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Medicine

Direkte intrabronchiale Verabreichung zur Verbesserung der selektiven Agentenablagerung innerhalb der Mauslunge

doi: 10.3791/59450 Published: May 20, 2019

Summary

Die intratracheale (IT) Verabreichung von Versuchsmitteln bei Mäusen führt oft zu einer asymmetrischen Abgabe in die distale Lunge.  In diesem Bericht beschreiben wir einen direkten intrabronchialen (IB) Ansatz, um jede Lunge bei lebenden Mäusen nicht operativ zu nulaten.  Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Wirkstoffe selektiv in eine Lunge zu verabreichen, oder kann angepasst werden, um die symmetrische Wirkstoffabgabe in beide Lungen zu verbessern.

Abstract

Die intratracheale (IT) Verabreichung von experimentellen Wirkstoffen ist eine wesentliche Technik bei murinen Modellen diffuser Lungenerkrankungen, wie Bleomycin-induzierte Lungenfibrose.  Die Verteilung der intratracheal verabreichten Wirkstoffe auf die distale Mauslunge ist jedoch oft asymmetrisch, wobei die Lungenparenchymalkonzentrationen in der kleineren (aber ebenso zugänglichen) linken Lunge der Maus erhöht werden.  Beschrieben in diesem Bericht ist ein neuartiger intrabronchialer (IB) Ansatz, um die linke und/oder rechte Lunge lebender Mäuse nicht operativ zu kleben.  Es wird auch gezeigt, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um Wirkstoffe selektiv an eine Lunge zu verabreichen oder angepasst (über dosisangepasste IB-Abgabe), um die Links-Rechts-Symmetrie der Lungenabgabe von Versuchsmitteln zu verbessern und dadurch die Modelle diffuser Lungenerkrankungen wie Bleomycin-induzierte Lungenfibrose.

Introduction

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Die direkte Lungenverabreichung von Experimentellen Wirkstoffen bei Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Lungenimmunreaktionen, akuten Lungenverletzungen und Lungenfibrose. Die direkte Lungenverabreichung erfolgt in der Regel über intratracheale (IT) Instillation, wie zuvor beschrieben1,2,3. Dieser Ansatz ist jedoch nicht selektiv und wirkt sich auf beide Lungen in einer nicht gezielten und oft asymmetrischen Weise aus.  Experimentelle Modellierung von Lungenverletzungen kann von der Fähigkeit profitieren, selektiv auf eine bestimmte Lunge zu zielen, was die Verwendung der kontralateralen Lunge als Kontrolle ermöglicht. Umgekehrt profitiert eine genaue Modellierung menschlicher diffuser Lungenerkrankungen von der symmetrischen Verteilung experimenteller Wirkstoffe auf das bilaterale Lungenparenchym.

Das übergeordnete Ziel dieses Berichts besteht darin, ein Verfahren zur selektiven Abgabe von Versuchsmitteln auf die linke oder rechte Lunge einer Maus zu beschreiben (Abbildung 1). Dieser intrabronchiale (IB) Verabreichungsansatz ermöglicht eine einseitige Behandlung einer Mauslunge und kann leicht angepasst werden, um die gleiche Abgabe eines Mittels an die bilaterale Mainstammbronchi zu gewährleisten. Durch die Verwendung der IB-Verabreichung, um größere Dosen von Experimentellen Wirkstoffen an die größere rechte Lunge und kleinere Volumina an die kleinere linke Lunge zu liefern (d. h. dosisbereinigte IB-Verabreichung), die in diesem Bericht gezeigt wird, ist eine Verbesserung der Homogenität der lungenmonalen Lieferung von Versuchsmitteln, Optimierung des Modells der diffusen Lungenverletzung bei Mäusen. Daher kann dieser Bericht für Forscher, die entweder einseitig Versuchsstoffe an Mäuse verabreichen oder die Symmetrie der Arzneimittelablagerung in beiden Lungen verbessern wollen, einen Wert haben.

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Protocol

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Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado Denver genehmigt. Alle unten beschriebenen Verfahren (Abschnitte 4–7) wurden sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen C57BL/6-Mäusen optimiert. Dieser Ansatz wurde mit Mäusen im Körpergewicht von 19 bis 40 g validiert.

1. Schaffung einer Plattform für die IB-Administration

  1. Biegen Sie das Buchend aus dem ursprünglichen 90°-Winkel zwischen dem Basalflügel und dem stehenden Flügel auf 70° (Abbildung2A).
  2. Bohren Sie ein Loch an der Mitte des stehenden Flügels des Metallbuchs (Abbildung 2A).
  3. Bohren Sie ein Loch gleicher Größe an der entsprechenden Position der Kunststoffplatte. Bohren Sie zwei kleinere Löcher minderwertig und seitlich (Abbildung 2A).
  4. Eine 4:0 Seidennaht zwischen diesen kleinen Löchern in der Kunststoffplatte (Abbildung2A) drapieren
  5. Legen Sie den Haken und das Schleifenband am Rand der Kunststoffplatine (Abbildung 2A).
  6. Montieren Sie die Kunststoffplatte mit der Schraube an das Metallbuchende (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass die Schraubmutter ausreichend fest ist, um die Platine in Position zu halten, während Sie bei Bedarf eine Winkeleinstellung ermöglichen.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Drehung der Kunststoffplatine im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn erfolgt und sich frei bewegt.
    HINWEIS: Bewegung im Uhrzeigersinn wird in diesem Bericht als (+) Graddrehung und gegen den Uhrzeigersinn als (-) Gradrotation dargestellt.
  8. Verwenden Sie einen Winkelwinkel, um die Kunststoffplatte bei +30°, +86°, -30° und -74° zu positionieren und sie am Buchende zu markieren.

2. Erstellung von verlängerten Kathetern für die IB-Agentenverwaltung

  1. Machen Sie einen rechten Winkel schnitt mit einer scharfen Klinge auf der Spitze eines ursprünglichen 22 G Katheter (25 mm, siehe Tabelle der Materialien) ( Abbildung3, Schritt 1a).
  2. Verschrägen Sie die Spitze des anderen Originalkatheters (25 mm) mit der Klinge , dann im rechten Winkel von der Nabe abgeschnitten (Abbildung3, Schritt 1b).
  3. Kleben Sie die beiden Katheter an ihren stumpfen Enden mit einem etwas weniger als 180° Winkel (Abbildung3, Schritt 2).
  4. Blunt die abgeschrägte Spitze durch Schmelzen mit einer niedrigen Temperatur Kautery (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Den verlängerten Katheter mit Schleifpapier der Größe "0" auf der geklebten Fläche und der abgeschrägten Spitze des verlängerten Katheters polieren (Abbildung3, Schritt 3).
  6. Markieren Sie den verlängerten Katheter mit verschiedenen Farben bei 25 mm, 30 mm und 35 mm (Abbildung3, Schritt 3).
  7. Geben Sie die Abschrägungsseite des verlängerten Katheters an, indem Sie ihre Nabe mit Marker beschriften.
  8. Spülen Sie den verlängerten Katheter mit DI-Wasser, gefolgt von Spülungen im Inneren des Katheters mit 70% Ethanol. Den Katheter lüften.
  9. Sterilisieren Sie mit UV-Licht für 10 min vor Gebrauch.

3. Vorbereitung vor dem Verfahren

  1. Machen Sie alle verabreichten Wirkstoffe in einer biologischen Sicherheitshaube unter steriler Technik.
  2. Reinigen Sie den Arbeitsplatz mit 70% Ethanol.
  3. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit 70% Ethanol.
  4. Befestigen Sie die Basis der Arbeitsbühne direkt vor dem Forscher, indem Sie C-Klemmen am Basalflügel des Buchends anbringen.
  5. Generieren Sie mehrere behelfsmäßige Spirometer, die Geräte sind, die die Detektion des Gezeitenluftstroms bei Mäusen ermöglichen. Kurz gesagt, legen Sie 60 l sterilisierte Saline in eine 1 ml Spritze (Plunger entfernt) mit einer Gel-Ladespitze ab.
    HINWEIS: Der abgelagerte Tropfen der Salzlinie verschließt das Fass und bewegt sich nach oben und unten, wenn er der Gezeitenbelüftung ausgesetzt ist3.
  6. Befestigen Sie die Nabe eines 22 G verlängerten Katheters lose am behelfsmäßigen Spirometer.
  7. Platzieren Sie jeden der Glastropfen auf jeder Seite der Plattform für einen einfachen Zugang.
  8. Verbinden Sie die Isofluran-Induktionskammer mit der Nagetieranästhesiemaschine (siehe Materialtabelle) in einem isofluran-kompatiblen biologischen Sicherheitsschrank.

4. Nicht-operativer IT-Intubationsansatz

  1. Anästhetisieren Sie eine C57BL/6-Maus (männlich oder weiblich, 8–10 Wochen, 25 g) mit Sauerstoff (2 l/min) und 5% Isofluran (siehe Materialtabelle)in einer Induktionskammer für 4 min.
  2. Aspirieren Sie das zu liefernde Versuchsmittel (z. B. Evans Blaufarbstoff oder FITC-Dextran, wie in Abbildung 4gezeigt), in zwei Pipetten und legen Sie sie dann während der Sedierung an jeder Seite der Plattform ab.
  3. Stellen Sie eine Atemfrequenz von ca. 24–30 Atemnot/min sicher, bevor Sie die Maus aus der Anästhesie-Induktionskammer entfernen.
    HINWEIS: Isoflurane Anästhesie dauert in der Regel für 4 min, ausreichend für alle IB-Verfahren. Wenn der Bediener mit der Technik nicht vertraut ist, kann Ketamin/Xylazin (80 mg/kg und 10 mg/kg intraperitoneal, siehe Materialtabelle) für längere Anästhesie verwendet werden.
  4. Halten Sie die Maus durch ihre Schneidezähne auf der drapierten Nahtlinie in der Supine-Position. Sichern Sie die Maus mit zwei bis drei Hakenstücken und schleifen Sie das Band lose, um eine Einschränkung der Belüftung zu vermeiden.
  5. Schalten Sie die LED-Glasfaserbeleuchtung ein (siehe Materialtabelle, Abbildung 2C).
  6. Positionieren Sie den Bediener hinter der Plattform (dorsal zur Maus).
  7. Richten Sie den Schwanenhals des Leuchters so aus, dass er den Kehlkopfbereich durch die Haut beleuchtet. Der Abstand zwischen Maus und Lichtquelle beträgt 2–3 cm (Abbildung 2C).
  8. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehen-/Pfoten-Pinch, bevor Sie alle unten aufgeführten Verfahren durchführen.
  9. Halten Sie die sterile Zange mit der dominanten Hand, dann ziehen Sie die Zunge aus der Mundhöhle mit der Zange.
  10. Halten Sie den sterilen Depressivum mit der nicht dominanten Hand, dann glätten Sie die Wurzel der Zunge mit dem Depressor, um den Oropharynx weit zu belichten. Die Zange kann dann freigesetzt werden, wodurch die dominante Hand frei wird.
  11. Verwenden Sie die dominante Hand, um den verlängerten Katheter über die Mundhöhle in die Luftröhre zu intubieren (Abbildung 2C).
  12. Bestätigen Sie die Platzierung, indem Sie beobachten, ob sich die Blase in der Spritze mit jedem Atemzug nach oben und unten bewegt.
  13. Weitere Details zur IT-Intubation wurden bereits veröffentlicht3. Die Gesamte Prozesszeit, ohne Anästhesie, dauert 10–15 s für einen gut ausgebildeten Bediener.

5. Nicht-operative IB-Intubations- und Lieferansätze

  1. IB-Ansatz zur selektiven Lobar-Cannulation der distalen rechten Lunge
    1. Nach der DURCHFÜHRUNG der IT-Kanulation (Schritt 4.11) drehen Sie die Kunststoffplatte +30° (Abbildung 4A).
    2. Halten Sie die Nabe des Katheters und führen Sie ihn natürlich parallel zur Mausmittellinie, und erweitern Sie ihn auf gewichtsbasierte Tiefen, wie in Tabelle 1beschrieben.
      HINWEIS: Der Widerstand in diesen Tiefen sollte beachtet werden. An diesem Punkt wird die Maus leicht tachypnoisch, wie in den repräsentativen Ergebnissen erklärt. Für einen erfahrenen Bediener können ca. 90% der Versuche erfolgreich die rechte Lunge (mit Tachypnoe festgestellt) annieren.
    3. Liefern Sie 20 l 0,3% Evans Blaufarbstoff (EBD, siehe Tabelle der Materialien) mit einer Gel-Ladespitze.
    4. Geben Sie 1-2 Aliquots (je 0,1 ml) Luft mit dem Glastropfen.
      HINWEIS: Dies gewährleistet die Freiraumung der verbleibenden EBD-Lösung (oder Versuchsmittel) von innen aus dem Katheter.
    5. Ziehen Sie den Katheter ab, und halten Sie dann die Mausposition für 30 s.
    6. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.
  2. IB-Ansatz zur selektiven segmentalen Cannulation der distalen linken Lunge
    1. Nach der DURCHFÜHRUNG der IT-Kanulation (Schritt 4.11) drehen Sie die Kunststoffplatte -74° (Abbildung 4B).
    2. Halten Sie die Nabe des Katheters und wenden Sie sanften Druck an, um den Katheter in den linken Mainstem Bronchus zu bringen, während Sie sowohl nach unten (90°) als auch in Richtung Buchende bescheidenen Druck ausüben. Bei tiefen, diein Tabelle 1 angegeben sind, sollte der Bediener Widerstand beachten, wenn die unteren Segmente der linken Lunge eingebunden sind. Wenn Tachypnoe auftritt, ziehen Sie den Katheter in die 20–25 mm Position, und versuchen Sie es erneut.
    3. Nach der Cannulation der linken unteren Lungensegmente ist eine Positionsänderung erforderlich, um Gravitationsunterstützung für die Agentenadministration zu ermöglichen. Drehen Sie die Kunststoffplatte -30° (Abbildung 4B).
    4. Liefern Sie 40 l 0,3% EBD mit einer Gel-Ladespitze.
      HINWEIS: Es ist möglich, ein größeres Volumen an Agenten zu liefern, da die linke Lunge nur einen Lappen hat.
    5. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit den Glastropfen.
      HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass alle verbleibenden EBD (oder Versuchsmittel) von innen aus dem Katheter frei werden.
    6. Ziehen Sie den Katheter ab, und halten Sie dann die Mausposition für 30 s.
    7. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.
  3. Anpassung der IB-Administration, um die Lieferung des Mittels an die gesamte linke oder rechte Lunge zu ermöglichen
    HINWEIS: Wenn der Bediener versucht, Wirkstoffe nicht an einen bestimmten rechten Lungenlappen oder ein linkes Lungensegment zu liefern, sondern an die gesamte Lunge (rechte oder linke Lunge), sollte der Katheter leicht auf die jeweiligen Mainstammbronchien zurückgezogen werden, wie folgt.
    1. Richtige gesamte Lungenadministration
      1. Nach Schritt 4.11 drehen Sie die Kunststoffplatte +30° (Abbildung 5A).
      2. Halten Sie die Nabe des Katheters und führen Sie ihn natürlich parallel zur Mausmittellinie, bis sie in tiefen reicht, die für die rechtsseitige distale Lobar-Kanonulation notwendig sind (Tabelle 1).
      3. Bestätigen Sie das Aussehen des Tachypnea-Zeichens.
      4. Drehen Sie die Maus -74°, um die Schwerkraftunterstützung für die Agentenlieferung zu aktivieren (Abbildung 5B).
      5. Ziehen Sie den Katheter in eine Position, die dem Start des rechten Hauptstammbronchus entspricht (Tabelle 1). Stellen Sie sicher, dass die Abschrägung des Katheters nach unten zeigt (Abbildung 5B).
      6. Liefern Sie 30 l 0,3% EBD mit einer Gel-Ladespitze auf die rechte Lunge.
      7. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit einem Glastropfen aus.
      8. Ziehen Sie den Katheter ab, halten Sie dann die Mausposition für 30 s. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.
    2. Linke gesamte Lungenverwaltung
      1. Nach Schritt 4.11 drehen Sie die Kunststoffplatte -74° (Abbildung 6A). Alternativ kann die Rotation nach Schritt 5.3.1.8 erfolgen, indem der Katheter in die Luftröhre zurückgezogen wird, was die bilaterale Ib-Agentenverwaltung ermöglicht.
      2. Halten Sie die Nabe des Katheters und wenden Sie sanften Druck an, um den Katheter in den linken Hauptstammkatheter zu bringen, während sie sowohl nach unten (90°) als auch in Richtung Buchende bescheidenen Druck ausüben. Die Tiefe der Intubation wird durch Tabelle 1geleitet.
      3. Bestätigen Sie das No-Tachypnoe-Zeichen.
      4. Drehen Sie die Maus +86°, um schwerkraftunterstützende Hilfe bei der Agentenadministration zu ermöglichen.
      5. Ziehen Sie den Katheter nach links Mainstem bronchus (die gleichen Entfernungen wie die rechte Lunge sind ausreichend, Tabelle 1) und drehen Sie die Abschrägung der Katheterflächen nach unten (Abbildung 6B).
      6. Liefern Sie 30 l 0,3% EBD mit einer Gel-Ladespitze in die linke Lunge.
      7. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit einem Glastropfen aus.
      8. Ziehen Sie den Katheter ab, halten Sie dann die Mausposition für 30 s. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.

6. Verwendung sequenzieller IB-Kanulationsansätze zur Dosisbereinigten Wirkstoffmenge an jede Lunge

  1. IT-Verwaltungsgruppe
    1. Führen Sie die IT-Cannulation wie in den Schritten 4.1–4.11 beschrieben durch.
    2. Liefern Sie 60 l von 0,05% FITC-dextran (siehe Materialtabelle) mit einer Gelladespitze (Abbildung 1B).
    3. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit den Glastropfen.
    4. Halten Sie die Position für 60 s und ermöglichen Sie die Mauswiederherstellung, wie oben beschrieben.
  2. Symmetrische bilaterale IB-Verwaltung
    1. Führen Sie die Schritte 5.3.1.1–5.3.1.8 (rechte Lunge) und die Schritte 5.3.2.1–5.3.2.8 (linke Lunge) aus.
    2. Verabreichen Sie auf jeder Seite der Lunge gleiche Volumina (30 l) von 0,05 % FITC-Dextran (oder einem Versuchsmittel).
  3. Dosisbereinigte bilaterale IB-Administration
    1. Führen Sie Schritt 5.3.1.1–5.3.1.8 (rechte Lunge) und Schritte 5.3.2.1–5.3.2.8 (linke Lunge) aus.
    2. Verabreichen Sie ein größeres Volumen (40 l) von 0,05 % FITC-Dextran an die größere rechte Lunge und ein kleineres Volumen (20 l) von 0,05 % FITC-Dextran auf die kleinere linke Lunge. Anstelle von FITC-dextran kann ein Versuchsmittel verabreicht werden.

7. Verwendung der dosisangepassten IB-Verabreichung zur Verbesserung der Symmetrie der Einzeldosis-Bleomycin (BLM)-induzierte Lungenverletzung

  1. BLM-Verwaltungsgruppen
    1. Dosisbereinigtes IB-BLM (1,2 mg/kg, siehe Materialtabelle)Verwaltungsgruppe: 60 l (20 l für die linke Lunge bzw. 40 l für die rechte Lunge) der BLM-Lösung wurden an Mäuse geliefert (n = 5). Die Steuerelemente (n = 5) erhielten ähnliche Mengen an Saline.
      HINWEIS: Siehe die Schritte 5.3.1 und 5.3.2.
    2. IT-Verwaltungsgruppe: 60 L BLM-Lösung wurden mäusen mit IT-Verwaltungstechniken geliefert.
      HINWEIS: Siehe die Schritte 6.1.1–6.1.4.
  2. Messung der Lungenfunktion
    1. An Tag 21 nach BLM oder Saline Mäuse mit einer intraperitonealen (IP) Injektion von Ketamin (160 mg/kg) und Xylazin (32 mg/kg) ansien.
    2. Nach der Bestätigung der Tiefe der Anästhesie durch Pfoten/Zehen-Pinch, führen Sie eine Tracheostomie mit einer 18 G Kanüle (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Verbinden Sie Mäuse mit dem Beatmungsgerät und messen Sie die Atemmechanik wie zuvor beschrieben4.
  3. Erfassung und Verarbeitung von Lungengewebe
    1. Nach Messung der Lungenmechanik, euthanisieren Sie die anästhesierten Mäuse durch Herzpunktion.
    2. Öffnen Sie die Brustwand und induzieren Sie bilaterale Pneumothoraces.
    3. Aufblasen der Lunge mit 1% niedriger Schmelzagarose (40 °C)5 in PBS bei einem konstanten Druck (42 cm H2O).
    4. Vier bis fünf Teile der Lunge entlang der langen Achse quer schneiden, in 10% Formalin fixieren und in Paraffin einbetten.
    5. Schneiden Sie 5 'm Abschnitte und Flecken mit Masson s trichrome, um Kollagenablagerung zu visualisieren.

8 Nachverfahrenspflege

  1. Am Ende der Überlebensverfahren, legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.

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Representative Results

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Selektive IB-Intubation zielt auf bestimmte Lappen (rechte Lunge) oder Basilarsegmente (linke Lunge).

Die IB-Verabreichung von EBD in die rechte Lunge wurde wie in Abschnitt 5.1 beschrieben durchgeführt. Nach Abschluss des Experiments wurde den Mäusen eine tödliche Dosis intraperitonealen Ketamins/Xylazins verabreicht, und die Lunge wurde geerntet, um die EBD-Verteilung zu demonstrieren (Abbildung4A, rechts). Das grobe Auftreten der Lunge zeigt, dass 90% der Versuche den kleinen hinteren Lappen der rechten Lunge anläden, während 10% der Versuche auf den minderwertigen Lappen abzielten. Es wird spekuliert, dass die kleinen Volumina dieser Lappen die kompensatorische Tachypnoe der Maus während der distalen Cannulation erklären (um die minutenlange Belüftung durch den Katheter aufrechtzuerhalten).

Die IB-Verabreichung von EBD in die linke Lunge wurde wie in Abschnitt 5.2 beschrieben durchgeführt. 100% der Versuche zielen auf die unteren Segmente der linken Lunge ab (Abbildung 4B). Im Gegensatz zur rechtsseitigen Intubation tritt bei diesem Eingriff keine Tachypnoe auf, die die Intubation (und Belüftung) der größeren linken Lungensegmente reflektiert.

Die Anpassung der selektiven IB-Kanulationstechnik kann auf die gesamte linke oder rechte Lunge abzielen.

Sobald die IB-Kanulation durchgeführt ist, kann die Entnahme des IB-Katheters (und Änderungen in der Mauspositionierung, wie in Abschnitt 5.3 beschrieben) verwendet werden, um die Verabreichung von Wirkstoffen an alle Lappen der rechten Lunge (und alle Segmente der linken Lunge) zu verbessern. Die Instillation der EBD-Lösung für die rechte Lunge (Abschnitt 5.3.1) zielte erfolgreich auf alle rechten Lappen ab, wie Abbildung 5Czeigt. Die Instillation der EBD-Lösung in die linke Lunge (Abschnitt 5.3.2) zielte erfolgreich auf alle linken Segmente ab (Abbildung 6C).

IT-Administration oder symmetrische IB-Administration ergibt asymmetrische Lunge Konzentrationen von parenchymalen Wirkstoffen, die durch IB-Dosisanpassung korrigiert werden können.

Mäuse wurden bilateral von 30 l 0,05% FITC-Dextran in die linke Lunge und 30 l von 0,05% FITC-Dextran in die rechte Lunge, wie in Abschnitt 6.2 beschrieben. Alternativ erhielten Die Mäuse gemäß Abschnitt 6.1 60 l von 0,05% FITC-Dextran intratracheal. Am Ende des Experiments wurden Mäuse über eine Terminalanästhesie-Überdosis (Ketamin/Xylazin) eingeschläfert. Die Lunge wurde sofort geerntet und homogenisiert. Die FITC-Fluoreszenz (quantifiziert durch optische Dichte) wurde mit 96-Well-Plattenlesern gemessen. Das Datum wurde mit dem T-Test der Schüler für Zwei-Gruppen-Vergleiche analysiert.

Wie in Abbildung 7beschrieben, führten sowohl die IT ( Abbildung7A) als auch die symmetrische IB-Administration (Abbildung 7B) von FITC-Dextran zu einer asymmetrischen Lungenparenchymalen FITC-Fluoreszenz, wobei größere relative Konzentrationen (normalisiert nach Gewicht) in der linke Lunge. Dies deutet darauf hin, dass die asymmetrische Lungenabgabe von Versuchsmitteln nach der IT-Verabreichung nicht eine Folge der asymmetrischen Darstellung dieser Wirkstoffe zu jedem Mainstammbronchus ist. Vielmehr wurde vermutet, dass die gleiche Hauptstammabgabe (wie durch symmetrische IB-Verabreichung gewährleistet) durch Unterschiede in den Lungengewichten/-masse verdünnt wurde, wie in Tabelle 2beobachtet.

Um diese Unterschiede in der symmetrischen Abgabe zu überwinden, wurden 40 l 0,05% FITC-Dextran der größeren rechten Lunge und 20 l der kleineren linken Lunge gemäß Abschnitt 6.3 verabreicht. Diese "dosisbereinigte IB-Verabreichung" verbesserte die Symmetrie der Verabreichung von Lungenparenchymalen (Abbildung 8A). Trotz dieser Korrektur beobachteten wir jedoch eine anhaltende Heterogenität in verschiedenen Lappen der rechten Lunge (Abbildung 8B).

BLM-induzierte Lungenverletzungen in verschiedenen Abgabesystemen:

Um zu zeigen, dass die dosisbereinigte IB-Verabreichung von Experimentellen Wirkstoffen die Modellierung diffuser Lungenerkrankungen verbessern kann, verabreichten wir BLM (ein Mausmodell der fibrosierenden Lungenverletzung) entweder intratracheal oder über dosisbereinigte IB-Verabreichung, 7. Wie bei diesem Verletzungsmodell erwartet, führten sowohl IT- als auch IB-Injektionen von BLM zu Lungenverletzungen und systemischen Erkrankungen (mit Gewichtsverlust). Diese systemische Krankheit löste sich in 7 Tagen. Die 21-Tage-Sterblichkeit betrug 20% (1/5) in der IT-Gruppe und 0% (0/5) in der dosisbereinigten IB-Gruppe.

21 Tage nach der IT- oder IB-BLM-Verabreichung wurden Mäuse für die Lungenhistologie geerntet. Wie in repräsentativen histologischen Bildern (Abbildung 9A) gezeigt,

Um festzustellen, ob diese verbesserte Links-Rechts-Homogenität der fibrotischen Lungenverletzung physiologisch relevant ist, wurde beobachtet, dass die dosisbereinigte IB-Verabreichung von BLM einen konsistenteren Verlust der Inspiratorkapazität (IC) und der Einhaltung der Atemwege (Crs), sowie eine konkordante Zunahme der Atmungssystem-Elastanz (Ers) (Abbildung 9B).

Figure 1
Abbildung 1: Anatomie der Maus-Atemwegskanulation. (A) Ein Maus-Atemweg wurde durch Aufblasen einer Mauslunge (geerntet aus einer 25 g Maus) mit Silizium-Elastomer hergestellt. (B) Katheterplatzierung für die Standard-IT-Administration. (C) Katheterplatzierung für die IB-Verwaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Einrichtung für die Arbeitsplattform. (A) Ein Metallbuch (90° Winkel) ist auf 70° gebogen. Ein Schraubloch wird in die obere Mittellinie gelegt, um eine bewegliche (80 mm x 150 mm) zu verankern. Haken- und Schleifenband und eine aufhängende Naht werden platziert, um die Positionierung einer anästhesierten Maus auf dem Brett zu ermöglichen. (B) Die Kunststoffplatte ist mit einer Schraube am Metallbuchende verankert. Die Schraube ist so locker, dass die Platine im Uhrzeigersinn (+) oder gegen den Uhrzeigersinn (-) gedreht werden kann. (C) Eine anästhesierte Maus wird mit Haken und Schleifenband (0,75" W) für die IT/IB-Agentenadministration positioniert. Eine Naht wird unter den Mausschneidezähnen übergeben, um eine Kopfstabilisierung zu ermöglichen. Der Bediener wird am dorsalen Aspekt der Maus positioniert, und der Hals wird über eine Gänsehalslampe beleuchtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erstellung von kundenspezifischen Kathetern für die IB-Verwaltung. (Schritt 1) Um eine ausreichende Katheterlänge zu ermöglichen, um die Mainstem-Bronchien einzubinden, werden zwei Katheter kombiniert. (Schritt 2) Katheter sind in einem leichten Winkel verbunden, was eine selektive Intubation mit den Hauptstammbronchien erleichtert. (Schritt 3) Darüber hinaus wird die distale Katheterspitze abgeschrägt, was eine bessere Richtungskontrolle der Atemwegsinstillation ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Ansatz für selektive rechte/linke Lungenlobar-Cannulation und -Verabreichung. (A) Um die rechte Lunge anzusprechen, wird die Kunststoffplatte +30° gedreht, was die einfache selektive Einbindung des rechten Hauptstammbronchus verbessert. Der Katheter wird (pro in Tabelle 1vorgeschlagener Abstand) so weit vorgeschoben, dass er selektiv rechtsseitige Lappen eingreift. 20 L von 0,3% EBD verabreicht. Bei 90 % der Versuche wird der hintere Lappen kanüliert. Die restlichen 10% der Versuche greifen den minderwertigen Lappen an. (B) Um die linke Lunge anzusprechen, wird die Kunststoffplatte zuerst um -74° gedreht, um das linke Hauptstammengagement zu ermöglichen. Nach erfolgreicher Intubation des Katheters wird die Rotation dann auf -30° verringert, um die Schwerkraft bei der Agentenzufuhr unterstützen zu können. Um ein selektives Engagement der linken Seite zu beweisen, wurden 40 L mit 0,3 % EBD geliefert. Dieser Ansatz zielte konsequent (100% der Versuche) auf linke Lungen-Basilarsegmente ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Symmetrischer Verabreichungsansatz zur einseitigen Lieferung von Wirkstoffen in die gesamte rechte Lunge. (A) Die rechte IB-Intubation wurde bei +30° durchgeführt, identisch mit der selektiven rechten Lungenlobarkannulation (Abbildung 4A). (B) Die Kunststoffplatte wurde dann auf -74° gedreht, um eine Schwerkraftunterstützung während der Agentenadministration zu ermöglichen. Die Katheterspitze wird dann in diein Tabelle 1 beschriebenen Tiefen zurückgezogen, entsprechend dem rechten Hauptstamm bronchus. Die Abschrägung der Spitze wird durch Drehen der Katheternabe nach unten positioniert. (C) 30 l EBD wurde bei -74° geliefert, was eine diffuse rechte Lungenverabreichung von EBD beweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Symmetrischer Verwaltungsansatz zur einseitigen Verabreichung von Wirkstoffen an die gesamte linke Lunge . (A) Die linksseitige IB-Intubation wurde bei -74° durchgeführt, identisch mit der selektiven linken Lungenlobar-Kannierung (Abbildung 4B). (B) Nach erfolgreicher Intubation wurde die Kunststoffplatte dann um +86° gedreht, um eine Schwerkraftunterstützung während der Agentenadministration zu ermöglichen. Die Katheterspitze wird dann in Tabelle 1in die Tiefe zurückgezogen. Die Abschrägung der Spitze wird durch Drehen der Katheternabe nach unten verschoben. (C) 30 l EBD wurde mit Gel-Ladespitze geliefert, was die diffuse linke Lungenverabreichung von EBD beweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Die IT-Verabreichung von Versuchsmitteln wird gleichermaßen an Mainstem-Bronchien geliefert, führt aber zu unterschiedlichen Lungenparenchymalkonzentrationen. (A) Die IT-Verabreichung von 0,05 % FITC-Dextran (60 l) setzte eine höhere Fluoreszenz in der linken Lunge auf, was auf ungleichmäßige Lungenkonzentrationen des gelieferten Mittels hindeutet. (B) Diese ungleiche Lungenparenchymale Fluoreszenz bleibt auch dann bestehen, wenn jedem Mainstammbronchus gleiche Volumina von 0,05% FITC-Dextran (30 'L) verabreicht werden. Dieses anhaltende parenchymale Ungleichgewicht, trotz gleicher Rechts/Links-Hauptstammabgabe, deutet darauf hin, dass Unterschiede in den Lungenwirkstoffkonzentrationen die Verdünnung in der größeren rechten Lunge widerspiegeln (n = 10 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Verbesserte Homogenität der Wirkstoffabscheidung durch dosisbereinigtes IB Verwaltung. (A) Die Asymmetrie der Lungenparenchymalabgabe wird verbessert, wenn der größeren rechten Lunge und einem geringeren Wirkstoffanteil (20 l von 0,05 % FITC-Dextran) ein größerer Anteil des Mittels (20 l von 0,05 % FITC-Dextran) an die kleinere linke Lunge verabreicht wird. (B) Trotz dieser verbesserten Links-Rechts-Symmetrie bleibt die Lobar-Heterogenität der Wirkstoffablagerung (schwarz: oberer Lappen; gelb: Mittellappen; blau: unterder Lappen; grün: hintere Lappen; rot: linke Lunge). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Verbesserung des BLM-induzierten Lungenfibrosemodells mit dosisbereinigter IB-Verabreichung. (A) Die IT-Verabreichung von BLM (1,2 mg/kg in 60 L-Lösung) induziert 21 Tage später eine vorherrschende Lungenverletzung/Fibrose auf der linken Seite, was mit höheren Lungenkonzentrationen des Wirkstoffs in dieser kleineren Lunge übereinstimmt. Die Links-Rechts-Symmetrie verbessert sich, indem das Volumen von BLM an jede Seite der Lunge angepasst wird: 40 l der Lösung werden der größeren rechten Lunge verabreicht und 20 l der Lösung wird der kleineren linken Lunge verabreicht. I: unterder Lappen, M: Mittellappen, S: Oberlappen, P: hintere Lappen. Bilder stellen Lappen aus einer einzigen, repräsentativen Maus dar. (B) In Übereinstimmung mit einer verbesserten Verteilungssymmetrie verbessert die dosisbereinigte IB-Verabreichung von BLM die physiologische Modellierung der Lungenfibrose, mit einer repräsentativeren Erhöhung der Atmungssystem-Elastance (Ers) und Inspiratorische Kapazität (IC) und dynamische Atemsystem-Compliance (Crs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Körpergewicht (g) Anzahl der getesteten Mäuse Kathetertiefe (mm)
für selektive Cannulation
Kathetertiefe (mm) für die gesamte Lungenkantonulation
Rechte Lunge Linke Lunge
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

Tabelle 1: Vorgeschlagene Tiefe der Kathetereinfügung. Die vorhergesagten Kathetertiefen, die notwendig sind, um die distale und proximale Lunge selektiv zu keimen, wurden empirisch mit C57BL/6-Mäusen mit verschiedenen Gewichten (insgesamt = 79 Mäuse) bestimmt.

Körpergewicht (g) Anzahl der getesteten Mäuse Verhältnis der Lungengewichte
14 - 10 25 2,01 bis 0,16
20 - 25 35 1,88 x 0,27
25 - 30 15 1,88 x 0,27
> 30 6 2,03 € 0,09

Tabelle 2: Rechte:linke Lungengewichtsverhältnisse. Unterschiede in den Lungengewichten, die bei 81 C57BL/6-Mäusen beobachtet wurden, zeigen die Gründe für eine korrigierte Verabreichung von IB-Medikamenten. Die Lunge wurde nach einer tödlichen Dosis Ketamin und Xylazin seziert und gewogen.

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Discussion

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Lungenverletzungen wurden bei Nagetieren mit Hilfe der IT-Verabreichung von schädigenden Wirkstoffen wie BLM6klassisch modelliert. Eine solche IT-Administration führt jedoch nur zu lückenhaften Verletzungen, was den nicht gezielten Charakter der Lungenabgabe mit diesem Ansatz widerspiegelt7. Diese Einschränkungen der Modellierung von Lungenverletzungen sind lehrreiche Herausforderungen, vor denen bei dem Versuch, die IT-Lieferung von nicht-verletzenden experimentellen Wirkstoffen wie Medikamenten, siRNA oder zellulären Therapien, zu versuchen.

In diesem Bericht beschreiben wir die direkte IB-Verabreichung von Versuchsmitteln. Dieser Ansatz bietet zwei unterschiedliche Vorteile gegenüber klassischen Ansätzen für die IT-Verwaltung. Erstens ermöglicht der Ansatz eine selektive einseitige Verabreichung an eine Lunge, wodurch die kontralaterale Lunge geschont werden kann. Dieser Ansatz ist nützlich für die selektive Verabreichung von Medikamenten in eine einseitig verletzte Lunge (z. B. Ischämie-Reperfusionsverletzung8), wodurch unspezifische Wirkungen in der nicht verletzten Lunge vermieden werden. Darüber hinaus kann die gezielte Verabreichung von Tumorzellen verwendet werden, um das primäre Tumorwachstum von kontralateraler, metastasierender Ausbreitung9,10zu unterscheiden.

Zweitens wird in dem Bericht auf einen bisher unbekannten Nutzen der IB-Administration eingestimmt. Wie in Abbildung 7Abeschrieben, konzentriert die IT-Administration die experimentellen Wirkstoffe in der kleineren linken Lunge. Diese Asymmetrie kann korrigiert werden, indem der größeren rechten Lunge ein relativ größeres Volumen an Agenten verabreicht wird (Tabelle 2), während der kleineren linken Lunge ein kleineres Volumen zur Seite steht (Abbildung 8A). Die Relevanz dieser dosisangepassten IB-Verabreichung auf BLM-induzierte fibrotische Lungenverletzungen wurde hier nachgewiesen. Die Dosisanpassung mildert die Verletzung der linken Lunge (die weniger BLM erhielt), während die Verletzung der rechten Lunge erhöht wird (Abbildung 9A). Diese erhöhte Symmetrie fällt mit der verminderten Variabilität der Lungenverletzung zusammen, wie durch Messungen der Lungenfunktion quantifiziert (Abbildung 9B).

Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, einschließlich der Notwendigkeit, einen Stand zu haben, der in der Lage ist, die Positionierung der Tiere einfach und wiederholt zu verändern (d. h. die Rotation). Wichtiger ist die Fähigkeit zu bestimmen, wann eine selektive Lungenkanonulation erreicht wurde. Wie in Abschnitt 4.12 beschrieben, sorgt die Verwendung eines Spirometers (bei dem eine Wassersäule die Gezeitenlüftung demonstriert) für eine erfolgreiche Trachealcannulation3. Die Beobachtung von Maus-Tachypnoe ist konsistent mit distalen rechten Lungensegment-Kannulation, während das Fehlen von Dyspnoe (trotz Gefühlsresistenz mit Katheter-Einfügung) eine Cannulation der linken Lunge nahelegte. Mit diesen nicht-operativen Lokalisierungstechniken sollte der Bediener in der Lage sein, die IB-Kannulation und die Abscheidung von Versuchsmitteln genau zu steuern.

Dieser Ansatz hat mehrere Einschränkungen. Das IT-Modell der Agentenlieferung ist in seiner Einfachheit attraktiv. Es erfordert ein moderates Maß an Praxis und technischem Geschick, obwohl ein erfahrener Bediener diese Technik noch schnell innerhalb des Fensters der Isoflurananästhesie durchführen kann. Die erforderliche zusätzliche technische Kompetenz/Praxis kann jedoch leicht durch den Nutzen dieses Ansatzes in Experimenten ausgeglichen werden, die entweder selektive Agenten-/siRNA/Zellabgabe oder eine erhöhte Homogenität der Wirkstoffabscheidung priorisieren. Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist die Ungewissheit hinsichtlich der Länge der Kathetereinfügung. Wie in Tabelle 1beschrieben, wurden 79 männliche und weibliche Mäuse gemessen, um die Für die selektive IB-Kannulation erforderliche Tiefe der Kathetereinfügung zu schätzen. Diese Daten dienen als Ressource, um den Bediener bei der Ausführung unseres Protokolls zu unterstützen. Wir können unsere Ressource jedoch nicht getrost auf andere Mausstämme (einschließlich Knockout-Mäuse) oder krankhaft fettleibige Mäuse extrapolieren. Darüber hinaus haben wir nicht gemessen, ob es Unterschiede im Luftraumvolumen (Lobar, segmental) gibt, die je nach Gewicht variieren. Daher ist es möglich, dass große Mäuse größere Instillationsvolumina mit IB-Verabreichung aufnehmen können. Daher sollte der Bediener einen ersten Optimierungs-/Fehlerbehebungsschritt (mit EBD-Instillation) durchführen, um sicherzustellen, dass unsere Technik gut an das gewünschte Mausmodell angepasst ist.

Zusammenfassend beschreibt dieser Bericht eine neuartige IB-Technik, die verwendet werden kann, um experimentelle Wirkstoffe selektiv an eine einzelne Lunge zu verabreichen oder angepasst, um eine symmetrische Verteilung in beiden Lungen zu gewährleisten. Diese Vorteile rechtfertigen die marginale Komplexitätssteigerung im Vergleich zu Standard-IT-Techniken.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch NHLBI Grant HL125371 an E.P.S. und durch DOD (CDMRP) Grant W81XWH-17-1-0051 an Y.Y. finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106, (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
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  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47, (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13, (6), 349-358 (2000).
Direkte intrabronchiale Verabreichung zur Verbesserung der selektiven Agentenablagerung innerhalb der Mauslunge
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Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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