Summary
Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri etkili tüp bebek ve içinde vivo Oligonükleotid tesliminde sentezi göstermektedir. Gözenekli Silisyum nano tanecikleri tarafından fusogenic lipidler kabuk oluşturmak için ekstrüzyon ile kaplı çekirdek oluşturmak üzere siRNA ile yüklenir. Hedefleme yan functionalization ve parçacık karakterizasyonu yer almaktadır.
Abstract
Gen tedavisi ve advent ile bir etkili içinde vivo nükleotit yükü gönderim sisteminin geliştirilmesi paralel ithalat haline gelmiştir. Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) son zamanlarda yüksek içinde vivo gen etkinliği nedeniyle yükleme kapasitesi ve endositoz önler benzersiz hücresel alımı yolu onun yüksek Oligonükleotid susturmak gösterdi. F-pSiNPs sentezi içeren çok adımlı bir işlemdir: (1) yükleme ve in silikon gözenekleri; Oligonükleotid payloads mühürleme (2) aynı anda kaplama ve fusogenic lipidler gözenekli Silisyum çekirdek çevresinde boyutlandırma; ve peptidler hedefleme ve aşırı Oligonükleotid, silikon enkaz ve peptid kaldırmak için yıkama (3) oluşun. Parçacığın boyutu tekdüzelik dinamik ışık saçılma ile karakterizedir ve çekirdek-kabuk yapısını iletim elektron mikroskobu tarafından doğrulanmadı. Fusogenic alımını bir lipofilik yükleyerek doğrulanır, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (dıı), fusogenic lipid bilayer boya ve hücrelere plazma zarı karşı boyama için gözlemlemek için tüp bebek tedavisi endositik yerelleştirmeler. Hedefleme ve içinde vivo gen silencing efficacies daha önce Staphylococcus aureus pnömoni, hangi hedefleme peptid enfeksiyon sitesine giriş için F-pSiNPs yardım bekleniyor, bir fare modeli sayısal. S. aureus enfeksiyon kendi uygulamasında, F-pSiNP sistemi hastalıkları, viral enfeksiyonlar, kanser ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere geniş bir gen tedavisi için herhangi bir Oligonükleotid teslim etmek için kullanılabilir.
Introduction
Gen tedavisi tedavi edici bir sonuç elde etmek için belirli bir gen ifade modüle. Gen modülasyon için çok sayıda araç keşfetti ve okudu, oligonucleotides (örneğin, kısa sokan RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 kullanarak ribonükleik asit girişim de dahil olmak üzere (RNAi) ), DNA plazmid5,6, enzimler (örneğin, çinko parmak, TALENS)7,8ve CRISPR/Cas9 sistemleri9,10. Her aracın etki mekanizması farklı olsa da, tüm araçları hücrenin sitoplazma veya aktif olmak için çekirdek ulaşmak gerekir. Bu nedenle, bu araçları gen ekspresyonu tüp bebek oransal olarak önemli etkisi ikna etmek için kanıtlanmış olsa da, içinde vivo etkinliği hücre içi ve hücre dışı engel uğrar. Biyolojik kökenlidir araçlar nedeniyle gerçeğini, düşebilir veya yabancı molekülleri11Kaldır seçeneğine sahipsiniz vücudumuzda birçok enzim ve temizleme sistemleri mevcut. Durumda bile araçları hedef hücre ulaşmak endositoz acı; bir mod, saklar ve aşağılamak veya hücre dışı araçlar sınırdışı asitli mide benzeri veziküller araçlarında yakalar hücresel Alım. Aslında, çalışmalar lipid nano tanecikleri içinden alımı12,1324 h içinde hücrelerden siRNA yaklaşık % 70'i exocytosed macropinocytosis, via endocytosed olduğunu göstermiştir. Kalan siRNA çoğunluğu lizozomal yolu ile bozulmuş ve sonuçta RNAi13,14 potansiyel olarak geçmesi endosomal kaçış elde başlangıçta nano tanecikleri ile hücreye girer siRNA, sadece 1-%2 .
Biz son zamanlarda gözenekli Silisyum nano tanecikleri ve fusogenic lipid kabuk15oluşan bir siRNA yüklenen çekirdek olan fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) geliştirdik. F-pSiNPs diğer geleneksel Oligonükleotid vasıtalarının üzerinde üç büyük avantajları sunmak: (1) bir fusogenic lipid endositoz bypass ve tüm yükü (1-%2 karşı hücreyi sitoplazmada doğrudan teslim parçacıklar sağlayan kaplama endocytosed parçacıklar13,14tarafından elde) (Resim 1); pSiNPs siRNA (2) yüksek toplu yükleme (> 20 wt % 1-15 wt % tarafından geleneksel sistemleri ile karşılaştırıldığında) bir kez (çekirdek parçacıkları lipid kaplama fusogenic alımı ile shed) hangi hızla siRNA; serbest bırakmak içinde sitoplazma aşağılamak15, ve (3) peptid konjugasyon için seçici posta için hedefleme istenen hücre tipleri içinde vivo.
F-pSiNP sistemi önemli gen etkinliğini susturmak göstermiştir (> % 95'in vitro; > % 80'i içinde vivo) ve sonraki tedavi etkisi bir ölümcül fare modeli S. aureus pnömoni; sonuçlarını hangi daha önce15yayınlandı. Ancak, hassas işleme ve ince ayar en iyi duruma getirme düzgün ve istikrarlı nano tanecikleri oluşturmak için F-pSiNP sisteminin karmaşık yapısını gerektirir. Böylece, bu çalışmanın amacı ayrıntılı bir protokol yanı sıra, functionalization, malzemelerin ve çift hedeflenen teslimini güçlü gen susturmak etkisi için kullanılmak üzere F-pSiNPs için en iyi duruma getirme stratejileri sunmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gözenekli Silisyum nano tanecikleri (pSINPs) sentezi
Dikkat: Her zaman hidroflorik asit (HF) ile çalışırken dikkatli olun. Onun güvenlik bilgi formu (SDS) göre tüm güvenlik kılavuzları izleyin, HF içeren herhangi bir kimyasal bir duman başlıklı işlemek ve uygun kişisel koruyucu donanımları (PPE; dış butil eldivenler ile çift eldiven, butil önlük önlük altında yüz ile koruyucu gözlük altında ile kalkan). Bütün üniversiteler ve Ar- Ge laboratuarı kullanım öncesinde HF güvenliği konusunda özel eğitim gerektirir. Burada açıklanmayan ek güvenlik önlemleri gerektiğinden HF ile senin yerel laboratuvar güvenlik koordinatörü ön onayı çalışmak çalışmayın.
-
Gravür çözümleri hazırlanması
- Gravür, (kullanılan adımları 1.3 ve 1.4) 3:1 HF çözüm bir plastik dolgu yapmak için silindir sulu % 48 HF 30 mL ve mutlak etanol (alkol) 10 mL ile mezun oldu. HF cam çözülür gibi çözüm yüksek yoğunluklu plastik (örneğin, HDPE) bulunmalıdır.
- Bir 1:29 yapmak için kalkış (kullanılan adım 1.5), plastik bir dolgu için HF çözüm silindir 1 mL sulu % 48 HF ve mutlak etanol 29 mL ile mezun oldu. HF cam çözülür gibi çözüm yüksek yoğunluklu plastik (örneğin, HDPE) bulunmalıdır.
- 1 M KOH çözüm % 10'luk olun alkol aşırı pSi dağılması (kullanılan adımları 1.3 ve 1.5) için.
-
Etch hücre kurma
- Bir Teflon 8,6 cm hücresiyle etch2 etch de (alan içinde O-ring aşındırma ve A tarafından alan hesaplama için mevcut silikon yüzeyinin çapı ölçerek hesaplanır πr2=), yer (şekil 2a) azalan düzende: (1) Teflon hücre üst; (2) bir O-ring; (3) çeyrek biteviye-in tek kristal (1 0 0) (elmas kesici kullanarak); dört eşit parçaya kesip - odaklı p ++ - tipi silikon gofret (4) alüminyum folyo; ve (5) Teflon hücre vidayla temel hafifçe sıkılır kaçağı önlemek için.
- Kuyu alkol ile doldurun. Bir mendil al ve yarık Bankası ve Teflon hücre üst arasında takabilirsiniz. Silme kaldırma üzerine kuru ise, etch hücre kilitlendi. Islak, hücre sızdırıyor ve sıkın vidaları mühürlü kadar daha.
-
Elektro-parlatma silikon gofret
- Birleştirilmiş etch hücre bir duman hood getir.
- İyi 10 mL 3:1 HF çözeltisi ile doldurun.
- Olumlu kurşun etch hücreden alüminyum folyo (elektrot) bağlanmak ve negatif kurşun devre (şekil 2b) tamamlamak için etch hücre 3:1 HF çözüm batırılır Platin bobin (Counter elektrot) bağlanın.
- Geçerli bir sabit 60 50 mA cm-2 çalıştırın s. Bir kez etch bitti, hücre devre kaldırın ve dikkatli bir şekilde kullanarak 3:1 HF durulayın. Alkol ile üç kez yıkayın.
- Kazınmış katman kuyu doldurarak eritmesi 10 mL 1 m KOH ile yavaş yavaş. Köpüren azalır kadar bekleyin.
- KOH su üç kere ve o zaman alkol üç kez dışarı durulayın.
-
Mamüllerinin gözenekli katmanları silikon gofret aşındırma
- Koşmak bir kare dalga biçimi, bir alternatif akım 0.6 s için 50 mA/cm2 alt current density ve 400 mA/cm2 0,36 için yüksek akım yoğunluğu ile s tekrarlanan 500 devredir.
- Bir kez etch bitti, hücre devre kaldırın ve dikkatli bir şekilde kullanarak 3:1 HF durulayın. Alkol ile üç kez yıkayın.
-
Silikon gofret gözenekli katmandan kaldırma kapalı
- Kuyu 1:29 10 mL ile doldurulması HF çözüm.
- Bir sabit 250 için 3.7 mA/cm2 çalıştırmak s. Bir kez etch bitti, hücre devre kaldırın. PSi katman dekolmanı kristalin silikon gofret üzerinden gösteren görünür dalgalanmalar olabilir. Yavaşça HF çözüm 1:29 yıkama ve alkol üç kez, sonra üç kez suyla durulayın.
- Pipet ucu kullanarak, sıkıca pSi katman tam dekolmanı için çevresi çatlamak. Alkol kullanarak, toplama Teflon üzerinden pSi parçaları (cips) hücre tartı tekneye etch. Fişleri bir cam şişe aktarın. PSi cips alkol içinde oda sıcaklığında 6 ay boyunca Muhafazası için tutulabilir.
- Kalan herhangi bir gözenekli silikon gofret üzerinde iyi doldurarak eritmesi 10 mL 1 m KOH ile yavaş yavaş. Köpüren azalır kadar bekleyin.
- KOH su üç kere ve o zaman alkol üç kez dışarı durulayın.
- Tüm gofret kalınlığı kazınmış 1.3-1.5 tamamlayana dek.
-
Sonicating gözenekli katmanları nanopartikül oluşumu için
- DI su 2 mL alkol üzerinden pSi cips içeren cam şişe solvent değiştirin.
- Sıkıca kapağı kapatın ve parafilm kullanarak kapatın.
- Cam bir sonicator banyosunda şişe ve öyle ki pSi cips hacmi yüzeyden tamamen sular altında askıya bir yer.
- 12 h 35 kHz ve 48W gücünü RF için solüsyon içeren temizleyicide. Sonication sırasında önemli su kaybını önlemek için balonun açılması su banyosu yüzeyine dokunduğundan böylece ters, su volumetric flask yerleştirin.
- Cam şişe altındaki yerleşmek daha büyük partiküller izin vermek 1 h için düz bir yüzeye yerleştirin. Bir pipet kullanarak süpernatant toplamak; süspansiyon alt-100 nm pSiNPs içerir.
2. fusogenic lipid film hazırlanması
-
Lipid hisse senedi çözümleri hazırlanması
- Bir duman başlık, DMPC, DSPE-PEG-MAL ve kloroform DOTAP lipidler nemlendirici lipidler 10 mg/mL stokları olun. Bu hisse senedi çözümler-20 ° C'de 6 ay sıkı parafilm mühür altında tutulabilir.
-
Fusogenic lipid film yapım
Not: Fusogenic kompozisyon lipidler, DMPC, DSPE-PEG ve DOTAP, 76.2:3.8:20 ve 96.2:3.8:0, molar oranı anılan sıraya göre yapılır.- Bir cam şişede pipetting tarafından DMPC, DSPE-PEG 15.16 μL ve DOTAP 19.63 μL 72.55 μL karıştırın.
- İsteğe bağlı: floresan lipid kaplama etiketleme için Ayrıca dıı 20 µL içinde alkol konsantrasyonu 1 mg/mL çözünmüş ekleyin.
- Şişeyi bir duman hood gecede buharlaşır kloroform izin vermek için gevşek bir kap ile yerleştirin. Kuru film bir bulutlu zor jel madde şişe dibinde olacak.
3. yükleme ve pSiNPs siRNA, mühürleme
-
Hisse senedi yükleme Kalsiyum klorür hazırlanması
- 1.11 CaCl gram dissolve2 2 M CaCl2 çözüm yapmak için su RNAse free 10 ml.
- Çözüm > 10.000'santrifüj kapasitesi x g agrega yerleşmek ve bir pipet kullanarak süpernatant toplamak için 1 dakika için. Alternatif olarak, çözüm 0,22 µm filtreden filtre.
-
Hisse senedi yükleme siRNA hazırlanması
- Hidrat veya siRNA RNAse free su 150 µM için sulandırmak. Bu hisse senedi çözüm bölünmemeli olabilir ve verilen bu sık donma-çözülme çevrimleri geçmesi değil en az 30 gün-20 ° C'de donmuş devam etti.
-
PSiNPs Kalsiyum klorür ile siRNA yükleme
- Bir buzlu sonication Banyosu hazırlamak.
- Küçük 15 dk ultrasonication, siRNA yavaşça µL pipet 150 ve 2 M CaCl2 pSiNP 150 µL içine 700 µL. Gaz üretimi için microcentrifuge tüp kapağını açık bıraktığınızdan emin olun.
- SiRNA yüklü kalsiyum kaplı pSiNPs üzerinden sonicator 1 mL içeren tüpü çıkarması.
4. kaplama siRNA yüklü pSiNPs fusogenic lipidler ile
-
Lipozom ekstrüzyon kiti hazırlanması
- Geniş bir ölçek DI su ile doldurun. Emmek 1 polikarbonat membran (200 nm gözenekleri) ve onları su yüzeyinde yüzen tarafından 4 filtre destekler. Üreticinin yönergelerini izleyerek lipozom ekstrüzyon kiti montajı
-
SiRNA yüklü pSiNps lipid filmle nemlendirici
- 3.3.3 adımından elde siRNA yüklü kalsiyum kaplı pSiNPs, 1 mL ile cam şişe kurutulmuş lipid filmde hidrat. Kadar tüm lipidler film şişe altından kaldırdın ve bulutlu bir homojen çözüm karışık pipet.
- Manyetik bir karıştırma çubuğu cam şişede getirin ve şişeyi parçacıklar 40 ° C (veya yukarıda lipidler faz dönüşümü sıcaklık daha akışkan sıvı kristal aşamasında lipidler korumak için yeterince yüksek) ısı sıcak bir tabak üzerine yerleştirin manyetik olarak süre 20 dk için çözüm karıştırma.
-
Boyut kontrolü için lipid kaplı pSiNPs yükseltme
- Ekstrüzyon şırınga çözümde lipid kaplı pSiNP-siRNA 1 mL Aspire edin. Ekstruder bir tarafındaki boş bir şırınga ve diğer ucu dolgulu şırıngayı takın.
- Ekstrüzyon yavaş yavaş parçacıklar--dan bir tenkıye, polikarbonat membran aracılığıyla ve diğer içine itmek için pistonu iterek başlayın. 20 kere tekrar edin. Piston takılırsa, filtre ve membran tıkanmış. Ekstruder sökmeye ve membran ve filtre destekler değiştirin. Sorun devam ederse, tıkanma yönetilebilir olana parçacıklar oranında seyreltin.
- Microcentrifuge tüp içine haddelenmiş parçacıkları toplamak.
5. konjugasyon peptidler hedefleme
-
Lipid kaplama için hedefleme peptid conjugating
- 1 mg/mL ile peptid stok peptid konsantrasyon RNAse free su hazırlamak.
- Fusogenic lipid kaplı pSiNPs içeren microcentrifuge tüpte 1 mg/mL peptid hisse senedi ve damlalıklı 100 µL yavaşça ekleyin. Tüp, oda sıcaklığında 20 dakika (alternatif olarak, > 2 h 4 ° C'de) statik tutun.
- Aşırı peptid veya siRNA ve diğer eksipientleri kaldırmak için 5000 x g 1 h. santrifüj PBS 1 mL aynı ayarı altında ile iki kez daha fazla için 25 ° c de iplik tarafından 30 kDa santrifüj filtre olarak yıkayın.
- Son fusogenic peptid Birleşik pSiNPs lipid kaplı PBS içinde istenen konsantrasyonu resuspend. Parçacıklar şimdi bölünmemeli ve en az 30 gün depolamak için-80 ° C'de donmuş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fusogenic pSiNPs başarılı bir sentezi (şekil 3a) homojen, biraz opak bir çözüm üretmek gerekir. Başarısızlık oranı ve pSiNPs konsantrasyonu en iyi duruma getirmek için: siRNA: CaCl2 (şekil 3b) yükleme üzerine toplama için neden olabilir. Parçacıklar 200 nm membranlar uzatılır, fusogenic pSiNPs DLS tarafından ölçülen ortalama hidrodinamik çapı yaklaşık 200 olmalıdır nm ve şekil 4' te gösterildiği gibi ortalama zeta-potansiyel yaklaşık + 7 mV. Peptidler hedefleme ile yüzey değiştirilmesinden sonra genel çapı küçük 230 olmak artırılmalıdır nm ve ortalama zeta potansiyel azaldı-3.4 aşağı mV15. Ekstrüzyon boyutu geniş herhangi bir sapma başarısız ekstrüzyon göstergesidir (dparçacık >> dekstrüzyon), ya da yükleme başarısız oldu (dparçacık << dekstrüzyon). Toplamalardan aynı zamanda DLS kullanarak sayısal. Ayrıca, bir kez sadece tekrarlanan donma-çözülme lipid membran ve intraparticular füzyon ve toplama (şekil 4) devir bozabilir, donmuş aliquots çözdürülen gerekir. Şekil 4a görüldüğü gibi fusogenic pSiNPs 30 gün süreyle saklanabilir ve yapısal değişiklikler neden olmadan çözdürülen. Ancak, tek bir aliquot donma-çözülme çevrimleri neden şiddetli toplama tekrarlanan (d >> 1000 nm) ve günlük döngüsü (şekil 4b) 4 gün içinde böylece bu parçacıklar tek kullanımlık birimleri için bölünmemeli tavsiye edilir.
Füzyon fusogenic lipidler lipofilik dıı (Adım 2.2.2) ile etiketleme ve confocal mikroskobu kullanılarak tüp bebek yerelleştirme gözlemleyerek teyit edilmesi. Şekil 1 d nerede fusogenic pSiNP'ın lipidler dıı plazma zarı aktarmak ve organellerin bağımsız yerelleştirilmiştir başarılı fusion, gösterir. Başarısız füzyon dıı yerelleştirme hücre sitoplazma ve organellerin (şekil 1 c) ile colocalization içinde gösterir.
Şekil 1: Fusogenic gözenekli Silisyum nanopartikül sistemi (F-pSiNP). (bir) şematik gösteren endositik alımını geleneksel nano tanecikleri ve sonraki endosomal tuzak. (b) şematik gösteren fusogenic alımını F-pSiNPs ve sonraki sitozolik teslim siRNA yük. Dıı lipofilik boya ile yüklenen endocytosed fusogenic sigara pSiNPs olan (c) CAOV 3 Confocal mikroskobik görüntü hücreyi. CAOV-3 hücreleri için % 80 izdiham 6 bir şey plaka, Yetişkin ve nano tanecikleri 10 µL ile tedavi ve % 5 CO2 15 dakika 37 ° C'de inkübe. Hücreleri DAPI bulunan cam slaytlarda takılacak %1 paraformaldehyde sabit, kurutulmuş ve karanlıkta confocal mikroskobu tarafından muayene kadar devam etti. (D) dıı lipofilik boya ile yüklenen fusogenic pSiNPs kadar almış bir CAOV-3 hücre confocal mikroskopik görüntüsü. Hücreleri LysoTracker yeşil ile % 5 CO2 üreticinin yönergelerine uygun olarak 37 ° C'de 1 h için önceden lekeli. Hücreler sonra PBS üç kez yıkanmış ve 15 dakika dıı yüklü parçacıkların 10 μL ile tedavi edildi. Hücreleri PBS ile üç kez yukarı alınmamıştır herhangi bir parçacıkları kaldırmak için yıkanmış ve wells PBS 1 mL ile dolu ve hemen canlı hücre görüntüleme için confocal mikroskobu tarafından alınan; DAPI nükleer leke ve lizozomal LysoTracker Green tarafından boyama Lysosome temsil eder; Ölçek çubuğu temsil eden 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre Kur Etch. (bir) şematik gösteren etch hücre bileşenleri ve derleme sırası; ve (b) diyagramı kurulum için silikon elektrokimyasal Dağlama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: son F-pSiNP ürün fotoğrafı. homojen ve bulutlu bir çözüm gösterilen (bir) başarılı sentez; (b) başarısız sentez toplama parçacıkların (sarı) gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: fusogenic pSiNPs tekrar tekrar donma-çözülme döngüsü neden toplama. (bir) ortalama boyutu ve zeta-fusogenic pSiNPs potansiyelini sonrası buz gibi bir kez çözdürülen zaman 30 gün boyunca sabit kalır; (b) ortalama boyutunu ve zeta-fusogenic pSiNPs potansiyelini gösterir toplama belirtileri ve yapısal bütünlüğü kaybı günlük donma-çözülme çevrimleri geçiyor sonra 4 gün içinde. Hata çubukları temsil eden standart sapma (n = 5). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: diyagramı gözenekli Silisyum nanoparçacık sentezi. Silikon gofret (Adım 1.4), kalkış gözenekli katmanın (Adım 1.5), parçacıklar gözenekli katmanına sonication ve gözenekli Silisyum nano tanecikleri (Adım 1.6) toplanması, elektrokimyasal gravür gösterilen şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gözenekli Silisyum nano tanecikleri sentezi şekil 5' te gösterilen. Fusogenic pSiNPs sentezi kritik adımda yükleme adım (Adım 3) var. Fusogenic nano tanecikleri toplayarak Eğer sonrası sentezi (şekil 3), nedeni aşağıdaki nedeniyle olabilir: (1) Kalsiyum klorür stok rastlanılmaması hazırlanan değil, böylece adım 3.1.2 olmalı dikkatle takip veya rafine; veya (2) pSiNP oranı: siRNA: CaCl2 veya bir veya daha fazla üç bileşeni konsantrasyonu en uygun olmayabilir. Yeniden optimizasyonu CaCl2 konsantrasyon başlayan önerilen (örneğin, 2 M 1 M ve 3 M için değiştirme). Ayrıca, aynı kimyasal farklı satıcılardan daha düşük pH yükleme adım ve siRNA yükleme sonraki hatası sonuçlandı bulduk gibi CaCl2 aynı satıcıdan olduğundan emin olmak önemlidir. PSiNPs Ayrıca, seyreltilmiş veya daha fazla yükleme işlemi önce bozulmuş RNAse free suda 2 gün sonra adım 1.6.6 için askıya parçacıklar bırakarak konsantre.
Sonrası yükleme, sık sık kaplama lipid ekstrüzyon konsantrasyon veya parçacıklar (Adım 4) yoğunluğu nedeniyle zorluk yol açar. Ekstrüzyon membran tıkanmış, ekstrüzyon zorlama membran rip. Tıkanma, üzerine Ekstruder sökmeye ve tıkanma kaybı küçük ise membran ve destekleri ile yeni bir küme değiştirin. Kaybı büyük ise, parçacık süspansiyon sulandırmak ve ekstrüzyon için 30 s rahip için solüsyon içeren temizleyicide. Sorun devam ederse, yeniden en iyi duruma getirme, pSiNP boyut ve yükleme oranı toplamları en aza indirmek için tavsiye edilir. Son olarak, biz süzme parçacık süspansiyon herhangi bir kirletici maddeleri veya toplamları hücre veya hayvan tedavi önce ortadan kaldırmak için 0,22 µm gözenek filtre yoluyla öneririz. Filtreleme özellikle tavsiye parçacıklar sentezlenmiş non-steril ortamlarda veya donmuş bir aliquot parçacıkların çözdürme sonra.
Parçacıkların fusogenicity confocal mikroskobu ( şekil 1 c, dgösterildiği gibi) ve transmisyon elektron mikroskobu lipid-shed gözenekli Silisyum çekirdek için sitoplazmada gözlemlemek için parçacıkları ile tedavi hücre tarafından doğrulanması 15.
Fusogenic pSiNPs ve onun sentez Protokolü bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Tüp Bebek gene uygulamaları susturmak için sunulan fusogenic pSiNPs ikna etmek için kanıtlanmış > % 90'ı devirme verimliliği bir dizi hücre hatları 100 nM doz; Nöro-2a fare Nöroblastom hücre kültürünü, CAOV-3 insan yumurtalık kanseri hücre satır ve ham 264.7 fare makrofaj Rootkitler zor-için-transfect hücre satırı da dahil olmak üzere. Ancak, biz gözlemledim > % 50 devirme verimlilikle Lipofectamine karşılaştırılabilir 25 nM doz olarak düşük. Katyonik lipidler sitotoksik etkisini azaltmak için en az kullanılması gerekir iken, daha önce bir lipid doz 1 mg15olarak yüksek onun güvenliği göstermiştir. İçinde vivo gene uygulamaları susturmak için fusogenic pSiNPs tarafından seçicilik sınırlıdır. Katyonik lipidler Elektrostatik herhangi bir hücre zarı çekmek gibi parçacıklar tedavi yerel kullanılması gerekir veya hedefleme yan (örneğin, peptidler, antikor, vb) değiştiren yüzeyi. Fusogenic pSiNPs için sentez iletişim kuralı şu anda en iyi duruma getirilmiş ve siRNA teslimat için sınırlı. Aynı yöntemi başarıyla miRNA yüklemek için doğrulandı ve mRNA, cDNA ve diğer büyük nükleotit payloads yüklemek edebilmek için olan, ancak bunlar henüz optimize edilmiş olması gerekir.
Sunulan iş gen tedavisi alan önemli bir katkı yapar. Tüp Bebek gen susturulması için standart kriter Lipofectamine 2000'dir. Biz eğer değil yüksek verimliliği15fusogenic pSiNPs karşılaştırılabilir, devirme etkisi neden olabilir göstermiştir. Fusogenic pSiNPs en büyük avantajı Lipofectamine 2000 üzerinden sistemik enjeksiyonları ile içinde vivo uygulamalarda kullanılmak üzere kendi yeteneğidir. Diğer ajanlar, Invivofectamine 3.0 gibi içinde vivo anlamları için ticari iken, onlar sadece karaciğer teslimat için uygundur ve artırmak için kimyasal olarak değiştirilmiş çift (ile ya da çıkıntılar olmadan veya kilitli nükleik asit (LNA) yapısında) gerektirir istikrar ve özgüllüğü. 16 , 17 , 18 fusogenic pSiNPs ancak, basit thiol-maleimide kimya, neyin (ki bu amaç için ilave bir sistein taşır) hedefleme peptid thiol grubunda bağlar ile hedefleme moieties çekimlerine modifiye sonrası sentez olabilir bir karbon çift bağ fusogenic kaplama pegile lipidler sonundaki maleimide ringde. Ayrıca, yüksek toplu yükleme ve teslim etkinliği için hücre sitoplazma hücre içi özgüllük için gerekliliğini en aza indirir ve güçlü gen etkisi olmayan değiştirilmiş çift15ile susturmak attains. Fusogenic pSiNPs bir dezavantajı sentez Protokolü piyasada bulunan transfection ajanlar daha karmaşık bir günden fazla süren süreç olmasıdır. Kıyaslama ürünleri taze transfection önce en iyi sonuçları elde etmek için hazır olmalıdır, ancak, fusogenic pSiNPs en az 30 gün boyunca devirme verimliliği azalan olmadan bölünmemeli ve donmuş olabilir.
Bu yöntem için gelecekteki uygulamalar yükleme ve mRNA'ların ve cDNAs gibi büyük nükleik asit payloads teslimatı için optimizasyon içerir. Sistem Anyonik payloads yüklemek için en uygun olduğu gibi Ayrıca, CRISPR/Cas9 protein-sgRNA kompleksi teslimini veya Cas9 mRNA ve sgRNA, bir kokteyl da bir geliştirme, seçenektir. Genel olarak, F-pSiNP ötesinde enfeksiyonlar, viral enfeksiyonlar, kanser ve otoimmün hastalıklar gibi hastalıkları tedavi etmek gen tedavisi için modüler bir nanoplatform sistemidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MJS Spinnaker Biosciences, Inc, bir bilimsel kurucusudur ve bir şirketin hisse senedi ilgi vardır. Her ne kadar bu hibe proje ve onun potansiyel fayda sağlayacak Spinnaker Biosciences, A.ş., genel kapsam göre çıkar çatışması yönetimi için tanımlanan belirli Bu yayında dahil araştırma bulguları ille olabilir Balon Yelken Biosciences, Inc ilgi alanları arasında bir ilişki Bu düzenleme koşulları incelenmeli ve University of California, San Diego, çıkar çatışması politikası doğrultusunda tarafından onaylanmalıdır. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri ile tarafından desteklenen sözleşme # R01 AI132413-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
