Summary
Demonstramos a síntese de nanopartículas de silício poroso fusogenic para entrega efectiva do oligonucleotide in vitro e in vivo. Nanopartículas de silício poroso são carregadas com siRNA para formar o núcleo, que é revestido por fusogenic lipídios através da extrusão para formar o reservatório. Direcionamento functionalization moiety e caracterização de partículas estão incluídos.
Abstract
Com o advento da terapia gênica, tornou-se o desenvolvimento de um sistema de entrega eficaz em vivo do nucleotide-carga de importação paralela. Nanopartículas de silício poroso de Fusogenic (F-pSiNPs) recentemente demonstraram alto vivo em eficácia devido a sua alta do oligonucleotide carregar a capacidade e a via de absorção celular exclusivo que evita a endocitose de silenciamento do gene. A síntese de F-pSiNPs é um processo de várias etapa que inclui: (1) carregamento e selagem de payloads do oligonucleotide nos poros do silicone; (2) revestimento simultâneo e dimensionamento de lipídios fusogenic em torno dos núcleos de silício poroso; e (3) conjugação de direcionamento de peptídeos e de lavagem para remover o excesso do oligonucleotide, detritos de silício e peptídeo. Uniformidade de tamanho da partícula é caracterizada pela difusão dinâmica da luz, e sua estrutura casca-núcleo pode ser verificada por microscopia eletrônica de transmissão. A absorção de fusogenic é validada por carregar um lipofílico tingir, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), para a fusogenic lipídica e tratá-la às pilhas in vitro para observar para coloração contra a membrana plasmática endocítica localizações. As direcionamento e in vivo eficácias silenciar do gene anteriormente foram quantificadas em um modelo do rato de pneumonia de Staphylococcus aureus , em que o peptídeo alvo é esperado para ajudar o F-pSiNPs a casa para o local da infecção. Além da sua aplicação na infecção por S. aureus , o sistema F-pSiNP pode ser usado para entregar qualquer do oligonucleotide para a terapia de gene de uma vasta gama de doenças, incluindo doenças auto-imunes, câncer e infecções virais.
Introduction
Terapia genética modula a expressão de genes específicos para obter um resultado terapêutico. Inúmeras ferramentas para modulação de genes foram descobertas e estudadas, incluindo ácido ribonucleico interferência (RNAi) usando oligonucleotídeos (por exemplo, curto interferência do RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmídeo5,6, nucleases (por exemplo, dedo de zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemas9,10. Enquanto mecanismo de cada ferramenta de ação é diferente, todas as ferramentas devem alcançar o citoplasma da célula ou o núcleo para ser ativo. Como tal, embora estas ferramentas têm comprovado para induzir um efeito significativo na modulação de expressão gênica in vitro, a eficácia in vivo sofre entraves extracelulares e intracelulares. Devido ao fato de que as ferramentas são de origem biológica, muitas enzimas e sistemas de limpeza existem em nosso corpo que têm a capacidade de degradar ou remover as moléculas estrangeiras11. Mesmo no caso que as ferramentas atingem a célula-alvo, eles sofrem de endocitose; um modo de captação celular que encapsula e prende as ferramentas em vesículas ácidas do estômago-como que degradam ou expulsar as ferramentas fora da célula. De fato, estudos têm mostrado que nanopartículas de lipídios são endocytosed através de macropinocitose, da qual cerca de 70% do siRNA são exocytosed das células dentro de 24h de captação12,13. A maior parte do restante siRNA é degradada através da via lisossomal, e em última análise, apenas 1-2% de siRNA que inicialmente entra na célula com as nanopartículas alcançar CDDP fuga potencialmente submeter-se a RNAi13,14 .
Recentemente desenvolvemos a nanopartículas de silício poroso de fusogenic (F-pSiNPs) que têm um núcleo de siRNA-carregado composto de nanopartículas de silício poroso e um fusogenic lipídica shell15. Os F-pSiNPs apresenta três grandes vantagens sobre outros sistemas de entrega convencional do oligonucleotide: (1) um lipídio fusogenic revestimento que permite que as partículas de ignorar a endocitose e entregar a carga inteira diretamente no citoplasma celular (contra o 1-2% alcançado por partículas de endocytosed13,14) (Figura 1); (2) alto carregamento em massa de siRNA no pSiNPs (> 20% em peso em comparação com 1-15% em peso por sistemas convencionais)15, que rapidamente degradar no citoplasma (uma vez que as partículas do núcleo derramou o revestimento lipídico através de captação de fusogenic) para liberar o siRNA; e (3) visando a conjugação de peptídeo para orientação seletiva para desejado tipos de células in vivo.
O sistema F-pSiNP demonstrou silenciamento eficácia significativa do gene (> 95% in-vitro; > 80% in vivo) e o subsequente efeito terapêutico em um modelo de mouse fatal de S. aureus pneumonia; os resultados dos quais foram anteriormente publicados15. No entanto, a estrutura complexa do sistema F-pSiNP requer manipulação delicada e otimização de aperfeiçoá-lo para gerar nanopartículas uniformes e estáveis. Assim, o objetivo deste trabalho é apresentar um protocolo completo, bem como estratégias de otimização para a síntese, functionalization e caracterização de F-pSiNPs para ser usado no alvo entrega de siRNAs para efeito silencioso potente gene.
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Protocol
1. síntese de nanopartículas de silício poroso (pSINPs)
Cuidado: Sempre tenha cuidado ao trabalhar com ácido fluorídrico (HF). Siga todas as guias de segurança, de acordo com sua ficha de dados de segurança (SDS), lidar com quaisquer produtos químicos que contenham HF em uma coifa e usar equipamento de protecção adequado (EPI; luvas duplas com luvas de butilo do lado de fora, butil avental com jaleco e por baixo, rosto proteger com óculos de segurança por baixo). Todas as universidades e laboratórios de p & D requerem treinamento específico sobre segurança de HF antes do uso. Não tente trabalhar com HF sem aprovação prévia do seu coordenador de segurança do laboratório local, pois são necessárias medidas de segurança adicionais não descritas aqui.
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Preparação das soluções de decapagem
- Para tornar a solução de HF de 3:1 para a gravura (usada em passos 1.3 e 1.4), preencher um plástico graduado cilindro com 30 mL de HF aquoso de 48% e 10 mL de etanol absoluto (EtOH). A solução deve estar contida em plásticos de alta densidade (por exemplo, PEAD), como o HF dissolve vidro.
- Tornar um 01:29 solução de HF para decolagem (usado no passo 1.5), preencher um plástico graduado cilindro com 1 mL de HF aquoso de 48% e 29 mL de etanol absoluto. A solução deve estar contida em plásticos de alta densidade (por exemplo, PEAD), como o HF dissolve vidro.
- Faça a solução KOH 1 M em 10% EtOH para dissolução de excesso libras por polegada quadrada (usada em passos 1.3 e 1.5).
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Configurando a célula etch
- Em um Teflon etch célula com um 8,6 cm2 etch bem (área é calculada medindo o diâmetro da superfície de silício disponível para gravura dentro o-Ring e calcular a área pela = πr2), coloque em decrescente (Figura 2a): (1) o Top de célula de Teflon; (2) um-Ring; (3) um pedaço do bairro do único cristal (1 0 0) - orientada p + + - tipo bolacha de silicone cortada em quartos (usando um cortador de diamante); (4) folha de alumínio; e (5) a célula de Teflon base com parafusos apertados suavemente para evitar fugas.
- Encha o poço com EtOH. Pegue uma limpeza e introduza a fenda entre o Teflon celular topo ea base. Se a limpeza for seca após a remoção, a célula etch está selada. Se molhado, a célula está vazando e aperte os parafusos mais até selado.
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Polimento electrolítico o wafer de silício
- Trazer a célula etch montado em uma coifa.
- Encha o poço com 10 mL de solução de HF de 3:1.
- Ligue para a folha de alumínio (eletrodo) a positivo da célula etch e conectar o cabo negativo para as molas de platina (Counter-eletrodo) imergida em solução de HF a 3:1 da célula de etch para completar o circuito (Figura 2b).
- Executar uma constante corrente de 50 mA cm-2 por 60 s. Uma vez etch é terminado, remover a célula do circuito e enxaguar o HF de 3:1 com cuidado, usando uma seringa. Enxágue com EtOH três vezes.
- Dissolverem a camada gravada através do preenchimento do poço lentamente com 10 mL de 1m KOH. Espere até a subida diminui.
- Enxague com água três vezes e depois com EtOH três vezes o KOH.
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Eletroquimicamente gravura camadas porosa em bolacha de silicone
- Executar uma corrente alternada de uma forma de onda quadrada, com menor current density de 50 mA/cm2 para 0,6 s e alta densidade de corrente de 400 mA/cm2 para 0,36 s repetiu para 500 ciclos.
- Uma vez etch é terminado, remover a célula do circuito e enxaguar o HF de 3:1 com cuidado, usando uma seringa. Enxágue com EtOH três vezes.
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Levantando-se a camada porosa do wafer de silício
- Encher o poço com 10 mL de 01:29 solução de HF.
- Executar uma constante de 3.7 mA/cm2 para 250 s. Uma vez etch é terminado, remover a célula do circuito. A camada de pSi pode ter ondulações visíveis indicando distanciamento da pastilha de silício cristalino. Delicadamente, lavar as 01:29 solução de HF e enxágue com EtOH três vezes e, em seguida, com água três vezes.
- Usando a ponta da pipeta, firmemente rachar a circunferência da camada pSi para completo desapego. Usando EtOH, recolher os fragmentos de libras por polegada quadrada (fichas) do Teflon etch célula em um pesagem do barco. Transferi as fichas para um frasco de vidro. Os chips de pSi podem ser mantidos à temperatura ambiente em EtOH por mais de 6 meses para armazenamento.
- Dissolverem qualquer restante silício poroso sobre a bolacha preenchendo o bem devagar com 10 mL de 1m KOH. Espere até a subida diminui.
- Enxague com água três vezes e depois com EtOH três vezes o KOH.
- Repita as etapas de 1,3-1,5 até a espessura da bolacha inteira tem sido gravada.
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Sonicating camadas porosas para formação de nanopartículas
- Substitua o solvente do frasco de vidro contendo fichas de pSi de EtOH a 2 mL de água Desionizada.
- Firmemente feche a tampa e selar usando parafilme.
- Lugar do vidro frasco em um banho do sonicador e suspenso de tal forma que o volume de chips libras por polegada quadrada é completamente submerso abaixo da superfície.
- Proceda à sonicação durante 12 horas a 35 kHz e potência de RF de 48W. Para evitar a perda de água significativa durante sonication, coloque um balão volumétrico preenchido com água, invertida de modo que a abertura do frasco toque a superfície do banho de água.
- Coloque o frasco de vidro sobre uma superfície plana de 1 h permitir que as partículas maiores resolver na parte inferior. Recolher o sobrenadante com uma pipeta; a suspensão contém pSiNPs sub-100 nm.
2. preparação do filme de lipídios fusogenic
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Preparação das soluções estoque de lipídeos
- Em uma coifa, fazer estoques de 10 mg/mL de lipídios por hidratante ácido, DSPE-PEG-MAL e lipídios DOTAP em clorofórmio. Essas soluções estoque podem ser mantidas a-20 ° C por até 6 meses sob selo apertado parafilme.
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Tornando o filme de lipídios fusogenic
Nota: A composição do fusogenic é composta de lipídios, ácido, DSPE-PEG e DOTAP, para a relação molar de 76.2:3.8:20 e 96.2:3.8:0, respectivamente.- Em um frasco de vidro, misture 72,55 μL de ácido e 15.16 μL de DSPE-PEG 19.63 μL de DOTAP pipetando.
- Opcional: Para rotulagem fluorescente do revestimento lipídico, além disso adicione 20 µ l de DiI dissolvido em EtOH numa concentração de 1 mg/mL.
- Coloque o frasco em uma coifa com uma tampa solta para permitir que o clorofórmio evapore durante a noite. O filme seco será uma substância de gelatinosa dura nublada na parte inferior do frasco.
3. carregamento e selagem de siRNA em pSiNPs
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Preparação do cloreto de cálcio carregar estoque
- Dissolver 1,11 g de CaCl2 em 10 mL de água livre de RNAse para fazer uma solução de2 CaCl 2 M.
- Centrifugue a solução no > 10.000 x g por 1 min resolver os agregados e recolher o sobrenadante com uma pipeta. Alternativamente, filtre a solução através de um filtro de 0,22 µm.
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Preparação do siRNA carregar estoque
- Hidratar ou diluir o siRNA para 150 µM em água livre de RNAse. Esta solução pode ser aliquotada e mantidas congelada a-20 ° C durante pelo menos 30 dias dado que, não sofrer ciclos de congelamento-descongelamento frequentes.
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Carregando o siRNA em pSiNPs com cloreto de cálcio
- Prepare um banho gelado sonication.
- Abaixo dos 15 min ultrasonication, delicadamente pipeta 150 µ l de siRNA e 700 µ l de 2 M CaCl2 em 150 µ l de pSiNP. Certifique-se de deixar a tampa do tubo microcentrifuga aberta para geração de gás.
- Retire o tubo contendo 1 mL de siRNA-carregado cálcio revestido pSiNPs partir do sonicador.
4. revestimento siRNA-carregado pSiNPs com lipídios fusogenic
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Preparação do kit de extrusão do lipossoma
- Encha um copo grande com água. Mergulhe 1 policarbonato membrana (200 nm poros) e 4 suportes de filtro por eles flutuando na superfície da água. Montar o kit de extrusão em lipossomas, seguindo as instruções do fabricante
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Hidratação do filme lipídico com siRNA-carregado pSiNps
- Hidrate o filme lipídico secas no frasco de vidro com 1 mL de siRNA-carregado cálcio revestido pSiNPs obtidos de passo 3.3.3. Pipete até todos os lipídios filme ter levantado do fundo do frasco e misturado em uma solução homogênea nublada.
- Coloque uma barra de agita magnética no frasco de vidro e coloque o frasco em um prato quente para aquecer as partículas de 40 ° C (ou alto o bastante acima da temperatura de transformação de fase dos lipídeos para manter os lipídios na fase de cristal líquido mais fluídico) enquanto magneticamente agitar a solução por 20 min.
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Expulsando os pSiNPs revestidos de lipídeos para controle de tamanho
- Aspire a 1 mL de solução de pSiNP-siRNA revestidos de lipídeos na seringa extrusão. Inserir uma seringa vazia de um lado da extrusora e a seringa na outra extremidade.
- Extrusão de Begin, empurrando o êmbolo lentamente para empurrar as partículas de uma seringa, através da membrana de policarbonato e para o outro. Repita 20 vezes. Se o pistão é preso, o filtro e a membrana podem estar entupidos. Desmonte a extrusora e substituir os suportes de membrana e filtro. Se o problema persistir, dilua as partículas até o entupimento é gerenciável.
- Recolha as partículas extrudadas em um tubo de microcentrifugadora.
5. conjugação de alvejar peptides
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Conjugação de peptídeo direcionamento para revestimento de lipídios
- Prepare o estoque de peptídeo com um 1 mg/mL de concentração de peptídeo em água livre de RNAse.
- No tubo de microcentrifugadora contendo fusogenic pSiNPs revestidos de lipídeos, adicionar 100 µ l do estoque de peptídeo de 1 mg/mL e pipeta suavemente. Mantenha o tubo estático em temperatura ambiente por 20 min (Alternativamente, > 2 h a 4 ° C).
- Para remover o excesso peptídeo ou siRNA e outros excipientes, lavar em um filtro centrífugo 30 kDa por fiação a 5.000 x g a 25 ° C, durante 1 h. centrífuga mais duas vezes com 1 mL de PBS sob a mesma configuração.
- Resuspenda o pSiNPs final fusogenic conjugados a peptídeo de revestidos de lipídeos em PBS na concentração desejada. As partículas podem agora ser aliquotadas e congeladas a-80 ° C para armazenamento pelo menos 30 dias.
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Representative Results
Uma síntese bem sucedida de fusogenic pSiNPs deve produzir uma solução homogênea, ligeiramente opaca (Figura 3a). Falha para otimizar a relação e a concentração de pSiNPs: siRNA: CaCl2 pode levar a agregação durante o carregamento (Figura 3b). Como as partículas são extrudadas através de membranas de 200 nm, o diâmetro médio hidrodinâmico da pSiNPs de fusogenic medidos por DLS deve ser aproximadamente 200 nm e o mV de zeta-potencial média aproximadamente + 7 como mostrado na Figura 4. Após a modificação da superfície com direcionamento peptídeos, o diâmetro total deve ser aumentado para ser abaixo dos 230 nm e a média de zeta-potencial diminuíram até-3.4 mV15. Qualquer desvio extensivo do tamanho de extrusão é indicativo de falha da extrusão (dpartícula >> dextrusão), ou falha de carregamento (dpartícula << dextrusão). As agregações podem também ser quantificadas usando DLS. Além disso, as alíquotas congeladas devem ser descongeladas apenas uma vez, como o congelamento e descongelamento repetido ciclos de romper a membrana lipídica e fusão intraparticular e agregação (Figura 4). Como mostra a figura 4a , fusogenic pSiNPs pode ser armazenado por 30 dias e descongelados sem causar mudanças estruturais. No entanto, repetidos ciclos de congelamento e descongelamento de uma única alíquota causam grave agregação (d >> 1.000 nm) e dentro de 4 dias do ciclo diário (figura 4b), assim, é aconselhável que as partículas ser aliquotadas para uso único volumes.
Fusão pode ser confirmada pela rotulagem os lipídios de fusogenic com o DiI lipofílico (etapa 2.2.2) e observando a localização in vitro utilizando microscopia confocal. D a Figura 1 mostra bem sucedida fusão, onde lipídios do pSiNP o fusogenic o DiI de transferência para a membrana plasmática e são localizados independente de lisossomos. Malsucedida fusão irá mostrar a localização de DiI dentro do citoplasma da célula e colocalization com lisossomos (Figura 1C).
Figura 1: sistema de nanopartículas de silício poroso de Fusogenic (F-pSiNP). (a) diagrama esquemático mostrando endocítica captação de nanopartículas convencionais e uma armadilha CDDP subsequentes. (b) esquema mostrando fusogenic absorção do F-pSiNPs e subsequente entrega citosólica da carga do siRNA. (c) imagem microscópica Confocal de Cardelli-3 célula que tem endocytosed não-fusogenic pSiNPs que foram carregados com corante lipofílico DiI. Cardelli-3 células foram crescidas a confluência de 80% em uma placa-6, tratadocom com 10 µ l de nanopartículas e incubadas a 37 ° C em 5% de CO2 por 15 min. As células foram fixadas em 1% paraformaldeído para ser montados em lâminas de vidro com DAPI, secos e mantidas no escuro até examinada por microscopia confocal. (D) confocal imagem microscópica de uma célula de Cardelli-3 que tem a sua fusogenic pSiNPs que foram carregados com corante lipofílico DiI. Células foram previamente coradas com LysoTracker Green durante 1 h a 37 ° C em 5% CO2 de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então lavadas PBS três vezes e foram tratadas com 10 μL de DiI-carregado partículas por 15 min. As células foram lavadas com PBS três vezes para remover quaisquer partículas que não foram retomadas, e os poços foram preenchidos com 1 mL de PBS e levados imediatamente para a imagem latente da viver-pilha pela microscopia confocal; DAPI representa mancha nuclear e lisossomo representa lisossomal coloração por LysoTracker Green; barra de escala representa 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etch instalação celular. (a) diagrama esquemático mostrando etch componentes celulares e ordem de montagem; e (b) diagrama de instalação para eletroquímica gravura de silício. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fotografia de produto final F-pSiNP. (um) bem sucedido síntese mostrando uma solução homogénea e nublada; (b) síntese malsucedido mostrando agregação de partículas (amarelo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ciclo de congelamento e descongelamento repetidos de pSiNPs de fusogenic causar agregação. (um) média tamanho e zeta-potencial de fusogenic pSiNPs permanece estável por 30 dias, quando descongelado uma vez pós-congelamento; (b) média de tamanho e potencial zeta de pSiNPs o fusogenic mostra sinais de agregação e perda da integridade estrutural dentro de 4 dias depois de ser submetido a ciclos de gelo-degelo diariamente. Barras de erro representam o desvio padrão (n = 5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: diagrama de síntese de nanopartículas de silício poroso. Diagrama esquemático mostrando a gravura eletroquímica de bolacha de silicone (etapa 1.4), decolagem da camada porosa (passo 1.5), sonication da camada porosa em partículas e a coleção de nanopartículas de silício poroso (passo 1.6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Síntese de nanopartículas de silício poroso é mostrado na Figura 5. O passo fundamental na síntese de fusogenic pSiNPs está na etapa de carregamento (etapa 3). Se as nanopartículas fusogenic são agregar pós-síntese (Figura 3), o motivo pode ser devido ao seguinte: (1) estoque de cloreto de cálcio não foi homogênea preparado, assim passo 3.1.2 deve ser cuidadosamente seguido ou refinado; ou (2) a relação de pSiNP: siRNA: CaCl2 ou a concentração de um ou mais dos três componentes pode não ser o ideal. Re-otimização a partir a CaCl2 concentração é sugerido (por exemplo, alterando de 2 M para 1 M ou 3 M). Além disso, é importante se certificar que o CaCl2 é do mesmo fornecedor, como achamos que a mesma substância química de diferentes fornecedores resultou em pH inferior à etapa de carregamento e subsequente falha ao carregar o siRNA. O pSiNPs pode também ser concentrada, diluída, ou ainda mais degradada antes do processo de carregamento, deixando as partículas em suspensão na água livre de RNAse por 2 dias depois passo 1.6.6.
Após o carregamento, o lipídeo revestimento muitas vezes leva à dificuldade na extrusão devido a concentração ou densidade das partículas (passo 4). Se a membrana de extrusão está entupida, forçando a extrusão pode rasgar a membrana. Em cima de entupimento, desmontar a extrusora e substituir a membrana e os suportes com um novo conjunto se a perda de entupimento é pequena. Se a perda é grande, então diluir a suspensão de partículas e proceda à sonicação durante 30 antes de s de extrusão. Se o problema persistir, aconselha-se re-otimização de pSiNP tamanho e taxa de carregamento para minimizar agregados. Por último, sugerimos que a suspensão de partículas de filtragem com filtros de 0,22 µm-poro para eliminar quaisquer contaminantes ou agregados antes da célula ou tratamento de animais. Filtragem é especialmente aconselhada se as partículas foram sintetizadas em um ambiente não-estéril, ou após o descongelamento de uma alíquota congelada das partículas.
O fusogenicity das partículas pode ser validado pela microscopia confocal (como mostrado na Figura 1 c, d) e por microscopia eletrônica de transmissão das células tratadas com as partículas de observar para núcleos de silício poroso lipid-galpão no citoplasma 15.
O pSiNPs de fusogenic e seu protocolo de síntese tem algumas limitações. Silenciamento de aplicações in vitro do gene, os pSiNPs de fusogenic apresentado provaram para induzir > 90% de eficiência "knockdown" em uma variedade de linhas de celulares na dose 100 nM; incluindo a linha de células de neuroblastoma de rato Neuro-2a, a linhagem de células de câncer de ovário humano Cardelli-3 e notoriamente difícil-para-transfect RAW 264.7 rato macrófago linhagem celular. No entanto, temos observado > 50% eficiência knockdown em tão baixo quanto 25 dose nM, que era comparável de Lipofectamine. Enquanto lipídios catiônicos devem ser utilizados minimamente para reduzir o efeito citotóxico, Nós demonstramos anteriormente sua segurança na dose de tão altamente quanto 1 mg15lipídios. Silenciamento de aplicações do gene in vivo, os pSiNPs de fusogenic são limitados pela seletividade. Como os lipídios catiônicos atraem eletrostaticamente para qualquer membrana da célula, as partículas devem ser utilizadas como um local terapêutico, ou ser superfície modificada com um grupo alvo (por exemplo, peptídeos, anticorpos, etc.). O protocolo de síntese para fusogenic pSiNPs atualmente é otimizado e limitado para siRNA entrega somente. O mesmo método foi verificado com sucesso carregar miRNA e é supor para ser capaz de carregar o mRNA, cDNA e outras cargas maiores de nucleotídeos, mas estes ainda têm que ser otimizado.
O trabalho apresentado faz uma contribuição significativa para o campo da terapia gênica. A referência padrão para o silenciamento de genes in vitro é o Lipofectamine 2000. Demonstrámos que o pSiNPs de fusogenic pode induzir efeito knockdown de comparável, se não maior, eficiências15. A grande vantagem de pSiNPs a fusogenic sobre Lipofectamine 2000 é sua capacidade de ser utilizada para aplicações em vivo com injeções sistêmicas. Enquanto que outros agentes, como o Invivofectamine 3.0, têm sido comercializados para usos em in vivo, eles são adequados para a entrega de fígado e exigem siRNAs quimicamente modificados (com ou sem saliências ou na estrutura do ácido nucleico bloqueado (LNA)) para aumentar a estabilidade e especificidade. 16 , 17 , 18 no entanto, o pSiNPs de fusogenic pode ser modificada pós-síntese conjugar direcionamentos metades com química thiol-maleimide simples, em que um grupo tiol na mira peptide (que transporta uma cisteína extra para essa finalidade) vincula um dobro-ligado carbono no anel na extremidade de lipídios peguilado no revestimento fusogenic maleimide. Além disso, a massa de alta eficácia de carregamento e entrega para o citoplasma da célula minimiza a necessidade de especificidade intracelular e alcança o silenciamento efeito com siRNAs não modificado15forte do gene. Uma desvantagem de pSiNPs a fusogenic é que o protocolo de síntese é um processo de vários dia que é mais complexo do que os agentes de transfeccao comercialmente disponível. No entanto, enquanto os produtos de referência devem ser preparados antes de Transfeccao para obter os melhores resultados, o pSiNPs de fusogenic pode ser aliquotadas e congelados pelo menos 30 dias sem diminuir a eficiência "knockdown".
Futuras aplicações para este método incluem otimização para carregamento e entrega de cargas maiores de ácido nucleico, como mRNAs e cDNAs. Além disso, entrega do complexo proteína-sgRNA CRISPR/Cas9 ou um cocktail do mRNA Cas9 e sgRNA, é também uma opção de desenvolvimento, como o sistema é ideal para carregar cargas aniônicas. Em geral, o sistema F-pSiNP é um nanoplatform modular para terapia gênica tratar doenças, além de infecções, incluindo infecções virais, câncer e doenças auto-imunes.
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Disclosures
MJS é um fundador científico da Spinnaker Biosciences, Inc. e tem uma participação na empresa. Embora este subsídio foi identificado para a gestão de conflito de interesses dependendo do escopo geral do projeto e seu benefício potencial de Spinnaker Biosciences, Inc., os findings da pesquisa incluídos nesta publicação particular podem não necessariamente se relacionam com os interesses da Spinnaker Biosciences, Inc. Os termos desse acordo foram revistos e aprovados pela Universidade da Califórnia, San Diego, em conformidade com suas políticas de conflito de interesses. Outros autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health, através de contrato # R01 AI132413-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
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