Summary
Vi visar syntesen av fusogenic porösa kisel nanopartiklar för effektiv in vitro- och in vivo oligonukleotiden leverans. Porösa kisel nanopartiklar är laddade med siRNA bildar kärnan, som täckas av fusogenic lipider genom extrudering att bilda skalet. Inriktning biexponentiellt funktionalisering och partikel karakterisering ingår.
Abstract
Med tillkomsten av genterapi blivit utvecklingen av en effektiv Invivo nukleotid-nyttolast leveranssystem av parallellimport. Fusogenic porösa kisel nanopartiklar (F-pSiNPs) har nyligen visat hög Invivo nedtystning effekt på grund av dess höga oligonukleotiden laddar kapacitet och unika cellernas upptag gångstig som undviker endocytos. Syntesen av F-pSiNPs är en process i flera steg som omfattar: (1) lastning och tätning av oligonukleotiden nyttolaster kisel porer; (2) samtidig beläggning och dimensionering av fusogenic lipider runt de porösa kisel gjutkärnor; och (3) Konjugation av riktade peptider och tvättning för att avlägsna överflödig oligonukleotiden, kisel skräp och peptid. Den partikelns storlek enhetlighet kännetecknas av dynamiska ljusspridning och dess core-shell struktur kan verifieras genom transmissionselektronmikroskopi. Fusogenic upptaget valideras av lastning en lipofila dye, 1, 1-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DiI), in i den fusogenic lipid lipidens och betraktar det till celler in vitro-att observera för plasma membran färgning kontra endocytic lokaliseringar. De inriktning och in vivo gen tysta efficacies kvantifierades tidigare i en musmodell av stafylokocker lunginflammation, där den inriktning peptiden förväntas hjälpa den F-pSiNPs hem till platsen för infektion. Utöver dess tillämpning i S. aureus infektion, kan F-pSiNP systemet användas att leverera någon oligonukleotiden för genterapi av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive virala infektioner, cancer och autoimmuna sjukdomar.
Introduction
Genterapi modulerar specifik genuttryck för att erhålla en terapeutiska resultat. Många verktyg för genen modulering har upptäckts och studerat, inklusive ribonukleinsyra störningar (RNAi) använder oligonukleotider (t.ex. kort störande RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nukleaser (t.ex. zink finger, TALENS)7,8och CRISPR/Cas9-system9,10. Medan varje verktygets verkningsmekanism skiljer sig, måste alla verktyg når cellens cytoplasma eller kärnan till vara aktiv. Som sådan, medan dessa verktyg har visat signifikant effekt i modulerande genuttryck in vitro-, lider in vivo effekten av extracellulära och intracellulära hinder. På grund av att verktygen är av biologiskt ursprung, finns många enzymer och system för tullklarering i vår kropp som har förmågan att försämra eller ta bort främmande molekyler11. Även i fallet lider att verktygen når målcellen, de av endocytos; ett läge i cellernas upptag som kapslar och fällor verktygen i sura magen-liknande blåsor som försämra eller utvisa verktyg ur cellen. I själva verket, har studier visat att lipid nanopartiklar är endocytosed via macropinocytosis, som är ungefär 70% av siRNA exocytosed från cellerna inom 24h upptag12,13. Majoriteten av de återstående siRNA bryts via lysosomala vägen, och i slutändan endast 1-2% av den siRNA som initialt går in i cellen med nanopartiklar uppnå endosomal fly potentiellt genomgå RNAi13,14 .
Nyligen har vi utvecklat fusogenic porösa kisel nanopartiklar (F-pSiNPs) som har en siRNA-laddad kärna består av porös kisel nanopartiklar och en fusogenic lipid skal15. De F-pSiNPs presentera tre stora fördelar framför andra konventionella oligonukleotiden leverans system: (1) en fusogenic lipid beläggning vilket gör att partiklarna att kringgå endocytos och leverera hela nyttolasten direkt i cellens cytoplasma (jämfört med 1-2% uppnås genom endocytosed partiklar13,14) (figur 1). (2) hög massa lastning av siRNA i pSiNPs (> 20 wt % jämfört med 1-15 wt % av konventionella system)15, som snabbt försämras i cytoplasman (när core partiklarna skjul lipid beläggningen via fusogenic upptag) för att släppa siRNA; och (3) inriktning peptid konjugation för selektiv homing till önskade celltyper Invivo.
F-pSiNP systemet har visat betydande nedtystning effekten (> 95% in vitro-; > 80% i vivo) och efterföljande terapeutisk effekt i en dödlig utgång musen modell av S. aureus lunginflammation; resultaten av som publicerades tidigare15. Den komplexa strukturen av F-pSiNP systemet kräver dock känslig hantering och finjusteras optimering att generera enhetlig och stabil nanopartiklar. Syftet med detta arbete är således att presentera en grundlig protokoll, samt optimering strategier för syntes, funktionalisering och karakterisering av F-pSiNPs som ska användas i riktade leverans av siRNAs för potenta gen tysta effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sammanfattning av porösa kisel nanopartiklar (pSINPs)
Varning: Använd alltid försiktighet när du arbetar med fluorvätesyra (HF). Följa alla säkerhet guider enligt dess säkerhetsdatablad (SDS), hanterar alla HF-innehållande kemikalier i ett dragskåp och bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE, dubbla handskar med butyl handskar på utsidan, butyl förkläde med labbrock under, ansikte sköld med skyddsglasögon under). Alla universitet och FoU labb kräver särskild utbildning på HF säkerhet före användning. Försök inte att arbeta med HF utan förhandsgodkännande av din lokala lab säkerhetssamordnare, som ytterligare säkerhetsåtgärder som inte beskrivs här krävs.
-
Förberedelse av etsning lösningar
- Graderad cylinder med 30 mL vattenlösning 48% HF och 10 mL absolut etanol (EtOH) för att göra 3:1 HF lösningen för etsning (används i steg 1.3 och 1.4), fylla en plast. Lösningen måste finnas i hög densitet plast (t.ex. HDPE), som HF upplöser glas.
- För att göra en 1:29 HF lösning för lyft (används i steg 1,5), Fyll en plast graderad cylinder med 1 mL vattenlösning 48% HF och 29 mL absolut etanol. Lösningen måste finnas i hög densitet plast (t.ex. HDPE), som HF upplöser glas.
- Gör 1 M KOH lösningen i 10% EtOH för överskjutande pSi upplösning (används i steg 1.3 och 1.5).
-
Ställa in cellen etch
- I en Teflon etch cell med en 8,6 cm2 etch väl (området beräknas genom att mäta diametern på kisel ytan tillgängliga för etsning inom o-ringen, och beräkna området av A = πr2), placera i fallande ordning (figur 2a): (1) den Teflon cellen överst; (2) en O-ring; (3) en fjärdedel bit av den enda kristallen (1 0 0) - orienterade p ++ - typ kisel wafer styckas i (med en diamant cutter). (4) aluminiumfolie; och (5) cellen Teflon bas med skruvar åtdragna försiktigt för att förhindra läckage.
- Fyll borrhålet med EtOH. Ta en torka och sätt i skreva mellan Teflon cell topp och bas. Om torka torrt efter borttagning, är cellen etch förseglad. Om vått, cellen är läcker och dra åt ytterligare skruvarna tills förseglad.
-
Electropolishing kisel rånet
- Sätta den monterade etch-cellen i dragskåp.
- Fyll borrhålet med 10 mL 3:1 HF lösning.
- Anslut den positiva ledningen till aluminiumfolie (elektroden) från cellen etch och Anslut negativa till platina spolen (kampen mot elektroden) nedsänkt i 3:1 HF lösningen av etch cellen att slutföra kretsen (figur 2b).
- Kör en konstant ström på 50 mA cm-2 för 60 s. En gång etch är klar, ta bort cellen från kretsen och Skölj ur den 3:1 HF noggrant med hjälp av en spruta. Skölj med EtOH tre gånger.
- Lös upp bort etsade lagret genom att fylla brunnen långsamt med 10 mL 1 M KOH. Vänta tills den bubblar avtar.
- Skölj ur KOH med vatten tre gånger, och sedan med EtOH tre gånger.
-
Elektrokemiskt etsning porösa lager i silicon wafer
- Kör en växelström av en fyrkantig vågform, med lägre current density 50 mA/cm2 för 0.6 s och hög strömtäthet av 400 mA/cm2 för 0,36 s upprepas för 500 cykler.
- En gång etch är klar, ta bort cellen från kretsen och Skölj ur den 3:1 HF noggrant med hjälp av en spruta. Skölj med EtOH tre gånger.
-
Lyft-off det porösa lagret från silicon rånet
- Fyll borrhålet med 10 mL av 1:29 HF lösning.
- Kör en konstant 3.7 mA/cm2 för 250 s. En gång etch är klar, ta bort cellen från kretsen. Iska lagret kanske synliga krusningar som anger avskildhet från kristallint kisel rånet. Försiktigt tvätta de 1:29 HF lösningen och skölj med EtOH tre gånger, sedan med vatten tre gånger.
- Använder en pipettspetsen, fast spricka omkretsen av lagrets pSi för fullständig avskildhet. Använda EtOH, etch samla pSi fragment (marker) från Teflon cell i en vägning båt. Överföra spelmarker till en injektionsflaska av glas. PSi marker kan förvaras vid rumstemperatur i EtOH över 6 månader för lagring.
- Lös upp bort eventuella kvarvarande porös kisel på rånet genom att fylla brunnen långsamt med 10 mL 1 M KOH. Vänta tills den bubblar avtar.
- Skölj ur KOH med vatten tre gånger, och sedan med EtOH tre gånger.
- Upprepa steg 1.3-1.5 tills hela rånet tjockleken har varit etsade.
-
Sonicating porösa lager för nanopartiklar bildas
- Ersätta spädningsvätskan i en injektionsflaska av glas innehållande pSi marker från EtOH till 2 mL DI vatten.
- Fast Stäng locket och försegla med parafilm.
- Plats på glas injektionsflaska i en någon sonikator bad och upphängd så att volymen av pSi marker är helt nedsänkt under ytan.
- Sonikera för 12 h vid 35 kHz och RF-effekten av 48W. För att förhindra betydande vattenförlust under ultraljudsbehandling, placera en mätkolv fyllda med vatten, inverterad så att öppnandet av kolven vidrör ytan av vattenbadet.
- Placera injektionsflaskan med glas på en plan yta för 1 h att tillåta större partiklar att bosätta sig på botten. Samla in supernatanten med pipett; suspensionen innehåller sub-100 nm pSiNPs.
2. förberedelse av fusogenic lipid film
-
Beredning av stamlösningar av lipid
- Gör 10 mg/mL bestånd av lipider i dragskåp, genom hydrating DMPC, DSPE-PEG-MAL och DOTAP lipider i kloroform. Dessa lager lösningar kan förvaras vid-20 ° C i upp till 6 månader under snäva parafilm sigill.
-
Göra fusogenic lipid filmen
Obs: Fusogenic sammansättning görs av lipider, DMPC, DSPE-PEG och DOTAP, på molar förhållandet av 76.2:3.8:20 och 96.2:3.8:0, respektive.- I en injektionsflaska av glas, blanda 72.55 μL DMPC, 15.16 μL av DSPE-PEG och 19.63 μL av DOTAP genom pipettering.
- Valfritt: För fluorescerande märkning av lipid beläggning, dessutom Tillsätt 20 µL av DiI upplöst i EtOH vid en koncentration av 1 mg/mL.
- Placera injektionsflaskan i dragskåp med ett löst lock att tillåta den kloroform avdunsta under natten. Torkade filmen blir en grumlig hård gel-liknande substans på botten av injektionsflaskan.
3. lastning och försegling av siRNA i pSiNPs
-
Beredning av den kalciumklorid som laddar lager
- Lös 1,11 g CaCl2 i 10 mL RNAse-fritt vatten för att göra en 2 M CaCl2 lösning.
- Centrifugera lösningen på > 10.000 x g för 1 min att kvitta aggregaten och samla supernatanten med pipett. Du kan också filtrera lösningen genom ett 0,22 µm filter.
-
Beredning av den siRNA lastning lager
- Återfukta eller späd siRNA till 150 µM i RNAse-gratis vatten. Denna stamlösning kan vara aliquoted och förvaras fryst vid-20 ° C under minst 30 dagar med tanke på att det inte genomgår frekvent frysning-tining cykler.
-
Laddar siRNA i pSiNPs med kalciumklorid
- Förbereda en iced ultraljudsbehandling bad.
- Under 15 min ultraljud, försiktigt pipett 150 µL av siRNA och 700 µL av 2 M CaCl2 till 150 µL av pSiNP. Se till att lämna locket på mikrocentrifug röret öppet för gas generation.
- Ta bort röret innehållande 1 mL siRNA-loaded kalcium belagda pSiNPs från den någon sonikator.
4. beläggning siRNA-laddat pSiNPs med fusogenic lipider
-
Förberedelse av Liposom extrudering kit
- Fyll en stor bägare med DI-vatten. Blötlägg 1 polykarbonat membran (200 nm porer) och 4 filter stöder av flytande dem på vattenytan. Montera i Liposom extrudering kit genom att följa tillverkarens instruktioner
-
Hydrating lipid filmen med siRNA-loaded pSiNps
- Hydrate torkade lipid filmen i glas injektionsflaska med 1 mL av siRNA-loaded kalcium belagda pSiNPs erhålls från steg 3.3.3. Pipettera tills alla lipider film har lyft från botten av injektionsflaskan och blandade till en homogen grumlig lösning.
- Placera en magnetisk omrörning bar i glasflaskan och placera injektionsflaskan först på en värmeplatta att värma partiklarna till 40 ° C (eller tillräckligt hög ovanför den lipider fas omvandlingstemperaturen att upprätthålla lipider i fasen mer fluidic flytande kristaller) medan magnetiskt omrörning lösningen för 20 min.
-
Strängpressning av lipid-belagda pSiNPs för storlekskontroll
- Aspirera i 1 mL av lipid-belagd pSiNP-siRNA lösning i extrudering sprutan. Infoga en tom spruta på ena sidan av extruder och den fyllda sprutan i andra änden.
- Börja extrudering genom att trycka kolven i långsamt att driva partiklarna från en spruta, genom polykarbonat membranet och in i den andra. Upprepa 20 gånger. Om kolven har fastnat, kan filter och membran vara igensatta. Demontera extruder och ersätta de membran och filtret stöder. Om problemet kvarstår, späd partiklarna tills igensättning är hanterbara.
- Samla in extruderad partiklarna i en mikrocentrifug rör.
5. konjugering av inriktning peptider
-
Konjugera inriktning peptid till lipid beläggning
- Förbereda peptid beståndet med 1 mg/mL peptid koncentration i RNAse-gratis vatten.
- I mikrocentrifug röret som innehåller fusogenic lipid-belagda pSiNPs, tillsätt 100 µL av 1 mg/mL peptid och Pipettera försiktigt. Förvara tuben statiska i rumstemperatur i 20 min (alternativt > 2 h vid 4 ° C).
- Ta bort överflödigt peptid eller siRNA och övriga hjälpämnen, tvätta i 30 kDa centrifugal filter av spinning på 5 000 x g vid 25 ° C under 1 h. centrifug två gånger mer med 1 mL PBS under samma inställning.
- Återsuspendera den slutliga peptid-konjugerad fusogenic lipid-belagd pSiNPs i PBS på önskad koncentration. Partiklarna kan nu vara aliquoted och fryst vid-80 ° C för lagring av minst 30 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lyckad syntes av fusogenic pSiNPs bör producera en homogen, något ogenomskinlig lösning (figur 3a). Underlåtenhet att optimera baserat och koncentrationen av pSiNPs: siRNA: CaCl2 kan leda till aggregering vid lastning (figur 3b). Som partiklarna är extruderad genom 200 nm membran, genomsnittliga hydrodynamiska diametern på den fusogenic pSiNPs mätt med DLS bör vara cirka 200 nm, och den genomsnittliga zeta potential cirka + 7 mV som visas i figur 4. Efter ytmodifiering med inriktning peptider, den totala diametern bör ökas för att vara under 230 nm och genomsnittliga zeta potential minskat ner till -3,4 mV15. Någon omfattande avvikelse från extrudering storlek är vägledande för misslyckade extrudering (dpartikel >> dextrudering), eller misslyckades lastning (dpartikel << dextrudering). Aggregeringar kan också kvantifieras med hjälp av DLS. Dessutom måste de frysta alikvoter tinas endast en gång, som upprepad frysning-tining cykler störa lipid membranet och intraparticular fusion och aggregation (figur 4). Som framgår av figur 4a kan fusogenic pSiNPs lagras i 30 dagar och tinade utan att orsaka strukturella förändringar. Men upprepad frysning-tining cykler av en enda delprov orsaka svår aggregation (d >> 1.000 nm) och inom 4 dagar av dagliga cykeln (figur 4b), således det rekommenderas att partiklarna vara aliquoted till engångsbruk volymer.
Fusion kan bekräftas genom märkning av fusogenic lipider med den lipofila DiI (steg 2.2.2), och observera den in vitro-lokalisering med konfokalmikroskopi. Figur 1 d visar framgångsrik fusion, där de fusogenic Psinp's lipider överföra DiI till plasmamembranet och är lokaliserade oberoende av lysosomer. Misslyckade fusion visar DiI lokaliseringen inom cellens cytoplasma och colocalization med lysosomer (figur 1 c).
Figur 1: Fusogenic porösa kisel nanopartiklar system (F-pSiNP). (en) Schematisk visar endocytic upptag av konventionella nanopartiklar och efterföljande endosomal entrapment. (b) Schematisk visar fusogenic upptag av F-pSiNPs och efterföljande cytosoliska leverans av siRNA nyttolast. (c), Confocal mikroskopiska bilden av en CAOV-3 cell som har endocytosed icke-fusogenic pSiNPs som var lastade med DiI lipofila färgämne. CAOV-3 celler odlades till 80% sammanflödet i en 6 väl-platta, behandlades med 10 µL av nanopartiklar och inkuberas vid 37 ° C i 5% CO2 för 15 min. Cellerna var fast i 1% paraformaldehyd monteras på glasskivor med DAPI, torkas och förvaras i mörker tills granskas av konfokalmikroskopi. (D) confocal mikroskopiska bilden av en CAOV-3-cell som har tagit upp fusogenic pSiNPs som var lastade med DiI lipofila färgämne. Cellerna var pre färgas med LysoTracker Green för 1 h vid 37 ° C i 5% CO2 enligt tillverkarens anvisningar. Cellerna var sedan tvättas PBS tre gånger, och behandlades med 10 μL av DiI-laddade partiklar i 15 min. Cellerna var tvättas med PBS tre gånger att ta bort eventuella partiklar som inte togs upp, och brunnarna var fylld med 1 mL PBS och omedelbart tas för live-cell avbildning av konfokalmikroskopi; DAPI representerar nukleära fläcken och Lysosomen lysosomala färgning av LysoTracker Green; skalstapeln representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Etch cell setup. (en) Schematisk visar etch cell komponenter och sammansättningsorder; och (b) diagrammet av installationsprogrammet för elektrokemisk etsning av kisel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fotografi av slutprodukten F-pSiNP. (en) framgångsrika syntes visar homogen och grumlig lösning; (b) misslyckat visar aggregering av partiklar (gul). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: upprepad frysning-tining cykel av fusogenic pSiNPs orsaka aggregering. (en) genomsnittliga storlek och zeta potential av fusogenic pSiNPs sken i 30 dagar när tinade när efter frysning; (b), genomsnittlig storlek och zeta potential av den fusogenic pSiNPs visar tecken på aggregering och förlust av strukturell integritet inom 4 dagar efter att ha genomgått dagligen frysning-tining cykler. Felstaplar representera standardavvikelse (n = 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Diagram över porösa kisel nanopartiklar syntes. Schematiska visar elektrokemisk etsning av kisel wafer (steg 1,4), lyft av det porösa lagret (steg 1,5), ultraljudsbehandling av porösa lager till partiklar och insamling av porösa kisel nanopartiklar (steg 1,6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntesen av porösa kisel nanopartiklar visas i figur 5. Det kritiska steget i syntesen av fusogenic pSiNPs är i lastning steg (steg 3). Om de fusogenic nanopartiklarna aggregera efter syntes (figur 3), anledningen kan bero på följande: (1) kalciumklorid aktie var likartad inte beredd, alltså steg 3.1.2 skall noggrant följt eller raffinerade; eller (2) förhållandet mellan pSiNP: siRNA: CaCl2 eller koncentrationen av en eller flera av de tre komponenterna kan inte vara optimal. Re optimering start från CaCl2 koncentrationen föreslås (t.ex. ändring från 2 M till 1 M eller 3 M). Dessutom är det viktigt att se till att CaCl2 är från samma leverantör, som vi funnit att den samma kemiskt från olika leverantörer resulterade i lägre pH vid lastning steg och efterföljande underlåtenhet att ladda siRNA. PSiNPs kan också vara koncentrerade, utspädda, eller ytterligare försämrat före inläsningen genom att lämna de partiklar svävande i vattnet RNAse-gratis för 2 dagar efter steg 1.6.6.
Efter lastning, leder den lipid beläggning ofta till svårigheter vid strängsprutning på grund av den koncentration eller densitet av partiklarna (steg 4). Om extrudering membranet är igensatt, kan tvingar extrudering rippa membranet. Vid igensättning, demontera extruder och byt membranet och stöttar med en ny uppsättning om förlusten från igensättning är liten. Om förlusten är bra, sedan späd den partikel fjädringen och sonikera under 30 s före extrudering. Om problemet kvarstår, rekommenderas förnyad optimering av pSiNP storlek och lastning förhållandet att minimera aggregat. Slutligen föreslår vi filtrering partikel suspensionen genom ett 0,22 µm-pore-filter för att eliminera eventuella föroreningar eller aggregat före cellen eller behandling av djur. Filtrering rekommenderas särskilt om partiklarna var syntetiseras i en icke-steril miljö eller efter upptining en fryst alikvot av partiklarna.
Fusogenicity av partiklarna kan valideras genom konfokalmikroskopi (som visas i figur 1 c, d) och transmissionselektronmikroskopi celler behandlas med partiklarna att observera för lipid-shed porösa kisel kärnor i cytoplasman 15.
Den fusogenic pSiNPs och dess sammanfattande protokoll har några begränsningar. För in vitro-nedtystning applikationer, de presenterade fusogenic pSiNPs har visat sig inducera > 90% knockdown effektivitet i en rad olika cellinjer med 100 nM dos; inklusive raden Neuro-2a mus neuroblastom cellen, raden CAOV-3 mänskliga äggstockscancer cell och den notoriskt svårt-att-transfect RAW 264,7 mus makrofag cellinje. Dock har vi observerat > 50% knockdown verkningsgrad vid så låga som 25 nM DOS, som var jämförbar med Lipofectamine. Medan katjoniska lipider måste användas minimalt att minska cytotoxisk effekt, har vi tidigare visat dess säkerhet i lipid dosen så hög som 1 mg15. För Invivo nedtystning applikationer, begränsas de fusogenic pSiNPs av selektivitet. Eftersom de katjoniska lipider locka elektrostatiskt till någon cellmembranet, partiklarna måste användas som en lokal terapeutiska eller vara yta modifierad med en inriktning biexponentiellt (t.ex. peptider, antikroppar, etc.). Syntes protokollet för fusogenic pSiNPs är för närvarande optimerade och begränsade för endast siRNA-leverans. Samma metod har verifierats att framgångsrikt ladda miRNA, och är en hypotes om att kunna ladda mRNA, cDNA och andra större nukleotid-nyttolaster, men dessa har ännu inte optimeras.
Presenterade lämnar ett betydande bidrag till fältet med genterapi. Standard riktmärke för in vitro-nedtystning är den Lipofectamine 2000. Vi har visat att den fusogenic pSiNPs kan framkalla knockdown effekt av jämförbara, om inte högre, effektivitetsvinster15. Den stora fördelen med den fusogenic pSiNPs över Lipofectamine 2000 är dess förmåga att användas för Invivo applikationer med systemisk injektioner. Medan andra medel, såsom Invivofectamine 3.0, har kommersialiserats för Invivo användningsområden, de lämpar sig endast för levern leverans och kräver kemiskt modifierade siRNAs (med eller utan överhäng, eller i låst nukleinsyra (LNA) struktur) att öka stabilitet och specificitet. 16 , 17 , 18 men den fusogenic pSiNPs kan vara modifierade efter syntes till konjugat inriktning beståndsdelarna med enkel thiol-maleimide kemi, vari en tiolgrupp i inriktning peptiden (som bär en extra Cystein för detta ändamål) binder en dubbel-bundna kolet i maleimide ringen i slutet av pegylerat lipider i fusogenic beläggning. Dessutom hög massan lastning och leverans effekt till cellens cytoplasma minimerar behovet av intracellulära specificitet och uppnår starka nedtystning effekt med icke-modifierade siRNAs15. En nackdel med den fusogenic pSiNPs är att protokollet syntes är en flerdagars-process som är mer komplex än kommersiellt tillgängliga transfection agenter. Medan jämförelseindex produkterna måste vara nyberedd före transfection att uppnå bästa resultat, kan den fusogenic pSiNPs dock aliquoted och fryst i minst 30 dagar utan att förringa knockdown effektivitet.
Framtida tillämpningar för den här metoden inkluderar optimering för lastning och leverans av större nukleinsyra payloads, såsom mRNA och cDNAs. Dessutom är leverans av CRISPR/Cas9 protein-sgRNA komplexet, eller en cocktail av Cas9 mRNA och sgRNA, också en utveckling alternativ, eftersom systemet är optimal för lastning anjon nyttolaster. F-pSiNP systemet är sammantaget en modulär nanoplatform för genterapi att behandla sjukdomar utöver infektioner, inklusive infektioner, cancer och autoimmuna sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MJS är en vetenskaplig grundare av Spinnaker biovetenskaper, Inc., och har ett eget intresse i företaget. Även om detta bidrag har identifierats för intressekonflikt förvaltning baserad på den totala omfattningen av projektet och dess potentiella nytta till Spinnaker biovetenskaper, Inc., kan de forskningsresultat som ingår i denna speciella publikation inte nödvändigtvis relatera till barnets Spinnaker biovetenskaper, Inc. Villkoren i detta avtal har granskats och godkänts av University of California, San Diego i enlighet med dess intressekonflikt politik. Andra författare har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health genom kontrakt nr R01 AI132413-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
