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Medicine

Administração Intrabronquial direta para melhorar a deposição do agente seletivo dentro do pulmão do rato

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59450
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Summary

A administração intratraqueal (TI) de agentes experimentais em camundongos geralmente resulta em parto assimétrico para os pulmões distais.  Neste relatório, nós descrevemos uma aproximação intrabronchial direta (IB) para canular cada pulmão em ratos vivos não-operatively.  Essa abordagem pode ser usada para administrar seletivamente agentes a um pulmão ou pode ser adaptada para melhorar a entrega do agente simétrico para ambos os pulmões.

Abstract

A administração intratraqueal (TI) de agentes experimentais é uma técnica essencial em modelos murinos de doenças pulmonares difusas, como a fibrose pulmonar induzida por bleomicina.  Entretanto, a distribuição de agentes intratracheally-administrados ao pulmão longe do ponto de origem do rato é frequentemente assimétrica, com as concentrações parenquimatosas do pulmão aumentadas no pulmão esquerdo menor (mas ingualmente acessível) do rato.  Descrito neste relatório é uma aproximação intrabronchial (IB) nova para canular os pulmões esquerdos e/ou direito de ratos vivos não-operatively.  Também é demonstrado como essa abordagem pode ser usada para administrar seletivamente os agentes a um pulmão ou adaptado (via parto IB ajustado pela dose) para melhorar a simetria esquerda-direita da entrega pulmonar de agentes experimentais, melhorando assim os modelos de difuso doença pulmonar, como a fibrose pulmonar induzida por bleomicina.

Introduction

A administração pulmonar direta de agentes experimentais em camundongos permite o estudo de respostas imunes pulmonares, lesão pulmonar aguda e fibrose pulmonar. A administração pulmonar direta é tipicamente realizada via intratraqueal (IT) instilação, como descrito anteriormente1,2,3. Entretanto, esta aproximação é nonselective, afetando ambos os pulmões em uma forma nonalvejada e frequentemente assimétrica.  A modelagem experimental de lesão pulmonar pode se beneficiar da capacidade de segmentar seletivamente um pulmão específico, permitindo o uso do pulmão contralateral como controle. Inversamente, a modelagem precisa de doenças pulmonares difusas humanas beneficia da distribuição simétrica de agentes experimentais para o parênquima pulmonar bilateral.

O objetivo geral deste relato é descrever um método para a entrega seletiva de agentes experimentais ao pulmão esquerdo ou direito de um camundongo (Figura 1). Esta aproximação da administração do intrabronchial (IB) permite o tratamento unilateral de um pulmão do rato e pode facilmente ser adaptada para assegurar a entrega igual de um agente aos brônquios bilaterais do do mainstem. Ao usar a administração de IB para entregar doses maiores de agentes experimentais ao pulmão direito maior e volumes menores ao pulmão esquerdo menor (isto é, administração dose-ajustada de IB), demonstrado neste relatório é uma melhoria na homogeneidade de pulmonar entrega de agentes experimentais, otimizando o modelo de lesão pulmonar difusa em camundongos. Como tal, este relatório pode prender o valor para investigadores que procuram unilateralmente administrar agentes experimentais aos ratos ou melhorar a simetria da deposição da droga em ambos os pulmões.

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Protocol

Todos os protocolos de animais foram aprovados pela Universidade de Colorado Denver Comitê de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC). Todos os procedimentos descritos abaixo (secções 4 – 7) foram otimizados com ratos machos e fêmeas C57BL/6. Esta aproximação foi validada usando os ratos que variam de 19 – 40 g no peso corporal.

1. criação de plataforma para administração de IB

  1. Dobre o bookend do ângulo 90 ° original entre a asa basal e a asa de pé para 70 ° (Figura 2a).
  2. Faça um furo no centro-parte superior da asa de pé do bookend do metal (Figura 2a).
  3. Perfure um furo do tamanho idêntico na posição correspondente da placa plástica. Perfure dois furos menores inferiormente e lateralmente (Figura 2a).
  4. Drapeje uma sutura de seda 4:0 entre estes pequenos furos na placa plástica (Figura 2a).
  5. Coloque a fita de gancho e laço na borda da placa plástica (Figura 2a).
  6. Montar a placa plástica no bookend de metal com o parafuso (Figura 2b). Assegure-se de que o parafuso-porca esteja suficientemente apertado para prender a placa na posição ao permitir o ajuste do ângulo, se necessário.
  7. Assegure-se de que a rotação da placa plástica seja no sentido horário e anti-horário, movendo-se livremente.
    Nota: o movimento no sentido horário é representado neste relatório como uma rotação do grau (+), e no sentido anti-horário é representado como uma rotação do grau (-).
  8. Use um transferidor do ângulo para posicionar a placa plástica em + 30 °, + 86 °,-30 °, e-74 ° e marcá-los no bookend, respectivamente.

2. criação de cateteres prolongados para administração de agentes IB

  1. Faça um corte de ângulo reto com uma lâmina afiada na ponta de um cateter original de 22 G (25 mm, ver tabela de materiais) (Figura 3, etapa 1a).
  2. Chanfro (~ 50 ° – 60 °) a ponta do outro cateter original (25 mm) com a lâmina, em seguida, cortada no ângulo reto do cubo (Figura 3, Etapa 1b).
  3. Cole os dois cateteres em suas extremidades sem corte com um ângulo ligeiramente inferior a 180 ° (Figura 3, etapa 2).
  4. Blunt a ponta chanfrada derretendo com um cauterização da baixa temperatura (veja a tabela dos materiais).
  5. Polir o cateter estendido com lixa de tamanho "0" na área colada e a ponta chanfrada do cateter estendido (Figura 3, etapa 3).
  6. Marcar no cateter estendido com cores diferentes a 25 mm, 30 mm e 35 mm (Figura 3, etapa 3).
  7. Indique o lado chanfrado do cateter prolongado etiquetando seu cubo com marcador.
  8. Enxague o cateter estendido com água DI, seguindo por rubor dentro do cateter com etanol a 70%. Airdry o cateter.
  9. Esterilizar com luz UV para 10 min antes de usar.

3. preparação do pré-procedimento

  1. Faça todos os agentes administrados em uma capa de segurança biológica a técnica estéril.
  2. Limpe o local de trabalho com 70% de etanol.
  3. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol.
  4. Fixar a base da plataforma de trabalho para o banco imediatamente na frente do pesquisador, afixando C-grampos para a asa basal do bookend.
  5. Gere vários espirômetros improvisados, que são dispositivos que permitirão a detecção de fluxo de ar corrente em camundongos. Momentaneamente, deposite 60 μL de soro fisiológico esterilizado numa seringa de 1 mL (êmbolo removido) com uma ponta de carga em gel.
    Nota: a gota depositada de soro fisiológico fecha o barril e move-se para cima e para baixo quando exposto à ventilação de maré3.
  6. Fixe frouxamente o cubo de um cateter prolongado de 22 G ao espirômetro improvisado.
  7. Coloque cada um dos conta-gotas de vidro para cada lado da plataforma para facilitar o acesso.
  8. Ligue a câmara de indução de isoflurano à máquina de anestesia de roedores (ver tabela de materiais) num gabinete de segurança biológico compatível com isoflurano.

4. não-operatório de ti de intubação abordagem

  1. Anestesie um rato C57BL/6 (macho ou fêmea, 8 – 10 semanas, ~ 25 g) com oxigénio (2 L/min) e 5% isoflurano (ver tabela de materiais) numa câmara de indução durante 4 min.
  2. Aspirar o agente experimental a ser entregue (por exemplo, corante azul de Evans ou FITC-Dextran, como demonstrado na Figura 4) em duas pipetas, em seguida, colocá-los para cada lado da plataforma durante a sedação.
  3. Assegure uma taxa respiratória de aproximadamente 24 – 30 respirs/minuto antes de remover o rato da câmara da indução da anestesia.
    Nota: a anestesia com isoflurano normalmente dura 4 min, suficiente para todos os procedimentos de IB. Se o operador não for proficiente com a técnica, a cetamina/xilazina (80 mg/kg e 10 mg/kg intraperitonealmente, ver tabela de materiais) pode ser usada para anestesia mais prolongada.
  4. Suspenda o rato pelos seus incisivos na linha de sutura drapeada na posição supina. Prenda o rato com duas a três partes de gancho e laço a fita frouxamente, evitando a limitação da ventilação.
  5. Ligue o iluminador de fibra óptica LED (ver tabela de materiais, Figura 2C).
  6. Posicione o operador atrás da plataforma (dorsal para o mouse).
  7. Oriente o gooseneck do iluminador de modo que ilumina a área da laringe através da pele. A distância entre o rato e a fonte luminosa é de 2 – 3 cm (Figura 2C).
  8. Confirme a profundidade da anestesia com uma pitada do dedo do pé/pata antes de executar todos os procedimentos abaixo.
  9. Segure o fórceps estéril com a mão dominante, em seguida, tirar a língua para fora da cavidade oral com o fórceps.
  10. Segure o depressor estéril com a mão não dominante, em seguida, aplainar a raiz da língua com o depressor para expor a orofaringe amplamente. O fórceps pode então ser liberado, liberando a mão dominante.
  11. Use a mão dominante para intubar o cateter estendido na traquéia através da cavidade oral (Figura 2C).
  12. Confirme a colocação observando se a bolha na seringa se move para cima e para baixo com cada respiração.
  13. Detalhes adicionais de intubação de ti foram publicados anteriormente3. O tempo total do procedimento, excluindo a anestesia, dura 10 – 15 s para um operador bem treinado.

5. não-operatório de intubação IB e abordagens de entrega

  1. Abordagem IB para a canulação lobar seletiva do pulmão direito distal
    1. Após a realização da canulação de ti (etapa 4,11), gire a placa plástica + 30 ° (figura 4a).
    2. Segure o cubo do cateter e guie-o naturalmente paralelamente à linha média do mouse, estendendo-a para profundidades à base de peso, conforme descrito na tabela 1.
      Nota: a resistência nestas profundidades deve ser anotada. Neste ponto, o mouse se tornará ligeiramente taquipneico, como explicado nos resultados representativos. Para um operador experiente, aproximadamente 90% das tentativas canular com sucesso o pulmão direito (com taquipneia anotado).
    3. Entregar 20 μL de 0,3% de corante azul Evans (EBD, ver tabela de materiais) com uma ponta de carga em gel.
    4. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 mL cada) de ar usando o conta-gotas de vidro.
      Nota: Isto assegura o afastamento da solução residual de EBD (ou de agentes experimentais) do interior do cateter.
    5. Retire o cateter e, em seguida, mantenha a posição do rato por 30 s.
    6. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.
  2. Abordagem IB para a canulação segmentar seletiva do pulmão esquerdo distal
    1. Após a realização da canulação de ti (etapa 4,11), gire a placa plástica-74 ° (Figura 4B).
    2. Segure o cubo do cateter e aplique uma pressão suave para avançar o cateter no brônquio do pilar esquerdo, enquanto coloca pressão modesta para baixo (90 °) e para o bookend. Nas profundidades anotadas na tabela 1, o operador deve anotar a resistência enquanto os segmentos mais baixos do pulmão esquerdo são acoplados. Se ocorrer taquipnea, retire o cateter para a posição de 20 – 25 mm e tente novamente.
    3. Após canulação os segmentos inferiores esquerdos do pulmão, uma mudança na posição é exigida para permitir o auxílio gravitacional para a administração do agente. Gire a placa plástica-30 ° (Figura 4B).
    4. Entregue 40 μL de 0,3% de EBD com uma ponta de carga de gel.
      Nota: é viável entregar um maior volume de agente porque o pulmão esquerdo tem apenas um lobo.
    5. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando os conta-gotas de vidro.
      Nota: Isto assegura o afastamento de todo o EBD residual (ou agentes experimentais) do interior do cateter.
    6. Retire o cateter e, em seguida, mantenha a posição do rato por 30 s.
    7. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.
  3. Adaptação da administração de IB para permitir a entrega do agente à totalidade do pulmão esquerdo ou direito
    Nota: se o operador procura entregar agentes não a um lobo do pulmão direito específico ou segmento de pulmão esquerdo, mas em vez de todo o pulmão (pulmão direito ou esquerdo), o cateter deve ser ligeiramente retirado para os respectivos brônquios do pilar, como se segue.
    1. Administração pulmonar inteira direita
      1. Após a etapa 4,11, gire a placa plástica + 30 ° (Figura 5a).
      2. Segure o cubo do cateter e guie-o naturalmente paralelamente à linha média do rato, atingindo-o até às profundidades necessárias para a canulação lobar distal do lado direito (tabela 1).
      3. Confirme a aparência do sinal de taquipnea.
      4. Gire o mouse-74 ° para permitir a assistência de gravidade para a entrega do agente (Figura 5b).
      5. Retire o cateter para uma posição que corresponda à decolagem do brônquio do pilar direito (tabela 1). Assegure-se de que o chanfro do cateter enfrenta para baixo (Figura 5b).
      6. Forneça 30 μL de 0,3% de EBD com uma ponta do carregamento do gel ao pulmão direito.
      7. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando um conta-gotas de vidro.
      8. Retire o cateter, em seguida, manter a posição do mouse para 30 s. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.
    2. Administração pulmonar inteira esquerda
      1. Após a etapa 4,11, gire a placa plástica-74 ° (Figura 6a). Alternativamente, a rotação pode ocorrer após a etapa 5.3.1.8 retirando o cateter à traquéia, permitindo a administração bilateral do agente IB.
      2. Segure o cubo do cateter e aplique uma pressão suave para avançar o cateter no cateter do pilar esquerdo, enquanto coloca pressão modesta para baixo (90 °) e para o bookend. A profundidade de intubação é guiada pela tabela 1.
      3. Confirme o sinal sem taquipnea.
      4. Gire o mouse + 86 ° para permitir a assistência por gravidade com a administração do agente.
      5. Retire o cateter para o brônquio do pilar esquerdo (as mesmas distâncias que o pulmão direito são suficientes, tabela 1) e gire o chanfro das faces do cateter para baixo (Figura 6B).
      6. Forneça 30 μL de 0,3% de EBD com uma ponta de carga de gel para o pulmão esquerdo.
      7. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando um conta-gotas de vidro.
      8. Retire o cateter, em seguida, manter a posição do mouse para 30 s. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.

6. uso de abordagens seqüenciais de canulação IB para entregar volumes ajustados por dose de agente a cada pulmão

  1. Grupo de administração de ti
    1. Realize a canulação de ti conforme descrito nas etapas 4.1 – 4.11.
    2. Entregar 60 μL de 0, 5% FITC-Dextran (ver tabela de materiais) com uma ponta de carregamento de gel (Figura 1b).
    3. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando os conta-gotas de vidro.
    4. Mantenha a posição para 60 s e permitir a recuperação do mouse como descrito acima.
  2. Administração bilateral simétrica de IB
    1. Realize etapas 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (pulmão direito) e etapas 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (pulmão esquerdo).
    2. Administrar volumes iguais (30 μL) de 0, 5% FITC-Dextran (ou um agente experimental) para cada lado do pulmão.
  3. Administração bilateral de IB ajustada pela dose
    1. Execute a etapa 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (pulmão direito) e os passos 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (pulmão esquerdo).
    2. Administrar maior volume (40 μL) de 0, 5% FITC-Dextran para o pulmão direito maior, e um volume menor (20 μL) de 0, 5% FITC-Dextran para o pulmão esquerdo menor. Em vez de FITC-Dextran, um agente experimental pode ser administrado.

7. uso da administração de IB ajustada por dose para melhorar a simetria da bleomicina de dose única (BLM)-lesão pulmonar induzida

  1. Grupos de administração BLM
    1. Grupo de administração de IB-BLM (1,2 mg/kg, ver tabela de materiais) ajustado pela Dose: 60 μl (20 μl para o pulmão esquerdo e 40 μl para o pulmão direito, respectivamente) da solução BLM foram entregues em camundongos (n = 5). Os controles (n = 5) receberam volumes similares de soro fisiológico.
      Nota: consulte as etapas 5.3.1 e 5.3.2.
    2. Grupo de administração de ti: 60 μL de solução BLM foram entregues a camundongos com técnicas de administração de ti.
      Nota: consulte as etapas 6.1.1 – 6.1.4.
  2. Medição da função pulmonar
    1. No dia 21 após BLM ou soro fisiológico, anestesiam camundongos com injeção intraperitoneal (IP) de cetamina (160 mg/kg) e xilazina (32 mg/kg).
    2. Depois de confirmar a profundidade da anestesia por pinça pata/dedo do pé, realize uma traqueostomia com uma cânula de 18 G (ver tabela de materiais).
    3. Conecte os camundongos ao ventilador e meça a mecânica respiratória como descrito anteriormente4.
  3. Coleta e processamento de tecido pulmonar
    1. Após a mensuração da mecânica pulmonar, eutanizar os camundongos anestesiados por punção cardíaca.
    2. Abra a parede torácica e induza pneumothoraces bilaterais.
    3. Inflar os pulmões com 1% de agarose de baixa fusão (40 ° c)5 em PBS a uma pressão consistente (42 cm H2O).
    4. Corte quatro a cinco partes do pulmão ao longo da linha central longa transversalmente, repare em formalin de 10%, e incorpore na parafina.
    5. Corte 5 μm secções e mancha com Tricrômico de Masson para visualizar a deposição de colágeno.

8 cuidados pós-processuais

  1. No final dos procedimentos de sobrevivência, coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.

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Representative Results

A intubação seletiva IB tem como alvo lóbulos específicos (pulmão direito) ou segmentos basilares (pulmão esquerdo).

A administração de IB de EBD para o pulmão direito foi realizada conforme descrito na seção 5,1. Após a conclusão do experimento, camundongos foram administrados uma dose letal de cetamina/xilazina intraperitoneal, e os pulmões foram colhidos para demonstração da distribuição de EBD (figura 4a, direita). A aparência bruta do pulmão demonstra que 90% das tentativas canulados o lóbulo do posterior pequeno do pulmão direito, quando 10% das tentativas alvejadas o lóbulo inferior. Especfica-se que os pequenos volumes destes lóbulos explicam a taquipnea compensatória do rato durante a canulação distal (para manter a ventilação minucioso através do cateter).

A administração de IB de EBD para o pulmão esquerdo foi realizada conforme descrito na seção 5,2. 100% das tentativas visam os segmentos inferiores do pulmão esquerdo (Figura 4B). Em contraste com a intubação direito-tomada o partido, nenhuma taquipneina ocorre com este acoplamento, refletindo a intubação (e a ventilação) dos segmentos esquerdos maiores do pulmão.

A adaptação da técnica seletiva do canulação de IB pode alvejar o pulmão esquerdo ou direito inteiro.

Uma vez que o canulação de IB é executado, a retirada do cateter de IB (e as mudanças no posicionamento do rato, como detalhado na seção 5,3) podem ser usadas para melhorar a entrega dos agentes a todos os lóbulos do pulmão direito (e todos os segmentos do pulmão esquerdo). A instilação da solução de EBD ao pulmão direito (seção 5.3.1) alvejou com sucesso todos os lóbulos direito, como demonstrado na Figura 5C. A instilação da solução de EBD ao pulmão esquerdo (seção 5.3.2) alvejou com sucesso todos os segmentos esquerdos (Figura 6C).

Administração de ti ou administração simétrica de IB produz pulmão assimétrico concentrações de agentes parenquimatosos, que podem ser corrigidas pelo ajuste da dose de IB.

Camundongos foram submetidos a administração bilateral de 30 μL de 0, 5% FITC-Dextran para o pulmão esquerdo e 30 μL de 0, 5% FITC-Dextran para o pulmão direito, conforme descrito na seção 6,2. Alternativamente, os ratos receberam 60 μL de 0, 5% de FITC-Dextran intratraqueal como por a seção 6,1. No final do experimento, os camundongos foram eutanasiados por meio de overdose de anestesia terminal (cetamina/xilazina). Os pulmões foram imediatamente colhidos e homogeneizados. FITC-fluorescência (quantificada por densidade óptica) foi medido com leitor de placa 96-well. A data foi analisada com o teste t de Student para comparações de dois grupos.

Conforme detalhado na Figura 7, tanto a ti (Figura 7a) quanto a administração simétrica de IB (Figura 7B) do FITC-Dextran levaram à fluorescência assimétrica do parênquima pulmonar FITC, com maiores concentrações relativas (normalizadas ao peso) observadas na pulmão esquerdo. Isto sugere que a entrega assimétrica do pulmão de agentes experimentais depois que a administração de ti não é uma conseqüência da apresentação assimétrica destes agentes a cada brônquio do do mainstem. Em vez disso, foi possível supor que a entrega de pilares iguais (como assegurada pela administração simétrica de IB) foi diluída por diferenças nos pesos/massa pulmonar, como observado na tabela 2.

Para superar essas diferenças no parto simétrico, 40 μL de 0, 5% FITC-Dextran foi administrado para o pulmão direito maior e 20 μL para o pulmão esquerdo menor, conforme a seção 6,3. Esta "administração de IB ajustada pela dose" melhorou a simetria do parto do agente parenquimatoso pulmonar (figura 8a). Apesar dessa correção, entretanto, observamos heterogeneidade persistente dentro de diferentes lóbulos do pulmão direito (Figura 8B).

Lesão pulmonar induzida por BLM em diferentes sistemas de parto:

Para demonstrar que a administração de IB ajustada por dose de agentes experimentais pode melhorar a modelagem da doença pulmonar difusa, nós administramos BLM (um modelo do rato de ferimento de pulmão fibrosante) intratraqueal ou através da administração dose-ajustada de IB, como por a seção 7. como esperado com este modelo de ferimento, ambas as injeções de ti e IB de BLM levaram a lesão pulmonar e doença sistêmica (com perda de peso). Esta doença sistemática resolvida em 7 dias. a mortalidade de 21 dias foi de 20% (1/5) no grupo de ti e 0% (0/5) no grupo IB ajustado pela dose.

21 dias após a administração de ti ou IB-BLM, os camundongos foram colhidos para histologia pulmonar. Como demonstrado em imagens histológicas representativas (Figura 9A),

Para determinar se esta homogeneidade esquerda-direita melhorada da lesão de pulmão fibrótica é fisiologicamente relevante, observou-se que a administração dose-ajustada de IB de BLM concedeu uma perda mais consistente da capacidade inspiratória (CI) e da conformidade do sistema respiratório (CRS), bem como um aumento concorente na elastância do sistema respiratório (ERS) (Figura 9B).

Figure 1
Figura 1: Anatomia da canulação das vias aéreas do camundongo. (A) um molde da via aérea do rato foi feito inflando um pulmão do rato (colhido de um rato de 25 g) com elastómetro do silicone. (B) colocação do cateter para a administração de ti padrão. C) colocação do cateter para administração de IB. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: configuração para a plataforma de trabalho. (A) um bookend do metal (ângulo de 90 °) é dobrado a 70 °. Um furo do parafuso é coloc na linha central superior para ancorar um móvel (80 milímetros x 150 milímetros). A fita do gancho e do laço e uma sutura suspendendo são coloc para permitir o posicionamento de um rato anestesiado na placa. (B) a placa plástica é ancorada com um parafuso no bookend do metal. O parafuso está suficientemente solto para permitir a rotação do tabuleiro no sentido horário (+) ou anti-horário (-). (C) um mouse anestesiado é posicionado usando com gancho e fita de loop (0,75 "W) para administração de agente de ti/IB. Uma sutura é passada os incisivos do rato para permitir a estabilização principal. O operador é posicionado no aspecto dorsal do rato, e o pescoço é iluminado através de uma lâmpada de pescoço de ganso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: criação de cateteres personalizados para administração de IB. (Passo 1) Para permitir o comprimento suficiente do cateter para acoplar os brônquios do do mainstem, dois cateteres são combinados. (Passo 2) Os cateteres são conectados em um ângulo ligeiro, facilitando a intubação seletiva aos brônquios do do mainstem. (Passo 3) Além disso, a ponta distal do cateter é chanfrada, permitindo melhor controle direcional da instilação das vias aéreas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: abordagem para canulação e administração de lobares pulmonares seletivos à direita/esquerda. (A) para alvejar o pulmão direito, a placa plástica é girada + 30 °, melhorando a facilidade de acoplar seletivamente o brônquio direito do do mainstem. O cateter é avançado (por distâncias propostas na tabela 1) para acoplar seletivamente os lóbulos do lado direito. foram administrados 20 μL de 0,3% de EBD. Em ~ 90% das tentativas, o lobo posterior é canulado. Os restantes 10% das tentativas envolvem o lobo inferior. (B) para alvejar o pulmão esquerdo, a placa plástica é girada primeiramente-74 ° para o acoplamento esquerdo do do mainstem. Após a intubação bem sucedida do cateter, a rotação é diminuída então a-30 ° para permitir que a gravidade ajude com a entrega do agente. Para comprovar o engajamento seletivo do lado esquerdo, 40 μL de 0,3% de EBD foram entregues. Esta aproximação consistentemente (100% das tentativas) alvejou segmentos basilar esquerdos do pulmão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: abordagem de administração simétrica para entregar unilateralmente agentes em todo o pulmão direito. (A) a intubação de IB do lado direito foi realizada a + 30 °, idêntica à canulação lobar do pulmão direito seletivo (figura 4a). (B) a placa plástica foi girada então a-74 ° para permitir a assistência da gravidade durante a administração do agente. A ponta do cateter é então retirada para profundidades detalhadas na tabela 1, correspondendo ao brônquio do pilar direito. O chanfro da ponta é posicionado para baixo girando o cubo do cateter. (C) 30 ΜL de EBD foi entregue em-74 °, provando a administração de pulmão direito difuso de EBD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Abordagem de administração simétrica para administrar unilateralmente agentes a todo o pulmão esquerdo . (A) a intubação do IB esquerdo-tomado o partido foi executada em-74 °, idêntica ao canulação lobar do pulmão esquerdo seletivo (Figura 4B). (B) após uma intubação bem sucedida, a placa plástica foi girada então + 86 ° para permitir a assistência da gravidade durante a administração do agente. A ponta do cateter é então retirada para a profundidade detalhada na tabela 1. O chanfro da ponta é deslocado para baixo girando o cubo do cateter. (C) 30 ΜL de EBD foi entregue com ponta de carga de gel, provando a administração de pulmão esquerdo difuso de EBD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: a administração de ti de agentes experimentais é igualmente entregue aos brônquios do pilar, mas leva a diferentes concentrações parenquimatosas pulmonares. (A) a administração de 0, 5% de FITC-dextran (60 μL) deu maior fluorescência no pulmão esquerdo, sugerindo concentrações irregulares de pulmão do agente entregado. (B) esta fluorescência desigual do parênquima pulmonar persiste mesmo quando volumes iguais de 0, 5% de FITC-Dextran (30 μL) são administrados a cada brônquio de esteem. Este desequilíbrio parenquimatoso persistente, apesar da entrega do pilar direito/esquerdo igual, sugere que as diferenças nas concentrações dos agentes pulmonares refletem a diluição no pulmão direito maior (n = 10 por grupo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: maior homogeneidade da deposição do agente por IB ajustado pela dose administração. (A) a assimetria da entrega do parênquima pulmonar é melhorada quando uma maior proporção de agente (40 μl de 0, 5% FITC-Dextran) é administrada ao pulmão direito maior e uma menor proporção de agente (20 μL de 0, 5% FITC-Dextran) para o pulmão esquerdo menor. (B) Apesar dessa melhora da simetria esquerda-direita, permanece a heterogeneidade lobar da deposição do agente (preto: lobo superior; amarelo: lobo médio; azul: lobo inferior; verde: lobo posterior; vermelho: pulmão esquerdo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: melhoramento do modelo de fibrose pulmonar induzida pelo rato, utilizando a administração de IB ajustada pela dose. (A) Aadministração de blm (1,2 mg/kg em solução de 60 μL) induz lesão pulmonar predominante no lado esquerdo/fibrose 21 dias depois, consistente com concentrações pulmonares mais elevadas de agente neste pulmão menor. A simetria esquerda-direita melhora ajustando o volume de BLM a cada lado do pulmão: 40 μL da solução são administrados ao pulmão direito maior e 20 μL da solução são administrados ao pulmão esquerdo menor. I: lobo inferior, M: lobo médio, S: lobo superior, P: lobo posterior. As imagens representam lóbulos de um único rato representativo. (B) consistente com a melhoria da simetria da distribuição, a administração de IB ajustada pela dose de BLM melhora a modelagem fisiológica da fibrose pulmonar, com aumentos mais representativos da elastância do sistema respiratório (ERS) e diminui em capacidade inspiratória (IC) e a complacência dinâmica do sistema respiratório (CRS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Peso corporal (g) Número de camundongos testados Profundidade do cateter (milímetro)
para o canulação seletivo		 Profundidade do cateter (milímetro) para o canulação inteiro do pulmão
Pulmão direito Pulmão esquerdo
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

Tabela 1: profundidade sugerida de inserção do cateter. As profundidades previstas do cateter necessárias seletivamente canular os pulmões longe do ponto de origem e os proximal foram determinados empiricamente usando C57Bl/6 ratos de vários pesos (total = 79 ratos).

Peso corporal (g) Número de camundongos testados Proporção de pesos pulmonares
14 - 10 25 2, 1 ± 0,16
20 - 25 35 1,88 ± 0,27
25 - 30 15 1,88 ± 0,27
> 30 6 2, 3 ± 0, 9

Tabela 2: direito: relações de peso do pulmão esquerdo. As diferenças nos pesos pulmonares observadas nos camundongos 81 C57BL/6 demonstram justificativa para a administração corrigida da droga IB. Os pulmões foram dissecados e pesados após uma dose letal de cetamina e xilazina.

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Discussion

A lesão pulmonar foi classicamente modelada em roedores usando a administração de ti de agentes prejudiciais como o BLM6. Tal administração de ti, no entanto, só leva a lesões irregulares, refletindo a natureza não direcionada do parto pulmonar com essa abordagem7. Estas limitações da modelagem de lesão pulmonar são desafios instrutivo enfrentados ao tentar a entrega de ti de agentes experimentais não-prejudiciais, tais como drogas, siRNA, ou terapias celulares.

Neste relato, descrevemos a administração direta de IB de agentes experimentais. Esta abordagem oferece dois benefícios distintos sobre abordagens clássicas para a administração de ti. Primeiramente, a aproximação permite a administração unilateral seletiva a um pulmão, reservando poupando do pulmão contralateral. Esta abordagem é útil para a administração seletiva de drogas em um pulmão unilateral ferido (por exemplo, lesão de isquemia-reperfusão8), evitando efeitos inespecíficos no pulmão não lesionado. Além disso, a administração dirigida de pilhas do tumor pode ser usada para distinguir o crescimento preliminar do tumor da propagação contralateral, metastática9,10.

Em segundo lugar, o relatório detalha um benefício previamente não reconhecido da administração IB. Conforme detalhado na Figura 7a, a administração de ti concentra relativamente os agentes experimentais dentro do pulmão esquerdo menor. Esta assimetria pode ser corrigida através da administração de um volume relativamente maior de agente para o pulmão direito maior (tabela 2), enquanto entregando um volume menor para o pulmão esquerdo menor (figura 8a). A relevância desta administração dose-ajustada do IB à lesão fibrótica BLM-induzida do pulmão foi demonstrada aqui. O ajuste da dose atenua o ferimento ao pulmão esquerdo (que recebeu menos BLM), ao aumentar ferimento ao pulmão direito (Figura 9A). Esse aumento da simetria coincide com a diminuição da variabilidade da lesão pulmonar, quantificada por medidas de função pulmonar (Figura 9B).

Existem várias etapas críticas no protocolo, incluindo a necessidade de ter um estande capaz de alterar facilmente e repetidamente o posicionamento dos animais (ou seja, rotação). Mais crítico é a habilidade de determinar quando o canulação seletivo do pulmão foi conseguido. Conforme descrito na seção 4,12, o uso de um espirômetro (no qual uma coluna de água demonstra ventilação de maré) assegura a canulação traqueal bem-sucedida3. A observação da taquipneia do rato é consistente com o canulação do segmento do pulmão direito longe do ponto de origem, quando a ausência de dispnéia (apesar da resistência do sentimento com inserção do cateter) sugeriu o canulação do pulmão esquerdo. Usando essas técnicas de localização não-operatória, o operador deve ser capaz de orientar com precisão a canulação de IB e a deposição de agente experimental.

Essa abordagem tem várias limitações. O modelo de ti da entrega do agente é atrativo em sua simplicidade. Requer um grau moderado de prática e habilidade técnica, embora um operador habilidoso ainda possa executar rapidamente esta técnica dentro da janela de anestesia isoflurana. A habilidade/prática técnica adicional exigida, entretanto, pode facilmente ser compensada pelo benefício desta aproximação nos experimentos que priorizam o agente seletivo/siRNA/entrega da pilha ou a homogeneidade aumentada da deposição do agente. Uma limitação adicional a esse método é a incerteza quanto ao comprimento da inserção do cateter. Conforme detalhado na tabela 1, 79 camundongos machos e fêmeas foram medidos para estimar a profundidade de inserção do cateter necessária para a canulação seletiva de IB. Esses dados servem como um recurso para orientar o operador para executar o nosso protocolo. No entanto, não podemos extrapolar com confiança nosso recurso para outras cepas de mouse (incluindo camundongos Knockout) ou camundongos obesos mórbidos. Além disso, não medimos se há diferenças no volume do espaço aéreo (lobar, segmental) que variam de acordo com o peso. Como tal, é possível que grandes camundongos podem ser capazes de acomodar maiores volumes de instilação com administração IB. Assim, o operador deve executar uma etapa inicial de otimização/solução de problemas (usando a instilação de EBD) para garantir que nossa técnica seja bem adaptada ao modelo de mouse desejado.

Em resumo, este relatório descreve uma técnica nova do IB que possa ser usada para administrar seletivamente agentes experimentais a um único pulmão ou ser adaptado para assegurar a distribuição simétrica durante todo ambos os pulmões. Estes benefícios justificam o aumento marginal da complexidade em comparação com as técnicas de ti padrão.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NHLBI Grant HL125371 para E.P.S. e pelo DOD (CDMRP) subvenção W81XWH-17-1-0051 para Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
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  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).

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Medicina edição 147 instilação intratraqueal instilação intrabronquial fibrose pulmonar bleomicina camundongo lesão pulmonar
Administração Intrabronquial direta para melhorar a deposição do agente seletivo dentro do pulmão do rato
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Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt,… More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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