Summary
Viser vi syntese av fusogenic porøse silisium nanopartikler for effektiv i vitro og in vivo oligonucleotide levering. Porøse silisium nanopartikler er lastet med siRNA til kjernen, som er belagt med fusogenic lipider gjennom ekstrudering til skallet. Målretting moiety functionalization og partikkel karakteristikk er inkludert.
Abstract
Med ankomsten av genterapi, har utviklingen av en effektiv i vivo nukleotid-nyttelast levering system blitt legemidler. Fusogenic porøse silisium nanopartikler (F-pSiNPs) har nylig vist høy i vivo genet stanse effekt på grunn av sin høye oligonucleotide lasting kapasitet og unike mobilnettet opptak sti som unngår endocytose. Syntese av F-pSiNPs er en flertrinnsprosess som inkluderer: (1) lessing og tetting av oligonucleotide payloads i silisium porene; (2) samtidig belegg og dimensjonering av fusogenic lipider rundt porøse silisium kjernene; og (3) Bøyning av målretting peptider og vaske for å fjerne overflødig oligonucleotide, silisium rusk og peptid. Partikkelens størrelse ensartethet er preget av dynamisk lysspredning og kjerne-shell strukturen kan verifiseres ved overføring elektronmikroskop. Fusogenic opptak valideres av lessing en lipofile fargestoff, 1, 1-dioctadecyl-3,3, 3', 3-tetramethylindocarbocyanine-perklorat (DiI), i fusogenic lipid bilayer og behandler det til celler i vitro å observere for plasma membran flekker endocytic steder. Målretting og in vivo genet stanse efficacies tidligere kvantifisert i en musemodell av Staphylococcus aureus lungebetennelse, der målretting peptid forventes å F-pSiNPs hjem til området av smitte. Utover sin søknad i S. aureus infeksjoner, kan F-pSiNP systemet brukes til å levere noen oligonucleotide for genterapi av en rekke sykdommer, inkludert virusinfeksjoner, kreft og autoimmune sykdommer.
Introduction
Genterapi modulerer bestemt genuttrykk for å få en terapeutisk utfall. Mange verktøy for genet moduleringshjul har blitt oppdaget og studert, inkludert ribonukleinsyre forstyrrelser (RNAi) med oligonucleotides (f.eks kort forstyrrende RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nucleases (f.eks sink finger, TALENS)7,8, og CRISPR/Cas9 systemer9,10. Mens hvert verktøy virkningsmekanismen er forskjellig, må alle verktøy nå i cellen cytoplasma eller kjernen å være aktiv. Som sådan, mens disse verktøyene har bevist for å forårsake betydelig effekt i modulerende genuttrykk i vitro, lider i vivo effekten av ekstracellulære og intracellulær hindringer. På grunn av at verktøyene er biologisk opprinnelse, finnes mange enzymer og klaring systemer i kroppen som kan redusere eller fjerne den fremmede molekyler11. Også i tilfelle lider at verktøyene nå målcelle, de av endocytose; en modus av mobilnettet opptak som omslutter og feller verktøyene i Sure mage som blemmer som fornedre eller utvise verktøyene av cellen. Faktisk har studier vist at lipid nanopartikler er endocytosed via macropinocytosis, som er ca 70% av siRNA exocytosed fra cellene innen 24 timer opptak12,13. Fleste av de gjenværende siRNA er degradert gjennom lysosomale sti, og til slutt bare 1-2% av siRNA som opprinnelig kommer inn i cellen med nanopartikler oppnå endosomal flykte til potensielt gjennomgå RNAi13,14 .
Vi har nylig utviklet fusogenic porøse silisium nanopartikler (F-pSiNPs) som har en siRNA-lastet core består av porøse silisium nanopartikler og en fusogenic lipid shell15. F-pSiNPs presenterer tre store fordeler over andre konvensjonelle oligonucleotide leveringssystemer: (1) en fusogenic lipid belegg som gjør at partiklene til å omgå endocytose og levere hele nyttelast direkte i cellen cytoplasma (i motsetning til 1-2% oppnådd ved endocytosed partikler13,14) (figur 1). (2) høy masse lasting av siRNA i pSiNPs (> 20 wt % i forhold til 1-15 wt % av konvensjonelle systemer)15, raskt redusere i cytoplasma (når kjernen partikler kaster lipid belegget via fusogenic opptak) for å løslate siRNA; og (3) målretting peptid Bøyning for selektiv homing til ønsket celletyper i vivo.
F-pSiNP systemet har vist betydelig genet stanse effekten (> 95% i vitro; > 80% i vivo) og påfølgende terapeutisk effekt i en alvorlig musemodell for S. aureus lungebetennelse; resultatene som ble utgitt tidligere15. Av kompliserte strukturer av F-pSiNP systemet krever imidlertid førsteklasses fingerfølsomhet og finjustert optimalisering generere enhetlig og stabil nanopartikler. Dermed er formålet med dette arbeidet å presentere en grundig protokoll, samt optimalisering strategier for syntese, functionalization og karakterisering av F-pSiNPs som skal brukes i målrettede levering av siRNAs for potente genet stanse effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese av porøse silisium nanopartikler (pSINPs)
FORSIKTIG: Bruk alltid forsiktighet når du arbeider med flussyre (HF). Følg alle sikkerheten guider ifølge sin sikkerhetsdatabladet (SDS) håndtere noen HF-inneholdende kjemikalier i avtrekksvifte og bruke riktig personlig verneutstyr (PVU, doble hansker med butyllitium hansker på utsiden, butyl forkle med Laboratoriefrakk under, ansikt Skjerme med vernebriller under). Alle universiteter og FoU -laboratorier krever spesifikk opplæring på HF sikkerhet før bruk. Ikke forsøk å arbeide med HF uten forhåndsgodkjenning av den lokale lab miljø koordinatoren, ytterligere sikkerhetstiltak som ikke er beskrevet her er nødvendig.
-
Forberedelse av etsing løsninger
- For å gjøre den 3:1 HF løsningen for etsning (brukt i trinn 1.3 og 1.4), fylle en plast uteksaminert sylinder med 30 mL av vandig 48% HF og 10 mL av absolutt etanol (EtOH). Løsningen må finnes i høy tetthet plast (f.eks HDPE), som HF oppløser glass.
- For å gjøre en 1:29 HF løsning for lift-off (brukt i trinn 1.5), fylle en plast uteksaminert sylinder med 1 mL av vandig 48% HF og 29 mL absolutt etanol. Løsningen må finnes i høy tetthet plast (f.eks HDPE), som HF oppløser glass.
- Gjøre 1 M KOH løsningen i 10% EtOH for overflødig pSi oppløsning (brukt i trinn 1.3 og 1.5).
-
Definere etch cellen
- I en Teflon etch cellen med en 8.6 cm2 etse godt (området beregnes ved å måle diameteren på silisium overflaten tilgjengelig for etsning innenfor O-ring og beregne området av A = πr2), sett i synkende rekkefølge (figur 2a): (1) den Teflon celletoppen; (2) en O-ring; (3) kvartal stykke enkelt krystall (1 0 0) - orientert p ++ - type silikon wafer skåret i fjerdedeler (med diamantsliping); (4) aluminiumsfolie; og (5) Teflon cellen basen med skruene strammes forsiktig for å hindre lekkasje.
- Fyll brønnen med EtOH. Ta en tørke og sett inn kløft mellom Teflon cellen øverst og base. Hvis tømmingen av er tørr på fjerning, er etch cellen forseglet. Hvis våt, cellen lekker og stram videre skruene til forseglet.
-
Electropolishing silisium kjeks
- Bringe den sammensatte etch-cellen i avtrekksvifte.
- Fyll brønnen med 10 mL 3:1 HF.
- Koble den positive og negative til aluminiumsfolie (elektrode) fra etch cellen og koble negative ledelsen til platina spolen (mot elektrode) i 3:1 HF løsningen i etch cellen å fullføre kretsen (figur 2b).
- Kjøre en konstant strøm på 50 mA cm-2 for 60 s. Når etch er ferdig, Fjern cellen fra krets, og skyll ut 3:1 HF forsiktig med en sprøyte. Skyll med EtOH tre ganger.
- Oppløse gang etset laget ved å fylle brønnen sakte med 10 mL 1 M KOH. Vent til boblende avtar.
- Skyll ut KOH med vann tre ganger, og deretter med EtOH tre ganger.
-
Electrochemically etsing porøse lag i silisium kjeks
- Kjøre en vekselstrøm over en firkantet bølgeform, med lavere current density av 50 mA/cm2 0,6 r og høy nåværende tetthet av 400 mA/cm2 for 0,36 s gjentas for 500 sykluser.
- Når etch er ferdig, Fjern cellen fra krets, og skyll ut 3:1 HF forsiktig med en sprøyte. Skyll med EtOH tre ganger.
-
Løfting av porøse laget fra silicon kjeks
- Fylle brønnen med 10 mL 1:29 HF løsning.
- Kjøre en konstant 3.7 mA/cm2 for 250 s. Når etch er ferdig, Fjern cellen fra krets. PSi laget må vises krusninger indikerer løsgjøring fra krystallinsk silisium kjeks. Forsiktig vaske ut 1:29 HF løsning og skyll med EtOH tre ganger, deretter med vann tre ganger.
- Bruker en pipette tips, fast sprekk omkretsen av pSi laget for fullstendig løsrivelse. Bruker EtOH, etch samle pSi fragmenter (chips) fra Teflon cellen inn i en veiing båt. Overføre sjetongene til en hetteglass. PSi chips kan oppbevares i romtemperatur i EtOH for over 6 måneder for lagring.
- Oppløse gang eventuelle gjenværende porøse silisium på kjeks ved å fylle brønnen sakte med 10 mL 1 M KOH. Vent til boblende avtar.
- Skyll ut KOH med vann tre ganger, og deretter med EtOH tre ganger.
- Gjenta trinn 1.3-1.5 til hele wafer tykkelsen har vært etset.
-
Sonicating porøse lag for hydrogenion formasjonen
- Erstatte løsemiddelet av glass ampullen inneholder pSi sjetonger fra EtOH 2 mL DI vann.
- Fast Lukk lokket, og forsegle bruker parafilm.
- Sted glasset medisinglass i et sonicator bad og suspendert slik at volumet på pSi chips er helt dekket under overflaten.
- Sonicate 12 h 35 kHz og RF power av 48W. For å hindre vanntap av viktige under sonication, kan du plassere en volumetriske kolbe fylt med vann, invertert slik at åpningen av kolbe berører overflaten av vannbad.
- Plass hetteglass på flate 1t tillate større partiklene til å bosette seg på bunnen. Samle nedbryting bruker en pipette; suspensjon inneholder sub-100 nm pSiNPs.
2. forberedelse av fusogenic lipid film
-
Forberedelse av lipid lager løsninger
- I avtrekksvifte, gjør 10 mg/mL aksjer av lipider ved fuktighetsgivende DMPC, DSPE-PEG-MAL og DOTAP lipider i kloroform. Følgende lager kan oppbevares på 20 ° C for inntil 6 måneder under tett parafilm segl.
-
Gjør fusogenic lipid filmen
Merk: Fusogenic sammensetningen er laget av lipider, DMPC, DSPE-pinne, og DOTAP, på molar forholdet mellom 76.2:3.8:20 og 96.2:3.8:0, henholdsvis.- I et hetteglass, bland 72.55 μL DMPC 15.16 μL DSPE-pinne og 19.63 μL DOTAP av pipettering.
- Valgfritt: Fluorescerende merking av lipid belegget, i tillegg legge til 20 µL av DiI oppløst i EtOH i en konsentrasjon av 1 mg/mL.
- Plass ampullen i avtrekksvifte med en løs cap å tillate kloroform å fordampe over natten. Tørket filmen blir en skyet vanskelig pærer i bunnen av ampullen.
3. lasting og tetting av siRNA i pSiNPs
-
Utarbeidelse av kalsium klorid lasting lager
- Oppløse 1.11 g CaCl2 i 10 mL RNAse gratis vann for å lage en 2 M CaCl2 løsning.
- Sentrifuge løsningen på > 10 000 x g for 1 min å avgjøre Aggregatene og samle nedbryting bruker en pipette. Du kan også filtrere løsningen gjennom filtere 0.22 µm.
-
Utarbeidelse av siRNA lasting lager
- Hydrat eller fortynne siRNA til 150 µM i RNAse-fritt vann. Denne lager løsningen kan være aliquoted og holdt frosset på 20 ° C i minst 30 dager gitt at den gjennomgår ofte fryse-Tin sykluser.
-
Laster inn siRNA i pSiNPs med veisalt
- Forberede en avkjølt sonication bad.
- Under 15 min ultrasonication, forsiktig pipette 150 µL av siRNA og 700 µL av 2 M CaCl2 til 150 µL av pSiNP. Pass på å la lokket på microcentrifuge røret åpen for gass generasjon.
- Fjerne røret som inneholder 1 mL av siRNA-lastet kalsium belagt pSiNPs fra sonicator.
4. coating siRNA lastet pSiNPs med fusogenic lipider
-
Forberedelse av liposome ekstrudering kit
- Fylle et bredt beaker med DI vann. Suge 1 polykarbonat membran (200 nm porene), og 4 filteret støtter av flytende dem på vannflaten. Montere liposome ekstrudering settet ved å følge produsentens instruksjoner
-
Hydrating lipid filmen med siRNA lastet pSiNps
- Hydrat tørket lipid filmen i hetteglass med 1 mL av siRNA-lastet kalsium belagt pSiNPs fra trinn 3.3.3. Pipetter til alle lipider film har løftet fra bunnen av ampullen og har blandet inn i en skyet homogen løsning.
- Plassere en magnetisk gripende bar i hetteglass, og plassere ampullen til en varm plate å varme partikler til 40 ° C (eller høyt nok lipider fase transformasjon temperatur å opprettholde lipider i mer fluidic flytende fase) mens magnetisk røring løsningen for 20 min.
-
Ekstrudering lipid-belagt pSiNPs for størrelse-kontrollen
- Sug opp den 1 mL av lipid-belagt pSiNP-siRNA løsning i ekstrudering sprøyten. Sette inn en tom sprøyte på én side av extruder og fylte sprøyten på den andre enden.
- Starte ekstrudering ved å trykke stempelet i sakte å presse partikler fra en sprøyte, gjennom polykarbonat membranen, og i den andre. Gjenta 20 ganger. Hvis stempelet er fast, kan tette filteret og membran. Demontere extruder og erstatte den membran og filteret støtter. Hvis problemet vedvarer, fortynne partikler til tilstopping er overkommelig.
- Samle ekstrudert partikler inn i et microcentrifuge rør.
5. Bøyning av målretting peptider
-
Bøye målretting peptid til lipid belegg
- Forberede peptid aksjen med en 1 mg/mL peptid konsentrasjon i RNAse-fritt vann.
- I microcentrifuge røret som inneholder fusogenic lipid-belagte pSiNPs, legge til 100 µL 1 mg/mL peptid og Pipetter forsiktig. Holde røret statisk ved romtemperatur for 20 min (eventuelt > 2t 4 ° c).
- For å fjerne overflødig peptid eller siRNA og andre hjelpestoffer, vaske i en 30 kDa sentrifugal filter av snurrende 5000 x g ved 25 ° C i 1 h. sentrifuge to ganger mer med 1 mL av PBS under samme innstilling.
- Resuspend siste peptid-konjugerte fusogenic lipid-belagt pSiNPs i PBS på ønsket konsentrasjonen. Partiklene kan nå aliquoted og frossen-80 ° c for lagring av minst 30 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket syntese av fusogenic pSiNPs skal produsere en homogen, litt ugjennomsiktig løsning (figur 3a). Unnlatelse av å optimalisere forholdet og konsentrasjonen av pSiNPs: siRNA: CaCl2 kan føre til samling på lessing (figur 3b). Som partiklene er ekstrudert gjennom 200 nm membraner, gjennomsnittlig etter diameteren på den fusogenic pSiNPs målt ved DLS bør være ca 200 nm og gjennomsnittlig zeta potensial ca 7 mV som vist i Figur 4. Etter overflate endring med målretting peptider, den totale diameteren økes skal under 230 nm og gjennomsnittet zeta potensial redusert ned-3.4 mV15. Omfattende avvik fra ekstrudering størrelsen er et tegn på mislykkede ekstrudering (dpartikkel >> dekstrudering), eller kan ikke laste inn (dpartikkel << dekstrudering). Samlinger kan også kvantifiseres bruker Distribusjonslister. De frosne dele må videre tines bare når, som gjentatte fryse-Tin sykluser forstyrre lipid membran og intraparticular fusion og aggregering (Figur 4). Som figur 4a viser, kan fusogenic pSiNPs lagres i 30 dager og tint uten å forårsake strukturelle endringer. Men gjentatt fryse-Tin sykluser av en enkelt aliquot føre til alvorlig aggregering (d >> 1000 nm) og innen 4 dager etter den daglige syklusen (figur 4b), så det anbefales at partiklene være aliquoted å bruke én volumer.
Fusion kan bekreftes av merking fusogenic lipider med lipofile DiI (trinn 2.2.2), og observere den i vitro lokaliseringen med AC confocal mikroskopi. Figur 1 d viser vellykket fusion, der fusogenic pSiNP lipider overføre i DiI til plasma membranen og er lokalisert uavhengig av lysosomer. Mislykket fusion vises DiI lokalisering i cellen cytoplasma og colocalization med lysosomer (figur 1 c).
Figur 1: Fusogenic porøse silisium hydrogenion system (F-pSiNP). (en) skjematisk viser endocytic opptak av konvensjonelle nanopartikler og påfølgende endosomal entrapment. (b) skjematisk viser fusogenic opptak av F-pSiNPs og påfølgende cytosolic levering av siRNA-nyttelast. (c) AC Confocal mikroskopiske bildet av en CAOV-3 celle som har endocytosed ikke-fusogenic pSiNPs som var lastet med DiI lipofile fargestoff. CAOV-3 celler var vokst til 80% samløpet i en 6 vel-plate, og behandlet med 10 µL av nanopartikler, og inkubert på 37 ° C i 5% CO2 i 15 min. Cellene ble løst i 1% paraformaldehyde å monteres på glass lysbilder med DAPI, tørket og holdt i mørket til undersøkt av AC confocal mikroskopi. (D) AC confocal mikroskopiske bilde av en CAOV-3-celle som har tatt opp fusogenic pSiNPs som var lastet med DiI lipofile fargestoff. Celler var pre farget med LysoTracker Green 1t på 37 ° C i 5% CO2 i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter vasket PBS tre ganger, og ble behandlet med 10 μL DiI lastet partikler i 15 min. Cellene ble vasket med PBS tre ganger for å fjerne partikler som ikke var tatt opp, og de ble fylt med 1 mL av PBS og øyeblikkelig for live-celle avbildning av AC confocal mikroskopi; DAPI representerer kjernefysiske flekken og Lysosome representerer lysosomale farging av LysoTracker Green; skala linjen representerer 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Etch celle oppsett. (en) skjematisk viser etse celle komponenter og montering rekkefølge. og (b) diagram av oppsettet for elektrokjemiske etsing av silisium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilde av F-pSiNP sluttprodukt. (en) vellykket syntese viser homogent og skyet løsning; (b) mislykket syntese viser samling av partikler (gul). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: gjentatte fryse-Tin syklus av fusogenic pSiNPs forårsake aggregering. (en) gjennomsnittlig størrelse og zeta-potensialet i fusogenic pSiNPs forblir stabil i 30 dager når tint når etter frysepunktet; (b) gjennomsnittlig størrelse og zeta-potensialet i fusogenic pSiNPs viser tegn på aggregering og tap av strukturelle integritet innen 4 dager etter under daglig fryse-Tin sykluser. Feilfelt representerer standardavvik (n = 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Diagram av porøse silisium hydrogenion syntese. Skjematisk viser elektrokjemiske etsing av silisium wafer (trinn 1.4), lift-off porøse lag (trinn 1.5), sonication av porøse laget partikler, og samling av porøse silisium nanopartikler (trinn 1.6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntese av porøse silisium nanopartikler er vist i figur 5. Det kritiske trinnet syntese av fusogenic pSiNPs er i lasting trinn (trinn 3). Hvis fusogenic nanopartikler samler etter syntese (Figur 3), årsaken kan skyldes følgende: (1) veisalt lager var ikke homogenously forberedt, dermed trinn 3.1.2 må være nøye fulgt eller raffinert; eller (2) forholdet mellom pSiNP: siRNA: CaCl2 eller konsentrasjonen av en eller flere av de tre komponentene kan ikke være optimal. Re optimalisering fra CaCl2 konsentrasjonen er foreslått (f.eks endre 2 M til 1 M eller 3 M). Videre er det viktig å sørge for at de CaCl2 er fra samme leverandør, som vi fant at det samme kjemiske fra forskjellige leverandører resultert i lavere pH på lessing steg og påfølgende kan ikke laste siRNA. I pSiNPs kan også være konsentrert, utvannet eller ytterligere degradert før lasting prosessen ved å la partikler suspendert i vannet RNAse-gratis 2 dager etter trinn 1.6.6.
Etter lasting, fører lipid belegg ofte til problemer med ekstrudering på grunn av konsentrasjon eller tettheten av partikler (trinn 4). Hvis ekstrudering membranen er tett, kan tvinge byggesystemer rippe membranen. Ved tilstopping, demontere extruder, og erstatte membranen og støtte med et nytt sett hvis tapet fra tilstopping er liten. Hvis tapet er flott, deretter fortynne partikkelen suspensjon, og sonicate for 30 s før ekstrudering. Hvis problemet vedvarer, anbefales re optimalisering av pSiNP størrelse og lasting forhold å minimere aggregat. Til slutt, vi foreslår filtrering partikkel suspensjon gjennom et 0.22 µm-pore-filter for å fjerne eventuelle forurensninger eller aggregater før cellen eller dyr behandling. Filtrering er spesielt anbefalt hvis partiklene ble syntetisert i et ikke-sterilt miljø eller etter tining en frossen aliquot av partikler.
Fusogenicity av partikler kan valideres AC confocal mikroskopi (som vist i figur 1 c, d), og overføring elektronmikroskop cellene behandlet med partikler å observere for lipid-shed porøse silisium kjerner i cytoplasma 15.
Fusogenic pSiNPs og dens syntese protokoll har noen begrensninger. For i vitro genet stanse programmer, presenterte fusogenic pSiNPs har vist seg for å indusere > 90% knockdown effektiviteten i en rekke cellelinjer på 100 nM dose; inkludert Nevro-2a musen neuroblastom celle linjen, CAOV-3 menneskelige eggstokkreft celle linjen og notorisk vanskelig å transfect rå 264.7 musen macrophage cellen linje. Men vi har observert > 50% knockdown effektivitet på så lite som 25 nM dose, som var sammenlignes med Lipofectamine. Mens kationisk lipider må brukes minimalt å redusere cytotoksiske effekt, har vi tidligere vist sin sikkerhet på en lipid dose så høyt som 1 mg15. For i vivo genet stanse programmer, er fusogenic pSiNPs begrenset av selektivitet. Som kationisk lipider elektrostatisk tiltrekke til noen cellemembranen, partikler må brukes som en lokal terapeutiske, eller være overflaten endret med en målretting moiety (f.eks peptider, antistoffer, etc.). Syntese protokollen for fusogenic pSiNPs er nå optimalisert og begrenset for siRNA levering bare. På samme måte har blitt bekreftet å med hell belaste miRNA og er antatt laste mRNA, cDNA og andre større nukleotid nyttelast, men dette har ennå ikke optimaliseres.
Presentert arbeidet gjør et betydelig bidrag til feltet av genterapi. Standard standarden for i vitro genet stanse er i Lipofectamine 2000. Vi har vist at fusogenic pSiNPs kan indusere knockdown effekten av sammenlignbare, hvis ikke høyere effektivitet15. Den store fordelen med den fusogenic pSiNPs over Lipofectamine 2000 er dens evne til å brukes for i vivo programmer med systemisk injeksjoner. Mens andre agenter, for eksempel Invivofectamine 3.0, har blitt kommersialisert for i vivo bruker, de er kun egnet for leveren levering, og krever kjemisk modifisert siRNAs (med eller uten overheng eller låst nukleinsyre (LNA) struktur) å øke stabilitet og spesifisitet. 16 , 17 , 18 men fusogenic pSiNPs kan være endret etter syntese å bøye målretting moieties med enkel thiol-maleimide kjemi, hvor en thiol gruppe i den målretting peptid (som bærer en ekstra cystein for dette formålet) binder en dobbel-limt karbon i maleimide ringen på slutten av pegylert lipider i fusogenic belegget. Dessuten, den høye massen lasting og levering effekt cellen cytoplasma minimerer behovet for intracellulær spesifisitet og oppnår sterk genet stanse effekten med ingen-modifisert siRNAs15. Ettall ulempen av fusogenic pSiNPs er at syntese protokollen er en multi-dagers prosess som er mer komplisert enn kommersielt tilgjengelige transfection agenter. Men mens benchmark produktene må forberedes før hva ferske å få de beste resultatene, kan fusogenic pSiNPs være aliquoted og frosne i minst 30 dager uten å svekke knockdown effektiviteten.
Fremtidige anvendelser for denne metoden inkluderer optimalisering for lasting og levering av større nukleinsyre payloads, som mRNAs og cDNAs. I tillegg er levering av CRISPR/Cas9 protein-sgRNA komplekset, eller en cocktail av Cas9 mRNA og sgRNA, også et utviklingsalternativ, som systemet er optimal for lasting anionic nyttelast. Total, F-pSiNP systemet er et modulært nanoplatform for genterapi å behandle sykdommer utover infeksjoner, inkludert virusinfeksjoner, kreft og autoimmune sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MJS er vitenskapelig grunnlegger Spinnaker biovitenskap, Inc., og har en eierandel i selskapet. Selv om dette stipendet er identifisert for inhabilitet ledelse basert på i hele omfanget av prosjektet og den potensielle fordelen til Spinnaker biovitenskap, Inc., kan forskningsfunn i denne spesielle publikasjonen ikke nødvendigvis knyttet til interessene til Spinnaker biovitenskap, Inc. Vilkårene i denne ordningen har blitt vurdert og godkjent av University of California, San Diego i samsvar med sin interessekonflikt politikk. Andre forfattere ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health gjennom kontrakt # R01 AI132413-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
