنه واحدة، عبر غشاء البولي، وفي الأخرى. كرر 20 مرة. إذا عالق المكبس، عامل التصفية والغشاء قد يكون انسداد. تفكيكه في الطارد واستبدال يدعم الغشاء والتصفية. إذا استمرت المشكلة، تمييع الجسيمات حتى انسداد يمكن التحكم فيها.
    3. جمع جزيئات البوليستيرين في أنبوب ميكروسينتريفوجي.

5-تصريف استهداف الببتيدات

  1. التصريف الببتيد الاستهداف لطلاء دهني
    1. إعداد المخزون الببتيد مع 1 ملغ/مل تركيز الببتيد في المياه خالية من رناسي.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على فوسوجينيك بسينبس المغلفة بالدهن، إضافة 100 ميليلتر من مخزون الببتيد 1 ملغ/مل وبيبيت بلطف. الاحتفاظ بالانبوب ثابتة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة (بدلاً من ذلك، > 2 ح في 4 درجات مئوية).
    3. لإزالة الزائدة الببتيد أو siRNA وأخرى سواغ، يغسل في عامل تصفية الطرد مركزي كاتشين 30 من الغزل في 5,000 س ز عند 25 درجة مئوية حاء 1 أكثر من مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني تحت نفس إعداد أجهزة الطرد المركزي.
    4. ريسوسبيند بسينبس المغلفة بدهن فوسوجينيك مترافق الببتيد النهائية في برنامج تلفزيوني في التركيز المطلوب. الآن يمكن الجسيمات اليكووتيد والمجمدة في-80 درجة مئوية للتخزين لمدة 30 يوما على الأقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

توليفة ناجحة من بسينبس فوسوجينيك وينبغي التوصل إلى حل متجانسة، مبهمة بعض الشيء (الشكل 3a). الفشل في تحسين نسبة وتركيز بسينبس: siRNA: كاكل2 قد يؤدي إلى التراكم عند تحميل (الشكل 3b). كما هي مقذوف الجسيمات من خلال 200 نانومتر الأغشية، قطر بسينبس فوسوجينيك تقاس DLS هيدرودينامية متوسط يجب أن يكون ما يقرب من 200 نانومتر، والمتوسط متوسط زيتا-إمكانات تقريبا + 7 كما هو مبين في الشكل 4. بعد تعديل السطح مع استهداف الببتيدات، ينبغي زيادة القطر عموما لتكون تحت 230 نيوتن متر، ومتوسط زيتا-إمكانات انخفضت وصولاً إلى-3.4 أم15. أي انحراف واسعة من حجم النتوء يدل على فشل البثق (دالجسيمات >> دالبثق)، أو فشل في تحميل (دالجسيمات << دالبثق). قد أيضا كمياً التجميعات باستخدام دائرة الأراضي والمساحة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكون مذاب مختبرين المجمدة إلا مرة واحدة، كتجميد أذاب المتكررة تعطيل دورات غشاء الدهن والانصهار إينترابارتيكولار والتجميع (الشكل 4). وكما يبين الشكل 4a ، قد المخزنة لمدة 30 يوما بسينبس فوسوجينيك وإذابة دون أحداث تغييرات هيكلية. ومع ذلك، تكرار دورات تجميد أذاب قاسمة واحد يسبب التراكم الشديد (د >> 1,000 nm) وخلال 4 أيام الدورة اليومية (الشكل 4 باء)، وبالتالي فإنه ينصح أن الجسيمات الكوتيد واحد باستخدام وحدات التخزين.

قد أكد الانصهار وسمها الدهون فوسوجينيك مع دي محبتين (الخطوة 2.2.2)، ومراقبة التعريب في المختبر باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. ويبين الشكل 1 د الانصهار ناجحة، حيث نقل دي لغشاء البلازما الدهون في بسينب فوسوجينيك وتكون مترجمة مستقلة من lysosomes. الانصهار غير ناجحة وسوف تظهر الترجمة دي داخل السيتوبلازم للخلية وكولوكاليزيشن مع ليسوسوميس (الشكل 1 ج).

Figure 1
رقم 1: فوسوجينيك السليكون مسامية نانوحبيبات نظام (F-بسينب)- () التخطيطي إظهار اندوسيتيك امتصاص جسيمات نانوية التقليدية وفخ اندوسومال اللاحقة. (ب) التخطيطي إظهار امتصاص فوسوجينيك و بسينبس وإيصال حمولة siRNA سيتوسوليك اللاحقة. (ج) [كنفوكل] صورة مجهرية من كاوف-3 خلية يحتوي على بسينبس غير فوسوجينيك المبتلعة التي كانت محملة بصبغ محبتين دي. كوب-3 الخلايا نمت إلى التقاء 80% في بئر 6-لوحة، وتعامل مع 10 ميليلتر من جسيمات نانوية والمحتضنة في 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة 15 دقيقة. الخلايا كانت ثابتة في بارافورمالدهيد 1% لتركيبها على الشرائح الزجاجية مع DAPI والمجففة وأبقى في الظلام حتى تدرس بالفحص المجهري [كنفوكل]. (د) [كنفوكل] صورة مجهرية من خلية كوب-3 التي اتخذت حتى بسينبس فوسوجينيك التي كانت محملة بصبغ محبتين دي. كانت ملطخة الخلايا قبل ليسوتراكير الأخضر ح 1 في 37 درجة مئوية في 5% CO2 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. الخلايا ثم تم غسلها PBS ثلاث مرات، وتعامل مع 10 ميكروليتر من الجزيئات دي-تحميل لمدة 15 دقيقة. تم غسلها الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لإزالة أي جزيئات لم تؤخذ حتى، والآبار كانت مليئة 1 مل من برنامج تلفزيوني وتتخذ فورا لتصوير خلية يعيش مجهرية [كنفوكل]؛ DAPI يمثل وصمة عار النووية ويحلول تلطيخ الليزوزومية بالأخضر ليسوتراكير؛ يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: أحفر الإعداد الخلية. () التخطيطي إظهار أحفر مكونات الخلية وترتيب الجمعية؛ و (ب) الرسم التخطيطي للإعداد للنقش الكهروكيميائية من السيليكون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: صورة للمنتج النهائي وبسينب- () نجاح توليف عرض حل متجانس وخفيف؛ (ب) توليف غير ناجحة عرض تجميع جزيئات (أصفر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: دورة تجميد أذاب المتكررة من بسينبس فوسوجينيك تسبب التجميع. () متوسط الحجم وزيتا-إمكانات بسينبس فوسوجينيك ما زال ثابت لمدة 30 يوما عند إذابة مرة واحدة بعد انتهاء التجميد؛ (ب) متوسط الحجم وزيتا-إمكانات بسينبس فوسوجينيك يظهر دلائل على التجميع وفقدان السلامة الهيكلية في غضون 4 أيام بعد أن خضع لدورات تجميد أذاب يوميا. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (n = 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
رقم 5: رسم تخطيطي لتوليف نانوحبيبات السليكون المسامية. التخطيطي يظهر النقش الكهروكيميائية لرقاقة السيليكون (الخطوة 1-4)، زنتها طبقة مسامية (الخطوة 1-5)، سونيكيشن طبقة مسامية إلى جزيئات، وجمع لجسيمات نانوية مسامية السليكون (الخطوة 1، 6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد توليف لجسيمات نانوية مسامية السليكون في الشكل 5. الخطوة الحاسمة في تركيب بسينبس فوسوجينيك في تحميل الخطوة (الخطوة 3). إذا كان يتم تجميع جسيمات نانوية فوسوجينيك بعد توليف (الشكل 3)، والسبب قد يكون بسبب ما يلي: (1) كلوريد الكالسيوم المخزون لم يعد المتجانس، وبالتالي خطوة 3.1.2 يجب أن تكون بعناية اتباعها أو صقلها؛ أو (2) نسبة بسينب: siRNA: كاكل2 أو تركيز واحد أو أكثر من هذه العناصر الثلاثة قد لا تكون الأمثل. ويقترح إعادة الأمثل بدءاً بتركيز2 كاكل (مثلاً، تغيير من 2 م إلى 1 م أو م 3). وعلاوة على ذلك، من المهم التأكد من أن كاكل2 من نفس البائع، كما وجدنا أن نفس المادة الكيميائية من مختلف البائعين أسفر عن انخفاض الأس الهيدروجيني في خطوة التحميل، وفشل اللاحقة لتحميل في siRNA. بسينبس قد أيضا تتركز، المخفف، أو زيادة المتدهورة قبل عملية التحميل بترك جسيمات معلقة في الماء خالية من رناسي لمدة يومين بعد الخطوة 1.6.6.

بعد انتهاء التحميل، دهن طلاء غالباً ما يؤدي إلى صعوبة في قذف بسبب تركيز أو كثافة الجسيمات (الخطوة 4). في حالة انسداد الغشاء البثق، مما اضطر قذف قد مزق الغشاء. عند انسداد، تفكيك في الطارد، واستبدال الغشاء ويدعم بمجموعة جديدة إذا كانت الخسارة من انسداد صغيرة. إذا كان الخسارة كبيرة، ثم تضعف تعليق الجسيمات، و sonicate عن 30 ثانية قبل قذف. إذا استمرت المشكلة، ينصح بإعادة الأمثل بسينب حجم ونسبة التحميل إلى أدنى حد من المجاميع. وأخيراً، فإننا نقترح تصفية تعليق الجسيمات من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر المسامية للقضاء على أي ملوثات أو المجاميع قبل الخلية أو معاملة الحيوانات. تصفية ينصح خاصة إذا تم توليفها من الجسيمات في بيئة غير معقمة، أو بعد ذوبان الجليد قاسمة مجمدة من الجسيمات.

فوسوجينيسيتي الجزيئات قد يمكن التحقق من صحة الفحص المجهري [كنفوكل] (كما هو مبين في الشكل 1 ج، د)، ومجهر إلكتروني للخلايا تعامل مع الجسيمات لمراقبة للدهن-تسلط مسامية السليكون النوى في السيتوبلازم 15.

بسينبس فوسوجينيك وبروتوكولها التوليف لديها عدد قليل من القيود. للجينات في المختبر إسكات التطبيقات، قد أثبتت بسينبس فوسوجينيك قدم لحمل > 90 ٪ كفاءة ضربة قاضية في مجموعة من خطوط الخلايا في جرعة 100 نانومتر؛ بما في ذلك خط الخلية العصبية-2a نيوروبلاستوما الماوس، خط خلية سرطان المبيض البشري 3 كوب، وصعوبة المعروف إلى ترانسفيكت 264.7 الخام الماوس بلعم خلية الخط. بيد أننا لاحظنا > 50% كفاءة ضربة قاضية في ما يصل إلى 25 نانومتر الجرعة، التي كانت مماثلة لتلك التي ليبوفيكتاميني. بينما الدهون الموجبة يجب استخدام الحد الأدنى للحد من الآثار السامة للخلايا، أثبتنا سابقا السلامة في جرعة المادة الدهنية ليصل إلى 1 مغ15. للجينات المجراة في إسكات التطبيقات، بسينبس فوسوجينيك محدودة بالانتقائية. كما الكهربية الاستاتية جذب الدهون الموجبة لأي غشاء الخلية، الجسيمات يجب استخدامه محلي علاجية، أو يكون السطح معدلة مع moiety استهداف (مثلاً، الببتيدات، والأجسام المضادة، إلخ.). حاليا هو بروتوكول توليف بسينبس فوسوجينيك الأمثل ومحدودة لتسليم siRNA فقط. نفس الأسلوب قد تحققت بنجاح تحميل ميرنا، وهو الافتراض ليتمكن من تحميل مرناً وكدنا وغيرها حمولات النوكليوتيدات أكبر، ولكن هذه لم الأمثل.

يجعل العمل الذي قدم إسهاما كبيرا في المجال العلاج بالجينات. المعيار القياسي لإسكات الجينات في المختبر هو ليبوفيكتاميني لعام 2000. لقد أظهرنا أن بسينبس فوسوجينيك يمكن أن تحدث أثر ضربة قاضية للمقارنة، إذا كانت الكفاءة أعلى لا،15. والميزة الرئيسية بسينبس فوسوجينيك على ليبوفيكتاميني 2000 هو قدرته على استخدامها في تطبيقات في المجراة مع حقن الجهازية. في حين أن عوامل أخرى، مثل إينفيفوفيكتاميني 3.0، قد تم تسويقها لاستخدامات المجراة في، تصلح فقط لإيصال الكبد، وتتطلب سيرناس المعدلة كيميائيا (مع أو دون يتدلى، أو في بنية الحمض النووي مؤمنة (LNA)) لزيادة الاستقرار وخصوصية. 16 , 17 , 18 ومع ذلك، يمكن أن بسينبس فوسوجينيك التوليف بعد تعديله متزاوجة مويتيس الاستهداف مع الكيمياء ماليميدي ثيول بسيطة، حيث تربط مجموعة ثيول في استهداف الببتيد (الذي يحمل سيستين إضافية لهذا الغرض) الكربون المستعبدين مزدوجة في الحلبة ماليميدي في نهاية الدهون سي في طلاء فوسوجينيك. وعلاوة على ذلك، كتلة ارتفاع كفاءة الشحن والتسليم إلى السيتوبلازم الخلية يقلل من الضرورة لخصوصية داخل الخلايا ويبلغ الجينات القوية إسكات تأثير مع سيرناس غير معدلة15. عيب واحد من بسينبس فوسوجينيك هو أن البروتوكول توليف عدة أيام عملية أكثر تعقيداً من وكلاء تعداء المتاحة تجارياً. ومع ذلك، بينما يجب أن يكون إعداد المنتجات المعيار طازجة قبل تعداء للحصول على أفضل النتائج، بسينبس فوسوجينيك قد تكون الكوتيد والمجمدة لمدة 30 يوما على الأقل دون التقليل من كفاءة ضربة قاضية.

وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب الأمثل للتحميل وتسليم الحمولات الحمض النووي أكبر، مثل مرناس وكدناس. بالإضافة إلى ذلك، إنجاز مجمع البروتين-سجرنا كريسبر/Cas9، أو كوكتيل مرناً Cas9 وسجرنا، أيضا خيار تنمية، كما النظام الأمثل لتحميل الحمولات أنيونى. عموما، النظام و بسينب نانوبلاتفورم وحدات للعلاج الجيني لعلاج أمراض ما بعد الإصابات، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ميس مؤسس علمية الشراع العلوم البيولوجية، وشركة، ورأس المال في الشركة.  على الرغم من أن هذه المنحة قد حددت لإدارة تضارب المصالح استناداً إلى النطاق العام للمشروع وفائدته المحتملة للشراع العلوم البيولوجية، وشركة، على نتائج البحوث التي يتضمنها هذا المنشور خاصة ربما ليس بالضرورة وتتعلق بمصالح الشراع العلوم البيولوجية، وشركة تم استعراض شروط هذا الترتيب وأقرتها جامعة كاليفورنيا، سان دييغو وفقا لسياساته تضارب في المصالح. ليس لها علاقة بالكشف عن مؤلفين آخرين.

Acknowledgments

هذا العمل معتمد من قبل "المعاهد الوطنية للصحة" عن طريق التعاقد # R01 AI132413-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6, (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91, (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18, (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9, (1), 1911 (2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136, (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31, (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31, (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31, (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9, (1), 1969 (2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63, (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8, (1), 2045893217750613 (2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
توليف، الروغان، وتوصيف جسيمات نانوية مسامية السليكون فوسوجينيك لإيصال اليغنوكليوتيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter