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Medicine

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

doi: 10.3791/59450 Published: May 20, 2019

Summary

マウスにおける実験剤の気管内(IT)投与は、しばしば遠位肺への非対称的な送達をもたらす。 本報告では、生きているマウスの各肺を非手術的にカニューレする直接気管支内(IB)アプローチについて述べた。 このアプローチは、1つの肺に薬剤を選択的に投与するために使用することができ、または両方の肺への対称剤送達を改善するために適合されてもよい。

Abstract

実験剤の気管内(IT)投与は、ブレオマイシン誘発肺線維症などの拡散性肺疾患のマウスモデルにおいて不可欠な技術である。 しかし、遠位マウス肺への気管内投与剤の分布はしばしば非対称であり、マウスの左肺の小さい(しかし同様にアクセス可能な)肺の無分別濃度が増加した。 この報告に記載されているのは、生きているマウスの左および/または右の肺を非手術的にカニューレする新しい気管支内(IB)アプローチである。 また、このアプローチを使用して、1つの肺に薬剤を選択的に投与するか、または(用量調整されたIB送達を介して)実験剤の肺送達の左右対称性を改善し、それによって拡散のモデルを改善するためにどのように使用できるかも実証されている。ブレオマイシン誘発肺線維症などの肺疾患。

Introduction

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マウスにおける実験剤の直接肺投与は、肺免疫応答、急性肺損傷、および肺線維症の研究を可能にする。直接肺投与は、典型的には、前述の1、2、3に記載されているように、気管内(IT)インスティレーションを介して行われる。しかし、このアプローチは非選択的であり、非標的およびしばしば非対称的な方法で両方の肺に影響を与える。 肺損傷の実験的モデリングは、1つの特定の肺を選択的に標的化する能力から利益を得ることができ、対照として反対索肺を使用することを可能にする。逆に、ヒト拡散性肺疾患の正確なモデリングは、両側肺無益に対称的な実験剤の分布から利益を得る。

このレポートの全体的な目標は、マウスの左右の肺に実験剤を選択的に送達する方法を記述することです(図1)。この気管支内(IB)投与アプローチは、マウス肺の一方的な治療を可能にし、両側の主体気管支への薬剤の均等な送達を確実にするために容易に適合させることができる。IB投与を使用して、より大きな右肺に大きな用量の実験剤を、より小さな左肺(すなわち、用量調整IB投与)に少量を提供することにより、この報告書で実証された肺の均質性の改善である。実験剤の送達は、マウスにおける拡散性肺損傷のモデルを最適化する。したがって、この報告書は、マウスに実験剤を一方的に投与するか、両肺における薬物沈着の対称性を改善しようとする研究者にとって価値を保持する可能性がある。

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Protocol

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すべての動物プロトコルは、コロラド大学デンバー大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。以下に説明するすべての手順(セクション4-7)は、雄および雌のC57BL/6マウスの両方を使用して最適化されている。このアプローチは、体重19~40gのマウスを用いて検証された。

1. IB管理のためのプラットフォームの構築

  1. 基底翼と立翼の間の元の 90° 角度から 70° にブックエンドを曲げます (図 2A)。
  2. 金属製ブックエンドの立ち翼の中央上部に穴を開けます(図2A)。
  3. プラスチック板の対応する位置で同じサイズの穴をドリルします。2つの小さな穴を下に、横にドリルします(図2A)。
  4. プラスチック板のこれらの小さな穴の間に4:0の絹縫合糸をドレープする(図2A)。
  5. フックテープとループテープをプラスチック製の基板の端に置きます(図2A)。
  6. プラスチック製のボードをネジで金属製のブックエンドに組み立てます(図2B)。必要に応じて、ネジナットが十分にしっかりと基板を固定し、角度の調整を可能にします。
  7. プラスチック製ボードの回転が時計回りと反時計回りに回転し、自由に動いていることを確認します。
    注: 時計回りの動きは、このレポートでは(+)度回転として表され、反時計回りは(-)度回転として表されます。
  8. 角度分度器を使用して、プラスチック板を+30°、+86°、-30°、-74°に配置し、ブックエンドにそれぞれマークします。

2. IB剤投与用拡張カテーテルの作成

  1. 元の22Gカテーテル(25mm、材料の表を参照)の先端に鋭い刃で直角カットを行います(図3、ステップ1a)。
  2. ベベル(〜50°~60°)は、ブレードを使用して他の元のカテーテル(25mm)の先端を切り取り、ハブから直角に切り取ります(図3、ステップ1b)。
  3. 2つのカテーテルを鈍い端に接着し、わずかに180°以下の角度で接着します(図3、ステップ2)。
  4. 低温焼灼で溶かして、ベブ状の先端を鈍くする(材料の表を参照)。
  5. 接着領域に「0」サイズのサンドペーパーと拡張カテーテルのベッベ先端で拡張カテーテルを磨きます(図3、ステップ3)。
  6. 25 mm、30 mm、および 35 mm で異なる色の拡張カテーテルにマークを付けます (図 3、ステップ 3)。
  7. ハブにマーカーでラベルを付け、拡張カテーテルのベベル側を示します。
  8. 拡張カテーテルをDI水で洗い流し、カテーテルの内部を70%エタノールで洗い流します。カテーテルをエアドライ。
  9. 使用前にUV光で10分間殺菌してください。

3. 事前手順の準備

  1. 無菌技術の下で生物学的安全フードですべての投与された薬剤を作る。
  2. 70%のエタノールで職場をきれいにします。
  3. 70%のエタノールが付いているすべての外科用具を殺菌する。
  4. ブックエンドの基底翼にCクランプを貼り付け、研究者の目の前のベンチに作業台のベースを固定します。
  5. マウスの潮流の検出を可能にする装置であるいくつかのメイクシフトスピロメーターを生成します。簡単に言えば、ゲルローディングチップで1 mLシリンジ(プランジャー除去)に殺菌生理生理生理生の60μLを堆積します。
    注:生理生理生理の堆積したドロップは、バレルを閉塞し、潮の換気3にさらされたときに上下に移動します。
  6. 22 G拡張カテーテルのハブをメイクシフトスピロメーターにゆるく取り付けます。
  7. アクセスを容易にするために、各ガラススポイトをプラットフォームの両側に置きます。
  8. イソファラン誘導室をげっ歯類麻酔機(材料の表を参照)に接続し、イソファラン互換の生物学的安全キャビネットに接続します。

4. 非運用型IT挿管アプローチ

  1. C57BL/6マウス(オスまたはメス、8〜10週間、~25g)を酸素(2L/min)と5%のイソルラン(材料の表を参照)を誘導室で4分間麻酔する。
  2. 2つのピペットに渡される実験剤(例えば、エバンスブルー染料またはFITC-dextran)を2つのピペットに吸引し、その後、落とし込む間にプラットフォームの両側に配置します。
  3. 麻酔誘導室からマウスを取り出す前に、約24~30回の呼吸/分の呼吸数を確認してください。
    注:イソファラン麻酔は通常、すべてのIB手順に十分な4分間持続する。オペレータが技術に堪能でない場合、ケタミン/キシラジン(80mg/kgおよび10mg/kgの経後経周期、材料の表を参照)は、より長期の麻酔に使用されてもよい。
  4. スポイン位置のドレープ縫合線上の切り傷によってマウスを中断します。2~3個のフックでマウスを固定し、テープをゆるくループさせ、換気の制限を回避します。
  5. LED光ファイバ照度器をオンにします(「材料の表、図2C」を参照)。
  6. プラットフォームの後ろにオペレータを配置します(マウスに向かいます)。
  7. イルミネーターのグースネックを向けて、皮膚を通して喉頭の領域を照らします。マウスと光源の間の距離は2~3cm(図2C)です。
  8. 以下のすべての手順を実行する前に、つま先/足のピンチで麻酔の深さを確認してください。
  9. 生殖不能鉗子を支配的な手で保持し、鉗子で口腔から舌を引き出します。
  10. 無菌の抑圧器を非支配的な手で保持し、その後、口腔を広く露出させるために、うつ病で舌の根を平らにします。鉗子は、支配的な手を解放し、解放することができます。
  11. 優勢な手を使用して、拡張カテーテルを口腔を介して気管に挿管します(図2C)。
  12. 注射器の泡が呼吸ごとに上下に動くかどうかを観察して配置を確認します。
  13. IT 挿管の追加の詳細は、以前に3.麻酔を除く合計手順時間は、十分な訓練を受けたオペレータに対して10〜15s続く。

5. 非手術IB挿管および送達アプローチ

  1. 遠位右肺の選択的ロバーカネンスに対するIBアプローチ
    1. IT カナンテーション(ステップ 4.11)を実行した後、プラスチック製ボードを +30° (図 4A)回転させます。
    2. カテーテルのハブを保持し、マウスの中線に平行に自然に導き、表 1に説明するように重量ベースの深さまで拡張します。
      注:これらの深さでの抵抗に注意する必要があります。この時点で、マウスは、代表的な結果で説明するように、わずかに頻脈になります。経験豊富なオペレータの場合、約90%の試みは右肺を正常にカナレートします(頻脈が記載されています)。
    3. ゲルローディングチップで0.3%のエバンスブルー染料(EBD、材料の表を参照)の20 μLを提供します。
    4. ガラススポイトを使用して、空気の1-2アリコット(各0.1 mL)を分配します。
      注:これはカテーテルの内部からの残留EBD溶液(または実験剤)のクリアランスを保障する。
    5. カテーテルを引き出し、マウスの位置を30sに維持します。
    6. 意識を取り戻すまで、温かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。
  2. 遠位左肺の選択的セグメントカネンスに対するIBアプローチ
    1. IT カナンテーション(ステップ 4.11)を実行した後、プラスチックボードを -74° (図 4B)回転させます。
    2. カテーテルのハブを保持し、左の主幹気管支にカテーテルを進めるために穏やかな圧力を加え、下向き(90°)およびブックエンドに向かって適度な圧力を置く。表1に記載の深さで、オペレータは左肺の下部セグメントが従事しているので抵抗性に注意する必要があります。頻脈が発生した場合は、カテーテルを20~25mmの位置に引き出し、再試行する。
    3. 左下下肺セグメントをカヌレートした後、薬剤投与のための重力援助を可能にするために位置の変化が必要である。プラスチック板を-30°回転させます(図4B)。
    4. ゲルローディングチップで0.3%EBDの40 μLを提供します。
      注:左肺は1つのローブしか持っていないため、より多くの量の薬剤を提供することが可能です。
    5. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
      注:これはカテーテルの内部からの残留EBD(または実験剤)のクリアランスを保障する。
    6. カテーテルを引き出し、マウスの位置を30sに維持します。
    7. 意識を取り戻すまで、温かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。
  3. 左または右肺全体への薬剤の送達を可能にするIB投与の適応
    注:オペレータが特定の右肺葉または左肺セグメントではなく、肺全体(右または左肺)に薬剤を送り出そうとする場合、カテーテルは、次のように、それぞれの主幹気管支にわずかに引き抜かれるべきである。
    1. 右の肺投与
      1. ステップ 4.11 の後、プラスチック製ボード +30° (図 5A)を回転させます。
      2. カテーテルのハブを保持し、マウスの中線に平行に自然に導き、右側の遠位ロバーのカニテーションに必要な深さに達します(表1)。
      3. 頻脈記号の外観を確認します。
      4. マウスを -74° 回転させて、エージェントの送達に対する重力アシスタンスを有効にします(図5B)。
      5. カテーテルを右の主幹気管支の離陸に相当する位置に引き出す(表1)。カテーテルのベベルが下向きであることを確認します (図 5B)。
      6. 右肺にゲルローディングチップで0.3%EBDの30 μLを提供します。
      7. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
      8. カテーテルを引き出し、30sのマウスの位置を維持し、それが意識を取り戻すまで、暖かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。
    2. 左肺投与
      1. ステップ4.11の後、プラスチック板を-74°(図6A)回転させます。あるいは、カテーテルを気管に引き抜くことによってステップ5.3.1.8の後に回転が起こり、両側IB剤投与を可能にする。
      2. カテーテルのハブを保持し、左の主ステムカテーテルにカテーテルを進めるために穏やかな圧力を加え、下向き(90°)およびブックエンドに向かって適度な圧力を置く。挿管の深さは表 1によって示されます。
      3. 頻脈の兆候がないことを確認します。
      4. マウスを +86° 回転させて、エージェントの投与に対する重力アシスタンスを可能にします。
      5. 左の主体気管支にカテーテルを引き出し(右肺と同じ距離で十分であり、表1)カテーテルの斜体を下方に回転させる(図6B)。
      6. 左肺にゲルローディングチップで0.3%EBDの30 μLを提供します。
      7. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
      8. カテーテルを引き出し、30sのマウスの位置を維持し、それが意識を取り戻すまで、暖かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。

6. 順次IBカネレーションアプローチを使用して、各肺に用量調整量の薬剤を提供する

  1. IT 管理グループ
    1. 手順 4.1 ~ 4.11 に説明するように、IT カナンテーションを実行します。
    2. ゲルローディングチップ(図1B)で0.05%FITC-dextran(材料の表を参照)の60 μLを提供します。
    3. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
    4. 60 s の位置を維持し、上記のようにマウスの回復を可能にします。
  2. 対称二国間 IB 投与
    1. ステップ 5.3.1.1 ~ 5.3.1.8 (右肺) とステップ 5.3.2.1 ~ 5.3.2.8 (左肺) を実行します。
    2. 0.05%のFITC-dextran(または実験剤)の等しい容積(30 μL)を肺の両側に投与する。
  3. 用量調整された二国間IB投与
    1. ステップ 5.3.1.1 ~ 5.3.1.8 (右肺) とステップ 5.3.2.1~ 5.3.2.8 (左肺) を実行します。
    2. より大きな右肺に0.05%のFITC-dextranのより大きな容積(40 μL)を、より小さい左肺に0.05%のFITC-dextranのより小さい容積(20 μL)を投与する。FITC-dextranの代わりに、実験剤を投与することができる。

7. 単回用量ブレオマイシン(BLM)誘発性肺損傷の対称性を改善するための用量調整IB投与の使用

  1. BLM 管理グループ
    1. 用量調整IB-BLM(1.2mg/kg、材料表参照)投与群:BLM溶液の60μL(左肺は20μL、右肺は40μL)をマウスに送達した(n=5)。コントロール (n = 5) は、同様の量の生理生理を受け取りました。
      注: 手順 5.3.1 および 5.3.2 を参照してください。
    2. IT管理群:BLM溶液の60μLをIT投与技術を用いたマウスに送達した。
      注: 手順 6.1.1 ~ 6.1.4 を参照してください。
  2. 肺機能測定
    1. BLMまたは生理生理生理生の後の21日目に、ケタミン(160mg/kg)とキシラジン(32mg/kg)の精肉注射でマウスを麻酔する。
    2. 足/つま先のピンチで麻酔の深さを確認した後、18Gカニューレで気管切開を行う(材料の表を参照)。
    3. マウスを人工呼吸器に接続し、前述の4のように呼吸力学を測定する。
  3. 肺組織の収集と処理
    1. 肺力学の測定に続いて、心臓穿刺によって麻酔マウスを安楽死させる。
    2. 胸壁を開き、両側性気球を誘発する。
    3. 一貫した圧力(42 cm H2O)でPBSで1%低溶融アガロース(40°C)5で肺を膨張させます。
    4. 長い軸に沿って肺の4~5個を横方向に切断し、10%ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込みます。
    5. 5 μmの切片をカットし、マッソンのトリクロムで染色し、コラーゲン堆積を視覚化します。

8 手続き後のケア

  1. 生存手順の最後に、意識を取り戻すまで、動物を暖かい毛布の上に置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。

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Representative Results

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選択的IB挿管は、特定の葉(右肺)またはバジラーセグメント(左肺)を標的とする。

右肺へのEBDのIB投与は、セクション5.1に記載されているように行われた。実験終了後、マウスに皮腔内ケタミン/キシラジンの致死量を投与し、EBD分布のデモンストレーションのために肺を採取した(図4A、右)。肺の総外観は、試みの90%が右肺の小さな後葉をカズにし、試みの10%が下の葉を標的にしたことを示している。これらのローブの小さな体積は、遠位カニプション中にマウスの補償性頻脈を説明すると推測される(カテーテルを通して微細換気を維持するために)。

左肺へのEBDのIB投与は、セクション5.2に記載されているように行われた。試行の100%は左肺の劣ったセグメントを標的とする(図4B)。右側の挿管とは対照的に、このエンゲージメントでは頻脈は起こらず、より大きな左肺セグメントの挿管(および換気)を反映する。

選択的IBカンヌレーション技術の適応は、左または右の肺全体を標的とすることができる。

IBカンヌレーションが行われたら、IBカテーテルの撤退(およびセクション5.3で詳述されているようにマウス位置の変化)を使用して、右肺のすべての葉(および左肺のすべてのセグメント)への薬剤の送達を改善するために使用することができる。右肺へのEBD溶液のインシュート(セクション5.3.1)は、図5Cに示すように、すべての右葉を標的にすることに成功した。左肺へのEBD溶液の浸透(セクション5.3.2)は、すべての左セグメントを標的に成功しました(図6C)。

IT 管理または対称 IB 管理非対称肺を生み出すこれは、IB用量調整によって補正することができる、マレンキマル剤濃度。

マウスは、セクション6.2に記載されているように、左肺に0.05%FITC-dextranの30 μLと0.05%FITC-dextranの30 μLを右肺に二国間投与した。あるいは、マウスはセクション6.1当たり0.05%FITC-デキストランの60μLを受け取った。実験の最後に、マウスを末端麻酔過剰摂取(ケタミン/キシラジン)を介して安楽死させた。肺はすぐに収穫され、均質化された。FITC蛍光(光学密度により定量)を96ウェルプレートリーダーで測定した。日付は、2つのグループ比較のための学生のt検定で分析されました。

図7に詳述したように、FITC-dextranのIT(図7A)と対称IB投与(図7B)の両方が非対称肺無色FITC蛍光を引き起こし、より大きな相対濃度(重量に正規化)を有する。左肺これは、IT投与後の実験剤の非対称肺送達が、各主幹気管支に対するこれらの薬剤の非対称提示の結果ではないことを示唆している。むしろ、表2に観察されるように、等しい主体分娩(対称IB投与によって保証されるように)が肺重量/質量の差によって希釈されたと仮定した。

対称送達のこれらの違いを克服するために、0.05%のFITC-dextranの40 μLを、セクション6.3に応じるように、より小さい左肺に20 μLを投与した。この「用量調整IB投与」は、肺同数剤送達の対称性を改善した(図8A)。しかし、この補正にもかかわらず、右肺の異なる葉の中で持続的な不均一性を観察した(図8B)。

異なる送達システムにおけるBLM誘発肺損傷:

実験剤の用量調整IB投与が拡散性肺疾患のモデリングを改善できることを実証するために、我々はBLM(線維化肺損傷のマウスモデル)を気管内または用量調整されたIB投与を介して、セクションごとに投与した。7.傷害のこのモデルで期待どおり、BLMのITおよびIB注射の両方が肺損傷および全身性疾患(体重減少)につながった。この全身性疾患は7日間で解決した。21日の死亡率は、ITグループで20%(1/5)、用量調整IB群では0%(0/5)であった。

IT-またはIB-BLM投与の21日後に、マウスを肺精素のために採取した。代表的なヒスロジカル画像で示されるように(図9A)

この線維性肺損傷の左右同一性の改善が生理学的に関連しているかどうかを判断するために、BLMの用量調整IB投与は、吸気能力(IC)および呼吸器系コンプライアンスのより一貫した損失を与えることが観察された。(Crs)、ならびに呼吸器系のエラストランス(Ers)の一致した増加(図9B)。

Figure 1
図1:マウス気道の解剖学。(A) マウスの気道キャストは、マウス肺(25gマウスから採取)をシリコンエラストマーで膨らませることによって作られた。(B) 標準的な IT 管理用のカテーテル配置。(C) IB投与のためのカテーテル配置。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 作業プラットフォームのセットアップ。(A) 金属製のブックエンド(90°角)を70°に曲げます。ねじ穴は可動(80 mm x 150 mm)を固定するために上部の中間線に置かれる。フックおよびループテープおよび中断された縫合は板の麻酔されたマウスの位置を可能にするために置かれる。(B) プラスチック製のボードは、金属製のブックエンドにネジで固定されています。ねじは十分に緩んでいて、ボードを時計回り(+)または反時計回り(-)方向に回転させることができます。(C) 麻酔マウスは、IT/IBエージェント管理用のフックおよびループテープ(0.75インチW)を使用して配置されます。縫合糸は、頭部の安定化を可能にするために、マウスの切開部の下に渡されます。オペレータはマウスの後部の側面に置かされ、首はガチョウの首のランプによって照らされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:IB投与用にカスタマイズされたカテーテルの作成(ステップ 1)主幹気管支に従事するのに十分なカテーテルの長さを可能にするために、2つのカテーテルが結合される。(ステップ 2)カテーテルはわずかな角度で接続され、主幹気管支への選択的挿管を容易にする。(ステップ 3)さらに、遠位カテーテル先端は、気道の浸透のより良い方向制御を可能にする、ベベターです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:選択的右/左肺の遺伝子関節の遺伝子組み取りおよび投与のためのアプローチ。(A) 右肺を標的とするために、プラスチック板は+30°回転し、右の主幹線管支を選択的に係合する容易さを改善する。カテーテルは、右側の葉を選択的に係合するために(表1で提案された距離ごとに)進んでいる。0.3%EBDの20μLを投与した。試行の約90%では、後葉がカニューレートされます。試行の残りの10%は、劣ったローブを従事させます。(B) 左肺を標的にするために、プラスチック板は最初に左の主体の関与のために-74°回転する。カテーテルの挿管に成功した後、回転は-30°に減少し、重力がエージェントの送達を支援することを可能にする。左側の選択的関与を証明するために、0.3%EBDの40 μLが送達された。このアプローチは一貫して(試行の100%)左肺基底セグメントを標的とした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:右肺全体に一方的に薬剤を提供する対称投与アプローチ。(A) 右側IB挿管は+30°で行い、選択的右肺ロバーンカネレーションと同一である(図4A)。(B) プラスチック板を-74°に回転させ、薬剤投与中の重力補助を可能にした。カテーテル先端は、右の主幹気管支に対応する表1に詳述された深さに引き抜かれる。先端の斜部はカテーテルのハブを回すことによって下方に置かれる。(C)EBDの30μLを-74°で送達し、EBDの拡散右肺投与を証明した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6:対称管理アプローチ左肺全体に一方的に薬剤を投与する.(A)左側IB挿管は-74°で行い、選択的左肺ロバーンカネレーションと同じ(図4B)。(B) 挿管に成功した後、プラスチック板を+86°回転させて、薬剤投与中の重力補助を可能にした。カテーテルの先端は表1で詳述されている深さに引き出される。先端の斜部はカテーテルのハブを回すことによって下方にシフトされる。(C)EBDの30μLをゲルローディングチップで送達し、EBDの拡散左肺投与を証明した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:実験剤のIT投与は、主幹気管支に等しく送達され、しかも異なる肺無核濃度につながる。(A) 0.05% FITC-dextran(60 μL)のIT投与は、左肺に高い蛍光を与え、送達された薬剤の不均一な肺濃度を示唆した。(B) この不等の肺無分光蛍光は、0.05%FITC-dextran(30 μL)の等しい体積が各主幹気管支に投与された場合でも持続する。この持続的な間質不均衡は、同じ右/左の主幹幹分娩にもかかわらず、肺剤濃度の差がより大きな右肺の希釈を反映することを示唆している(n = 10群当たり)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:用量調整IBによる薬剤沈着の均質性の向上管理。(A) 肺・同化分娩の非対称性は、より大きな右肺に投与される薬剤(40 μLの0.05%FITC-dextran)と、より小さい左肺に対する薬剤(20 μLのFITC-dextran)の割合が小さい場合に改善される。(B) この改善された左右対称性にもかかわらず、エージェント沈着のロバー不均一性が残っている(黒:優れたローブ、黄色:中間ローブ、青:下ローブ、緑:後葉;赤:左肺)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:用量調整IB投与を用いてマウスBLM誘発肺線維症モデルの改善。(A) BLMのIT投与(60μL溶液中1.2mg/kg)は、21日後に左側優勢な肺損傷/線維症を誘発し、この小さな肺における薬剤のより高い肺濃度と一致する。左対称性は、BLMの体積を肺の両側に調整することによって改善される:溶液の40 μLは、より大きな右肺に投与され、溶液の20 μLは、より小さい左肺に投与される。I:劣ったローブ、M:ミドルローブ、S:優れたローブ、P:後葉。イメージは、単一の代表的なマウスのローブを表します。(B) 分布の対称性の向上と一致して、BLMの用量調整IB投与は、肺線維症の生理学的モデリングを改善し、呼吸器系のエラスチング(Ers)のより代表的な増加と減少する吸気容量(IC)および動的呼吸器系のコンプライアンス(Crs)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

体重(g) テストしたマウスの数 カテーテルの深さ(mm)
選択的なカナンレーション用
全肺のカネレーションのためのカテーテルの深さ(mm)
右肺 左肺
15~19 17歳 37歳 38歳 26歳
20~25 22歳 38歳 39歳 27歳
25~30 29歳 39歳 40歳 28歳
> 30 11歳 40歳 41歳 31歳

表 1: カテーテル挿入の推奨深さ。遠位および近位肺を選択的に播種するために必要な予測カテーテル深度は、様々な重量のC57BL/6マウス(合計=79マウス)を用いて経験的に決定した。

体重(g) テストしたマウスの数 肺重量の比率
14~10 25名 2.01 ± 0.16
20~25 35歳 1.88 ± 0.27
25~30 15歳 1.88 ± 0.27
> 30 6 2.03 ± 0.09

表2:右:左肺重量比。81 C57BL/6マウスで観察された肺重量の違いは、補正されたIB薬物投与の根拠を示す。肺を解剖し、ケタミンとキシラジンの致死量の後に重量を量った。

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Discussion

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肺損傷は、BLM6などの有害な薬剤のIT投与を用いてげっ歯類で古典的にモデル化されている。しかし、このようなIT投与は、このアプローチ7を用いて肺送達の非標的性を反映した斑状の傷害を引き起こしうる。肺損傷のモデリングのこれらの制限は、薬物、siRNA、細胞療法などの有害でない実験薬のIT提供を試みる際に直面する有益な課題です。

本報告では、実験剤の直接IB投与について述べた。このアプローチは、IT 管理に対する従来のアプローチに対して 2 つの明確な利点を提供します。第一に、このアプローチは、1つの肺に選択的な一方的な投与を可能にし、反対方の肺のスペアリングを可能にする。このアプローチは、一方的に損傷を受けた肺への薬物の選択的投与(例えば、虚血再灌流損傷8)に有用であり、無傷の肺における非特異的効果を回避する。さらに、腫瘍細胞の指向投与は、原発性腫瘍増殖と反対方向、転移転移9、10を区別するために使用することができる。

第二に、この報告書は、IB投与の以前に認識されていなかった利点を詳述する。図7Aに詳述したように、IT投与は比較的小さい左肺内に実験剤を集中する。この非対称性は、より大きな右肺(表2)に比較的大きな量の薬剤を投与し、より小さい左肺に小さい体積を送ることによって修正することができる(図8A)。BLM誘発線維性肺損傷に対するこの用量調整IB投与の関連性をここで実証した。用量調整は、左肺の損傷を軽減し(BLMを少なくした)、右肺への損傷を増加させる(図9A)。この対称性の増加は、肺機能の測定によって定量化された肺損傷の変動性の低下と一致する(図9B)。

プロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、動物の位置を簡単かつ繰り返し変更できるスタンド(すなわち、回転)が必要です。より重要なのは、選択的肺のカニテーションが達成された時期を決定する能力である。セクション4.12で説明されているように、スピロメーター(水柱が潮の換気を示す)の使用は、成功した気管カニテーション3を保証します。マウス頻脈の観察は遠位右肺セグメントのカンヌレーションと一致し、呼吸困難の欠如(カテーテル挿入による抵抗性にもかかわらず)は左肺のカニュレーションを示唆した。これらの非作動ローカリゼーション技術を使用して、オペレータはIBのカンヌレーションおよび実験剤の堆積を正確に導くことができる必要があります。

この方法にはいくつかの制限があります。エージェントデリバリの IT モデルは、そのシンプルさに魅力的です。熟練したオペレータは、イソファラン麻酔の窓内でこの技術を迅速に行うことができますが、それは、練習と技術的なスキルの適度な程度を必要とします。しかし、必要な追加の技術的スキル/実践は、選択的剤/siRNA/細胞送達または薬剤沈着の均質性の増加を優先する実験において、このアプローチの利点によって容易に相殺されるかもしれません。この方法に対する追加の制限は、カテーテル挿入の長さに関する不確実性です。表1に詳述したように、79匹の雄および雌マウスを測定し、選択的IBカンヌレーションに必要なカテーテル挿入の深さを推定した。これらのデータは、オペレータがプロトコルを実行するように導くリソースとして機能します。しかし、我々は自信を持って他のマウス株(ノックアウトマウスを含む)または病的に肥満マウスにリソースを外挿することはできません。また、重量によって変化する空域量(ロバー、セグメント)に差がある場合は測定していません。したがって、大型マウスは、IB投与により大きなインスティ量を収容することができる可能性がある。したがって、オペレータは、私たちの技術が目的のマウスモデルに十分に適合していることを確認するために、(EBDインスティレーションを使用して)初期最適化/トラブルシューティングステップを実行する必要があります。

要約すると、このレポートは、単一の肺に実験剤を選択的に投与したり、両方の肺全体で対称分布を確保するために適応するために使用することができる新しいIB技術について説明する。これらの利点は、標準的な IT 手法と比較して、複雑さのわずかな増加を正当化します。

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Disclosures

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

Acknowledgments

この研究は、NHLBI助成金HL125371からE.P.S.に、DOD(CDMRP)助成金W81XWH-17-1-0051によってY.Y.Y.に資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

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  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
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マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与
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Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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