Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

الإدارة داخل الشعب الهوائية مباشرة لتحسين ترسب عامل انتقائي داخل الرئة الماوس

doi: 10.3791/59450 Published: May 20, 2019

Summary

إدارة الرغامى (IT) من العوامل التجريبية في الفئران غالبا ما يؤدي إلى تسليم غير متناظرة إلى الرئتين البعيدة.  في هذا التقرير، نقوم بوصف نهج داخل الشعب الهوائية مباشرة (IB) لcannulate كل رئة في الفئران الحية غير الجراحية.  ويمكن استخدام هذا النهج لإدارة انتقائية وكلاء إلى رئة واحدة أو يمكن تكييفها لتحسين تسليم عامل متناظرة لكلا الرئتين.

Abstract

إدارة الرغامى (IT) من العوامل التجريبية هي تقنية أساسية في نماذج المورين من أمراض الرئة المنتشرة، مثل التليف الرئوي الناجم عن البلميسين.  ومع ذلك، فإن توزيع العوامل التي تدار داخل التراخالية على رئة الفأر البعيدة غالباً ما يكون غير متماثل، مع زيادة تركيزات الرئة في الرئة اليسرى الأصغر (ولكن يمكن الوصول إليها على قدم المساواة).  الموصوفة في هذا التقرير هو نهج جديد داخل الشعب الهوائية (IB) لcannulate الرئتين اليسرى و / أو اليمنى من الفئران الحية غير الجراحية.  ويتضح أيضا كيف يمكن استخدام هذا النهج لإدارة انتقائية وكلاء إلى رئة واحدة أو تكييفها (عنطريق تسليم IB تعديل الجرعة) لتحسين التماثل بين اليسار واليمين من تسليم الرئة من العوامل التجريبية، وبالتالي تحسين نماذج من انتشار أمراض الرئة مثل التليف الرئوي الناجم عن البلميسين.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الإدارة الرئوية المباشرة للعوامل التجريبية في الفئران تسمح بدراسة الاستجابات المناعية للرئة، وإصابة الرئة الحادة، والتليف الرئوي. يتم تنفيذ الإدارة الرئوية المباشرة عادة عن طريق الغرس داخل الرغامى (IT)، كما هو موضح سابقا 1،3. ومع ذلك، فإن هذا النهج غير انتقائي، ويؤثر على كلا الرئتين بطريقة غير مستهدفة وغير متناظرة في كثير من الأحيان.  قد تستفيد النمذجة التجريبية لإصابة الرئة من القدرة على استهداف رئة واحدة محددة بشكل انتقائي، مما يسمح باستخدام الرئة التعارضية كتحكم. وعلى العكس من ذلك، فإن النمذجة الدقيقة لأمراض الرئة المنتشرة البشرية تستفيد من التوزيع المتناظر للعوامل التجريبية إلى parenchyma الرئة الثنائية.

الهدف العام لهذا التقرير هو وصف طريقة للتسليم الانتقائي للعوامل التجريبية إلىالرئة اليسرى أو اليمنى للفأر (الشكل 1). هذا النهج الإداري داخل الشعب الهوائية (IB) يسمح لعلاج من جانب واحد من الرئة الماوس ويمكن تكييفها بسهولة لضمان التسليم على قدم المساواة من عامل إلى الشعب الهوائية الرئيسية الثنائية. باستخدام إدارة IB لتقديم جرعات أكبر من العوامل التجريبية إلى الرئة اليمنى الأكبر وكميات أصغر إلى الرئة اليسرى الأصغر (أي، إدارة IB المعدلة بالجرعة)، التي يتضح من هذا التقرير هو تحسن في تجانس الرئة تسليم العوامل التجريبية، وتحسين نموذج إصابة الرئة المنتشرة في الفئران. وعلى هذا النحو، قد يكون لهذا التقرير قيمة بالنسبة للمحققين الذين يسعون إما إلى إعطاء عوامل تجريبية من جانب واحد للفئران أو تحسين تماثل ترسب المخدرات في كلتا الرئتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل جامعة كولورادو دنفر المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). تم تحسين جميع الإجراءات الموضحة أدناه (الأقسام 4-7) باستخدام فئران C57BL/6 من الذكور والإناث على حد سواء. وقد تم التحقق من صحة هذا النهج باستخدام الفئران تتراوح بين 19-40 غرام في وزن الجسم.

1- إنشاء منبر لإدارة المكتب الدولي

  1. ثني bookend من زاوية 90 درجة الأصلي بين الجناح القاعدية والجناح الدائم إلى 70 درجة (الشكل2A).
  2. حفر حفرة في أعلى مركز الجناح الدائم من bookend المعادن (الشكل2A).
  3. حفر حفرة من حجم متطابقة في الموقف المقابل لللوحة البلاستيكية. حفر اثنين من الثقوب أصغر دون أدنى وأفقيا (الشكل2A).
  4. الستائر خياطة الحرير 4:0 بين هذه الثقوب الصغيرة في المجلس البلاستيك (الشكل2A).
  5. وضع هوك وحلقة الشريط على حافة المجلس البلاستيك (الشكل2A).
  6. تجميع المجلس البلاستيك إلى bookend المعادن مع المسمار (الشكل2B). تأكد من أن المسمار الجوز هو ضيق بما فيه الكفاية لعقد المجلس في موقف مع السماح لتعديل زاوية، إذا لزم الأمر.
  7. تأكد من أن دوران المجلس البلاستيك هو في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة، وتتحرك بحرية.
    ملاحظة: يتم تمثيل الحركة في اتجاه عقارب الساعة في هذا التقرير كاستدارة درجة (+)، ويتم تمثيل عكس اتجاه عقارب الساعة كتناوب درجة (-).
  8. استخدام منقلة زاوية لوضع المجلس البلاستيك في +30 درجة، +86 درجة، -30 درجة، و -74 درجة ووضع علامة عليها على bookend، على التوالي.

2. إنشاء قسطرة موسعة لإدارة وكيل IB

  1. جعل قطع الزاوية اليمنى مع شفرة حادة على طرف القسطرة الأصلي 22 G (25 ملم، انظر جدولالمواد) (الشكلالخطوة 1أ).
  2. شطبة (~ 50 درجة -60 درجة) غيض من القسطرة الأصلية الأخرى (25 مم) مع النصل، ثم قطع في الزاوية اليمنى من المحور (الشكلالخطوة 1ب).
  3. الغراء القسطرة اثنين في نهايات حادة مع زاوية أقل قليلا من 180 درجة (الشكلالخطوة 2).
  4. قم بفك الطرف المنقطع بالذوبان مع الكي المنخفض في درجات الحرارة (انظر جدولالمواد).
  5. قم بتلميع القسطرة الممتدة بورق الصنفرة "0" على المنطقة الملتصقة والطرف المنقطع للقسطرة الممتدة (الشكلالخطوة 3).
  6. وضع علامة على القسطرة الموسعة بألوان مختلفة في 25 مم، 30 مم، و 35 مم (الشكلالخطوة 3).
  7. قم بالإشارة إلى جانب شطبة القسطرة الممتدة عن طريق وضع علامة على محورها بعلامة.
  8. شطف القسطرة الموسعة مع الماء DI، وبعد ذلك عن طريق التنظيف داخل القسطرة مع الإيثانول 70٪. تجفيف القسطرة.
  9. تعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة قبل الاستخدام.

3- الإعداد المسبق للإجراءات

  1. جعل جميع العوامل التي تدار في غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية تحت تقنية معقمة.
  2. تنظيف مكان العمل مع الإيثانول 70٪.
  3. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70٪.
  4. إصلاح قاعدة منصة العمل إلى مقاعد البدلاء مباشرة أمام الباحث عن طريق تثبيت C-المشابك إلى الجناح القاعدية من bookend.
  5. توليد العديد من مقاييس الببيروتية المؤقتة، والتي هي الأجهزة التي من شأنها أن تسمح للكشف عن تدفق الهواء المد والجزر في الفئران. باختصار، إيداع 60 درجة مئوية من المالحة المعقمة في حقنة 1 مل (إزالة الغطاس) مع طرف تحميل هلام.
    ملاحظة: انخفاض المودعة من المالحة occludes البرميل ويتحرك صعودا وهبوطا عندما تتعرض للتهوية المد والجزر3.
  6. قم بإرفاق محور قسطرة 22 G الموسعة بمقياس التنفس المؤقت.
  7. ضع كل من قطرات الزجاج على كل جانب من المنصة لسهولة الوصول إليها.
  8. توصيل غرفة الحث isoflurane إلى آلة التخدير القوارض (انظر جدولالمواد) في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية متوافق مع isoflurane.

4- نهج تنبيب تكنولوجيا المعلومات غير الجراحي

  1. التخدير ماوس C57BL/6 (ذكر أو أنثى، 8-10 أسابيع، ~ 25 غرام) مع الأكسجين (2 لتر / دقيقة) و 5٪ isoflurane (انظر جدولالمواد) في غرفة التعريفي لمدة 4 دقائق.
  2. قم بفصل العامل التجريبي ليتم تسليمه (على سبيل المثال، صبغة إيفانز الزرقاء أو FITC-dextran، كما هو موضح في الشكل4) إلى ماصتين، ثم ضعها على كل جانب من المنصة أثناء التخدير.
  3. تأكد من معدل تنفس يتراوح بين 24 و30 نفسًا تقريبًا/دقيقة قبل إزالة الماوس من غرفة التخدير التعريفي.
    ملاحظة: التخدير Isoflurane عادة ما يستمر لمدة 4 دقائق، بما يكفي لجميع إجراءات IB. إذا كان المشغل لا يتقن هذه التقنية، يمكن استخدام الكيتامين/ إكسلازين (80 مغ/كغ و 10 ملغ/كغ داخل اقبية، انظر جدولالمواد) للتخدير لفترات أطول.
  4. تعليق الماوس بواسطة القواطع على خط خياطة رايات في موقف supine. تأمين الماوس مع قطعتين إلى ثلاث قطع من هوك وحلقة الشريط فضفاضة، وتجنب تقييد التهوية.
  5. تشغيل الإنارة الألياف البصرية LED (انظر جدولالمواد، الشكل 2C).
  6. ضع المشغل خلف المنصة (الـ dorsal إلى الماوس).
  7. قم بتوجيه عنق المضيئة بحيث يضيء منطقة الحنجرة من خلال الجلد. المسافة بين الماوس ومصدر الضوء هي 2-3 سم (الشكل2C).
  8. تأكد من عمق التخدير بقرصة اصبع القدم/الكفو قبل إجراء جميع الإجراءات أدناه.
  9. عقد ملقط معقمة مع اليد المهيمنة، ثم رسم اللسان من تجويف الفم مع ملقط.
  10. عقد الاكتئاب المعقم مع اليد غير المهيمنة، ثم تسطيح جذر اللسان مع الاكتئاب لفضح البلعوم على نطاق واسع. ويمكن بعد ذلك الإفراج عن الملقط، وتحرير اليد المهيمنة.
  11. استخدام اليد المهيمنة لتنبيب القسطرة الموسعة في القصبة الهوائية عن طريق تجويف الفم (الشكل2C).
  12. تأكد من الموضع من خلال مراقبة ما إذا كانت الفقاعة في الحقنة تتحرك صعودا وهبوطا مع كل نفس.
  13. وقد نشرت تفاصيل إضافية عن تنبيب تكنولوجيا المعلومات سابقا3. إجمالي وقت العملية، باستثناء التخدير، يستمر 10-15 ق لمشغل مدرب تدريبا جيدا.

5- نُهُج التنبيب والتسليم غير العملية للـ IB

  1. نهج IB لكانيشن الفص ية الانتقائية في الرئة اليمنى البعيدة
    1. بعد إجراء تعليب تكنولوجيا المعلومات (الخطوة 4.11)، تدوير المجلس البلاستيك +30 درجة (الشكل4A).
    2. عقد محور القسطرة وتوجيهها بشكل طبيعي بالتوازي مع خط الوسط الماوس، وتوسيعه إلى أعماق الوزن على النحو المبين في الجدول1.
      ملاحظة: يجب ملاحظة المقاومة في هذه الأعماق. عند هذه النقطة، سوف يصبح الماوس عدم انتظام دقات القلب قليلا، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. بالنسبة للمشغل من ذوي الخبرة، فإن ما يقرب من 90٪ من المحاولات بنجاح cannulate الرئة اليمنى (مع عدم انتظام دقات القلب لاحظت).
    3. تسليم 20 درجة مئوية من 0.3٪ إيفانز صبغ ة زرقاء (EBD، انظر جدولالمواد) مع طرف تحميل هلام.
    4. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرات الزجاج.
      ملاحظة: هذا يضمن إزالة الحل EBD المتبقية (أو العوامل التجريبية) من داخل القسطرة.
    5. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على موقف الماوس لمدة 30 ق.
    6. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.
  2. نهج IB للتعليب القطاعي الانتقائي للرئة اليسرى البعيدة
    1. بعد إجراء تعليب تكنولوجيا المعلومات (الخطوة 4.11)، تدوير المجلس البلاستيك -74 درجة (الشكل4B).
    2. عقد محور القسطرة وتطبيق ضغط لطيف لدفع القسطرة في القصبات الرئيسية اليسرى، في حين وضع ضغط متواضع على حد سواء إلى أسفل (90 درجة) ونحو نهاية الكتابة. في الأعماق المشار إليها في الجدول 1، يجب على المشغل ملاحظة المقاومة كما يتم تشغيل الأجزاء السفلى من الرئة اليسرى. في حالة حدوث عدم انتظام دقات القلب، اسحب القسطرة إلى موضع 20-25 مم، وحاول من مرة أخرى.
    3. بعد قنية أجزاء الرئة السفلى اليسرى، يلزم تغيير في الموقف للسماح بالمساعدة الجاذبية لإدارة العامل. تدوير المجلس البلاستيك -30 درجة (الشكل4B).
    4. تقديم 40 درجة مئوية من 0.3٪ EBD مع طرف تحميل هلام.
      ملاحظة: من الممكن تسليم حجم أكبر من العامل لأن الرئة اليسرى لديها فص واحد فقط.
    5. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرات الزجاج.
      ملاحظة: هذا يضمن إزالة أي EBD المتبقية (أو العوامل التجريبية) من داخل القسطرة.
    6. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على موقف الماوس لمدة 30 ق.
    7. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.
  3. تكييف إدارة IB للسماح بتسليم عامل إلى كامل الرئة اليسرى أو اليمنى
    ملاحظة: إذا كان المشغل يسعى إلى تسليم وكلاء ليس إلى فص الرئة الأيمن محددة أو جزء الرئة اليسرى، ولكن بدلا من الرئة بأكملها (الرئة اليمنى أو اليسرى)، يجب سحب القسطرة قليلا إلى الشعب الهوائية الرئيسية ذات الصلة، على النحو التالي.
    1. إدارة الرئة بالكامل
      1. بعد الخطوة 4.11، تدوير المجلس البلاستيك +30 درجة (الشكل5A).
      2. عقد محور القسطرة وتوجيهها بشكل طبيعي بالتوازي مع خط الوسط الماوس، والوصول إلى الأعماقاللازمة لالتعليب الفص يبعد الجانب الأيمن (الجدول 1).
      3. تأكد من ظهور علامة عدم انتظام دقات القلب.
      4. تدوير الماوس -74 درجة لتمكين مساعدة الجاذبية لتسليم وكيل (الشكل5B).
      5. سحب القسطرة إلى وضع يتوافق مع إقلاع الشعب الهوائيةالرئيسية اليمنى (الجدول 1). تأكد من أن شطبة القسطرة تواجه الهبوط (الشكل5B).
      6. تقديم 30 درجة مئوية من 0.3٪ EBD مع طرف تحميل هلام إلى الرئة اليمنى.
      7. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرة زجاجية.
      8. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على وضع الماوس لمدة 30 ق. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.
    2. ترك إدارة الرئة بأكملها
      1. بعد الخطوة 4.11، تدوير المجلس البلاستيك -74 درجة (الشكل6A). بدلاً من ذلك، قد يحدث التناوب بعد الخطوة 5.3.1.8 عن طريق سحب القسطرة إلى القصبة الهوائية، مما يتيح الإدارة الثنائية لوكيل IB.
      2. عقد محور القسطرة وتطبيق ضغط لطيف لدفع القسطرة إلى القسطرة الرئيسية اليسرى، مع وضع ضغط متواضع على حد سواء إلى أسفل (90 درجة) ونحو نهاية الكتابة. ويسترشد عمق التنبيب بالجدول1.
      3. تأكيد علامة عدم انتظام دقات القلب.
      4. تدوير الماوس +86 درجة للسماح للحصول على مساعدة الجاذبية مع إدارة وكيل.
      5. سحب القسطرة إلى القصبات الرئيسية اليسرى (نفس المسافات مثل الرئة اليمنى كافية، الجدول1) وتدوير شطبة من القسطرة يواجه إلى أسفل (الشكل6B).
      6. تسليم 30 درجة مئوية من 0.3٪ EBD مع طرف تحميل هلام إلى الرئة اليسرى.
      7. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرة زجاجية.
      8. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على وضع الماوس لمدة 30 ق. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.

6- استخدام نُهُج التعليب المتسلسلة للأرقام الأوجاع الدولية لإيصال كميات من العوامل معدلة بالجرعات إلى كل رئة

  1. مجموعة إدارة تكنولوجيا المعلومات
    1. إجراء تعليب تكنولوجيا المعلومات كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.11.
    2. تقديم 60 ميكرولتر من 0.05٪ FITC-dextran (انظر جدولالمواد) مع طرف تحميل هلام (الشكل1B).
    3. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرات الزجاج.
    4. الحفاظ على موقف ل 60 ق والسماح لاسترداد الماوس كما هو موضح أعلاه.
  2. إدارة ثنائية متناظرة للبنك الدولي
    1. تنفيذ الخطوات 5-3-1-1-5-3-1-8 (الرئة اليمنى) والخطوات 5-3-2-1-5-3-2-8 (الرئة اليسرى).
    2. إدارة كميات متساوية (30 درجة مئوية) من 0.05٪ FITC-dextran (أو وكيل تجريبي) إلى كل جانب من الرئة.
  3. إدارة الـ IB الثنائية المعدلة حسب الجرعة
    1. تنفيذ الخطوة 5.3.1.1-5.3.1.8 (الرئة اليمنى) والخطوات 5.3.2.1-5.3.2.8 (الرئة اليسرى).
    2. إدارة حجم أكبر (40 درجة مئوية) من 0.05٪ FITC-dextran إلى الرئة اليمنى أكبر، وحجم أصغر (20 درجة مئوية) من 0.05٪ FITC-dextran إلى الرئة اليسرى أصغر. بدلا من FITC-dextran، يمكن إدارة عامل تجريبي.

7. استخدام إدارة IB المعدلة بالجرعة لتحسين التماثل من جرعة واحدة من إصابة الرئة الناجمة عن جرعة واحدة (BLM)

  1. مجموعات إدارة BLM
    1. تم تسليم IB-BLM المعدل بالجرعة (1.2 ملغم/كغم، انظر جدولالمواد) مجموعة الإدارة: 60 ميكرولتر (20 ميكرولتر للرئة اليسرى و40 ميكرولتر للرئة اليمنى، على التوالي) من محلول BLM إلى الفئران (ن = 5). وتلقت عناصر التحكم (n = 5) كميات مماثلة من المالحة.
      ملاحظة: راجع الخطوتين 5.3.1 و 5.3.2.
    2. مجموعة إدارة تكنولوجيا المعلومات: تم تسليم 60 ميكرولتر من حل BLM إلى الفئران مع تقنيات إدارة تكنولوجيا المعلومات.
      ملاحظة: راجع الخطوات 6-1-1-6-1-4.
  2. قياس وظيفة الرئة
    1. في اليوم 21 بعد BLM أو المالحة، والتخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق (IP) من الكيتامين (160 ملغ / كغ) وxylazine (32 ملغ / كغ).
    2. بعد التأكد من عمق التخدير بواسطة قرصة مخلب / اصبع القدم، إجراء استئصال القصبة الهوائية مع قنية 18 G (انظر جدولالمواد).
    3. ربط الفئران إلى جهاز التنفس الصناعي وقياس ميكانيكا الجهاز التنفسي كما سبق وصفها4.
  3. جمع أنسجة الرئة ومعالجتها
    1. بعد قياس الميكانيكا الرئوية، قتل الفئران التخدير عن طريق ثقب القلب.
    2. فتح جدار الصدر والحث على الاعتلال الثنائي.
    3. تضخيم الرئتين مع 1٪ منخفضة تذوب أغاروز (40 درجة مئوية)5 في PBS في ضغط ثابت (42 سم H2O).
    4. قطع أربع إلى خمس قطع من الرئة على طول المحور الطويل عرضيًا، وإصلاح في شكلي 10٪، وتضمين في البارافين.
    5. قطع 5 أقسام ميكرومتر ووصمة عار مع trichrome ماسون لتصور ترسب الكولاجين.

8 رعاية ما بعد الإجراءات

  1. في نهاية إجراءات البقاء على قيد الحياة، وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يستهدف التنبيب الانتقائي IB فصوص محددة (الرئة اليمنى) أو أجزاء باسيلار (الرئة اليسرى).

تم تنفيذ إدارة IB من EBD إلى الرئة اليمنى على النحو المبين في القسم 5.1. بعد الانتهاء من التجربة، أعطيت الفئران جرعة قاتلة من الكيتامين داخل مجلس اكلى / إكسلازين، وتم حصاد الرئتين لمظاهرة توزيع EBD (الشكل4A،الحق). يظهر المظهر الإجمالي للرئة أن 90٪ من المحاولات تُقوّه الفص الخلفي الصغير للرئة اليمنى، في حين أن 10% من المحاولات استهدفت الفص السفلي. ومن التكهن بأن كميات صغيرة من هذه الفصوص يفسر عدم انتظام دقات القلب التعويضي للماوس أثناء التعليب القاصي (للحفاظ على التهوية الدقيقة من خلال القسطرة).

وقد أُجريت إدارة المكتب الدولي للأمراض في الرئة اليسرى على النحو المبين في الفرع 5-2. 100٪ من المحاولات تستهدف الأجزاء السفلية من الرئة اليسرى (الشكل4B). على النقيض من التنبيب على الجانب الأيمن، لا يحدث عدم انتظام دقات القلب مع هذه المشاركة، مما يعكس التنبيب (والتهوية) من أكبر أجزاء الرئة اليسرى.

يمكن أن يستهدف تكييف تقنية التعليب IB الانتقائية الرئة اليسرى أو اليمنى بأكملها.

بمجرد إجراء تعليب IB، يمكن استخدام سحب قسطرة IB (والتغيرات في تحديد موقع الماوس، كما هو مفصل في القسم 5.3) لتحسين توصيل العوامل إلى جميع فصوص الرئة اليمنى (وجميع أجزاء الرئة اليسرى). غرس محلول EBD إلى الرئة اليمنى (القسم 5.3.1) استهدف بنجاح جميع الفصوص الصحيحة، كما هو موضح في الشكل 5C. غرس محلول EBD في الرئة اليسرى (القسم 5.3.2) بنجاح استهدف جميع الأجزاء اليسرى (الشكل6C).

إدارة تكنولوجيا المعلومات أو إدارة IB متناظرة ينتج رئة غير متناظرة تركيزات العوامل البارانكيمال، والتي يمكن تصحيحها عن طريق تعديل جرعة IB.

خضعت الفئران لإدارة ثنائية من 30 ميكرولتر من 0.05٪ فيتك-dextran إلى الرئة اليسرى و 30 ميكرولتر من 0.05٪ فيتك-dextran إلى الرئة اليمنى كما هو موضح في القسم 6.2. وبدلاً من ذلك، تلقت الفئران 60 ميكرولتر من 0.05٪ فيتك-دإكستراين داخل التراخالياً وفقاً للمادة 6.1. في نهاية التجربة، تم قتل الفئران عن طريق جرعة زائدة من التخدير النهائي (الكيتامين / إكسلازين). تم حصاد الرئتين على الفور والتجانس. تم قياس FITC-الفلورة (كميا من قبل الكثافة البصرية) مع قارئ لوحة 96 جيدا. تم تحليل التاريخ مع اختبار t للطالب للمقارنات بين مجموعتين.

كما هو مفصل في الشكل 7، كل من تكنولوجيا المعلومات (الشكل7A) وإدارة IB متناظرة (الشكل7B) من FITC-dextran أدى إلى الفلورة فيتك parenchymal الرئة غير متناظرة ، مع تركيزات نسبية أكبر (تطبيع إلى الوزن) لوحظ في الرئة اليسرى. وهذا يشير إلى أن تسليم الرئة غير المتماثلة من العوامل التجريبية بعد إدارة تكنولوجيا المعلومات ليست نتيجة لعرض غير متناظرة من هذه العوامل إلى كل القصبات الرئيسية الجذعية. وبدلاً من ذلك، افترض أن التسليم المتساوي للجذع الرئيسي (كما تكفله إدارة الـ IB المتناظرة) قد تم تخفيفه بسبب الاختلافات في أوزان/كتلة الرئة، كما لوحظ في الجدول2.

وللتغلب على هذه الاختلافات في التسليم المتناظر، أُدير 40 ميكرولتر من 0.05 في المائة فيتك-ديإكسترون إلى الرئة اليمنى الأكبر و20 ميكرولتر إلى الرئة اليسرى الأصغر حجماً، وفقاً للقسم 6.3. هذا "الجرعة المعدلة IB الإدارة" تحسين التماثل من تسليم عامل parenchymal الرئة (الشكل8A). على الرغم من هذا التصحيح، ومع ذلك، لاحظنا عدم التجانس المستمر داخل فصوص مختلفة من الرئة اليمنى (الشكل8B).

إصابات الرئة الناجمة عن BLM في أنظمة الولادة المختلفة:

لإثبات أن إدارة IB المعدلة بالجرعة من العوامل التجريبية يمكن أن تحسن النمذجة من أمراض الرئة المنتشرة، قمنا بإدارة BLM (نموذج الماوس من إصابات الرئة التليف) إما داخل التراشموم أو عن طريق إدارة IB المعدلة بالجرعة، وفقا للقسم 7- وكما هو متوقع مع هذا النموذج من الإصابة، أدت حقن تكنولوجيا المعلومات والبكالوريا الدولية في BLM إلى إصابة الرئة والمرض الجهازي (مع فقدان الوزن). تم حل هذا المرض الجهازي في 7 أيام. وكان معدل الوفيات لمدة 21 يوماً 20 في المائة (1/5) في مجموعة تكنولوجيا المعلومات و0 في المائة (0/5) في مجموعة الـ IB المعدلة حسب الجرعة.

بعد 21 يوما من إدارة تكنولوجيا المعلومات أو IB-BLM، تم حصاد الفئران لعلم الأنسجة الرئة. كما هو مبين في الصور الأنسجة التمثيلية (الشكل9A)،

لتحديد ما إذا كان هذا التجانس المحسن من اليسار واليمين من إصابة الرئة الليفية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، لوحظ أن إدارة IB المعدلة بالجرعة من BLM أضفت خسارة أكثر اتساقا من القدرة الانسبيراسية (IC) والامتثال الجهاز التنفسي (Crs)، فضلا عن زيادة توافقية في الجهاز التنفسي elastance (Ers) (الشكل9B).

Figure 1
الشكل 1: تشريح تعليب مجرى الهواء للماوس. (أ) تم إجراء يلقي مجرى الهواء الماوس عن طريق تضخيم الرئة الماوس (حصادها من 25 ز الماوس) مع الاستومر السيليكون. (ب) وضع القسطرة لإدارة تكنولوجيا المعلومات القياسية. (ج) وضع القسطرة لإدارة IB. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد النظام الأساسي للعمل. (أ) وbookend معدنية (زاوية 90 درجة) عازمة على 70 درجة. يتم وضع ثقب المسمار في خط الوسط العلوي لإرساء المنقولة (80 مم × 150 مم). يتم وضع هوك وحلقة الشريط وخياطة تعليق للسماح لتحديد المواقع من الماوس التخدير على متن الطائرة. (B) ورست لوحة من البلاستيك مع المسمار على bookend المعدنية. المسمار فضفاضة بما فيه الكفاية للسماح تناوب المجلس في اتجاه عقارب الساعة (+) أو عكس اتجاه عقارب الساعة (-). (C) يتم وضع ماوس التخدير باستخدام مع هوك والشريط حلقة (0.75 "W) لإدارة عامل IT /IB. يتم تمرير خياطة تحت قواطع الماوس للسماح استقرار الرأس. يتم وضع المشغل في الجانب الظهري من الماوس، ويتم إضاءة الرقبة عن طريق مصباح عنق الأوزة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إنشاء قسطرة مخصصة لإدارة IB. (الخطوة1) لتمكين طول القسطرة كافية لإشراك الشعب الهوائية mainstem، يتم الجمع بين اثنين من القسطرة. (الخطوة2) يتم توصيل القسطرة بزاوية طفيفة، مما يسهل التنبيب الانتقائي إلى الشعب الهوائية الرئيسية. (الخطوة3) وعلاوة على ذلك، يتم البصال طرف القسطرة البعيدة، مما يسمح بتحكم أفضل في الاتجاه من غرس مجرى الهواء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نهج انتقائي لقانة الفص الرئوي الأيمن/الأيسر الانتقائية والإدارة. (أ) لاستهداف الرئة اليمنى، يتم تدوير اللوحة البلاستيكية +30 درجة، مما يحسن سهولة إشراك الشعب الهوائية الرئيسية اليمنى بشكل انتقائي. يتم تقدم القسطرة (لكل مسافات مقترحة في الجدول1) للانخراط بشكل انتقائي الفصوص من جانب اليمين. تم إعطاء 20 ميكرولتر من 0.3٪ EBD. في ~ 90٪ من المحاولات، يتم معليب الفص الخلفي. ال 10% متبقّي محاولات يشبك الفص سفليّة. (B) لاستهداف الرئة اليسرى، يتم تدوير اللوحة البلاستيكية لأول مرة -74 درجة للمشاركة الرئيسية اليسرى. بعد أنقبأ ناجحة من القسطرة، ثم يتم تقليل دوران إلى -30 درجة للسماح للجاذبية للمساعدة في تسليم وكيل. لإثبات المشاركة الانتقائية للجانب الأيسر، تم تسليم 40 ميكرولتر من 0.3٪ EBD. هذا النهج باستمرار (100٪ من المحاولات) تستهدف أجزاء باسيلار الرئة اليسرى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: نهج الإدارة المتناظرة لتسليم العوامل من جانب واحد إلى الرئة اليمنى بأكملها. (أ) تم إجراء تنبيب IB على الجانب الأيمن عند +30 درجة، مطابقًا لقانبة الفص الرئوي الأيمن الانتقائي (الشكل4A). (ب) ثم تم تدوير المجلس البلاستيك إلى -74 درجة للسماح للمساعدة الجاذبية أثناء إدارة وكيل. ثم يتم سحب طرف القسطرة إلى أعماق مفصلة في الجدول 1، المقابلة للقصبات الرئيسية اليمنى. يتم وضع شطبة الطرف إلى الأسفل عن طريق تدوير محور القسطرة. (C) تم تسليم 30 درجة مئوية من EBD في -74 درجة، مما يثبت منتشر إدارة الرئة اليمنى من EBD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: نهج الإدارة المتناظرة لإدارة وكلاء من جانب واحد إلى الرئة اليسرى بأكملها . (أ) تم إجراء تنبيب IB على الجانب الأيسر عند -74 درجة، مطابقًا لقانبة الفص الرئوي الأيسر الانتقائي (الشكل4B). (B) بعد التنبيب ناجحة، ثم تم تدوير المجلس البلاستيك +86 درجة للسماح للمساعدة الجاذبية أثناء إدارة وكيل. ثم يتم سحب طرف القسطرة إلى عمق مفصل في الجدول1. يتم تحويل شطبة الطرف إلى الأسفل عن طريق تدوير محور القسطرة. (C) تم تسليم 30 درجة مئوية من EBD مع طرف تحميل هلام، مما يثبت منتشر إدارة الرئة اليسرى من EBD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: يتم تسليم إدارة تكنولوجيا المعلومات من العوامل التجريبية على قدم المساواة إلى الشعب الهوائية mainstem، ومع ذلك يؤدي إلى تركيزات مختلفة من الرئة parenchymal. (أ) إدارة تكنولوجيا المعلومات من 0.05٪ FITC-dextran (60 درجة مئوية) نقل الفلورة أعلى في الرئة اليسرى، مما يشير إلى تركيزات الرئة متفاوتة من وكيل تسليمها. (ب) يستمر هذا الفلورة اللامساواة في الرئة حتى عندما يتم إعطاء كميات متساوية من 0.05٪ فيتك-ديإكسترون (30 درجة مئوية) لكل الشعب الهوائية الرئيسية. ويشير هذا الاختلال المستمر في الاختلال المستمر، على الرغم من تساوي تسليم الجذعية الرئيسية اليمنى/اليسرى، إلى أن الاختلافات في تركيزات عوامل الرئة تعكس التخفيف في الرئة اليمنى الأكبر (n = 10 لكل مجموعة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تحسين تجانس ترسب العوامل حسب الجرعة المعدلة الإدارة. (أ) يتم تحسين عدم التماثل في الولادة parenchymal الرئة عندما تدار نسبة أكبر من وكيل (40 ميكرولتر من 0.05٪ FITC-dextran) إلى الرئة اليمنى أكبر ونسبة أقل من عامل (20 ميكرولتر من 0.05٪ FITC-dextran) إلى الرئة اليسرى الأصغر. (ب) على الرغم من هذا التماثل المحسن بين اليسار واليمين، لا يزال هناك تباين في ترسب العامل (أسود: فص متفوق؛ أصفر: فص الأوسط؛ أزرق: فص سفلي؛ أخضر: فص خلفي؛ أحمر: الرئة اليسرى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تحسين نموذج التليف الرئوي الناجم عن الماوس BLM باستخدام إدارة IB المعدلة بالجرعة. (أ) إدارة تكنولوجيا المعلومات من BLM (1.2 ملغ / كغ في محلول 60 درجة مئوية) يحفز الجانب الأيسر إصابة الرئة السائدة / التليف 21 يوما في وقت لاحق، بما يتفق مع تركيزات الرئة أعلى من عامل في هذه الرئة الصغيرة. يحسن التماثل من اليسار إلى اليمين عن طريق ضبط حجم BLM إلى كل جانب من الرئة: يتم إعطاء 40 ميكرولتر من الحل إلى الرئة اليمنى الأكبر و 20 ميكرولتر من الحل تدار إلى الرئة اليسرى الأصغر. I: الفص السفلي، M: الفص الأوسط، S: الفص متفوقة، P: الفص الخلفي. تمثل الصور فصوص من ماوس تمثيلي واحد. (ب) بما يتفق مع تحسين التماثل في التوزيع، فإن إدارة IB المعدلة بالجرعة من BLM تحسن النمذجة الفسيولوجية للتليف الرئوي، مع زيادات أكثر تمثيلا في elastance الجهاز التنفسي (Ers) وينخفض في القدرة الانسبيراسية (IC) والامتثال الجهاز التنفسي الديناميكي (Crs). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وزن الجسم (ز) عدد الفئران التي تم اختبارها عمق القسطرة (مم)
لقانة انتقائية
عمق القسطرة (مم) لقانة الرئة بأكملها
الرئة اليمنى الرئة اليسرى
15-19 17 سنة 37 38 26
20-25 22 38 39 27
25-30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

الجدول 1: العمق المقترح لإدخال القسطرة. تم تحديد أعماق القسطرة المتوقعة اللازمة لcannulate انتقائيالرئتين البعيدة والقريبة تجريبيا ً باستخدام الفئران C57BL/6 من أوزان مختلفة (المجموع = 79 فأراً).

وزن الجسم (ز) عدد الفئران التي تم اختبارها نسبة أوزان الرئة
14-10 25 2.01 ± 0.16
20-25 35 1.88 ± 0.27
25-30 15 1.88 ± 0.27
> 30 6 2.03 ± 0.09

الجدول 2: اليمين: نسب وزن الرئة اليسرى. الاختلافات في أوزان الرئة لوحظفي 81 C57BL/6 الفئران تبين الأساس المنطقي لتصحيح إدارة المخدرات IB. تم تشريح الرئتين ووزنها بعد جرعة قاتلة من الكيتامين والإكسيلازين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم على غرار إصابة الرئة بشكل كلاسيكي في القوارض باستخدام إدارة تكنولوجيا المعلومات من العوامل الضارة مثل BLM6. ومع ذلك، فإن إدارة تكنولوجيا المعلومات هذه لا تؤدي إلا إلى إصابة غير مكتملة، مما يعكس الطبيعة غير المستهدفة لإيصال الرئة مع هذا النهج7. هذه القيود على نمذجة إصابات الرئة هي تحديات مفيدة تواجه عند محاولة تسليم تكنولوجيا المعلومات من العوامل التجريبية غير الضارة، مثل الأدوية، سيرنا، أو العلاجات الخلوية.

في هذا التقرير، نقوم بوصف الإدارة المباشرة للعوامل التجريبية من IB. ويقدم هذا النهج عرضين متميزين على النهج الكلاسيكية لإدارة تكنولوجيا المعلومات. أولا، يسمح هذا النهج بالإدارة الأحادية الانتقائية إلى رئة واحدة، مما يسمح بتجنيب الرئة المناوة. هذا النهج مفيد للإدارة الانتقائية للأدوية في الرئة المصابة من جانب واحد(على سبيل المثال، إصابة نقص التروية-التسريب 8)، وتجنب الآثار غير المحددة في الرئة غير المصابة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الإدارة الموجهة للخلايا السرطانية للتمييز بين نمو الورم الأولي والانتشار النقيلي9و10 .

ثانياً، يفصّل التقرير فائدة لم يُعترف بها من قبل لإدارة الـ IB. كما هو مفصل في الشكل 7A، تركز إدارة تكنولوجيا المعلومات نسبيا العوامل التجريبية داخل الرئة اليسرى الصغيرة. ويمكن تصحيح هذا التفاوت عن طريق إعطاء حجم أكبر نسبيا من العامل إلى الرئة اليمنى الأكبر (الجدول2) ، في حين تقديم حجم أصغر إلى الرئة اليسرى أصغر (الشكل8A). وقد ثبت هنا أهمية هذه الإدارة IB المعدلة بالجرعة لإصابة الرئة الليفية الناجمة عن BLM هنا. تعديل الجرعة يخفف من إصابة الرئة اليسرى (التي تلقت أقل BLM)، في حين زيادة الإصابة في الرئة اليمنى (الشكل9A). ويتزامن هذا التماثل المتزايد مع انخفاض تقلب إصابات الرئة، كما هو محدد كمياً بقياسات الوظيفة الرئوية (الشكل9باء).

وهناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول، بما في ذلك الحاجة إلى اتخاذ موقف قادر على تغيير مواقع الحيوانات بسهولة وبشكل متكرر (أي التناوب). والأمر الأكثر أهمية هو القدرة على تحديد متى تم تحقيق تعليب الرئة الانتقائي. وكما هو موضح في القسم 4-12، فإن استخدام مقياس التنفس (الذي يدل فيه عمود الماء على التهوية المدية) يضمن نجاح تعليب القصبة الهوائية3. مراقبة عدم انتظام دقات القلب الماوس يتسق مع القاصي الجزء الأيمن من الرئة القاصي، في حين أن عدم وجود ضيق التنفس (على الرغم من الشعور بالمقاومة مع إدخال القسطرة) اقترح تعليب الرئة اليسرى. باستخدام تقنيات التعريب غير الجراحية هذه، يجب أن يكون المشغل قادراً على توجيه تعليب IB وترسب العامل التجريبي بدقة.

ولهذا النهج عدة قيود. نموذج تكنولوجيا المعلومات من تسليم وكيل جذابة في بساطته. فإنه يتطلب درجة معتدلة من الممارسة والمهارة التقنية، على الرغم من أن المشغل المهرة لا يزال يمكن أداء هذه التقنية بسرعة داخل نافذة التخدير isoflurane. غير أن المهارة/الممارسات التقنية الإضافية المطلوبة يمكن تعويضها بسهولة بالاستفادة من هذا النهج في التجارب التي تعطي الأولوية إما للعوامل الانتقائية/الرنا/تسليم الخلايا أو زيادة تجانس ترسب العوامل. وثمة قيد إضافي على هذه الطريقة هو عدم اليقين فيما يتعلق بطول إدخال القسطرة. وكما هو مفصل في الجدول1، تم قياس 79 فأراً ذكراً وأنثى لتقدير عمق إدخال القسطرة اللازم ة لكانوليب IB الانتقائي. تعمل هذه البيانات كمورد لتوجيه المشغل لتنفيذ بروتوكولنا. ومع ذلك، لا يمكننا استقراء مواردنا بثقة لسلالات الماوس الأخرى (بما في ذلك الفئران بالضربة القاضية) أو الفئران البدناء. وبالإضافة إلى ذلك، لم نقم بقياس ما إذا كانت هناك اختلافات في حجم المجال الجوي (lobar, segmental) تختلف على أساس الوزن. وعلى هذا النحو، من الممكن أن تكون الفئران الكبيرة قادرة على استيعاب كميات أكبر من الغرس مع إدارة IB. وبالتالي، يجب على المشغل تنفيذ خطوة تحسين/استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية (باستخدام غرس EBD) لضمان أن تقنيتنا مكيفة بشكل جيد مع نموذج الماوس المطلوب.

وباختصار، يصف هذا التقرير تقنية IB جديدة يمكن استخدامها لإدارة العوامل التجريبية بشكل انتقائي إلى رئة واحدة أو تكييفها لضمان التوزيع المتماثل في جميع أنحاء الرئتين. وتبرر هذه الفوائد الزيادة الهامشية في التعقيد مقارنة بتقنيات تكنولوجيا المعلومات القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة NHLBI HL125371 إلى E.P.S. ومن قبل إدارة التنمية (CDMRP) منحة W81XWH-17-1-0051 إلى Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106, (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
  5. Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71, (1), 149-153 (1994).
  6. Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95, (1), 117-130 (1979).
  7. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, (3), L379-L399 (2008).
  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44, (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47, (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13, (6), 349-358 (2000).
الإدارة داخل الشعب الهوائية مباشرة لتحسين ترسب عامل انتقائي داخل الرئة الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter