Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Direkte Intrabronchial administration til at forbedre den selektive agens deposition i mus lunge

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59450
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Summary

Intratracheal (IT) administration af eksperimentelle agenter i mus resulterer ofte i asymmetrisk levering til de distale lunger.  I denne rapport beskriver vi en direkte intrabronchial (IB) tilgang til at cannulere hver lunge i levende mus ikke-operativt.  Denne fremgangsmåde kan bruges til selektivt at administrere agenter til en lunge eller kan tilpasses til at forbedre den symmetriske middel levering til begge lunger.

Abstract

Intratracheal (IT) administration af eksperimentelle agenser er en essentiel teknik i murine modeller af diffuse lungesygdomme, såsom bleomycin-induceret lungefibrose.  Men fordelingen af intratracheally-administrerede midler til den distale mus lunge er ofte asymmetrisk, med lunge parentchymale koncentrationer øges i den mindre (men lige så tilgængelig) venstre lunge af musen.  Beskrevet i denne rapport er en roman intrabronchial (IB) tilgang til at cannulere venstre og/eller højre lunger af levende mus ikke-operativt.  Det er også påvist, hvordan denne fremgangsmåde kan anvendes til selektivt at administrere agenter til en lunge eller tilpasset (via dosis justeret Ib-levering) for at forbedre den venstre-højre symmetri i lunge leveringen af eksperimentelle agenser og derved forbedre modeller af diffus lungesygdom såsom bleomycin-induceret lungefibrose.

Introduction

Direkte lunge administration af eksperimentelle agenter i mus giver mulighed for studiet af lunge immunrespons, akut lungeskade, og lungefibrose. Direkte lunge administration udføres typisk via intratrakeal (IT) instillation, som beskrevet tidligere1,2,3. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke selektiv og påvirker begge lunger på en ikke-målrettet og ofte asymmetrisk måde.  Eksperimentel modellering af lungeskade kan drage fordel af evnen til selektivt at målrette en bestemt lunge, giver mulighed for brug af den kontralaterale lunge som en kontrol. Omvendt, nøjagtig modellering af humane diffuse lungesygdomme nyder godt af symmetrisk fordeling af eksperimentelle agenter til den bilaterale lunge parenkyma.

Det overordnede mål med denne rapport er at beskrive en metode til selektiv levering af forsøgs agenter til venstre eller højre lunge af en mus (figur 1). Denne intrabronchial (Ib) administration tilgang giver mulighed for ensidig behandling af en mus lunge og kan let tilpasses for at sikre lige levering af en agent til den bilaterale højre bronkier. Ved at anvende IB-administration til at levere større doser af forsøgsmidler til den større højre lunge og mindre volumener til den mindre venstre lunge (dvs. dosis justeret IB-administration), er påvist i denne rapport en forbedring af homogeniteten af pulmonal levering af eksperimentelle agenter, optimering af modellen af diffus lungeskade i mus. Som sådan kan denne rapport være af værdi for undersøgere, som søger enten ensidigt at administrere forsøgs agenter til mus eller forbedre symmetrien af narkotika aflejring i begge lunger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle animalske protokoller er blevet godkendt af University of Colorado Denver institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC). Alle procedurer beskrevet nedenfor (afsnit 4 – 7) er blevet optimeret ved hjælp af både mandlige og kvindelige C57BL/6 mus. Denne fremgangsmåde er blevet valideret ved hjælp af mus, som spænder fra 19 – 40 g i legemsvægt.

1. oprettelse af en platform for IB-administration

  1. Bøj bogenden fra den originale 90 ° vinkel mellem basal fløjen og den stående vinge til 70 ° (figur 2a).
  2. Bore et hul i midten-toppen af den stående fløj af metal bogstøtte (figur 2a).
  3. Bor et hul af samme størrelse på den tilsvarende position af plastik brættet. Bor to mindre huller inferiorly og sideværts (figur 2a).
  4. Drape a 4:0 silke sutur mellem disse små huller i plastik brættet (figur 2a).
  5. Anbring krogen og loop tape på kanten af plastik brættet (figur 2a).
  6. Saml plastikkortet i metal bogenden med skruen (figur 2b). Sørg for, at skrue møtrikken er tilstrækkelig stram til at holde brættet i position, mens du om nødvendigt kan justere vinklen.
  7. Sørg for, at rotation af plastik brættet er med uret og mod uret, bevæger sig frit.
    Bemærk: med uret bevægelse er repræsenteret i denne rapport som en (+) grad rotation, og mod uret er repræsenteret som en (-) grad rotation.
  8. Brug en vinkelmåler til at placere plastikkortet på + 30 °, + 86 °,-30 °, og-74 ° og markere dem på bookenden, hhv.

2. oprettelse af udvidede katetre til administration af IB-agent

  1. Lav en ret vinkel udskæring med en skarp klinge på spidsen af et originalt 22 G kateter (25 mm, se tabel over materialer) (figur 3, trin 1a).
  2. Facet (~ 50 ° – 60 °) spidsen af det andet originale kateter (25 mm) med bladet, derefter afskåret i højre vinkel fra navet (figur 3, trin 1b).
  3. Lim de to katetre på deres stumme ender med en lidt mindre end 180 ° vinkel (figur 3, trin 2).
  4. Sløv den skrå spids ved at smelte med en lav temperatur Cautery (Se tabel over materialer).
  5. Polere det udvidede kateter med "0" størrelse sandpapir på limet område og den skrå spids af det udvidede kateter (figur 3, trin 3).
  6. Marker på det udvidede kateter med forskellige farver ved 25 mm, 30 mm og 35 mm (figur 3, trin 3).
  7. Angiv facet siden af det udvidede kateter ved at mærke dets hub med markør.
  8. Det udvidede kateter skylles med DI-vand, som følger ved at skylle indersiden af kateteret med 70% ethanol. Lufttørre kateteret.
  9. Steriliser med UV-lys i 10 minutter før brug.

3. forberedelse forud for proceduren

  1. Gør alle administrerede agenter i en biologisk sikkerhedshætte under steril teknik.
  2. Rengør arbejdspladsen med 70% ethanol.
  3. Steriliser alle kirurgiske værktøjer med 70% ethanol.
  4. Fastgør bunden af arbejdsplatformen til bænken umiddelbart foran forskeren ved at anbringe C-klemmer til den basale fløj af bogenden.
  5. Generer flere interimistiske spirometre, som er enheder, der vil give mulighed for påvisning af tidevands luftstrøm i mus. Kortvarigt, Indbetal 60 μL steriliseret saltvand i en 1 mL sprøjte (stemplet fjernet) med en gel-læsse spids.
    Bemærk: den deponerede dråbe saltvand okcerer tønden og bevæger sig opad og nedad, når den udsættes for tidevands ventilation3.
  6. Fastgør navet med et 22 G udvidet kateter løst til det interimistiske spirometer.
  7. Placer hver af glas pipetterne på hver side af platformen for at lette adgangen.
  8. Tilslut isofluran induktions kammeret til gnaver anæstesi maskinen (Se tabel over materialer) i et isofluran-kompatibelt biologisk sikkerhedskabinet.

4. ikke-operative IT intubation tilgang

  1. Anæstetize en C57BL/6 mus (mand eller kvinde, 8 – 10 uger, ~ 25 g) med ilt (2 L/min) og 5% isofluran (Se tabel over materialer) i en induktions kammer i 4 min.
  2. Aspirer det forsøgsmiddel, der skal leveres (f. eks. Evans Blue Dye eller FITC-dextran, som vist i figur 4) i to pipetter, og Placer dem derefter på hver side af platformen under sedation.
  3. Sørg for en respirationsfrekvens på ca. 24 – 30 vejrtrækninger/min, før du fjerner musen fra anæstesi induktions kammeret.
    Bemærk: Isoflurane anæstesi varer typisk 4 min, tilstrækkelig til alle IB procedurer. Hvis operatøren ikke er dygtige med teknikken, ketamin/xylazin (80 mg/kg og 10 mg/kg intraperitoneally, se tabel over materialer) kan anvendes til mere langvarig anæstesi.
  4. Suspendere musen ved sine fortænder på draperet sutur linje i liggende position. Fastgør musen med to til tre stykker krog og loop båndet løst, undgå begrænsning af ventilation.
  5. Tænd for LED-fiberoptisk illuminator (Se tabel over materialer, figur 2c).
  6. Placer operatøren bag platformen (dorsal til musen).
  7. Drej den svanehals af illuminatoren, så den belyser strubehovedet området gennem huden. Afstanden mellem musen og lyskilden er 2 – 3 cm (figur 2c).
  8. Bekræft dybden af anæstesi med en tå/pote knivspids, før du udfører alle procedurer nedenfor.
  9. Hold de sterile pincet med den dominerende hånd, og træk derefter tungen ud af mundhulen med pincet.
  10. Hold den sterile træspatel med den ikke-dominerende hånd, derefter flade roden af tungen med træspatel at udsætte oropharynx bredt. Pincet kan derefter frigives og frigøre den dominerende hånd.
  11. Brug den dominerende hånd til at intubat det forlængede kateter ind i luftrøret via mundhulen (figur 2c).
  12. Bekræft placering ved at observere, hvis boblen i sprøjten bevæger sig op og ned med hver åndedræt.
  13. Yderligere oplysninger om IT intubation er blevet offentliggjort tidligere3. Samlet procedure tid, eksklusive anæstesi, varer 10 – 15 s for en veluddannet operatør.

5. ikke-operative IB intubation og leveringsmetoder

  1. Ib-tilgang til selektiv betændelse-kanyle af den distale højre lunge
    1. Drej plastikkortet + 30 ° (figur 4a) efter at have udført det kanyle (trin 4,11).
    2. Hold omdrejningspunktet på kateteret og guide det naturligt parallelt med musens midterlinje, og Udvid det til vægtbaserede dybder som beskrevet i tabel 1.
      Bemærk: modstanden ved disse dybder skal noteres. På dette tidspunkt, vil musen blive lidt tachypneic, som forklaret i de repræsentative resultater. For en erfaren operatør vil ca. 90% af forsøgene med held cannulere den rigtige lunge (med takypnea noteret).
    3. Levér 20 μL 0,3% Evans Blue Dye (EBD, se tabel over materialer) med en gel-læsse spids.
    4. 1 – 2 aliquoter (0,1 mL hver) af luft ved hjælp af glas pipette dispenserer.
      Bemærk: Dette sikrer clearance af den resterende EBD-opløsning (eller eksperimentelle agenser) fra indersiden af kateteret.
    5. Træk kateteret ud, og hold derefter muse positionen i 30 s.
    6. Placer dyret på et opvarmnings tæppe, indtil det genvinder bevidstheden. Recovery er typisk komplet inden for 2 min.
  2. IB-tilgang til selektiv segmental-kanylering af den distale venstre lunge
    1. Drej plastikkortet-74 ° (figur 4b) efter at have udført det ved kanyle (trin 4,11).
    2. Hold katetrets knudepunkt, og pres forsigtigt for at fremme katetret i den venstre højre bronchus, mens du placerer beskedent tryk både nedad (90 °) og mod bogenden. På dybder, som er noteret i tabel 1, skal operatøren notere modstand, da de nederste segmenter af den venstre lunge er engageret. Hvis tachypnea opstår, trækkes kateteret til 20 – 25 mm position, og genforsøg.
    3. Efter at have cannulere venstre nedre lunge segmenter, en ændring i position er nødvendig for at give gravitations assistance til agentadministration. Drej plastikkortet-30 ° (figur 4b).
    4. Levér 40 μL 0,3% EBD med en gel-læsse spids.
      Bemærk: det er muligt at levere et større volumen af agent, fordi den venstre lunge kun har én lap.
    5. 1 – 2 aliquoter (0,1 – 0,3 mL hver) af luft ved hjælp af glas pipetterne.
      Bemærk: Dette sikrer clearance af eventuelle resterende EBD (eller eksperimentelle agenter) fra indersiden af kateteret.
    6. Træk kateteret ud, og hold derefter muse positionen i 30 s.
    7. Placer dyret på et opvarmnings tæppe, indtil det genvinder bevidstheden. Recovery er typisk komplet inden for 2 min.
  3. Tilpasning af IB-administrationen, således at agenten kan leveres til hele venstre eller højre lunge
    Bemærk: Hvis operatøren søger at levere agenter ikke til en bestemt højre lunge lap eller venstre lunge segment, men snarere til hele lungerne (højre eller venstre lunge), kateteret skal være lidt trukket tilbage til de respektive højre bronkier, som følger.
    1. Højre hele lunge administration
      1. Efter trin 4,11 drejes plastikkortet + 30 ° (figur 5a).
      2. Hold omdrejningspunktet i kateteret og guide det naturligt parallelt med musens midterlinje, og nå det til dybder er nødvendige for højre sidet distale betændelse kanyle (tabel 1).
      3. Bekræft udseendet af tachypnea-skiltet.
      4. Drej musen-74 ° for at aktivere tyngdekraften assistance til agent levering (figur 5b).
      5. Træk kateteret tilbage til en position, der svarer til start af den højre højre Bronkie (tabel 1). Sørg for, at katetrets facet vender nedad (figur 5b).
      6. Giv 30 μL 0,3% EBD med en gel-læsse spids til højre lunge.
      7. Der dispenserer 1 – 2 aliquoter (0,1 – 0,3 mL hver) luft med en glas dråbe.
      8. Træk kateteret ud, og hold derefter muse positionen i 30 s. Placer dyret på et opvarmnings tæppe, indtil det genvinder bevidstheden. Recovery er typisk komplet inden for 2 min.
    2. Venstre hele lunge administration
      1. Efter trin 4,11 drejes plastikkortet-74 ° (figur 6a). Alternativt kan rotation forekomme efter trin 5.3.1.8 ved at trække kateteret til luftrøret, hvilket muliggør bilateral IB-agentadministration.
      2. Hold katetrets knudepunkt, og pres forsigtigt for at fremme katetret i det venstre højre kateter, mens du placerer beskedent tryk både nedad (90 °) og mod bogenden. Dybden af intubation styres af tabel 1.
      3. Bekræft intet tachypnea-tegn.
      4. Drej musen + 86 ° for at give tyngdekraften assistance med agentadministration.
      5. Træk kateteret til venstre højre Bronkie (de samme afstande som den rigtige lunge er tilstrækkelige, tabel 1) og drej facet af kateteret vender nedad (figur 6b).
      6. Der leveres 30 μL 0,3% EBD med en gel-læsse spids til venstre lunge.
      7. Der dispenserer 1 – 2 aliquoter (0,1 – 0,3 mL hver) luft med en glas dråbe.
      8. Træk kateteret ud, og hold derefter muse positionen i 30 s. Placer dyret på et opvarmnings tæppe, indtil det genvinder bevidstheden. Recovery er typisk komplet inden for 2 min.

6. brug af sekventielle IB-kanyle tilgange til at levere dosis justerede volumen midler til hver lunge

  1. IT-administrationsgruppe
    1. Udfør den kanyle som beskrevet i trin 4.1-4.11.
    2. Levere 60 μL 0,05% FITC-dextran (Se tabel over materialer) med en gel-læsse spids (figur 1b).
    3. 1 – 2 aliquoter (0,1 – 0,3 mL hver) af luft ved hjælp af glas pipetterne.
    4. Hold positionen for 60 s og lad musen opsving som beskrevet ovenfor.
  2. Symmetrisk bilateral IB-administration
    1. Udfør trin 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (højre lunge) og trin 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (venstre lunge).
    2. Giv lige store mængder (30 μL) 0,05% FITC-dextran (eller et forsøgsstof) til hver side af lungerne.
  3. Dosis justeret bilateral IB-administration
    1. Udfør trin 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (højre lunge) og trin 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (venstre lunge).
    2. Der administreres større volumen (40 μL) 0,05% FITC-dextran til den større højre lunge, og en mindre mængde (20 μL) 0,05% FITC-dextran til den mindre venstre lunge. I stedet for FITC-dextran kan der indgives et forsøgsmiddel.

7. brug af dosis justeret IB-administration til at forbedre symmetrien af enkelt dosis Bleomycin (BLM)-induceret lungeskade

  1. BLM-administrationsgrupper
    1. Dosis justeret IB-BLM (1,2 mg/kg, se tabel over materialer) administration gruppe: 60 μl (20 μl for venstre lunge og 40 μl for højre lunge, henholdsvis) af BLM opløsning blev leveret til mus (n = 5). Kontrol (n = 5) modtog lignende mængder saltvand.
      Bemærk: Se trin 5.3.1 og 5.3.2.
    2. IT-administrationsgruppe: 60 μL BLM-opløsning blev leveret til mus med IT-administrationsteknikker.
      Bemærk: Se trin 6.1.1 – 6.1.4.
  2. Måling af lungefunktion
    1. På dag 21 efter BLM eller saltvand, anæstetize mus med en intraperitoneal (IP) injektion af ketamin (160 mg/kg) og xylazin (32 mg/kg).
    2. Efter at have bekræftet dybden af anæstesi af Paw/tå knivspids, udføre en trakeostomi med en 18 G kanyle (Se tabel over materialer).
    3. Tilslut mus til ventilatoren og måle respiratorisk mekanik som tidligere beskrevet4.
  3. Indsamling og behandling af lunge væv
    1. Efter måling af lunge mekanik, aflive bedøvet mus ved hjerte punktering.
    2. Åbn brystvæggen og Fremkald bilaterale pneumothoresser.
    3. Oppuere lunger med 1% lav smelte agopstået (40 °C)5 i PBS ved et konstant tryk (42 cm H2O).
    4. Skær fire til fem stykker af lungerne langs den lange akse på tværs, fix i 10% formalin, og indlejre i paraffin.
    5. Skær 5 μm sektioner og pletten med Masson trichrome at visualisere kollagen deposition.

8 pleje efter procedure

  1. Ved afslutningen af overlevelse procedurer, placere dyret på en opvarmning tæppe, indtil det genvinder bevidstheden. Recovery er typisk komplet inden for 2 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selektiv Ib intubation er rettet mod specifikke lapper (Right Lung) eller basilær segmenter (venstre lunge).

IB administration af EBD til højre lunge blev udført som beskrevet i punkt 5,1. Efter afslutningen af forsøget, mus blev administreret en dødelig dosis af intraperitoneal ketamin/xylazine, og lunger blev høstet til påvisning af EBD-distribution (figur 4a, højre). Brutto udseendet af lungen viser, at 90% af forsøgene cannulerede den lille bageste lap på den højre lunge, mens 10% af forsøgene målrettet den ringere lap. Det er spekuleret, at de små mængder af disse lapper forklarer kompenserende tachypnea af musen under distale kanyle (for at opretholde minut ventilation gennem kateteret).

IB administration af EBD til venstre lunge blev udført som beskrevet i punkt 5,2. 100% af forsøgene er rettet mod de ringere segmenter i venstre lunge (figur 4b). I modsætning til højre-sidet intubation opstår der ingen tachypnea med dette engagement, hvilket afspejler intubation (og ventilation) af de større venstre lunge segmenter.

Tilpasning af den selektive IB-kanyle teknik kan være rettet mod hele den venstre eller højre lunge.

Når IB-kanylen er udført, kan seponering af IB-kateteret (og ændringer i musens placering, som beskrevet i punkt 5,3) anvendes til at forbedre leveringen af agenter til alle lapper i den højre lunge (og alle segmenter af den venstre lunge). Instillation af EBD-opløsning til højre lunge (afsnit 5.3.1) med held rettet mod alle højre lapper, som vist i figur 5c. Instillation af EBD-opløsning til venstre lunge (afsnit 5.3.2) vellykket målrettet alle venstre segmenter (figur 6c).

It-administration eller symmetrisk Ib-administration udbytter asymmetriske lunge koncentrationer af parenkymal-agens, som kan korrigeres med Ib-dosisjustering.

Mus gennemgik bilateral administration af 30 μL 0,05% FITC-dextran til venstre lunge og 30 μL 0,05% FITC-dextran til højre lunge som beskrevet i afsnit 6,2. Alternativt fik mus 60 μL 0,05% FITC-dextran intratracheally pr. afsnit 6,1. Ved afslutningen af forsøget, mus blev aflives via Terminal anæstesi overdosis (ketamin/xylazine). Lungerne blev straks høstet og homogeniseret. FITC-fluorescens (kvantificeret ved optisk tæthed) blev målt med 96-brønd plade læser. Dato blev analyseret med elevens t-test for to-gruppe sammenligninger.

Som beskrevet i figur 7førte både det (figur 7a) og den symmetriske Ib-administration (figur 7b) af FITC-dextran til asymmetrisk lunge parentchymal FITC-fluorescens med større relative koncentrationer (normaliseret til vægt) i venstre lunge. Dette antyder, at asymmetrisk lunge levering af forsøgs agenter efter it-administration ikke er en konsekvens af asymmetrisk præsentation af disse stoffer til hver højre bronchus. Det var snarere en hypotese, at lige højre levering (som sikret ved symmetrisk Ib administration) blev fortyndet af forskelle i lunge vægt/masse, som det ses i tabel 2.

For at overvinde disse forskelle i symmetrisk levering blev 40 μL af 0,05% FITC-dextran administreret til den større højre lunge og 20 μL til den mindre venstre lunge, som pr. afsnit 6,3. Denne "dosis justerede IB-administration" forbedrede symmetrien i leveringen af lunge parentchymal (figur 8a). På trods af denne korrektion observerede vi imidlertid vedvarende heterogenitet inden for forskellige lapper af den højre lunge (figur 8b).

BLM-induceret lungeskade i forskellige leveringssystemer:

For at påvise, at den dosis justerede IB-administration af forsøgsmidler kan forbedre modellering af diffus lungesygdom, administrerede vi BLM (en musemodel for fibroserende lungeskade) enten intratrachealt eller via dosis justeret IB-administration i 7. som forventet med denne model for skade, både det og IB injektioner af BLM førte til lungeskade og systemisk sygdom (med vægttab). Denne systemiske sygdom forsvandt i 7 dage. 21-dages dødelighed var 20% (1/5) i IT-gruppen og 0% (0/5) i den dosis justerede IB-gruppe.

21 dage efter det-eller IB-BLM administration, mus blev høstet for lunge histologi. Som påvist i repræsentative histologiske billeder (figur 9a),

For at afgøre, om denne forbedrede venstre-højre homogenitet af fibrotisk lungeskade er fysiologisk relevant, blev det observeret, at dosis justeret IB-administration af BLM bibringe et mere konsistent tab af inspiratorisk kapacitet (IC) og overholdelse af åndedrætssystemet (CRS) samt en samstemmende stigning i respirationssystemet (ers) (figur 9b).

Figure 1
Figur 1: anatomi af musens luftvej-kanyle. (A) en mus luftveje støbt blev lavet ved at oppustethed en mus lunge (høstet fra en 25 g mus) med silicium elastomer. (B) placering af kateter til standard it-administration. C) placering af kateter til Ib-administration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Opsætning af arbejdsplatformen. A) en metal bogende (90 ° vinkel) er bøjet til 70 °. Et skrue hul anbringes i den øverste midterlinje for at forankre en bevægelig (80 mm x 150 mm). Krog og loop tape og en suspension sutur er placeret for at tillade positionering af en bedøvet mus på brættet. B) plastikkortet er forankret med en skrue på metal bogenden. Skruen er tilstrækkelig løs til at muliggøre rotation af brættet i en retning med uret (+) eller mod uret (-). (C) en bedøvet mus er placeret ved hjælp af krog og loop tape (0,75 "W) for it/Ib agentadministration. En sutur er passeret under musens fortænder at tillade hoved stabilisering. Operatøren er placeret på rygningen aspekt af musen, og halsen er belyst via en gåsehals lampe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: oprettelse af tilpassede katetre til Ib-administration. (Trin 1) For at give tilstrækkelig kateter længde til at engagere højre bronkier kombineres to katetre. (Trin 2) Katetre er forbundet i en lille vinkel, hvilket letter selektiv intubation til højre bronkier. (Trin 3) Desuden er det distale kateterspids Affaset, hvilket giver bedre retningsstyring af luftvejs instillation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tilgang til selektiv højre/venstre lunge-betændelse-kanyle og administration. (A) for at målrette den rigtige lunge, plastik bord roteres + 30 °, forbedre lethed selektivt at engagere den rigtige højre bronchus. Kateteret er avanceret (pr. afstand foreslået i tabel 1) til selektivt at engagere højre sidede lapper. 20 μL 0,3% EBD blev administreret. I ~ 90% af forsøgene, er den bageste lap kanyle. De resterende 10% af forsøgene engagere den ringere lap. (B) for at målrette den venstre lunge, plastik bord er først roteret-74 ° for venstre højre engagement. Efter vellykket intubation af kateteret, er rotation derefter faldt til-30 ° for at gøre det muligt for tyngdekraften til at hjælpe med agent levering. For at bevise selektiv engagement i venstre side blev 40 μL 0,3% EBD leveret. Denne tilgang konsekvent (100% af forsøg) målrettede venstre lunge basilær segmenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: symmetrisk administration tilgang til ensidigt at levere agenter til hele højre lunge. A) den højre side Ib intubation blev udført ved + 30 °, identisk med selektiv højre lunge-betændelse-kanyle (figur 4a). (B) plastik brættet blev derefter drejet til-74 ° for at give mulighed for tyngdekrafts hjælp underagent administrationen. Kateterspidsen trækkes derefter tilbage til dybder, som er beskrevet i tabel 1, svarende til den højre højre bronchus. Spidsen er placeret nedad ved at rotere kateter navet. C) 30 ΜL EBD blev leveret ved-74 °, hvilket viste diffus højre lunge administration af EBD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Symmetrisk administration tilgang til ensidigt at administrere agenter til hele venstre lunge . A) den venstresidede Ib-intubation blev udført ved-74 °, identisk med den selektive venstre lunge-kanyle (figur 4b). (B) efter en vellykket intubation blev plastik brættet derefter roteret + 86 ° for at give mulighed for gravitations assistance underagent administrationen. Kateterspidsen trækkes derefter til dybden detaljeret i tabel 1. Den facet af spidsen er forskudt nedad ved at rotere kateter navet. C) 30 ΜL EBD blev leveret med gel-læsse spids, som viste diffus venstre lunge administration af EBD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: it-administration af eksperimentelle agenter er ligeledes leveret til højre bronkier, men fører til forskellige lunge parentchymale koncentrationer. A) it-administration af 0,05% FITC-dextran (60 μl) gav højere fluorescens i venstre lunge, hvilket tyder på ujævn lunge koncentration af den leverede agens. B) denne ulige lunge parentchymal fluorescens fortsætter, selv når der administreres lige store mængder 0,05% FITC-dextran (30 μl) til hver højre bronchus. Denne vedvarende parentchymale ubalance, på trods af lige højre/venstre højre levering, tyder på, at forskelle i lunge agens koncentrationer afspejler fortynding i den større højre lunge (n = 10 pr. gruppe). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: forbedret homogenitet af agens deposition efter dosis justeret Ib administration. A) asymmetrien i lunge parcelal levering forbedres, når en større del af midlet (40 μl 0,05% FITC-dextran) administreres til den større højre lunge og en mindre del af midlet (20 μl 0,05% FITC-dextran) til den mindre venstre lunge. (B) på trods af denne forbedrede venstre-højre symmetri, er der stadig betændelse heterogenitet af agent deposition (sort: overlegen lap; gul: mellemlap; blå: ringere lap; grøn: posterior lap; rød: venstre lunge). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: forbedring af musens BLM-inducerede lungefibrose-model ved hjælp af dosis justeret Ib-administration. (A) it-administration af BLM (1,2 mg/kg i 60 μl opløsning) inducerer den dominerende lungeskade/fibrose fra venstre side 21 dage senere, i overensstemmelse med højere lunge koncentrationer af agens i denne mindre lunge. Venstre-højre symmetri forbedres ved at justere volumen af BLM til hver side af lungerne: 40 μL af opløsningen administreres til den større højre lunge, og 20 μL af opløsningen administreres til den mindre venstre lunge. I: ringere lap, M: mellemste lap, S: Superior lap, P: posterior lap. Billeder repræsenterer lapper fra en enkelt, repræsentativ mus. B) i overensstemmelse med forbedret symmetri i distributionen forbedrer den dosis justerede Ib-administration af BLM den fysiologiske modellering af lungefibrose, med mere repræsentative stigninger i åndedrætssystemet (ers) og fald i (IC) og overholdelse af dynamiske åndedrætssystemer (CRS). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Legemsvægt (g) Antal testede mus Kateter dybde (mm)
for selektiv kanylering		 Kateter dybde (mm) for hel lunge kanyle
Højre lunge Venstre lunge
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

Tabel 1: foreslået dybde af kateter indsættelse. Forventede kateter dybder er nødvendige for selektivt at kanyle de distale og proksimale lunger blev empirisk bestemt ved hjælp af C57BL/6 mus af forskellige vægte (total = 79 mus).

Legemsvægt (g) Antal testede mus Forholdet mellem lunge vægte
14 - 10 25 2,01 ± 0,16
20 - 25 35 1,88 ± 0,27
25 - 30 15 1,88 ± 0,27
> 30 6 2,03 ± 0,09

Tabel 2: højre: venstre lunge vægt ratio. Forskelle i lunge vægt observeret i 81 C57BL/6 mus demonstrere rationale for korrigeret IB Drug Administration. Lungerne blev dissekeret og vejet efter en dødelig dosis af ketamin og xylazin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lungeskade er blevet klassisk modelleret i gnavere ved hjælp af IT-administration af skadelige agenser såsom BLM6. En sådan IT-administration, dog kun fører til fragmentarisk skade, afspejler den ikke-målrettede karakter af lunge levering med denne tilgang7. Disse begrænsninger af modellering lungeskade er lærerige udfordringer, når de forsøger den IT-leveringen af ikke-skadevoldende eksperimentelle agenter, såsom narkotika, siRNA, eller cellulære terapier.

I denne rapport beskriver vi den direkte IB-administration af forsøgs agenter. Denne tilgang giver to forskellige fordele i forhold til klassiske tilgange til IT-administration. For det første giver tilgangen mulighed for selektiv ensidig administration til en lunge, hvilket giver mulighed for at skåne den kontralaterale lunge. Denne fremgangsmåde er nyttig for selektiv indgivelse af lægemidler til en ensidigt skadet lunge (f. eks. iskæmi-reperfusion skade8), at undgå uspecifikke virkninger i den uforkrænkede lunge. Desuden kan målrettet administration af tumorceller bruges til at skelne primær tumorvækst fra kontralateral, metastatisk spredning9,10.

For det andet beskriver rapporten en hidtil ukendt fordel ved IB-administrationen. Som beskrevet i figur 7akoncentrerer it-administrationen sig relativt om eksperimentelle agenser i den mindre venstre lunge. Denne asymmetri kan korrigeres ved at administrere et relativt større volumen af midlet til den større højre lunge (tabel 2), samtidig med at der leveres et mindre volumen til den mindre venstre lunge (figur 8a). Relevansen af denne dosis justerede IB-administration for BLM-induceret fibrotisk lungeskade blev påvist her. Dosisjustering mindsker skaden på den venstre lunge (som fik mindre BLM), mens den øgede skade på den højre lunge (figur 9a). Denne øgede symmetri falder sammen med nedsat variabilitet i lungeskade som kvantificeret ved målinger af lungefunktionen (figur 9b).

Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder behovet for at have en stand til nemt og gentagne gange at ændre dyrenes positionering (dvs. rotation). Mere kritisk er evnen til at afgøre, hvornår selektiv lunge kanyle er opnået. Som beskrevet i afsnit 4,12, anvendelse af et spirometer (hvor en vandsøjle viser tidevands ventilation) sikrer vellykket trakeal kanyle3. Observation af mus tachypnea er i overensstemmelse med distale højre lunge segment kanyle, mens fraværet af dyspnø (trods følelse modstand med kateter indsættelse) foreslog kanylering af venstre lunge. Ved hjælp af disse ikke-operative lokaliserings teknikker bør operatøren være i stand til nøjagtigt at vejlede IB-kanyle og udfældning af forsøgs agenter.

Denne fremgangsmåde har flere begrænsninger. IT-modellen af agent levering er attraktiv i sin enkelhed. Det kræver en moderat grad af praksis og teknisk dygtighed, selv om en dygtig operatør kan stadig hurtigt udføre denne teknik inden for vinduet af isofluran anæstesi. Den yderligere tekniske færdigheder/praksis, der kræves, kan dog let opvejes af fordelen ved denne tilgang i eksperimenter, der prioriterer enten selektiv agent/siRNA/celle levering eller øget homogenitet af agent deposition. En yderligere begrænsning til denne metode er usikkerheden med hensyn til længden af kateter indsættelse. Som beskrevet i tabel 1, 79 blev han-og hunmus målt til at anslå den dybde af kateter indsættelse, der var nødvendig for selektiv Ib-kanyle behandling. Disse data tjener som en ressource til at vejlede operatøren til at udføre vores protokol. Vi kan dog ikke trygt ekstrapolere vores ressource til andre muse stammer (herunder Knockout-mus) eller sygeligt fede mus. Desuden har vi ikke målt, om der er forskelle i luftrums volumen (lobar, segmental), der varierer baseret på vægt. Som sådan er det muligt, at store mus kan være i stand til at rumme større instillation volumener med IB administration. Således skal operatøren udføre en indledende optimering/fejlfinding trin (ved hjælp af EBD instillation) for at sikre, at vores teknik er godt tilpasset til den ønskede musemodel.

Sammenfattende beskriver denne rapport en ny IB-teknik, der kan anvendes til selektivt at administrere forsøgs agenter til en enkelt lunge eller tilpasses for at sikre symmetrisk fordeling i begge lunger. Disse fordele berettiger den marginale stigning i kompleksiteten i forhold til standard IT-teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NHLBI Grant HL125371 to E.P.S. og af DOD (CDMRP) Grant W81XWH-17-1-0051 til Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
  5. Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
  6. Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
  7. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).

Tags

Medicin Intratracheal instillation intrabronchial instillation lungefibrose bleomycin mus lungeskade
Direkte Intrabronchial administration til at forbedre den selektive agens deposition i mus lunge
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt,… More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter