Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מינהל הארגון הישיר כדי לשפר את הסוכן הסלקטיבי התצהיר בתוך הריאה של העכבר

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59450
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Summary

Intratracheal (IT) המינהל של סוכנים ניסיוניים בעכברים לעתים קרובות מביא משלוח אסימטרי הריאות המרוחק.  בדוח זה, אנו מתארים גישה ישירה בלתי-מרורונצ'יאל (ליברות) כדי לאגור כל ריאה בעכברים חיים שאינם מבצעית.  גישה זו יכולה לשמש באופן סלקטיבי לניהול סוכנים לריאה אחת או להתאים כדי לשפר את מסירת הסוכן הסימטרי לשתי הריאות.

Abstract

Intratracheal (IT) המינהל של סוכנים ניסיוניים היא טכניקה חיונית במודלים murine של מחלות ריאות מפוזר, כגון פיברוזיס ריאתי ליאומיצין.  עם זאת, הפצה של סוכנים מנוהל intratracheally לריאות העכבר הקטן הוא אסימטרי לעתים קרובות, עם הריכוזים של הריאה בתוך הריאות הגדילה את הריאה הקטנה (אבל נגיש באותה מידה) שמאל של העכבר.  המתואר בדו ח זה הוא הרומן הבלתי מטרורוציאל (ליברות) הגישה לצינורית השמאלית ו/או הימנית של עכברים חיים שאינם מבצעית.  הוא גם הוכיח כיצד גישה זו יכולה לשמש לניהול באופן סלקטיבי סוכנים לריאה אחת או מותאם (באמצעות משלוח מותאם מינון מסירה) כדי לשפר את הסימטריה הימנית השמאלית של משלוח הריאות של סוכני ניסיוני, ובכך לשפר את המודלים של לפזר מחלות ריאות כגון פיברוזיס של הריאות ליאומיצין המושרה.

Introduction

מינהל ריאתי ישיר של סוכני ניסיוני בעכברים מאפשר לימוד של תגובות החיסון לריאות, פציעה בריאה חריפה, פיברוזיס ריאות. מינהל ריאתי ישיר מבוצע בדרך כלל באמצעות intratracheal (זה), כמתואר בעבר1,2,3. עם זאת, גישה זו אינה סלקטיבית, להשפיע על שתי הריאות בצורה לא ממוקדת לעתים קרובות אסימטרית.  מידול ניסיוני של פגיעה בריאה עשוי להועיל מהיכולת באופן סלקטיבי היעד ריאה ספציפית אחת, ומאפשר להשתמש בריאה הצלעות בתור שליטה. לעומת זאת, דוגמנות מדויקת של מחלות ריאה מפוזר האדם היתרונות של התפלגות סימטרית של סוכני ניסיוני על הריאה הדו כימומה.

המטרה הכוללת של דו ח זה היא לתאר שיטה למסירה סלקטיבית של סוכנים ניסיוניים לריאה השמאלית או הימנית של העכבר (איור 1). הגישה הזאת לניהול הארגון מאפשרת טיפול חד צדדי בריאות העכבר וניתן להתאים בקלות כדי להבטיח משלוח שווה של סוכן לברוצ הגזע הדו. על-ידי שימוש בניהול ה-, כדי לספק מינונים גדולים יותר של סוכני ניסוי לריאה הימנית הגדולה יותר ולאמצעי אחסון קטנים יותר לריאה השמאלית הקטנה יותר (כלומר, מנהל מינון מותאם במינון), הפגינו בדו ח זה שיפור בהומוגניות של הריאות משלוח של סוכני ניסיוני, אופטימיזציה של המודל של פגיעה ריאה מפוזר בעכברים. ככזה, דו ח זה עשוי להכיל ערך לחוקרים המבקשים לנהל באופן חד-צדדי סוכנים ניסיוניים לעכברים או לשפר את הסימטריה של התצהיר בשתי הריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו דנבר טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה להשתמש (IACUC). כל ההליכים המתוארים להלן (סעיפים 4 – 7) כבר ממוטבים באמצעות זכר ונקבה C57BL/6 עכברים. גישה זו אומתה באמצעות עכברים הנע בין 19 – 40 g במשקל הגוף.

1. יצירת פלטפורמה לניהול המערכת

  1. כופפו את המטרה מזווית 90 המקורית בין הכנף הבזוית לכנף העמידה 70 ° (איור 2A).
  2. קדוח חור במרכז העליון של הכנף העמידה של קצה המתכת (איור 2A).
  3. מקדחה חור בגודל זהה במיקום המקביל של לוח פלסטיק. מקדחה שני חורים קטנים יותר מפורטים (איור 2A).
  4. לעטוף את תפר המשי 4:0 בין החורים הקטנים האלה בלוח הפלסטיק (איור 2A).
  5. הצב את הקרס ואת סרט הלולאה בקצה לוח הפלסטיק (איור 2A).
  6. הכנס את לוח הפלסטיק לסוף המתכת עם הבורג (איור 2B). ודא שהבורג-אגוז מתוח מספיק כדי להחזיק את הלוח במקומו תוך מתן התאמה של זווית, במידת הצורך.
  7. הקפידו שסיבוב של לוח הפלסטיק יהיה בכיוון השעון ונגד כיוון השעון.
    הערה: תנועה בכיוון השעון מיוצגת בדוח זה כסיבוב מדרגה, וכנגד כיוון השעון מיוצגת כסיבוב מדרגה (-).
  8. להשתמש בזווית מד למקם את לוח פלסטיק ב + 30 °, + 86 °,-30 °, ו-74 ° ולסמן אותם על הקצה, בהתאמה.

2. יצירת קטטרים מורחבות למינהל הסוכנים

  1. להפוך זווית ימין לחתוך עם להב חדה על קצה המקורי 22 גרם הצנתר (25 מ"מ, ראה טבלת חומרים) (איור 3, שלב 1a).
  2. שיקוע (~ 50 ° – 60 °) קצה הצנתר המקורי השני (25 מ"מ) עם הלהב, ולאחר מכן לגזור בזווית הנכונה מן הרכזת (איור 3, שלב 1b).
  3. הדבק את שני הקטטרים בקצוות קהה עם זווית קצת פחות מ 180 ° (איור 3, שלב 2).
  4. קהה את הטיפ משופע על ידי התכה עם החום נמוך הזנב (ראה שולחן חומרים).
  5. פולנית קטטר מורחב עם "0" גודל נייר זכוכית על האזור המודבק ואת קצה משופע של קטטר מורחב (איור 3, שלב 3).
  6. סמן על קטטר מורחב עם צבעים שונים ב 25 מ"מ, 30 מ"מ, ו 35 מ"מ (איור 3, שלב 3).
  7. לציין את הצד המשופעת של הקטטר המורחבת על ידי תיוג הרכזת שלה עם סמן.
  8. לשטוף את הקטטר המורחבת עם מים DI, בעקבות שטיפה בתוך הקטטר עם 70% אתנול. . לייבש את הצנתר
  9. לחטא עם אור UV עבור 10 דקות לפני השימוש.

3. הכנה לפני הליך

  1. הפוך את כל סוכני מנוהל במכסה בטיחות ביולוגית תחת טכניקה סטרילית.
  2. לנקות את מקום העבודה עם 70% אתנול.
  3. לחטא את כל כלי הניתוח עם 70% אתנול.
  4. לתקן את הבסיס של פלטפורמת העבודה על הספסל מיד מול החוקר על ידי דבקת C-התפסים לכנף הבסיס של הסוף.
  5. צור מספר מטרים זמניים, שהם התקנים שיאפשרו זיהוי של זרימת אוויר גאות בעכברים. בקצרה, הפקדה 60 μL של תמיסת מלח מעוקר לתוך מזרק 1 מ ל (בבוכנה הוסר) עם טיפ הטעינה ג'ל.
    הערה: ירידה מלוחים של מלין לאוטם את החבית נע כלפי מעלה כלפי מטה כאשר נחשף אוורור גאות3.
  6. לצרף באופן רופף את הרכזת של הצנתר 22 גרם מורחב לספימטר מאולתר.
  7. מניחים כל אחד מכלי הזכוכית לכל צד של הפלטפורמה כדי להקל על הגישה.
  8. חבר את החדר האינדוקציה isof, למכונה הרדמה מכרסם (ראה שולחן חומרים) בארון ביטחון ביולוגי התואם isofלאנה.

4. גישה באמצעות צנרור IT שאינה אופרטיבית

  1. מורדם C57BL/6 העכבר (זכר או נקבה, 8 – 10 שבועות, ~ 25 גרם) עם חמצן (2 L/דקות) ו 5% isofלכאן (ראה טבלת חומרים) בחדר אינדוקציה עבור 4 דקות.
  2. מנושף את הסוכן הניסיוני כדי להישלח (למשל, לצבוע אוונס כחול או FITC-dextran, כפי שמתואר באיור 4) לשני פיפטות, ואז למקם אותם לכל צד של הפלטפורמה במהלך הרגעה.
  3. ודא שקצב הנשימה של כ -24 – 30 נשימות/דקות לפני הסרת העכבר מחדר אינדוקציה ההרדמה.
    הערה: הרדמה Isofלוריאן בדרך כלל נמשך 4 דקות, מספיק עבור כל הליכי ליברות. אם המפעיל אינו מיומן עם הטכניקה, קטמין/xylazine (80 מ"ג/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג intraperitoneally, ראה טבלת חומרים) ניתן להשתמש להרדמה ממושכת יותר.
  4. להשעות את העכבר על ידי חותכות על קו תפר עטוף במצב פרקדן. לאבטח את העכבר עם שניים עד שלוש פיסות וו לולאה הסרט באופן רופף, הימנעות הגבלה של אוורור.
  5. הפעל את מאייר סיבים אופטיים LED (ראה טבלת חומרים, איור 2c).
  6. הצב את האופרטור מאחורי הפלטפורמה (מאחור לעכבר).
  7. כוון את הגוסנאק של המאיר כך שהוא מאיר את אזור הגרון דרך העור. המרחק בין העכבר למקור האור הוא 2 – 3 ס מ (איור 2C).
  8. לאשר את עומק ההרדמה עם צביטה בבוהן/כפה לפני ביצוע כל ההליכים להלן.
  9. להחזיק את מלקחיים סטרילי עם היד הדומיננטית, ואז לצייר את הלשון מתוך חלל הפה עם מלקחיים.
  10. החזיקו את הדיכאון הסטרילי או עם היד הלא-דומיננטית, ולאחר מכן שטחו את השורש של הלשון עם המקלות או כדי לחשוף את הoropharynx במידה רבה. לאחר מכן ניתן לשחרר את הלקחיים, לשחרר את היד הדומיננטית.
  11. השתמש ביד דומיננטי כדי לצנרור את הצנתר המורחב לתוך קנה הנשימה דרך חלל הפה (איור 2c).
  12. לאשר את המיקום על ידי התבוננות אם הבועה במזרק נע למעלה ולמטה עם כל נשימה.
  13. פרטים נוספים של צנרור IT פורסמו בעבר3. סה כ זמן ההליך, למעט הרדמה, נמשך 10-15 s עבור אופרטור מיומן היטב.

5. גישה לצנרור וגישות מסירה שאינן פעילות

  1. גישה ל-ליברות בעזרת צינורית לוורת בריאה הצודקת ביותר
    1. לאחר ביצוע צינורית ה-IT (שלב 4.11), סובב את לוח הפלסטיק + 30 ° (איור 4A).
    2. להחזיק את הרכזת של הצנתר ולהנחות אותו באופן טבעי במקביל לעכבר האמצע קו, הרחבת אותו משקל מבוסס במעמקי כמתואר בטבלה 1.
      הערה: יש לציין את ההתנגדות במעמקים. בשלב זה, העכבר יהפוך מעט התחנומית, כפי שהוסבר בתוצאות הנציג. עבור מפעיל מנוסה, כ-90% מהניסיונות בהצלחה לסדר את הריאה הימנית (באמצעות שגיאה מציינת).
    3. לספק 20 μL של 0.3% הצבע הכחול של אוונס (EBD, ראה טבלת חומרים) עם טיפ טעינת ג'ל.
    4. מוותר 1 – 2 הבליטים (0.1 mL כל אחד) של אוויר באמצעות טפטפת זכוכית.
      הערה: הדבר מבטיח אישור של פתרון EBD שיורית (או סוכנים ניסיוניים) מתוך הקטטר.
    5. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר 30 s.
    6. הנח את החיה על שמיכה מחממת עד שתחזור להכרה. השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.
  2. הגישה לכלי לצינורית סלנטלית סלקטיבית של הריאה השמאלית המרוחק
    1. לאחר ביצוע צינורית ה-IT (שלב 4.11), סובב את לוח הפלסטיק-74 ° (איור 4B).
    2. להחזיק את הרכזת של הקטטר ולהחיל לחץ עדין כדי לקדם את הקטטר לתוך הסמפון השמאלי גזע מימין, תוך הצבת לחץ צנוע הן כלפי מטה (90 °) ולקראת הקצה. בעומק המצוין בטבלה 1, על המפעיל לשים לב להתנגדות כאשר החלקים הנמוכים יותר של הריאה השמאלית מאורסים. אם המצב מתרחש, למשוך את הקטטר אל המיקום 20-25 מ"מ, ולנסות שוב.
    3. לאחר קבלת מקטעי הריאה השמאלית התחתונה, שינוי בעמדה נדרש כדי לאפשר סיוע כבידה עבור מינהל הסוכנים. סובב את לוח הפלסטיק 30 ° (איור 4B).
    4. ספק 40 μL של 0.3% EBD עם קצה הטעינה ג'ל.
      הערה: ניתן לספק נפח גדול יותר של סוכן כי הריאה השמאלית יש רק אונה אחת.
    5. מוותר 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות הזכוכית מטפטפת.
      הערה: הדבר מבטיח אישור של כל שרידי EBD (או סוכנים ניסיוניים) מתוך הקטטר.
    6. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר 30 s.
    7. הנח את החיה על שמיכה מחממת עד שתחזור להכרה. השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.
  3. הסתגלות של מינהל ליברות כדי לאפשר אספקת סוכן לשלמותו או לריאה שמאל או ימין
    הערה: אם המפעיל מבקש לספק סוכנים לא לאונה ריאה מסוימת או מקטע ריאה שמאל, אלא על הריאה כולה (מימין או שמאל ריאה), הקטטר צריך להיות מעט מסוגר על הברוצ גזע המתאים, כדלקמן.
    1. מינהל הריאות כולו
      1. לאחר שלב 4.11, לסובב את הלוח פלסטיק + 30 ° (איור 5A).
      2. להחזיק את הרכזת של הקטטר ולהנחות אותו באופן טבעי במקביל לעכבר האמצע קו, להגיע אליו במעמקי הצורך הימני הצדדי הצינורית (שולחן 1).
      3. אשר את הופעת. סימן הנשימה
      4. לסובב את העכבר-74 ° כדי לאפשר סיוע הכבידה עבור משלוח הסוכן (איור 5B).
      5. למשוך את הצנתר למצב המתאים להמראה של ברופון הגזע הימני (שולחן 1). ודא כי שיקוע של הקטטר פונה כלפי מטה (איור 5B).
      6. לספק 30 μL של 0.3% EBD עם ג'ל טעינת טיפ לריאה הימנית.
      7. מדבקות 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות טפטפת זכוכית.
      8. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר עבור 30 s. מניחים את החיה על שמיכה. מחממת עד שתחזור להכרה השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.
    2. מינהל הריאות השמאלי
      1. לאחר שלב 4.11, לסובב את לוח הפלסטיק-74 ° (איור 6A). לחילופין, הסיבוב עלול להתרחש לאחר שלב 5.3.1.8 על ידי נסיגה הקטטר לקנה הנשימה, המאפשר לניהול הסוכן הדו.
      2. להחזיק את הרכזת של קטטר ולהחיל לחץ עדין כדי לקדם את הקטטר לתוך קטטר גזע שמאל, תוך הצבת לחץ צנוע הן כלפי מטה (90 °) ולקראת הקצה. עומק של צנרור מונחה על-ידי שולחן 1.
      3. . אשר את סימן הנשימה
      4. לסובב את העכבר + 86 ° כדי לאפשר סיוע כבידה עם מינהל הסוכן.
      5. למשוך את הקטטר אל הברופון השמאלי הגבעול (באותו מרחקים כמו הריאה הימנית מספיקים, שולחן 1) ולסובב את השיקוע של הקטטר פונה כלפי מטה (איור 6b).
      6. לספק 30 μL של 0.3% EBD עם ג'ל טעינת טיפ לריאה שמאל.
      7. מדבקות 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות טפטפת זכוכית.
      8. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר עבור 30 s. מניחים את החיה על שמיכה. מחממת עד שתחזור להכרה השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.

6. שימוש בגישות של הצינורית הרציפה לאספקת אמצעי אחסון מנוכי מינון של סוכן לכל ריאה

  1. קבוצת מינהל IT
    1. בצעו צינורית IT כמתואר בצעדים 4.1 – 4.11.
    2. ספק 60 μL של 0.05% FITC-dextran (ראה טבלת חומרים) עם קצה העמסה ג'ל (איור 1b).
    3. מוותר 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות הזכוכית מטפטפת.
    4. לשמור על המיקום של 60 s ולאפשר שחזור העכבר כמתואר לעיל.
  2. מנהל ליברות דו-ממדי סימטרי
    1. בצע שלבים 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (ריאה ימנית) ושלבים 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (ריאה שמאל).
    2. ניהול אמצעי אחסון שווים (30 μL) של 0.05% FITC-dextran (או סוכן ניסיוני) לכל צד של הריאה.
  3. מינהל ליברות
    1. בצע שלב 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (ריאה ימנית) ושלבים 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (ריאה שמאל).
    2. ניהול נפח גדול יותר (40 μL) של 0.05% FITC-dextran לריאה הימנית הגדולה יותר, ואמצעי אחסון קטן יותר (20 μL) של 0.05% FITC-dextran לריאה השמאלית הקטנה יותר. במקום FITC-dextran, סוכן ניסיוני יכול להינתן.

7. השימוש במינון מותאם לניהול ליברות כדי לשפר את הסימטריה של ליאומיצין מנה אחת (BLM)-פציעת ריאה הנגרמת

  1. קבוצות ניהול של BLM
    1. מינון-ליברות-BLM (1.2 מ"ג/ק"ג, ראה טבלת חומרים) קבוצת הניהול: 60 μl (20 μl עבור ריאה שמאל ו40 μl עבור הריאה הימנית, בהתאמה) של פתרון blm נמסרו עכברים (n = 5). פקדים (n = 5) קיבלו כמויות דומות של תמיסת מלח.
      הערה: עיין בשלבים 5.3.1 ו-5.3.2.
    2. קבוצת מינהל IT: 60 μL של פתרון BLM נמסרו לעכברים עם טכניקות ניהול ה-IT.
      הערה: עיין בצעדים 6.1.1 – 6.1.4.
  2. מדידת תפקודי ריאה
    1. ביום 21 לאחר BLM או תמיסת מלח, עכברים מורדם עם הזרקת הצפק (IP) הזרקה של קטמין (160 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (32 מ"ג/ק"ג).
    2. לאחר שתאשר עומק של הרדמה על ידי צביטה/הבוהן, לבצע הקנה הנשימה עם הצינורית 18 G (ראה טבלת חומרים).
    3. לחבר עכברים למכונת ההנשמה ולמדוד מכניקת הנשימה כפי שתוארה בעבר4.
  3. איסוף ועיבוד רקמות ריאות
    1. לאחר המדידה של מכניקת הריאות, המתת החסד של העכברים המכאניקה על ידי ניקוב לב.
    2. תפתח את קיר החזה ותגרום. לדו-הינע הפנאומטי
    3. מנפח את הריאות עם 1% להמיס ממיסים נמוך (40 ° c)5 ב PBS בלחץ עקבי (42 ס"מ H2O).
    4. חותכים ארבע עד חמש חתיכות של הריאה לאורך הציר הארוך, לתקן 10% פורמאלין, ולהטביע פרפין.
    5. גזור 5 יקרומטר סעיפים וכתם עם trichrome של מאסנה כדי להמחיש את התצהיר קולגן.

8 לאחר טיפול פרוצדורלי

  1. בסוף הליכי ההישרדות, הנח את החיה על שמיכה מחממת עד שתחזור להכרה. השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צנרור בררני מטרות האונות הספציפיות (הריאה הימנית) או מקטעי בזיאר (שמאל ריאה).

מינהל ה-ליברות של EBD לריאה הימנית בוצע כמתואר בסעיף 5.1. לאחר סיום הניסוי, היו לעכברים מנה קטלנית של קטמין/xylazine, והריאות נקצרו להדגמה של התפלגות EBD (איור 4A, ימין). הופעתו הגולמית של הריאה ממחישה כי 90% מהניסיונות מקנידים את האונה האחורי הקטנה של הריאה הימנית, ואילו 10% מהניסיונות מיועדים לאונה הנחותה. זה מעריך כי הכרכים הקטנים של האונות האלה מסביר את מילוי הפיצוי של העכבר במהלך הצינורית הקצרה (כדי לשמור על אוורור הדקה דרך הקטטר).

מינהל ה-ליברות של EBD לריאה השמאלית בוצע כמתואר בסעיף 5.2. 100% מהניסיונות מכוונים לחלקים הנחותים של הריאה השמאלית (איור 4B). בניגוד לצנרור הימני, לא מתרחשת התחניאה אף היא עם מעורבות זו, המשקף צנרור (ואוורור) של מקטעי הריאה השמאליים הגדולים יותר.

הסתגלות של טכניקת הצינורית הסלקטיבית של ליברות יכולה לכוון את הריאה השמאלית או הימנית כולה.

לאחר ביצוע צינורית ה-ליברות, הנסיגה של הקטטר ליברות (ושינויים במיקום העכבר, כפי שמפורט בסעיף 5.3) ניתן להשתמש כדי לשפר את אספקת הסוכנים לכל האונות של הריאה הימנית (וכל חלקי הריאה השמאלית). הסטיזילציה של פתרון EBD לריאה הימנית (סעיף 5.3.1) ממוקד בהצלחה את כל האונות הנכון, כפי שמתואר באיור 5C. הסטיזילציה של פתרון EBD לריאה השמאלית (סעיף 5.3.2) מוצלח ממוקד כל הקטעים השמאליים (איור 6C).

IT מינהל או מינהל ליברות סימטרי מניב ריאה אסימטרית ריכוזי הסוכנים של התחנה, שניתן לתקנו באמצעות התאמת מינון ליברות.

עכברים עברו הממשל הדו צדדי של 30 μL של 0.05% FITC-dextran לריאות שמאל 30 μL של 0.05% FITC-dextran לריאה הימנית כפי שמתואר בסעיף 6.2. לחילופין, עכברים קיבלו 60 μL של 0.05% FITC-dextran intratracheally לפי סעיף 6.1. בסוף הניסוי, עכברים מורדמים באמצעות מנת יתר של הרדמה מסוף (קטמין/xylazine). הריאות נקצרו מיד. והומוגניים FITC-פלואורסצנטית (ככמת על ידי צפיפות אופטית) נמדד עם 96-ובכן קורא צלחת. התאריך נותח עם מבחן t של סטודנט עבור השוואות של שתי קבוצות.

כפי שמפורט באיור 7, הן ה-IT (איור 7a) ו-מינהל ליברות סימטרי (איור 7a) של fitc-dextran הובילו ל-פלואורסצנט של הריאה האסימטרית של fitchymal, עם ריכוזים יחסית גבוהים יותר (מנורמל למשקל) שצוין ב . הריאה השמאלית זה מציע כי משלוח ריאה אסימטרית של סוכני ניסיוני לאחר ממשל IT אינה תוצאה של הצגת אסימטרי של סוכני אלה על כל מסמפון גזע ראשי. ליתר דיוק, היה זה שיערו כי שווה משלוח הגזע הראשי (כפי שהוא מובטחת על ידי מינהל ליברות סימטרי) היה מדולל על ידי הבדלים משקולות הריאות/המסה, כפי שנצפתה בטבלה 2.

כדי להתגבר על הבדלים אלה במסירה סימטרית, 40 μL של 0.05% FITC-dextran היה מנוהל לריאות ימין גדול יותר 20 μL לריאות שמאל קטן יותר, כמו לכל סעיף 6.3. מינהל ה-ליברות מותאם למינון "שיפר את הסימטריה של משלוח סוכן הריאות של הריאה (איור 8A). למרות תיקון זה, לעומת זאת, הבחנו טרוגניות עיקשת בתוך אונות שונות של הריאה הימנית (איור 8B).

פציעת ריאה מושרה בלמ במערכות משלוח שונות:

כדי להדגים את הטיפול במינון מותאם מינון של סוכני ניסיוני יכול לשפר את הדוגמנות של מחלת ריאות מפוזר, הצלחנו BLM (מודל העכבר של פציעה בריאות פיברוסינג) או באמצעות מינון מותאם למתן ליברות, לפי מקטע 7. כצפוי עם מודל זה של פציעה, הן הזרקת IT ו-ליברות של BLM הובילה לפגיעה בריאות ומחלות מערכתיות (עם אובדן משקל). מחלה מערכתית זו נפתרה ב -7 ימים. תמותת הימים הייתה 20% (1/5) בקבוצת ה-IT ו -0% (0/5) בקבוצת ה-IT המותאמת למינון.

21 ימים לאחר IT-או ליברות-BLM הממשל, העכברים נקצרו עבור היסטולוגיה ריאות. כפי שמתואר בתמונות היסטולוגית ייצוגית (איור 9A),

כדי לקבוע אם ההומוגניות המשופרת הימנית הזאת של פציעת הריאות הפיברוטית הינה רלוונטית בצורה פיזיולוגית, היא נצפתה שניהול מינון המינון של BLM הקנה אובדן עקבי יותר של קיבולת inspiratory (IC) ותאימות מערכת הנשימה (Crs), כמו גם גידול בconcordant של מערכת הנשימה elastance (מגזרי) (איור 9B).

Figure 1
איור 1: אנטומיה של צינורית דרכי הנשימה של העכבר. (א) הטלת נתיב האוויר של העכבר נעשתה על ידי מנפח את הריאה של העכבר (שנקטפו מ 25 גרם עכבר) עם אלסטומר סיליקון. (ב) קטטר מיקום עבור מינהל IT סטנדרטי. (ג) צנתר מיקום עבור מינהל ה-ליברות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ההתקנה עבור פלטפורמת העבודה. (א) מתכת למטרה (זווית 90 °) הוא כפוף ל 70 °. חור בורג ממוקם בקו האמצע העליון כדי עוגן הנייד (80 מ"מ x 150 מ"מ). הוק וקלטת לולאה והשעיית תפר ממוקמים כדי לאפשר מיצוב של עכבר מורדם על הלוח. (ב) לוח הפלסטיק מעוגן עם בורג על מסוף המתכת. הבורג משוחרר מספיק כדי לאפשר סיבוב של הלוח בכיוון כיוון השעון (+) או כנגד כיוון השעון (-). (ג) עכבר מורדם ממוקם באמצעות הקרס והקלטת לולאה (0.75 "W) עבור מינהל הסוכן IT/ליברות. תפר עובר תחת חותכות העכבר כדי לאפשר ייצוב ראש. המפעיל ממוקם בהיבט העורפי של העכבר, והצוואר מואר באמצעות מנורת צוואר אווז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יצירת קטטרים מותאמים אישית למינהל. (שלב 1) כדי לאפשר אורך קטטר מספיק כדי להעסיק את הסמאצ גזע הראשי, שני קטטרים משולבים. (שלב 2) הקטטרים מחוברים בזווית קלה, ומקלה על צנרור סלקטיבי לברוצ הגזע הראשי. (שלב 3) . ומאפשר שליטה טובה יותר בדרכי הנשימה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גישה לצינורית ומינהל בריאות מימין/שמאל סלקטיבי. (א) כדי למקד את הריאה הימנית, לוח פלסטיק מסובב + 30 °, שיפור קלות של באופן סלקטיבי העוסקים ברונטה גזע מימין. הקטטר הוא מתקדם (לכל מרחקים המוצעים בטבלה 1) כדי לעסוק באופן סלקטיבי האונות צד ימין. 20 μL של 0.3% EBD נוהל. , ב ~ 90% מהניסיונות. האונה האחורי מאופחת הנותרים 10% של ניסיונות לעסוק האונה הנחותה. (ב) כדי למקד את הריאה השמאלית, לוח פלסטיק מסובב תחילה-74 ° עבור האירוסין שמאל הגזע הראשי. לאחר צנרור מוצלח של הקטטר, סיבוב הוא ירד לאחר מכן ל -30 ° כדי לאפשר את הכבידה כדי לסייע עם משלוח הסוכן. כדי להוכיח מעורבות סלקטיבית של הצד השמאלי, 40 μL של 0.3% EBD נמסר. גישה זו באופן עקבי (100% של ניסיונות) ממוקדות מקטעים ריאה שמאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: גישת הניהול הסימטרית לספק סוכנים באופן חד-צדדי לריאה כולה. (A) מימין-הצנרור השני התבצע ב-+ 30 °, זהה לצינורית הריאה הימנית סלקטיבית (איור 4a). (ב) לוח פלסטיק הסתובב לאחר מכן ל-74 ° כדי לאפשר סיוע כבידה במהלך מינהל הסוכן. הקצה הקטטר הוא הנסוג למעמקים מפורטים בטבלה 1, המתאים לברונזה גזע הימני. שיקוע של הקצה ממוקם כלפי מטה על ידי סיבוב רכזת קטטר. (ג) 30 μl של ebd נמסר ב-74 °, להוכיח מפוזר הריאה הימנית מינהל של ebd. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: גישת הניהול הסימטרי לנהל סוכנים באופן חד-צדדי. לכל הריאה השמאלית . (א) משמאל לצנרור (A) בוצע ב-74 °, הזהה לצינורית הריאה השמאלית (איור 4b). (ב) לאחר צנרור מוצלח, לוח פלסטיק הסתובב לאחר מכן + 86 ° כדי לאפשר סיוע כבידה במהלך מינהל הסוכן. קצה הקטטר הוא נסוג לעומק מפורט בטבלה 1. שיקוע של הקצה הוא זז כלפי מטה על ידי סיבוב רכזת קטטר. (ג) 30 μl של ebd נמסר עם טיפ הטעינה ג'ל, הוכחת לפזר הריאה השמאלית ניהול של ebd. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: מינהל IT של סוכני ניסיוני הוא נמסר באופן שווה לברונטה הראשי, עדיין מוביל לריכוזים שונים של הריאות בתוך מחסום. (א) זה מינהל של 0.05% fitc-dextran (60 μl) הנחילה פלואורסצנטית גבוה יותר בריאה השמאלית, מציע ריכוזי ריאות אחיד של הסוכן המסור. (ב) זה שאין שוויון הקרינה הפלואורסצנטית ממשיך גם כאשר כרכים שווים של 0.05% fitc-dextran (30 μl) מנוהלים כל הסמפון גזע ראשי. חוסר איזון מתמשך זה מדומה, למרות שוויון שווה/שמאל משלוח גזע, מציע כי הבדלים ריכוזי סוכן ריאות לשקף דילול בריאה הימנית גדול (n = 10 לכל קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: משופרת של התצהיר של הסוכן על ידי מינון מותאם במינון. אדמיניסטרציה. (א) א-סימטריה של מסירת משלוח של הריאה משופר כאשר חלק גדול יותר של הסוכן (40 μl של 0.05% fitc-dextran) ניתנת לריאות הימנית גדול יותר ושיעור נמוך יותר של סוכן (20 μl של 0.05% fitc-dextran) לריאות שמאל קטן יותר. (ב) למרות הסימטריה שמאל-ימין משופרת, שם אוני טרוגניות של התצהיר הסוכן (שחור: האונה העליונה; צהוב: האונה האמצעית; כחול: האונה הנחותה; ירוק: האונה האחורי; אדום: ריאה שמאל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: שיפור של העכבר BLM המושרה לריאות פיברוזיס מודל באמצעות מינון מותאם לניהול ליברות. (א) מנהל IT של blm (1.2 מ"ג/ק"ג ב 60 μl פתרון) גורם לפציעה בריאה שמאלית בצד/פיברוזיס 21 ימים לאחר מכן, עקבי עם ריכוזי ריאות גבוהים יותר של הסוכן בריאה קטנה זו. סימטריה משמאל לימין משפרת את עוצמת הקול של BLM לכל צד של ריאה: 40 μL של הפתרון מנוהל לריאה הימנית הגדולה יותר ו -20 μL של הפתרון מנוהל לריאות שמאלית קטנה יותר. אני: האונה הנחותה, מ ': האונה האמצעית, S: האונה העליונה, P: האונה האחורי. תמונות מייצגות אונות מעכבר יחיד ומייצג. (ב) בעקביות עם סימטריה משופרת של הפצה, מערכת המינון מותאם מינון של blm משפרת את הדוגמנות הפיזיולוגית של סיסטיק ריאות, עם עליות מייצגות יותר של אלעמידת מערכת הנשימה (Ers) ופוחתת ב inspiratory קיבולת (IC) ותאימות מערכת הנשימה הדינמית (Crs). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משקל גוף (גר') מספר העכברים שנבדקו עומק קטטר (mm)
לצינורית סלקטיבית		 עומק קטטר (ממ) לצינורית ריאה שלמה
ריאה ימנית ריאה שמאלית
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

טבלה 1: הצעת עומק של החדרת קטטר. במעמקי הקטטר החזוי הכרחי באמצעות צינורית סלקטיבית הריאות המרוחק והאבוהיכן היו באופן אמפירי נקבע באמצעות C57BL/6 עכברים של משקולות שונות (סה כ = 79 עכברים).

משקל גוף (גר') מספר העכברים שנבדקו יחס משקולות הריאה
14 - 10 25 2.01 ± 0.16
20 - 25 35 1.88 ± 0.27
25 - 30 15 1.88 ± 0.27
> 30 6 2.03 ± 0.09

טבלה 2: מימין: יחס שמאלי במשקל הריאה. הבדלים משקולות הריאה שנצפו 81 C57BL/6 עכברים להפגין הרציונל עבור מתוקן מינהל התרופות ליברות. הריאות היו גזור ושקלו לאחר מנה קטלנית של קטמין ו xylazine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פגיעה בריאה כבר מעוצבת באופן קלאסי במכרסמים באמצעות מינהל IT של סוכנים מזיק כגון BLM6. עם זאת, מינהל IT מסוג זה מוביל לפציעה בלתי אחידה, ומשקף את האופי הלא ממוקד של משלוח ריאות עם גישה זו7. מגבלות אלה של פגיעה בריאות מידול הם אתגרים לימודיים מול כאשר מנסים את משלוח ה-IT של סוכני ניסיוני שאינם מזיקים, כגון סמים, siRNA, או טיפולים סלולריים.

בדוח זה אנו מתארים את מינהל ה-ליברות הישיר של הסוכנים הניסיוניים. גישה זו מציעה שני יתרונות שונים על פני גישות קלאסיות לניהול IT. ראשית, הגישה מאפשרת מינהל חד צדדי סלקטיבי לריאה אחת, המאפשר להתיר את הריאה הצלעות. גישה זו שימושית עבור הממשל סלקטיבי של תרופות לתוך ריאה פצועה באופן חד-צדדי (למשל, איסכמיה-reperfusion פציעה8), הימנעות השפעות ספציפיות בריאה בלתי נפגעת. יתר על כן, מונחה מינהל של תאים סרטניים ניתן להשתמש כדי להבדיל צמיחת הגידול העיקרי מתוך הצלעות, גרורות מתפשטת9,10.

שנית, הדוח מפרט תועלת בלתי מוכרת בעבר של ניהול ה-ליברות. כפי שמפורט באיור 7A, מינהל IT מתמקד יחסית לסוכני ניסיוני בתוך הריאה השמאלית הקטנה יותר. ניתן לתקן סימטריה זו על-ידי ניהול נפח גדול יחסית של הסוכן לריאה הימנית הגדולה יותר (טבלה 2), תוך אספקת נפח קטן יותר לריאה השמאלית הקטנה (איור 8a). הרלוונטיות של הממשל הזה מותאם מינון לפגיעה בריאה המושרה הנגרמת הוכח כאן. התאמת המינון מפחית את הפגיעה בריאה השמאלית (שקיבלה פחות BLM), תוך הגברת הפציעה בריאה הימנית (איור 9A). סימטריה מוגברת זו מעלה בקנה אחד עם שינויים בלתי משופרים של פגיעה בריאה, ככמת ממידות של תפקוד ריאתי (איור 9B).

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל הצורך לעמוד ביכולת לשנות בקלות ושינוי חוזר של מיצוב בעלי חיים (כלומר, סיבוב). קריטי יותר הוא היכולת לקבוע מתי הושגה צינורית ריאה סלקטיבית. כפי שמתואר בסעיף 4.12, השימוש בספימטר (שבו מראה עמודת המים מדגים אוורור גאות) מבטיח שימוש בצינורית קנה הנשימה המוצלחת3. התבוננות על מחיצת העכבר מתאימה לצינורית של מקטע הריאה הימני, ואילו היעדר קוצר נשימה (למרות תחושת התנגדות עם החדרת קטטר) הציע צינורית של הריאה השמאלית. באמצעות טכניקות לוקליזציה לא-אופרטיביות אלה, על המפעיל להיות מסוגל להנחות במדויק את השימוש בצינורית ליברות ובתצהיר של סוכן ניסיוני.

לגישה זו יש מספר מגבלות. דגם ה-IT של משלוח הסוכן הוא אטרקטיבי בפשטותו. היא דורשת מידה מתונה של תרגול ומיומנות טכנית, למרות שמפעיל מיומן עדיין יכול לבצע במהירות את הטכניקה הזאת בתוך חלון של הרדמה isofלוריאן. מיומנות טכנית נוספת/תרגול נדרש, עם זאת, יכול להיות בקלות לקזז על ידי היתרון של גישה זו בניסויים כי סדרי עדיפויות או בררנית סוכן/siRNA/משלוח התא או מוגברת הומוגניות של הסוכן התצהיר. מגבלה נוספת לשיטה זו היא חוסר הוודאות לגבי אורך של החדרת קטטר. כפי שמפורט בטבלה 1, 79 עכברים זכר ונקבה נמדדו כדי להעריך את עומק החדרת קטטר הדרוש עבור צינורית ליברות סלקטיבית. נתונים אלה משמשים כמשאב כדי להנחות את המפעיל לבצע את הפרוטוקול שלנו. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשער בביטחון את המשאב שלנו לזנים אחרים של העכבר (כולל עכברים מנוקאאוט) או עכברים צורה חולנית שמנים. בנוסף, לא מדדנו אם יש הבדלים בנפח האווירי (lobar, segmental) המשתנים בהתבסס על משקל. בתור שכזה, ייתכן שעכברים גדולים יוכלו להכיל כמויות גדולות יותר של אמצעי אחסון עם הנהלת המערכת. לפיכך, על המפעיל לבצע שלב ראשוני של אופטימיזציה/פתרון בעיות (באמצעות הודעת EBD) כדי להבטיח שהטכניקה שלנו מותאמת היטב לדגם העכבר הרצוי.

לסיכום, דו ח זה מתאר טכניקת ליברות מקורית שיכולה לשמש לניהול הסוכנים הניסיוניים באופן סלקטיבי לריאה אחת או לצורך הבטחת הפצה סימטרית בכל הריאות. יתרונות אלה מצדיקים את העלייה השולי במורכבות בהשוואה לטכניקת ה-IT הסטנדרטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי מענק NHLBI HL125371 כדי E.P.S. ועל ידי משרד ההגנה (CDMRP) מענק W81XWH-17-1-0051 ל Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
  5. Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
  6. Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
  7. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).

Tags

רפואה סוגיה 147 ה האינטרציאל הליאומיצין בעיות המשך הריאות פיברוזיס העכבר פציעה בריאה
מינהל הארגון הישיר כדי לשפר את הסוכן הסלקטיבי התצהיר בתוך הריאה של העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt,… More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter