Summary
우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.
Abstract
유전자 치료의 도래와 함께 효과적인 vivo에서 뉴클레오티드-페이로드 전달 시스템의 개발의 병행 수입 되고있다. Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F-pSiNPs)은 최근 높은 생체 조건 유전자 침묵 때문에 용량과 endocytosis를 방지 하는 독특한 세포 통풍 관 통로 로드 하는 높은 oligonucleotide 효능 설명 했다. F-pSiNPs의 합성은 포함 하는 다단계 프로세스: (1) 로드 및 실리콘 모;에서 oligonucleotide 페이로드 씰링 (2) 동시 코팅 및 다공성 실리콘 코어; 주위 fusogenic 지질의 크기 조정 그리고 펩 티 드를 지정 하 고 초과 oligonucleotide, 실리콘 파편, 및 펩 티 드를 제거 하는 세척의 (3) 활용. 그리고 동적 산란, 입자의 크기가 균일 특징 이다 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 그것의 코어-쉘 구조를 확인할 수 있습니다. Fusogenic 이해는 질 성 로드 하 여 유효성을 검사할 염색, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 (DiI), fusogenic 지질 bilayer에 고 대 얼룩 원형질 막에 대 한 관찰을 생체 외에서 세포 치료 endocytic 있어입니다. 대상 및 생체 조건 유전자 입을 신진대사 이전 대상 펩 티 드 F-pSiNPs의 가정 감염의 사이트에 도움 것으로 예상 된다 황색 포도상구균 폐 렴의 마우스 모델에서 정량 했다. S. 구 균 감염에의 응용, 넘어 F-pSiNP 시스템 바이러스 감염, 암, 자가 면역 질환 등 질병의 광범위의 유전자 치료에 대 한 어떤 oligonucleotide를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
유전자 치료는 치료 결과 얻기 위해 특정 유전자 발현을 조절 한다. 유전자 변조에 대 한 수많은 도구 발견 되었고 ribonucleic 산 간섭 (RNAi) oligonucleotides (예를 들어, 짧은 간섭 RNA (siRNA)1,2, 예측에 관한 (미르)3,4 사용 하 여 포함 하 여 공부 ), DNA 플라스 미드5,6, nucleases (예, 아연 손가락, TALENS)8,7,및 CRISPR/Cas9 시스템9,10. 작업의 각 도구의 메커니즘 다릅니다, 하는 동안 모든 도구 셀의 세포질 또는 활성 핵을 도달 해야 합니다. 따라서, 이러한 도구 유도 생체 외에서 유전자 발현 조절에 중요 한 영향을 입증 했다, 하는 동안 생체 조건 효 험 extracellular와 세포 장애물에서 겪고 있다. 사실은 도구는 생물학 근원의 이다, 많은 효소 및 허가 시스템 저하 또는 외국 분자11제거 능력을가지고 우리 몸에 존재 합니다. 경우에도 그들은 endocytosis;에서 고통 받는 도구에 도달 목표 셀 캡슐화 하 고 산 성 위 같은 vesicles 저하 또는 셀에서 도구를 추방 하는에서 도구를 트랩 세포질 통풍 관의 모드입니다. 실제로, 연구는 지질 나노 입자는 약 70%는 siRNA의 통풍 관12,13의 24 시간 이내 셀에서 exocytosed는 macropinocytosis 통해 endocytosed 나타났습니다. 나머지 siRNA의 대다수는 lysosomal 통로가 통해 타락 및 궁극적으로 처음가 나노 입자와 셀 siRNA의 유일한 1-2% 달성 잠재적으로 RNAi13,14 endosomal 이스케이프 .
최근 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F pSiNPs) 다공성 실리콘 나노 입자와 fusogenic 지질 셸15의 구성 하는 siRNA 로드 코어를 개발 했습니다. 세 가지 주요 이점을 다른 기존의 oligonucleotide 전달 시스템을 제시 하는 F-pSiNPs: (1) fusogenic 지질 endocytosis를 무시 하 고 (1-2% 대 세포 세포질에 직접 전체 페이로드를 전달 하는 입자를 가능 하 게 코팅 endocytosed 입자13,14달성) (그림 1); (2) 높은 대량 로드는 pSiNPs에 siRNA의 (> 20 wt % 기존의 시스템에 의해 1-15 wt %에 비해)15, 급속 하 게 타락 세포질에 (일단 코어 입자 fusogenic 통풍 관을 통해 지질 코팅 창 고) 출시 siRNA; (3) 세포 유형 vivo에서 원하는 대상에 선택적 추적에 대 한 펩 티 드 활용.
F-pSiNP 시스템 효능 입을 중요 한 유전자를 시연 하고있다 (> 95% 생체 외에서; > 80 %vivo에서) 및 S. 구 균 폐 렴;의 치명적인 마우스 모델에서 후속 치료 효과 결과 출판 이전15. 그러나, F-pSiNP 시스템의 복잡 한 구조는 섬세 한 처리 및 생성 하는 균일 하 고 안정 된 나노 입자를 미세 조정된 최적화 필요 합니다. 따라서,이 작품의 목적은 철저 한 프로토콜 합성과 기능화, 같은 강력한 유전자 입을 효과 siRNAs의 대상된 배달에 사용 될 F-pSiNPs의 특성에 대 한 최적화 전략 제시 하는 것 이다.
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Protocol
1. 다공성 실리콘 나노 입자 (pSINPs)의 합성
주의: 화 수 소산 (HF)을 작업할 때는 항상 주의 사용 합니다. 그것의 안전 데이터 시트 (SDS) 모든 안전 지침을 따르십시오, 연기 후드, HF 포함 된 화학 물질을 처리 하 고 적절 한 개인 보호 장비 (PPE, 외부에 부 틸 장갑 이중 장갑, 랩 코트 밑, 얼굴 부 틸 앞치마를 착용 아래 안전 고글 방패). 모든 대학 및 R & D 연구소 HF 안전 사용 이전에 특정 교육이 필요합니다. 여기에 설명 되지 않은 추가적인 안전 대책도 필요으로 로컬 실험실 안전 조정자의 사전 승인 없이 HF를 사용 하지 마십시오.
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에칭 솔루션의 준비
- 3:1 HF에 대 한 솔루션 에칭 (단계 1.3과 1.4에서 사용), 플라스틱을 채우기 있도록 수성 48 %HF 30 mL와 10 mL 절대 에탄올 (EtOH)의 실린더를 졸업 했다. 솔루션으로는 HF 유리를 녹이 고 고밀도 플라스틱 (예: 고밀도 폴 리 에틸렌)에 포함 되어야 합니다.
- 1시 29분을 이륙 (1.5에서 사용된 단계), 플라스틱을 채우기 위한 HF 솔루션 1 mL의 수성 48 %HF 절대 에탄올의 29 mL와 실린더를 졸업 했다. 솔루션으로는 HF 유리를 녹이 고 고밀도 플라스틱 (예: 고밀도 폴 리 에틸렌)에 포함 되어야 합니다.
- 10%에서 1 M 코 솔루션 만들기 EtOH 초과 pSi 해산 (단계 1.3과 1.5에서 사용).
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Etch 셀 설정
- 테 플 론에서 8.6 cm 셀 엣지2 잘 엣지 (지역 o-링, 내 에칭 하 고 A에 의해 영역을 계산 하는 데 사용할 수 있는 실리콘 표면의 직경을 측정 하 여 계산 = πr2), 내림차순 (그림 2a)에: (1)는 테 플 론 셀 가기; (2) 링; (3) 단 결정의 4 분의 1 조각 (1 0 0)-지향적인 p + +-유형 실리콘 웨이퍼 (다이아몬드 커터를 사용 하 여); 내 무 반으로 잘라 (4) 알루미늄 호 일; (5) 테 플 론 셀 베이스 나사를 부드럽게 누설을 방지 하기 위해 강화.
- EtOH에 잘 채워. 닦 고 테 플 론 셀 상단과 기지 사이 틈새에 삽입. 제거 시 건조 닦아 이면 엣지 셀 밀봉 된다. 젖은, 셀 누출 되 고 강화 하는 경우 나사 밀봉 될 때까지 더.
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실리콘 웨이퍼 연마
- 증기 두건으로 조립된 etch 셀을 가져.
- 3:1 HF 용액 10 mL에 잘 채워.
- Etch 셀에서 긍정적인 리드를 알루미늄 호 일 (전극)에 연결할 연결 부정적인 리드 백 금 코일 (카운터 전극) 회로 (그림 2b)를 완료 하는 etch 셀의 3:1 HF 용액에 몰입 하 고.
- 정 전류 50 mA cm-2 60에서 실행 s. 일단 엣지 완료 되 면, 회로에서 셀을 제거 하 고 3:1 HF 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 밖으로 헹 굴. 세 번 EtOH 린스 합니다.
- 잘 작성 하 여 에칭된 레이어를 멀리 해산 1 M 코의 10 mL를 천천히. 버블링가 라 앉 다 때까지 기다립니다.
- 물을 세 번, 그리고 EtOH 3 번 코를 씻어.
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실리콘 웨이퍼에 다공성 층을 화학적 에칭
- 사각 파형의 교류 전류 50 mA/cm2 0.6 s의 낮은 current density와 400 mA/cm2 0.36의 높은 전류 밀도 실행 s 500 사이클 반복.
- 일단 엣지 완료 되 면, 회로에서 셀을 제거 하 고 3:1 HF 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 밖으로 헹 굴. 세 번 EtOH 린스 합니다.
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해제-실리콘 웨이퍼에서 다공성 계층에서
- 1시 29분의 10 mL 잘 채워 HF 솔루션.
- 3.7 mA/cm2 250의 상수 실행 s. 일단 엣지 완료 되 면, 회로에서 셀을 제거. PSi 레이어 표시 파문 나타내는 결정 실리콘 웨이퍼에서 분리를 할 수 있습니다. 부드럽게 HF 솔루션 1시 29분에 밖으로 세척 하 고 EtOH 3 번, 그 후에 세 번 물으로 씻어.
- 완전 한 분리에 대 한 pSi 계층의 둘레를 균열 단단히 피 펫 팁을 사용 하 여. EtOH를 사용 하 여 수집 된 테 플 론에서 pSi 조각 (칩) 에칭 셀 무게 보트로. 유리 제 작은 유리병에 칩을 전송. PSi 칩 저장을 위해 6 개월 이상 EtOH에 실내 온도에 보관 수 있습니다.
- 잘 작성 하 여 모든 나머지 다공성 실리콘 웨이퍼에 멀리 분해 1 M 코의 10 mL를 천천히. 버블링가 라 앉 다 때까지 기다립니다.
- 물을 세 번, 그리고 EtOH 3 번 코를 씻어.
- 1.3-1.5 단계를 반복 하 여 전체 웨이퍼 두께 에칭.
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Sonicating 다공성 층 나노 입자 형성에 대 한
- 디 물 2 ml EtOH에서 pSi 칩이 포함 된 유리 유리병의 용 매를 교체 합니다.
- 단단히 뚜껑을 닫고 parafilm를 사용 하 여 밀봉.
- 유리 sonicator 목욕에서 유리병 및 중단 pSi 칩의 볼륨은 표면 아래에 완전히 빠져들 것 같은 장소.
- 12 h 35 kHz 및 RF 전력 48W의 sonicate. 쥡니다 동안 중요 한 물 손실 방지, 플라스 크의 여 물 목욕의 표면 접촉 되도록 반전 물으로 채워진 부피 플라스 크를 배치 합니다.
- 유리 약 병을 1 h 더 큰 입자는 아래쪽에 정착를 허용 하기 위해 평평한 표면에 놓습니다. 상쾌한 피 펫;를 사용 하 여 수집 정지에는 하위-100 nm pSiNPs를 포함 되어 있습니다.
2입니다. fusogenic 지질 필름 준비
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지질 재고 솔루션의 준비
- 증기 두건에서 DMPC, DSPE-말뚝-말 및 클로 프롬에 DOTAP 지질 수 화에 의해 지질 10 mg/mL 주식을 확인 합니다. 이러한 재고 솔루션 꽉 parafilm 물개에서 최대 6 개월 동안-20 ° C에 보관 수 있습니다.
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Fusogenic 지질 필름 만들기
참고: fusogenic 구성이 이루어집니다 지질, DMPC, DSPE-말뚝, 및 DOTAP, 76.2:3.8:20 및 96.2:3.8:0의 어 금 니 비율에서 각각.- 유리 병, DMPC, DSPE-말뚝의 15.16 μ 및 DOTAP의 19.63 μ 72.55 μ pipetting으로 혼합.
- 선택 사항: 형광 라벨 지질 코팅, 또한 추가 DiI의 20 µ L 1 mg/mL의 농도에 EtOH에 녹아.
- 하룻밤 증발을 클로 프롬 있도록 느슨한 모자와 함께 증기 두건에서 유리병을 놓습니다. 건조 필름 유리병의 하단에 흐린 하드 젤 같은 물질을 될 것입니다.
3. 로드 하 고 pSiNPs에 siRNA의 씰링
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재고를 로드 하는 염화 칼슘의 준비
- 1.11 g CaCl의 분해2 M CaCl2 솔루션 RNAse 무료 물 10 mL에2 .
- > 10, 000에서 솔루션 원심 집계를 정착 하는 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 수집 1 분 동안 g x. 또는, 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
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재고를 로드 하는 siRNA의 준비
- 수 화 또는 RNAse 무료 물에서 150 µ m siRNA를 희석. 이 재고 솔루션 aliquoted 수 있으며 자주 freeze-thaw 주기를 받아야 하지 않습니다는 적어도 30 일 동안-20 ° C에서 냉동 보관.
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염화 칼슘과 pSiNPs에 siRNA를 로드
- 아이스 쥡니다 목욕을 준비 합니다.
- 15 분 ultrasonication, siRNA의 부드럽게 피 펫 150 µ L 및 pSiNP의 150 µ L에 2 M CaCl2 의 700 µ L. 가스 생성을 위한 microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 열어두고 해야 합니다.
- 포함 하는 sonicator에서 siRNA 로드 칼슘 코팅 pSiNPs의 1 mL 튜브를 제거 합니다.
4. 코팅 fusogenic 지질와 siRNA 로드 pSiNPs
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Liposome 압출 장비의 준비
- 디 물으로 넓은 비 커를 채우십시오. 담가 1 폴 리카 보 네이트 막 (200 nm 모 공), 그리고 물 표면에 떠 여 4 필터 지원 제조업체의 지침에 따라 liposome 압출 키트 조립
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SiRNA 로드 pSiNps와 함께 지질 영화 하이드레이팅
- 3.3.3 단계에서 얻은 siRNA 로드 칼슘 코팅 pSiNPs의의 1 mL와 함께 유리 유리병에 말린된 지질 영화 하이드 레이트. 플라스틱 모든 지질 영화 유리병의 바닥에서 고 흐린 동종 솔루션으로 혼합 때까지.
- 유리 병에 자석 교 반 막대를 배치 하 고 40 ° C (또는 높은 만큼 더 유체 액체 크리스탈 단계에 지질을 유지 하기 위해 지질 위상 변환 온도 이상) 입자가 열 하는 뜨거운 접시에 유리병을 배치 하면서 자석으로 20 분에 대 한 솔루션을 감동.
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돌출 크기 제어에 대 한 지질 코팅 pSiNPs
- 압출 주사기에 지질 코팅 pSiNP-siRNA 솔루션의 1 mL 발음 압출 기의 1 개의 측에 빈 주사기와 다른 쪽 끝에 채워진된 주사기를 삽입 합니다.
- 천천히 한 주사기, 폴 리카 보 네이트 막 통해 그리고 다른로에서 입자를 추진 하는 피스톤 밀고 하 여 압출을 시작 합니다. 20 회 반복 한다. 피스톤 붙어있다 면 필터와 멤브레인 막힌 될 수 있습니다. 압출 기를 분해 하 고 멤브레인 및 필터 지원 교체. 문제가 지속 되 면, 관리는 막힘 때까지 입자를 희석.
- Microcentrifuge 관으로 밀어낸된 입자를 수집 합니다.
5입니다. 펩 티 드를 타겟팅의 활용
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대상 펩타이드 지질 코팅을 변화
- 1 mg/mL와 펩 티 드 주식 RNAse 무료 물에 펩 티 드 농도 준비 합니다.
- Fusogenic를 포함 하는 microcentrifuge 관에서 지질 코팅 pSiNPs, 부드럽게 1 mg/mL의 펩 티 드 사진 및 피펫으로 100 µ L를 추가 합니다. 튜브 20 분 (또는 > 2 h 4 ° C에서)에 대 한 실 온에서 정적 유지.
- 초과 펩 티 드 또는 siRNA와 다른 소를 제거 하려면 1 h. 동일한 설정에서 PBS의 1 mL와 함께 두 번 더 원심 분리기 25 ° C에서 5000 x g 에서 회전 하 여 30 kDa 원심 필터에 세척.
- 원하는 농도에서 PBS에 마지막 펩 티 드 활용 fusogenic 지질 코팅 pSiNPs를 resuspend. 입자 지금 aliquoted 및 적어도 30 일 저장을 위한-80 ° C에서 냉동 수 있습니다.
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Representative Results
Fusogenic pSiNPs의 성공적인 합성 균질 성, 약간 불투명 한 솔루션 (그림 3a)를 생산 한다. 실패 비율 및 pSiNPs의 농도 최적화: siRNA: CaCl2 (그림 3b) 로딩 시 집계 될 수 있습니다. 입자는 200 nm 세포 막을 통해 돌출 되어, DL로 측정 하는 fusogenic pSiNPs의 평균 유체역학 직경 해야한다 약 200 nm, 그리고 그림 4와 같이 평균 제타-잠재력 약 7 mV. 펩 티 드를 대상으로 표면 개 질, 후 전반적인 직경에서 230 될 증가 한다 nm, 그리고 평균 zeta 잠재력-3.4 아래로 감소 mV15. 돌출 크기에서 모든 광범위 한 편차는 실패 한 돌출 (d입자 >> d입체 면), 또는 로드 실패 (d입자 << d입체). 또한 DL을 사용 하 여 집계를 측정할 수 있습니다. 또한, 언된 aliquots 한 번만 반복된 동결-해 동으로 사이클 지질 막과 intraparticular 융합 및 집계 (그림 4)을 방해 해 동 될 해야 합니다. 그림 4a 에서 알 수 있듯이, fusogenic pSiNPs은 30 일 동안 저장 되며 구조적인 변화를 유발 하지 않고 해 동 수 있습니다. 그러나, freeze-thaw 주기 단일 약 수의 원인이 심각한 집계 반복 (d >> 1000 nm) 및 일일 주기 (그림 4b)의 4 일 안에 따라서 조언 된다 입자 수 단일 사용 볼륨을 aliquoted.
퓨전 라벨 닥터지 DiI (2.2.2 단계)와 fusogenic 지질 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 생체 외에서 지역화를 관찰에 의해 확인 될 수 있습니다. 그림 1 d 성공적인 퓨전, fusogenic pSiNP의 지질 원형질 막에는 DiI를 전송 하 고 리소좀의 독립적인 지역화 되어 표시 됩니다. 실패 한 퓨전 셀의 세포질 및 리소좀 (그림 1c)와 colocalization 내 DiI 지역화를 표시 됩니다.
그림 1: Fusogenic 다공성 실리콘 나노 시스템 (F-pSiNP). 기존 나노 입자와 후속 endosomal 함정 (a) 회로도 보여주는 endocytic 글귀. (b) 회로도 표시 fusogenic F pSiNPs와 siRNA 페이로드의 후속 cytosolic 배달의 통풍 관. (c) CAOV-3의 Confocal 현미경 이미지 DiI 닥터지 염료와 함께 로드 된 endocytosed 비 fusogenic pSiNPs를 가진 셀입니다. CAOV-3 셀의 나노 입자, 10 µ L로 치료 그리고 5% CO2 15 분 동안 37 ° C에서 incubated 6 잘 플레이트, 합류 점 80%를 성장 했다. 셀 1% paraformaldehyde DAPI 유리 슬라이드에 탑재 될에 고정, 건조 되었고 confocal 현미경 검사 법에 의해 검사 될 때까지 어둠 속에 보관. (DiI 닥터지 염료와 함께 로드 된 fusogenic pSiNPs를 채택 했다 CAOV-3 셀의 D) confocal 현미경 이미지. 셀은 제조업체의 지침에 따라 5% CO2 에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 LysoTracker 녹색 사전 스테인드 했다. 셀 다음 PBS에 게 세 번을 씻어 했다 그리고 15 분 DiI 로드 입자 10 μ로 치료 했다. 셀 씻 겨 했다 PBS와 세 번, 촬영 되지 않았다 모든 입자를 제거 하 고 우물 1 mL의 PBS로 가득 되었고 즉시 라이브 셀 이미징에 대 한 촬영 confocal 현미경 검사 법; DAPI 핵 얼룩 나타내고 리소좀 lysosomal 얼룩 LysoTracker 그린; 눈금 막대를 나타냅니다 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 엣지 셀 설치. (a) 회로도 표시 엣지 셀 구성 요소 및 어셈블리 순서; 그리고 (b) 실리콘의 전기 화학 에칭에 대 한 설치의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 마지막 F-pSiNP 제품의 사진. (한) 성공 합성 보여주는 균일 하 고 흐린 솔루션; (b) 실패 한 합성 입자 (노란색)의 집계를 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: fusogenic pSiNPs의 반복된 동결-해 동 주기 발생 집계. (한) 평균 크기와 fusogenic pSiNPs의 제타-잠재력 남아 때 해 동 후 동결; 일단 30 일 동안 꾸준한 (b) 평균 크기와 fusogenic pSiNPs의 제타-잠재력 매일 freeze-thaw 주기를 받은 후 4 일 이내 집계의 징후와 구조적 무결성의 손실을 보여 줍니다. 오차 막대를 나타내는 표준 편차 (n = 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다공성 실리콘 나노 입자 합성의 다이어그램. 실리콘 웨이퍼 (단계 1.4), 다공성 층은 (단계 1.5), 입자에 다공성 층의 쥡니다 및 다공성 실리콘 나노 입자 (단계 1.6)의 컬렉션의 이륙의 전기 화학 에칭을 보여주는 회로도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다공성 실리콘 나노 입자의 합성은 그림 5에 표시 됩니다. 로딩 단계 (3 단계)에서 fusogenic pSiNPs의 합성에 중요 한 단계가입니다. Fusogenic 나노 입자는 집계 하는 경우 후 합성 (그림 3), 이유는 다음과 같은 원인일 수 있습니다: (1) 염화 칼슘 주식 homogenously 준비 되지 않았습니다, 따라서 단계 3.1.2 신중 하 게 따라 하거나 해야 세련 된; (2) 또는 pSiNP의 비율: siRNA: CaCl2 또는 하나 이상의 세 가지 구성 요소 농도 최적화 되지 않을 수 있습니다. 다시 최적화 CaCl2 농도에서 출발이 좋습니다 (예를 들어, 1m 또는 3m 2 M에서에서 변경). 또한, 그것은 우리가 발견 하는 다른 공급 업체에서 동일한 화학 로드 단계, 그리고는 siRNA 로드 후속 실패에 더 낮은 pH 귀착되 CaCl2 동일한 공급 업체에서 있는지 확인 하는 것이 중요. pSiNPs 수 있습니다 또한 집중 될, 희석, 또는 더 저하 로드 프로세스 이전 단계 1.6.6 후 2 일 동안 RNAse 무료 물에 일시 중지 입자를 두어서.
후 로드, 종종 코팅 지질 농도 또는 밀도 (단계 4) 입자의 압출에 어려움에 지도 한다. 압출 막 막힌 경우 돌출을 강제로 막을 추출 수 있습니다. 막힘, 압출 기, 분해 고 막 지원 막힘에서 손실이 작은 경우 새로운 세트로 교체. 손실이 큰 경우 입자 현 탁 액을 희석 하 고 압출 30 s 이전의 sonicate. 문제가 계속 되 면 다시 최적화 pSiNP 크기 및 로딩 비율 집계를 최소화 하기 위해 조언 된다. 마지막으로, 어떤 오염 물질 또는 세포 또는 동물 치료 전에 집계 제거 하 0.22 μ m 기 공 필터를 통해 입자 현 탁 액을 필터링 하는 것이 좋습니다. 입자 합성 했다 특히 좋습니다 필터링 비 메 마른 환경에서 또는 입자의 얼어붙은 약 수 녹고 후.
Confocal 현미경 검사 법 (같이 그림 1 c, d), 및 지질 창 고 다공성 실리콘 코어는 세포질에서 관찰 하는 입자와 함께 치료 하는 세포의 전송 전자 현미경 입자의 fusogenicity 확인할 수 있습니다. 15.
Fusogenic pSiNPs와 그것의 합성 프로토콜 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 생체 외에서 유전자 침묵 응용 프로그램에 대 한 제시 fusogenic pSiNPs 입증 유도 > 100 nM 복용량;에 셀 라인의 범위에서 90% 최저 효율 신경-2a 마우스 신경 세포 선, CAOV-3 인간 난소 암 세포 선 및 RAW 264.7 마우스 대 식 세포 세포 선 악명 어려운-하-transfect에 포함 하 여. 그러나, 우리가 관찰 > 50%에서 최저 효율 낮은 25 nM 복용량, Lipofectamine의 비교 했다. 양이온 지질 세포 독성 효과 줄이기 위해 최소한으로 사용 해야 합니다, 우리 이전 1 mg15으로 높은 지질 복용량에 그것의 안전을 증명 하고있다. Vivo에서 유전자 침묵 응용 프로그램에 대 한 fusogenic pSiNPs는 선택에 의해 제한 됩니다. 양이온 지질 정전 모든 세포 막에 유치, 입자 또는 표면 (예를 들면, 펩 티 드 항 체, 등) 대상 moiety 수정 될 현지 치료,으로 사용 해야 합니다. Fusogenic pSiNPs에 대 한 합성 프로토콜 현재 최적화 하 고 siRNA 배송 전용에 대 한 제한. 동일한 메서드를 성공적으로 로드 미르, 확인 되었습니다 mRNA, cDNA, 및 다른 더 큰 뉴클레오티드 페이로드 로드할 수 가설 하지만 이러한 최적화가 아직.
제시 일 유전자 치료의 분야에 상당한 기여를 합니다. 생체 외에서 유전자 침묵에 대 한 표준 벤치 마크 Lipofectamine 2000입니다. 우리 경우 하지 높은 효율성15fusogenic pSiNPs의 비교, 최저의 효과 일으킬 수 있다 증명 하고있다. Lipofectamine 2000 fusogenic pSiNPs의 주요 장점은 조직의 주사 vivo에서 응용 프로그램에 사용 되는 기능입니다. Invivofectamine 3.0 등 다른 에이전트는 vivo에서 사용에 대 한 상용화 되었습니다 있다, 하는 동안 그들은 적합 간 배달, 그리고 증가 (돌출부, 없이 또는 잠긴된 핵 산 (LNA) 구조에서) 화학적 수정된 siRNAs를 필요로 안정성과 특이성입니다. 16 , 17 , 그러나 18 , fusogenic pSiNPs는 간단한 thiol maleimide 화학, 어떤 점에서 대상 펩 티 드 (이이 목적에 대 한 여분의 시스테인을 운반)에 thiol 그룹 바인딩 대상 moieties 켤레 수정된 후 합성 될 수는 fusogenic 코팅에서 PEGylated 지질의 끝에 maleimide 반지에 두 배 보 세 품 탄소. 또한, 높은 질량 세포 세포질에 로드 및 배달 효능 세포내 특이성에 대 한 필요성을 최소화 하 고 강한 진 입을 비 수정 siRNAs15효과 달성. Fusogenic pSiNPs의 1 개의 결점 합성 프로토콜 상용 transfection 요원 보다 더 복잡 한 여러 날 프로세스입니다. 그러나, 벤치 마크 제품 최상의 결과 얻으려면 transfection 전에 갓 준비 해야, 하는 동안 fusogenic pSiNPs 수 aliquoted와 냉동 적어도 30 일 동안 최저 효율 감소 하지 않고 있습니다.
이 방법에 대 한 미래 응용 프로그램 로드 및 더 큰 핵 산 페이로드, mRNAs 등 cDNAs의 배달에 대 한 최적화를 포함합니다. 또한, CRISPR/Cas9 단백질 sgRNA 복합물의 배달 또는 Cas9 mRNA와 sgRNA의 칵테일 이기도 개발 옵션 음이온 페이로드를 로드 하기 위한 최적의 시스템으로 합니다. 전반적으로, F-pSiNP 시스템은 감염, 바이러스 감염, 암, 자가 면역 질환 등을 넘어 질병을 치료 하는 유전자 치료에 대 한 모듈 nanoplatform.
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Disclosures
MJS는 스피너 커 생물 과학, Inc.의 과학 설립자 이며 회사에 주식 관심 있습니다. 이 프로젝트와 스피너 커 생물 과학, Inc.에 그것의 잠재적인 혜택의 전체 범위에 따라 상충 관리에 대 한 발견 되었습니다 있지만이 특정 게시에 포함 된 연구 결과 반드시 수 없습니다. 큰 삼각 돛 생물 과학, i n c.의 관심사와 관련 이 계약의 용어를 검토 하 고, 이해 충돌 정책에 따라 샌디에고가 주 대학에 의해 승인 되었습니다. 다른 사용 없다 공개 수 있습니다.
Acknowledgments
이 작품을 통해 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다 # R01 AI132413-01 계약.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
