Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

Sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna del Oligonucleotide

doi: 10.3791/59440 Published: April 16, 2019

Summary

Dimostriamo la sintesi di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna effettiva del oligonucleotide in vitro e in vivo. Silicio poroso nanoparticelle vengono caricate con siRNA per formare il nucleo, che è rivestito dai lipidi fusogena attraverso estrusione per formare il guscio. I servizi e le dotazioni comprendono targeting frazione funzionalizzazione e caratterizzazione delle particelle.

Abstract

Con l'avvento della terapia genica, lo sviluppo di un sistema di consegna efficaci in vivo del nucleotide-payload è diventata di importazione parallela. Fusogena silicio poroso nanoparticelle (F-pSiNPs) hanno recentemente dimostrato alto genico in vivo di efficacia a causa sua oligonucleotide ad alto capacità di carico e via di assorbimento cellulare unico che evita endocitosi. La sintesi di F-pSiNPs è un processo a più fasi che include: (1) di carico e la sigillatura di payload del oligonucleotide nei pori di silicio; (2) rivestimento simultanea e dimensionamento dei lipidi fusogena intorno i nuclei di silicio poroso; e (3) coniugazione di peptidi di targeting e lavaggio per rimuovere l'eccesso del oligonucleotide, detriti di silicio e il peptide. Uniformità di dimensione della particella è caratterizzata da diffusione dinamica della luce, e la sua struttura core-shell può essere verificata da microscopia elettronica di trasmissione. L'assorbimento di fusogena viene convalidato caricando un lipofilico tingere, 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), in bilayer del lipido fusogena e trattandolo alle cellule in vitro per osservare per membrana plasmatica colorazione contro localizzazioni endocitosi. I efficacies di silenziamento gene targeting e in vivo in precedenza sono stati quantificati in un modello murino di polmonite Staphylococcus aureus , in cui è previsto il peptide targeting per aiutare il F-pSiNPs a casa per il sito di infezione. Oltre la sua applicazione nell'infezione di S. aureus , il sistema di F-pSiNP può essere usato per fornire qualsiasi oligonucleotide per la terapia genica di una vasta gamma di malattie, compreso le infezioni virali, cancro e malattie autoimmuni.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Terapia genica modula l'espressione genica specifici per ottenere un risultato terapeutico. Numerosi strumenti per la modulazione del gene sono stati scoperti e studiati, compreso acido ribonucleico interferenza (RNAi) utilizzando oligonucleotidi (ad es., breve interfering RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmidi5,6, nucleasi (ad es., dito di zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemi9,10. Mentre il meccanismo di ciascuno strumento di azione è diverso, tutti gli strumenti deve raggiungere il citoplasma della cellula o il nucleo è attivo. Come tale, mentre questi strumenti hanno dimostrato di indurre un effetto significativo nella modulazione della espressione genica in vitro, in vivo l'efficacia soffre da ostacoli extracellulari ed intracellulari. Dovuto al fatto che gli strumenti sono di origine biologica, molti enzimi e sistemi di sdoganamento esistano nel nostro corpo che hanno la capacità di degradare o rimuovere le molecole estranee11. Anche nel caso che gli strumenti di raggiungano la cella obiettivo, essi soffrono di endocitosi; una modalità di assorbimento cellulare che incapsula e intrappola gli strumenti in acido dello stomaco-come vescicole che degradano o espellere gli strumenti fuori dalla cella. Infatti, studi hanno dimostrato che nanoparticelle lipidiche sono stimolazione tramite Macropinocitosi, da cui circa il 70% dei siRNA sono exocytosed dalle cellule all'interno di 24h di assorbimento12,13. La maggior parte del siRNA rimanente vengono degradata attraverso il pathway lisosomiale, e in definitiva soltanto 1-2% di siRNA che inizialmente entra nella cellula con le nanoparticelle ottenere fuga endosomal potenzialmente subire RNAi13,14 .

Recentemente abbiamo sviluppato le nanoparticelle di silicio poroso fusogena (F-pSiNPs) che hanno un nucleo caricato siRNA composto di silicio poroso nanoparticelle e un fusogena lipidica shell15. F-pSiNPs presentano tre vantaggi principali rispetto ad altri sistemi di consegna del oligonucleotide convenzionale: (1) un lipide fusogena rivestimento che permette alle particelle di bypassare endocitosi e consegnare l'intero payload direttamente nel citoplasma delle cellule (contro l'1-2% raggiunto da stimolazione particelle13,14) (Figura 1); (2) carico di massa elevata di siRNA nella pSiNPs (> 20% in peso rispetto al 1-15 wt % dai sistemi convenzionali)15, che degradano rapidamente nel citoplasma (una volta che le particelle del nucleo capannone il rivestimento lipidico tramite l'assorbimento fusogena) per rilasciare il siRNA; e (3) targeting coniugazione del peptide per homing selettiva al desiderato tipi di cellule in vivo.

Il sistema F-pSiNP ha dimostrato notevole efficacia il silenziamento genico (> 95% in vitro; > 80% in vivo) e conseguente effetto terapeutico in un modello murino mortale di polmonite Staphylococcus aureus ; i risultati di cui sono stati pubblicati in precedenza15. Tuttavia, la complessa struttura del sistema F-pSiNP richiede manipolazioni delicate e ottimizzazione fine-tuned per generare nanoparticelle uniforme e stabile. Così, lo scopo di questo lavoro è di presentare un protocollo approfondito, nonché strategie di ottimizzazione per la sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di F-pSiNPs per essere utilizzato in somministrazione mirata di siRNA per effetto di silenziamento del gene potente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. sintesi di nanoparticelle di silicio poroso (pSINPs)

Attenzione: Usare sempre cautela quando si lavora con acido fluoridrico (HF). Seguire tutte le guide di sicurezza secondo la sua scheda di dati di sicurezza (SDS), maneggiare sostanze chimiche contenenti HF in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE; doppie guanti con guanti di butyl all'esterno, grembiule di butile con camice sotto, viso scudo con occhiali di sicurezza sotto). Tutte le università e i laboratori R & D richiedono una formazione specifica sulla sicurezza HF prima dell'uso. Non tentare di lavorare con HF senza pre-approvazione del Coordinatore sicurezza laboratorio locale, come sono necessarie misure di sicurezza aggiuntive non descritte qui.

  1. Preparazione delle soluzioni acquaforte
    1. Per rendere la soluzione di HF di 3:1 per acquaforte (utilizzato nei punti 1.3 e 1.4), riempire una plastica laureato cilindro con 30 mL di acquosa 48% HF e 10 mL di etanolo assoluto (EtOH). La soluzione deve essere contenuta in materiale plastico ad alta densità (ad es., HDPE), come la HF scioglie il vetro.
    2. Per rendere un 01:29 soluzione di HF per decollo (usato nel passaggio 1.5), riempimento a plastica laureato cilindro con 1 mL di acquosa 48% HF e 29 mL di etanolo assoluto. La soluzione deve essere contenuta in materiale plastico ad alta densità (ad es., HDPE), come la HF scioglie il vetro.
    3. Rendono la soluzione KOH 1 M in 10% EtOH per dissoluzione del pSi in eccesso (utilizzato in passaggi 1.3 e 1.5).
  2. Impostare la cella di etch
    1. In Teflon etch cella con una 8,6 cm2 etch bene (zona viene calcolato misurando il diametro della superficie del silicio disponibile per incisione all'interno l'o-ring e calcolare l'area di A = πr2), posto in senso decrescente (Figura 2a): (1) il Parte superiore della cella Teflon; (2) un o-ring; (3) un pezzo di quarto del cristallo singolo (1 0 0) - orientato p + + - wafer di silicio del tipo tagliati in quarti (utilizzando una fresa di diamante); (4) foglio di alluminio; e (5) la cella di Teflon base con viti serrate delicatamente per evitare perdite.
    2. Riempire il pozzetto con EtOH. Prendere un wipe e inserire nella fessura tra la parte superiore della cella in Teflon e la base. Se la cancellazione è asciutta dopo l'estrazione, la cella di etch è sigillata. Se bagnato, la cella sta perdendo e stringere le viti più ulteriormente fino a quando non sigillato.
  3. Elettrolucidatura il wafer di silicio
    1. Portare la cella di etch montato in una cappa aspirante.
    2. Riempire il pozzetto con 10 mL di soluzione di HF di 3:1.
    3. Collegare il cavo positivo per il foglio di alluminio (elettrodo) dalla cella etch e collegare il polo negativo della bobina platino (contro-elettrodo) immersi nella soluzione di HF di 3:1 della cella etch per completare il circuito (Figura 2b).
    4. Eseguire una corrente costante a 50 mA cm-2 per 60 s. Una volta etch è finito, rimuovere la cella dal circuito e risciacquare l'HF di 3:1 con attenzione usando una siringa. Risciacquare con EtOH tre volte.
    5. Sciogliere via lo strato inciso compilando il pozzo lentamente con 10 mL di 1 M di KOH. Attendere che le bolle si abbassa.
    6. Risciacquare il KOH con acqua tre volte e poi con EtOH tre volte.
  4. Elettrochimicamente acquaforte strati porosi in wafer di silicio
    1. Eseguire una corrente alternata di una forma d'onda quadra, con current density inferiore di 50 mA/cm2 per 0,6 s e alta densità di corrente di 400 mA/cm2 per 0.36 s ripetuto per 500 cicli.
    2. Una volta etch è finito, rimuovere la cella dal circuito e risciacquare l'HF di 3:1 con attenzione usando una siringa. Risciacquare con EtOH tre volte.
  5. Sollevamento-off lo strato poroso da wafer di silicio
    1. Riempire il pozzetto con 10 mL di 01:29 soluzione di HF.
    2. Eseguire una costante di 3,7 mA/cm2 per 250 s. Una volta etch è finito, rimuovere la cella dal circuito. Lo strato di pSi potrebbe essere visibile ondulazioni che indica distacco dai wafer di silicio cristallino. Delicatamente lavare fuori il 01:29 soluzione di HF e risciacquare con EtOH tre volte, poi con acqua tre volte.
    3. Utilizzando un puntale, crepa saldamente la circonferenza dello strato pSi per separazione completa. Utilizzando EtOH, raccogliere i frammenti di pSi (chip) dal Teflon etch cella in una barca di pesatura. Trasferire il chip di un flaconcino di vetro. I chip di pSi possono essere tenuti a temperatura ambiente in EtOH per oltre 6 mesi per l'archiviazione.
    4. Sciogliere via qualsiasi residuo silicio poroso sul wafer compilando il pozzo lentamente con 10 mL di 1 M di KOH. Attendere che le bolle si abbassa.
    5. Risciacquare il KOH con acqua tre volte e poi con EtOH tre volte.
    6. Ripetere i passaggi 1.3-1.5 per lo spessore del wafer intero è stato inciso.
  6. Sonicating strati porosi per la formazione di nanoparticelle
    1. Sostituire il solvente del flaconcino di vetro contenente pSi chip da EtOH a 2 mL di acqua deionizzata.
    2. Saldamente chiudere il tappo e guarnizione con parafilm.
    3. Posto il vetro fiala in un bagno sonicatore e sospeso tale che il volume di pSi chip completamente sommerso sotto la superficie.
    4. Sonicare per 12 h a 35 kHz e potenza RF di 48W. Per evitare perdite d'acqua significative durante la sonicazione, posizionare un matraccio riempito d'acqua, invertito in modo che l'apertura del pallone tocca la superficie del bagno d'acqua.
    5. Collocare il flaconcino di vetro su una superficie piana per 1 h per consentire le particelle più grandi di stabilirsi nella parte inferiore. Raccogliere il surnatante con una pipetta; la sospensione contiene pSiNPs di sotto dei 100 nm.

2. preparazione del film lipidico fusogena

  1. Preparazione delle soluzioni stock del lipido
    1. In una cappa, fanno scorte di 10 mg/mL di lipidi da idratante DMPC, DSPE-PEG-MAL e DOTAP lipidi in cloroformio. Queste soluzioni di riserva possono essere conservate a-20 ° C fino a 6 mesi sotto stretto parafilm sigillo.
  2. Rendendo il film lipidico fusogena
    Nota: La composizione fusogena è costituita i lipidi, DMPC, DSPE-PEG e DOTAP, al rapporto molare di 76.2:3.8:20 e 96.2:3.8:0, rispettivamente.
    1. In un flaconcino di vetro, mescolare 72.55 μL di DMPC, 15.16 μL di DSPE-PEG e 19.63 μL di DOTAP pipettando.
    2. Facoltativo: Per l'etichettatura fluorescente del rivestimento lipidico, inoltre aggiungere 20 µ l di DiI disciolto in EtOH ad una concentrazione di 1 mg/mL.
    3. Collocare il flaconcino in una cappa con un tappo allentato per permettere il cloroformio di evaporare durante la notte. Il film essiccato sarà una sostanza gelatinosa dura nuvolosa in fondo del flaconcino.

3. caricamento e la sigillatura di siRNA in pSiNPs

  1. Preparazione del cloruro di calcio caricamento di supporti
    1. Sciogliere 1,11 g di CaCl2 in 10 mL di acqua RNAsi-libera per fare una soluzione di2 CaCl 2 M.
    2. Centrifughi la soluzione a > 10.000 x g per 1 min di stabilirsi degli aggregati e raccogliere il surnatante con una pipetta. In alternativa, è possibile filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm.
  2. Preparazione di siRNA caricamento di supporti
    1. Idratare o diluire il siRNA a 150 µM in acqua RNAsi-libera. Questa soluzione può essere aliquotata e conservati congelata a-20 ° C per almeno 30 giorni dato che non subisce frequenti di congelamento-scongelamento.
  3. Caricamento del siRNA in pSiNPs con cloruro di calcio
    1. Preparare un bagno ghiacciato sonicazione.
    2. A meno di 15 min sonicazione, delicatamente dispensare 150 µ l di siRNA e 700 µ l di 2m CaCl2 in 150 µ l di pSiNP. Assicurarsi di lasciare aperto il coperchio del tubo del microcentrifuge per la generazione di gas.
    3. Togliere la provetta contenente 1 mL di pSiNPs di calcio siRNA-caricato rivestito da sonicatore.

4. rivestimento pSiNPs siRNA-caricato con i lipidi fusogena

  1. Preparazione del kit estrusione liposoma
    1. Riempire un bicchiere largo con dell'acqua distillata. Membrana di ammollo 1 policarbonato (200 nm pori) e 4 supporti filtro facendo loro galleggiare sulla superficie dell'acqua. Montare il kit di estrusione liposoma seguendo le istruzioni del produttore
  2. Idratante il film lipidico con siRNA-caricato pSiNps
    1. Idratare il film lipidico secchi in flaconcino di vetro con 1 mL di siRNA-caricato calcio rivestito pSiNPs ottenuti dal punto 3.3.3. Pipettare fino a quando tutti i film di lipidi hanno sollevato dal fondo del flaconcino e sono mescolati in una soluzione omogenea nuvolosa.
    2. Inserire una barra di agitazione magnetica in flaconcino di vetro e inserire il flaconcino su una piastra calda per riscaldare le particelle a 40 ° C (o abbastanza in alto sopra la temperatura di trasformazione di fase dei lipidi per mantenere i lipidi nella fase di cristalli liquidi più fluidica) mentre magneticamente mescolando la soluzione per 20 min.
  3. Il pSiNPs del lipido-rivestito per controllo di dimensione di estrusione
    1. Aspirare il 1 mL di soluzione di lipido-rivestito pSiNP-siRNA nella siringa estrusione. Inserire una siringa vuota su un lato dell'estrusore e la siringa riempita a altra estremità.
    2. Estrusione di Begin spingendo il pistone lentamente a spingere le particelle da una siringa, attraverso la membrana di policarbonato e in altra. Ripetere 20 volte. Se il pistone è bloccato, il filtro e la membrana potrebbe essere ostruiti. L'estrusore di smontare e sostituire la membrana e filtro supporta. Se il problema persiste, è necessario diluire le particelle fino a intasamento è gestibile.
    3. Raccogliere le particelle estruse in una microcentrifuga.

5. coniugazione di targeting peptidi

  1. Coniugazione del peptide targeting al rivestimento lipidico
    1. Preparare il brodo di peptide con un 1mg/mL concentrazione nel peptide in acqua RNAsi-libera.
    2. Nel tubo del microcentrifuge contenente fusogena lipido-rivestito pSiNPs, aggiungere 100 µ l del 1 mg/mL di brodo di peptide e pipettare delicatamente. Tenere il tubo statica a temperatura ambiente per 20 minuti (in alternativa, > 2 h a 4 ° C).
    3. Per rimuovere l'eccesso peptide o siRNA e altri eccipienti, lavare in un filtro centrifugo di 30 kDa di filatura a 5.000 x g a 25 ° C per 1 h. centrifuga altre due volte con 1 mL di PBS sotto la stessa impostazione.
    4. Risospendere il finale fusogena coniugati peptide del lipido-rivestito pSiNPs in PBS alla concentrazione desiderata. Le particelle possono ora essere aliquotati e congelati a-80 ° C per la conservazione di almeno 30 giorni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Una riuscita sintesi di fusogena pSiNPs dovrebbe produrre una soluzione omogenea, leggermente opaca (Figura 3a). Il mancato rispetto di ottimizzare il rapporto e la concentrazione di pSiNPs: siRNA: CaCl2 può condurre all'aggregazione al caricamento (Figura 3b). Come le particelle vengono estruse attraverso membrane di 200 nm, il diametro medio di idrodinamico della pSiNPs fusogena misurata da liste di distribuzione deve essere circa 200 nm e la mV di potenziale zeta media circa + 7 come mostrato nella Figura 4. Dopo la modificazione superficiale con peptidi di targeting, il diametro complessivo dovrebbe essere aumentato per essere sotto 230 nm e la media di potenziale zeta è diminuito fino a -3,4 mV15. Qualsiasi scostamento estesa rispetto alla dimensione di estrusione è indicativo di estrusione non riuscita (dparticella >> destrusione), o non riuscito di caricamento (dparticella << destrusione). Le aggregazioni possono essere quantificate anche utilizzando le liste di distribuzione. Inoltre, le aliquote congelate devono essere scongelate solo una volta, come ripetuti di congelamento-scongelamento cicli perturbare la membrana lipidica e intraparticular fusione e aggregazione (Figura 4). Come illustrato nella Figura 4a , fusogena pSiNPs possono essere conservati per 30 giorni e scongelati senza causare cambiamenti strutturali. Tuttavia, ripetuti cicli di congelamento-scongelamento di una singola aliquota causano grave aggregazione (d >> 1.000 nm) e nei 4 giorni del ciclo giornaliero (Figura 4b), pertanto è consigliabile che le particelle sia pipetta monouso volumi.

Fusione può essere confermata dall'etichettatura i lipidi fusogena con i DiI lipofilico (punto 2.2.2) e osservando la localizzazione in vitro usando la microscopia confocal. Figura 1 d Mostra riuscita fusione, dove i lipidi di pSiNP di fusogena trasferimento DiI alla membrana plasmatica e sono localizzati indipendenti dei lisosomi. Riuscita fusione mostrerà la localizzazione DiI all'interno del citoplasma della cellula e la colocalizzazione con i lisosomi (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: sistema di fusogena silicio poroso delle nanoparticelle (F-pSiNP). (un) schema visualizzando endocitico assorbimento di nanoparticelle convenzionale e l'allettamento endosomal successive. (b) schema visualizzando fusogena assorbimento del F-pSiNPs e successiva consegna citosolica del payload siRNA. (c), confocale immagine microscopica di un carubbi-3 cella che ha pSiNPs di non-fusogena di stimolazione che sono stati caricati con tintura lipofilica DiI. Castellaneta-3 cellule sono state coltivate per 80% confluenza in un pozzo 6-piastra, trattati con 10 µ l di nanoparticelle e incubate a 37 ° C in 5% CO2 per 15 min. Le cellule erano fissi in 1% paraformaldeide per essere montato sulle lastre di vetro con DAPI, secchi e tenute all'oscuro fino a quando esaminate mediante microscopia confocale. (D) confocale immagine al microscopio di una cellula di Castellaneta-3 che ha preso fusogena pSiNPs che sono stati caricati con tintura lipofilica DiI. Cellule sono state pre-macchiate con LysoTracker Green per 1 h a 37 ° C in 5% CO2 secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state quindi lavate PBS tre volte e sono state trattate con 10 μL di DiI-caricato di particelle per 15 min. Le cellule sono state lavate con PBS tre volte per rimuovere eventuali particelle che non sono presi, e i pozzi sono stati riempiti con 1 mL di PBS e portati immediatamente per l'imaging di cellule vive al microscopio confocale; DAPI rappresenta macchia nucleare e lisosoma lysosomal macchiatura di LysoTracker Green; barra della scala rappresenta 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Etch installazione cell. (a) schema mostrando etch componenti delle cellule e ordine di assemblaggio; e (b) diagramma del programma di installazione per acquaforte elettrochimica di silicio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: fotografia del prodotto finale F-pSiNP. (un) riuscita sintesi risultati soluzione omogenea e nuvoloso; (b) sintesi infruttuosa risultati aggregazione di particelle (giallo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: ciclo di congelamento-scongelamento ripetuti di fusogena pSiNPs causare aggregazione. (un) media dimensioni e potenziale zeta di fusogena pSiNPs rimane stabile per 30 giorni quando scongelati una volta post-congelamento; (b) media dimensioni e potenziale zeta del pSiNPs fusogena Mostra segni di aggregazione e perdita di integrità strutturale entro 4 giorni dopo che subiscono quotidianamente i cicli di gelo-disgelo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: schema di sintesi di nanoparticelle di silicio poroso. Disegno schematico mostrando incisione elettrochimica di wafer di silicio (punto 1.4), lift-off dello strato poroso (passo 1,5), sonicazione dello strato poroso in particelle e raccolta delle nanoparticelle di silicio poroso (punto 1.6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sintesi di nanoparticelle di silicio poroso sono illustrato nella Figura 5. Il passaggio fondamentale nella sintesi di fusogena pSiNPs è in fase di caricamento (passaggio 3). Se le nanoparticelle fusogena aggregano post-sintesi (Figura 3), il motivo potrebbe essere a causa di quanto segue: (1) stock di cloruro di calcio non era preparato omogeneamente, così passo 3.1.2 dovrà essere attentamente seguito o raffinato; o (2) il rapporto di pSiNP: siRNA: CaCl2 o la concentrazione di uno o più dei tre componenti potrebbe non essere ottima. Riottimizzazione partendo dalla concentrazione CaCl2 è suggerito (ad es., modificando da 2 M a 1 M o 3 M). Inoltre, è importante assicurarsi che il CaCl2 è dello stesso fornitore, come abbiamo trovato che la stessa sostanza chimica da diversi fornitori hanno provocato pH inferiore al caricamento passo e conseguente mancato caricamento del siRNA. Il pSiNPs può anche concentrato diluito, o ulteriormente degradato prima del processo di caricamento lasciando le particelle sospese nell'acqua RNAsi-libera per 2 giorni dopo passo 1.6.6.

Post-caricamento, il lipido rivestimento spesso porta a difficoltà nell'estrusione a causa della concentrazione o densità delle particelle (passaggio 4). Se la membrana di estrusione è intasata, costringendo l'estrusione può strappare la membrana. Al momento di intasamento, smontare l'estrusore e sostituire la membrana ed i supporti con un nuovo set, se la perdita da intasamento è piccola. Se la perdita è grande, quindi diluire la sospensione di particelle e trattare con ultrasuoni per 30 prima s estrusione. Se il problema persiste, è consigliato riottimizzazione di pSiNP dimensioni e rapporto di caricamento per ridurre al minimo gli aggregati. Infine, ti consigliamo di filtrare la sospensione di particelle attraverso un filtro di 0,22 µm-poro per eliminare eventuali contaminanti o aggregati prima cella o il trattamento degli animali. Filtro è particolarmente consigliato se le particelle sono state sintetizzate in un ambiente non sterile, o dopo lo scongelamento di un'aliquota congelata delle particelle.

Il fusogenicity delle particelle può essere validata mediante microscopia confocale (come mostrato in Figura 1 c, d) e da microscopia elettronica di trasmissione delle cellule trattate con le particelle ad osservare per nuclei di silicio poroso del lipido-capannone nel citoplasma 15.

Il pSiNPs di fusogeniche e il suo protocollo di sintesi presentano alcuni limiti. Per applicazioni di silenziamento genico in vitro, il pSiNPs presentato fusogena hanno dimostrato di indurre > 90% efficienza atterramento in una gamma di linee cellulari alla dose di 100 nM; tra cui la linea cellulare di neuroblastoma di Neuro-2a del mouse, la linea cellulare di carcinoma ovarico umano carubbi-3 e la linea di cellulare di notoriamente difficili a transfect 264,7 topo del macrofago. Tuttavia, abbiamo osservato > 50% efficienza atterramento alla dose di 25 nM, che era paragonabile a quella di Lipofectamine à partir. Mentre i lipidi cationici devono essere utilizzati come minimo per ridurre l'effetto citotossico, precedentemente abbiamo dimostrato la sicurezza ad una dose del lipido di alto come 1 mg15. Per applicazioni di silenziamento genico in vivo, il pSiNPs fusogena sono limitate dalla selettività. Come i lipidi cationici attirano elettrostaticamente per qualsiasi membrana delle cellule, le particelle devono essere utilizzate come un locale terapeutico, o essere superficie modificata con una frazione di targeting (ad es., peptidi, anticorpi, ecc.). Il protocollo di sintesi per fusogena pSiNPs è attualmente ottimizzato e limitato per siRNA consegna solo. Lo stesso metodo è stato verificato correttamente caricare miRNA ed è supposto per essere in grado di caricare mRNA, cDNA e altri più grandi carichi di nucleotidi, ma questi devono ancora essere ottimizzato.

Il lavoro presentato rende un contributo significativo nel campo della terapia genica. Il benchmark standard per il silenziamento genico in vitro è la Lipofectamine 2000. Abbiamo dimostrato che la pSiNPs fusogena può indurre l'effetto colpo di paragonabile, se non superiore, efficienze15. Il vantaggio principale della pSiNPs fusogena sopra Lipofectamine 2000 è la sua capacità di essere utilizzato per applicazioni in vivo con iniezioni sistemiche. Mentre altri agenti, ad esempio Invivofectamine 3.0, sono stati commercializzati per usi in vivo, sono solo adatti per la consegna del fegato e richiedono siRNA chimicamente modificati (con o senza sporgenze o nella struttura dell'acido nucleico bloccato (LNA)) per aumentare stabilità e specificità. 16 , 17 , 18 tuttavia, la pSiNPs fusogena possono essere modificate post-sintesi di coniugare moiety targeting con semplice del tiolo-maleimide chimica, in cui un gruppo tioalcool nel peptide targeting (che trasporta una cisteina supplementare per questo scopo) si lega una doppio-legato al carbonio nell'anello all'estremità dei lipidi pegilato nel rivestimento fusogena maleimide. Inoltre, la massa alta efficacia carico e consegna al citoplasma delle cellule riduce al minimo la necessità di specificità intracellulare e raggiunge il forte effetto con siRNA non modificato15il silenziamento genico. Uno svantaggio della pSiNPs fusogena è che il protocollo di sintesi è un processo multi-giorno che è più complesso rispetto agli agenti di transfezione commercialmente disponibili. Tuttavia, mentre i prodotti di riferimento devono essere preparati prima di transfezione per ottenere i migliori risultati, il pSiNPs fusogena può essere aliquotati e congelati per almeno 30 giorni senza diminuire l'efficienza di atterramento.

Future applicazioni per questo metodo includono l'ottimizzazione per il carico e consegna di grandi carichi di acido nucleico, come mRNA e cDNA. Inoltre, consegna del complesso proteina-sgRNA CRISPR/Cas9, o un cocktail del mRNA di Cas9 e sgRNA, è anche un'opzione di sviluppo, come il sistema è ottimo per il caricamento di payload anionici. Nel complesso, il sistema di F-pSiNP è un nanoplatform modulari per la terapia genica curare le malattie di là di infezioni, incluse infezioni virali, cancro e malattie autoimmuni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MJS è un fondatore scientifico di Spinnaker Biosciences, Inc. e ha una partecipazione azionaria nella società.  Anche se questa concessione è stata identificata per la gestione del conflitto di interessi basata sulla portata complessiva del progetto e suo potenziale beneficio per Spinnaker Biosciences, Inc., i risultati di ricerca inclusi nella presente pubblicazione particolare potrebbero non necessariamente riguardano gli interessi di Spinnaker Biosciences, Inc. I termini di questo accordo sono stati esaminati e approvati dal Università di California, San Diego secondo le proprie politiche di conflitto di interessi. Altri autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health attraverso contratto n # R01 AI132413-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) Avanti Polar Lipids 890890P Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) Avanti Polar Lipids 880126P Powder
Aluminum foil VWR International, LLC 12175-001
Calcium chloride (CaCl2) Spectrum C1977 Anhydrous, Pellets
Chloroform Fisher Scientific C6061
Computer Dell Dimension 9200 Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) Life Technologies D3911
Ethanol (EtOH) UCSD Store 111 200 Proof
Hydrofluric acid (HF) VWR International, LLC MK264008  Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter Keithley 2651A
LabVIEW National Instruments Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526
Liposome extrusion set with heating block Avanti Polar Lipids 610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit EMD Millipore MRCF0R030
O-ring ChemGlass CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-049
Platinum coil VWR International, LLC AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-3
Silicon wafer Siltronix Custom order
siRNA Dharmacon Custom order IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator VWR International, LLC 97043-960
Targeting peptide (CRV) CPC Scientific Custom order sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell Interface Performance Materials, Inc. Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water  Thermo Fisher Scientific 10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6, (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91, (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18, (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9, (1), 1911 (2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136, (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31, (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31, (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31, (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9, (1), 1969 (2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63, (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8, (1), 2045893217750613 (2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
Sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna del Oligonucleotide
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).More

Kim, B., Sailor, M. J. Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery. J. Vis. Exp. (146), e59440, doi:10.3791/59440 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter