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Medicine

Administración intrabronquial directa para mejorar la deposición selectiva del agente dentro del pulmón del ratón

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59450
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Summary

La administración intratraal (IT) de agentes experimentales en ratones a menudo resulta en un parto asimétrico a los pulmones distales.  En este informe, describimos un enfoque intrabronquial directo (IB) para canalizar cada pulmón en ratones vivos de forma no operativa.  Este enfoque se puede utilizar para administrar selectivamente agentes a un pulmón o puede adaptarse para mejorar el suministro de agentes simétricos a ambos pulmones.

Abstract

La administración intratraqueal (IT) de agentes experimentales es una técnica esencial en modelos murinos de enfermedades pulmonares difusas, como la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina.  Sin embargo, la distribución de agentes administrados por vía intratratal al pulmón del ratón distal es a menudo asimétrica, con concentraciones parénquimas pulmonares incrementadas en el pulmón izquierdo más pequeño (pero igualmente accesible) del ratón.  En este informe se describe un nuevo enfoque intrabronquial (IB) para canalizar los pulmones izquierdo y/o derecho de ratones vivos de forma no operativa.  También se demuestra cómo este enfoque puede utilizarse para administrar selectivamente agentes a un pulmón o adaptados (mediante la administración de IB ajustada por dosis) para mejorar la simetría izquierda-derecha de la administración pulmonar de agentes experimentales, mejorando así los modelos de difusión difundido enfermedad pulmonar como la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina.

Introduction

La administración pulmonar directa de agentes experimentales en ratones permite el estudio de las respuestas inmunitarias pulmonares, la lesión pulmonar aguda y la fibrosis pulmonar. La administración pulmonar directa se realiza típicamente a través de la instilación intratrahealal (IT), como se describió anteriormente1,2,3. Sin embargo, este enfoque no es selectivo, afectando ambos pulmones de una manera no objetivo y a menudo asimétrica.  El modelado experimental de la lesión pulmonar puede beneficiarse de la capacidad de apuntar selectivamente a un pulmón específico, permitiendo el uso del pulmón contralateral como control. Por el contrario, el modelado preciso de las enfermedades pulmonares difusas humanas se beneficia de la distribución simétrica de agentes experimentales al parénquima pulmonar bilateral.

El objetivo general de este informe es describir un método para la entrega selectiva de agentes experimentales al pulmón izquierdo o derecho de un ratón (Figura 1). Este enfoque de administración intrabronquial (IB) permite el tratamiento unilateral de un pulmón ratón y se puede adaptar fácilmente para garantizar la entrega equitativa de un agente a los bronquios bilaterales del tronco principal. Mediante el uso de la administración del IB para administrar dosis mayores de agentes experimentales en el pulmón derecho más grande y volúmenes más pequeños en el pulmón izquierdo más pequeño (es decir, la administración del IB ajustada a la dosis), demostrada en este informe es una mejora en la homogeneidad de la agentes experimentales, optimizando el modelo de lesión pulmonar difusa en ratones. Como tal, este informe puede tener valor para los investigadores que buscan administrar unilateralmente agentes experimentales a ratones o mejorar la simetría de la deposición de fármacos en ambos pulmones.

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Protocol

Todos los protocolos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de la Universidad de Colorado denver. Todos los procedimientos descritos a continuación (secciones 4–7) se han optimizado utilizando ratones C57BL/6 masculinos y femeninos. Este enfoque ha sido validado utilizando ratones que van de 19-40 g en peso corporal.

1. Creación de una plataforma para la administración del IB

  1. Doblar el extremo del libro desde el ángulo original de 90o entre el ala basal y el ala de pie a 70o (Figura2A).
  2. Taladre un agujero en la parte superior central del ala de pie del libro de metal (Figura2A).
  3. Taladre un agujero de tamaño idéntico en la posición correspondiente de la placa de plástico. Taladre dos agujeros más pequeños inferior y lateralmente (Figura2A).
  4. Cubra una sutura de seda 4:0 entre estos pequeños agujeros en la placa de plástico (Figura2A).
  5. Coloque el gancho y la cinta de bucle en el borde de la placa de plástico (Figura2A).
  6. Montar la placa de plástico en el bookend de metal con el tornillo (Figura 2B). Asegúrese de que la tuerca de tornillo esté lo suficientemente apretada para mantener la placa en posición mientras permite ajustar el ángulo, si es necesario.
  7. Asegúrese de que la rotación de la placa de plástico sea en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj, moviéndose libremente.
    NOTA: El movimiento en el sentido de las agujas del reloj se representa en este informe como una rotación de grado (+) y en sentido contrario a las agujas del reloj se representa como una rotación de grado (-).
  8. Utilice un transportador angular para colocar la placa de plástico a +30o, +86o, -30o y -74o y márquelos en el extremo del libro, respectivamente.

2. Creación de catéteres extendidos para la administración de agentes del IB

  1. Haga un corte en ángulo recto con una cuchilla afilada en la punta de un catéter original de 22 G (25 mm, ver Tabla de materiales)(Figura3, paso 1a).
  2. Biselado (50o–60o) la punta del otro catéter original (25 mm) con la cuchilla y, a continuación, corte en ángulo recto desde el cubo (Figura3, paso 1b).
  3. Pegue los dos catéteres en sus extremos contundentes con un ángulo ligeramente inferior a 180o (Figura3, paso 2).
  4. Desnatar la punta biselada derritiéndose con una cadencia a baja temperatura (ver Tabla de Materiales).
  5. Pulir el catéter extendido con papel de lija de tamaño "0" en el área encolada y la punta biselada del catéter extendido (Figura3, paso 3).
  6. Marque en el catéter extendido con diferentes colores a 25 mm, 30 mm y 35 mm (Figura3, paso 3).
  7. Indique el lado biselado del catéter extendido etiquetando su cubo con marcador.
  8. Enjuague el catéter extendido con agua DI, después de lavar el interior del catéter con 70% de etanol. Seque el catéter.
  9. Esterilice con luz UV durante 10 minutos antes de su uso.

3. Preparación previa al procedimiento

  1. Hacer todos los agentes administrados en una campana de seguridad biológica bajo técnica estéril.
  2. Limpie el lugar de trabajo con un 70% de etanol.
  3. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas con un 70% de etanol.
  4. Fije la base de la plataforma de trabajo al banco inmediatamente delante del investigador mediante la colocación de abrazaderas C en el ala basal del extremo del libro.
  5. Generar varios espirómetros improvisados, que son dispositivos que permitirán la detección del flujo de aire de marea en ratones. En resumen, deposite 60 ml de salina esterilizada en una jeringa de 1 ml (plunger eliminado) con una punta de carga de gel.
    NOTA: La gota depositada de oclusión salina el barril y se mueve hacia arriba y hacia abajo cuando se expone a la ventilación de marea3.
  6. Fije libremente el cubo de un catéter extendido de 22 G al espirómetro improvisado.
  7. Coloque cada uno de los cuentagotas de vidrio a cada lado de la plataforma para facilitar el acceso.
  8. Conecte la cámara de inducción de isoflurano a la máquina de anestesia de roedores (ver Tabla de Materiales)en un gabinete de seguridad biológica compatible con isoflurano.

4. Enfoque de intubación de TI no operativo

  1. Anestetizar un ratón C57BL/6 (masculino o femenino, 8-10 semanas, 25 g) con oxígeno (2 L/min) y 5% de isoflurano (ver Tabla de Materiales)en una cámara de inducción durante 4 min.
  2. Aspirar el agente experimental a entregar (por ejemplo, tinte azul Evans o FITC-dextran, como se muestra en la Figura 4) en dos pipetas, luego colóquelas a cada lado de la plataforma durante la sedación.
  3. Asegurar una frecuencia respiratoria de aproximadamente 24–30 respiraciones/min antes de extraer el ratón de la cámara de inducción de anestesia.
    NOTA: La anestesia con isoflurano suele durar 4 minutos, suficiente para todos los procedimientos del IB. Si el operador no es competente con la técnica, se puede utilizar ketamina/xilazina (80 mg/kg y 10 mg/kg por vía intraperitoneal, ver Tabla de materiales)para una anestesia más prolongada.
  4. Suspenda el ratón por sus incisivos en la línea de sutura cubierta en la posición supina. Asegure el ratón con dos o tres piezas de gancho y coloque la cinta libremente, evitando la restricción de la ventilación.
  5. Encienda el iluminador de fibra óptica LED (consulte Tabla de materiales, Figura 2C).
  6. Coloque al operador detrás de la plataforma (dorsal al ratón).
  7. Orientar el cuello de cisne del iluminador para que ilumine la zona de la laringe a través de la piel. La distancia entre el ratón y la fuente de luz es de 2-3 cm (Figura2C).
  8. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco de dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del toque antes de realizar todos los procedimientos a continuación.
  9. Sostenga los fórceps estériles con la mano dominante, luego extraiga la lengua de la cavidad oral con los fórceps.
  10. Sostenga el depresor estéril con la mano no dominante, luego aplanar la raíz de la lengua con el depresor para exponer la orofaringe ampliamente. Los fórceps pueden ser liberados, liberando la mano dominante.
  11. Utilice la mano dominante para intubar el catéter extendido en la tráquea a través de la cavidad oral (Figura2C).
  12. Confirme la colocación observando si la burbuja de la jeringa se mueve hacia arriba y hacia abajo con cada respiración.
  13. Los detalles adicionales de la intubación de TI se han publicado previamente3. El tiempo total del procedimiento, excluyendo la anestesia, dura de 10 a 15 s para un operador bien entrenado.

5. Enfoques de intubación y entrega del IB no operativos

  1. Enfoque IB para la cannulación selectiva de lobar del pulmón derecho distal
    1. Después de realizar la cannulación de TI (paso 4.11), gire la placa de plástico +30o (Figura4A).
    2. Sostenga el cubo del catéter y guíelo naturalmente en paralelo a la línea media del ratón, extendiéndolo a profundidades basadas en el peso como se describe en la Tabla1.
      NOTA: Debe tenerse en cuenta la resistencia a estas profundidades. En este punto, el ratón se volverá ligeramente taquipneico, como se explica en los resultados representativos. Para un operador experimentado, aproximadamente el 90% de los intentos cannuarán con éxito el pulmón derecho (con taquipnea observada).
    3. Proporcione 20 ml de tinte azul Evans al 0,3% (EBD, ver Tabla de materiales)con una punta de carga de gel.
    4. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1 ml cada una) de aire mediante el uso del gotero de vidrio.
      NOTA: Esto garantiza el aclaramiento de la solución residual de EBD (o agentes experimentales) desde el interior del catéter.
    5. Retire el catéter y, a continuación, mantenga la posición del ratón durante 30 s.
    6. Coloque el animal sobre una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.
  2. Enfoque IB para la cannulación segmental selectiva del pulmón izquierdo distal
    1. Después de realizar la cannulación de TI (paso 4.11), gire la placa de plástico -74o (Figura4B).
    2. Sostenga el cubo del catéter y aplique una presión suave para avanzar el catéter en el bronquio del tronco principal izquierdo, mientras coloca una presión modesta tanto hacia abajo (90o) como hacia el extremo del libro. A las profundidades indicadas en la Tabla 1, el operador debe observar la resistencia a medida que se enganchan los segmentos inferiores del pulmón izquierdo. Si se produce taquipnea, retire el catéter a la posición de 20-25 mm y vuelva a intentarlo.
    3. Después de cánular los segmentos pulmonares inferiores izquierdos, se requiere un cambio de posición para permitir la asistencia gravitacional para la administración del agente. Gire la placa de plástico -30o (Figura4B).
    4. Proporcione 40 ml de EBD al 0,3% con una punta de carga de gel.
      NOTA: Es factible entregar un mayor volumen de agente porque el pulmón izquierdo tiene solo un lóbulo.
    5. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire utilizando los goteros de vidrio.
      NOTA: Esto garantiza el aclaramiento de cualquier EBD residual (o agentes experimentales) desde el interior del catéter.
    6. Retire el catéter y, a continuación, mantenga la posición del ratón durante 30 s.
    7. Coloque el animal sobre una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.
  3. Adaptación de la administración del IB para permitir la administración del agente a la totalidad del pulmón izquierdo o derecho
    NOTA: Si el operador busca entregar agentes no a un lóbulo pulmonar derecho específico o segmento pulmonar izquierdo, sino más bien a todo el pulmón (pulmón derecho o izquierdo), el catéter debe retirarse ligeramente a los respectivos bronquios del tronco principal, como se indica a continuación.
    1. Administración pulmonar completa correcta
      1. Después del paso 4.11, gire la placa de plástico +30o (Figura5A).
      2. Sostenga el cubo del catéter y guíelo naturalmente en paralelo a la línea media del ratón, llegando a las profundidades necesarias para la cannulación de lobar distal del lado derecho (Tabla 1).
      3. Confirme la aparición del signo de taquipnea.
      4. Gire el ratón -74o para habilitar la asistencia por gravedad para la entrega del agente (Figura5B).
      5. Retirar el catéter a una posición que corresponda al despegue del bronquio del tronco principal derecho (Tabla 1). Asegúrese de que el bisel del catéter esté mirando hacia abajo (Figura5B).
      6. Entregar 30 sl de EBD al 0,3% con una punta de carga de gel en el pulmón derecho.
      7. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire con un gotero de vidrio.
      8. Retire el catéter, luego mantenga la posición del ratón durante 30 s. Coloque el animal en una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.
    2. Administración pulmonar entera a la izquierda
      1. Después del paso 4.11, gire la placa de plástico -74o (Figura6A). Alternativamente, la rotación puede ocurrir después del paso 5.3.1.8 retirando el catéter a la tráquea, lo que permite la administración bilateral del agente del IB.
      2. Sostenga el cubo del catéter y aplique una presión suave para avanzar el catéter en el catéter del tronco principal izquierdo, mientras coloca una presión modesta tanto hacia abajo (90o) como hacia el bookend. La profundidad de la intubación se guía por la Tabla1.
      3. Confirme la señal de no taquipnea.
      4. Gire el ratón +86o para permitir la asistencia de gravedad con la administración del agente.
      5. Retirar el catéter al bronquio del tronco principal izquierdo (las mismas distancias que el pulmón derecho son suficientes, Tabla 1) y gire el bisel del catéter hacia abajo (Figura6B).
      6. Entregar 30 sl de EBD al 0,3% con una punta de carga de gel en el pulmón izquierdo.
      7. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire con un gotero de vidrio.
      8. Retire el catéter, luego mantenga la posición del ratón durante 30 s. Coloque el animal en una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.

6. Uso de enfoques secuenciales de cánula IB para administrar volúmenes de agente ajustados a la dosis a cada pulmón

  1. Grupo de administración de TI
    1. Realice la cánula ción de TI como se describe en los pasos 4.1–4.11.
    2. Entregar 60 ml de 0,05% FITC-dextran (ver Tabla de Materiales)con una punta de carga de gel (Figura1B).
    3. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire utilizando los goteros de vidrio.
    4. Mantenga la posición durante 60 s y permita la recuperación del ratón como se describió anteriormente.
  2. Administración bilateral simétrica del IB
    1. Realice los pasos 5.3.1.1–5.3.1.8 (pulmón derecho) y los pasos 5.3.2.1–5.3.2.8 (pulmón izquierdo).
    2. Administrar volúmenes iguales (30 l) de 0,05% FITC-dextran (o un agente experimental) a cada lado del pulmón.
  3. Administración bilateral del IB ajustada a la dosis
    1. Realice los pasos 5.3.1.1–5.3.1.8 (pulmón derecho) y los pasos 5.3.2.1–5.3.2.8 (pulmón izquierdo).
    2. Administrar un volumen mayor (40 l) de 0,05% de FITC-dextran al pulmón derecho más grande, y un volumen más pequeño (20 l) de 0,05% DE FITC-dextran al pulmón izquierdo más pequeño. En lugar de FITC-dextran, se puede administrar un agente experimental.

7. Uso de la administración del IB ajustada por dosis para mejorar la simetría de una lesión pulmonar inducida por bleomicina monodosis (BLM)

  1. Grupos de administración de BLM
    1. IB-BLM ajustado a la dosis (1,2 mg/kg, ver Tabla de materiales) grupo de administración: 60 l (20 l para el pulmón izquierdo y 40 l para el pulmón derecho, respectivamente) de solución de BLM se administraron en ratones (n .5). Los controles (n x 5) recibieron volúmenes similares de salina.
      NOTA: Consulte los pasos 5.3.1 y 5.3.2.
    2. Grupo de administración de TI: se entregaron 60 l de solución de BLM a ratones con técnicas de administración de TI.
      NOTA: Consulte los pasos 6.1.1–6.1.4.
  2. Medición de la función pulmonar
    1. El día 21 después de BLM o salina, los ratones anestetizan con una inyección intraperitoneal (IP) de ketamina (160 mg/kg) y xilazina (32 mg/kg).
    2. Después de confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco de pata/dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo, realice una traqueotomía con una cánula de 18 G (ver Tabla de Materiales).
    3. Conecte los ratones al respirador y mida la mecánica respiratoria como se describió anteriormente4.
  3. Recolección y procesamiento de tejido pulmonar
    1. Tras la medición de la mecánica pulmonar, eutanasia a los ratones anestesiados por punción cardíaca.
    2. Abra la pared torácica e induzca neumotóramos bilaterales.
    3. Inflar los pulmones con 1% de agarosa de fusión baja (40 oC)5 en PBS a una presión constante (42 cm H2O).
    4. Cortar de cuatro a cinco trozos del pulmón a lo largo del eje largo transversalmente, fijar en 10% de formalina, e incrustar en parafina.
    5. Corta 5 secciones y tensa con el tricromo de Masson para visualizar la deposición de colágeno.

8 Atención postprocesal

  1. Al final de los procedimientos de supervivencia, coloque al animal en una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.

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Representative Results

La intubación selectiva del IB se dirige a lóbulos específicos (pulmón derecho) o segmentos basilares (pulmón izquierdo).

La administración del IB de EBD al pulmón derecho se realizó como se describe en la sección 5.1. Después de la finalización del experimento, a los ratones se les administró una dosis letal de ketamina/xilazina intraperitoneal, y los pulmones fueron cosechados para la demostración de la distribución de EBD (Figura4A,derecha). La apariencia bruta del pulmón demuestra que el 90% de los intentos canularon el pequeño lóbulo posterior del pulmón derecho, mientras que el 10% de los intentos apuntaron al lóbulo inferior. Se especula que los pequeños volúmenes de estos lóbulos explican la taquipnea compensatoria del ratón durante la cánula distal (para mantener la ventilación diminal a través del catéter).

La administración del IB de EBD en el pulmón izquierdo se realizó como se describe en la sección 5.2. El 100% de los intentos se dirigen a los segmentos inferiores del pulmón izquierdo (Figura4B). En contraste con la intubación del lado derecho, no se produce taquipnea con este compromiso, lo que refleja la intubación (y ventilación) de los segmentos pulmonares izquierdos más grandes.

La adaptación de la técnica de cánula selectiva del IB puede dirigirse a todo el pulmón izquierdo o derecho.

Una vez realizada la cánula del IB, la retirada del catéter IB (y los cambios en el posicionamiento del ratón, como se detalla en la sección 5.3) se pueden utilizar para mejorar la administración de agentes a todos los lóbulos del pulmón derecho (y a todos los segmentos del pulmón izquierdo). La insitación de la solución EBD en el pulmón derecho (sección 5.3.1) se dirigió con éxito a todos los lóbulos correctos, como se muestra en la Figura 5C. Inspílización de la solución EBD en el pulmón izquierdo (sección 5.3.2) se dirigió de manera exitosa a todos los segmentos izquierdos (Figura6C).

Administración de TI o administración simétrica del IB produce pulmón asimétrico concentraciones de agente parenquimales, que se pueden corregir mediante el ajuste de la dosis del IB.

Los ratones fueron sometidos a una administración bilateral de 30 ml de 0,05% de FITC-dextran al pulmón izquierdo y 30 oL de 0,05% de FITC-dextran al pulmón derecho, como se describe en la sección 6.2. Alternativamente, los ratones recibieron 60 ml de 0,05% de FITC-dextran por vía intrachealla según la sección 6.1. Al final del experimento, los ratones fueron eutanasiados a través de una sobredosis de anestesia terminal (ketamina/xilazina). Los pulmones fueron inmediatamente cosechados y homogeneizados. La fluorescencia FITC (cuantificada por densidad óptica) se midió con un lector de placas de 96 pocillos. La fecha se analizó con la prueba t del estudiante para comparaciones de dos grupos.

Como se detalla en la Figura 7, tanto la TI (Figura7A)como la administración simétrica del IB (Figura7B)de FITC-dextran dieron lugar a fluorescencia proempimal pulmonar asimétrica, con mayores concentraciones relativas (normalizadas al peso) observadas en el pulmón izquierdo. Esto sugiere que la administración pulmonar asimétrica de agentes experimentales después de la administración de TI no es una consecuencia de la presentación asimétrica de estos agentes a cada bronquio del tronco principal. Más bien, se hipotetizó que la misma administración del tronco principal (garantizada por la administración simétrica del IB) se diluyó por diferencias en el peso/masa pulmonar, como se observa en el Cuadro2.

Para superar estas diferencias en la administración simétrica, se administró 40 ml de 0,05% de FITC-dextran al pulmón derecho más grande y de 20 oL al pulmón izquierdo más pequeño, según la sección 6.3. Esta "administración del IB ajustada a la dosis" mejoró la simetría de la administración de agente parénquimal pulmonar (Figura8A). A pesar de esta corrección, sin embargo, observamos heterogeneidad persistente dentro de diferentes lóbulos del pulmón derecho (Figura8B).

Lesión pulmonar inducida por BLM en diferentes sistemas de administración:

Para demostrar que la administración de agentes experimentales del IB ajustada a la dosis puede mejorar el modelado de la enfermedad pulmonar difusa, administramos BLM (un modelo de ratón de lesión pulmonar fibrosa) ya sea por vía intrafrecuencia o a través de la administración del IB ajustada por dosis, según la sección 7. Como se espera con este modelo de lesión, tanto las inyecciones de TI como de IB de BLM dieron lugar a lesiones pulmonares y enfermedades sistémicas (con pérdida de peso). Esta enfermedad sistémica se resolvió en 7 días. La mortalidad de 21 días fue del 20% (1/5) en el grupo de TI y del 0% (0/5) en el grupo IB ajustado a la dosis.

21 días después de la administración de TI o IB-BLM, los ratones fueron cosechados para la histología pulmonar. Como se demuestra en las imágenes histológicas representativas (Figura9A),

Para determinar si esta mejor homogeneidad izquierda-derecha de la lesión pulmonar fibrosa es fisiológicamente relevante, se observó que la administración del IB ajustada por dosis de BLM impartió una pérdida más consistente de la capacidad inspiratoria (IC) y el cumplimiento del sistema respiratorio (Crs), así como un aumento concordante en el sistema respiratorio elastance (Ers) (Figura9B).

Figure 1
Figura 1: Anatomía de la cannulación de las vías respiratorias del ratón. (A) Se hizo un molde de ratón inflando un pulmón de ratón (cosechado a partir de un ratón de 25 g) con elastómero de silicio. (B) Colocación del catéter para la administración estándar de TI. (C) Colocación del catéter para la administración del IB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración de la plataforma de trabajo. (A) Un bookend metálico (ángulo de 90o) se dobla a 70o. Se coloca un orificio de tornillo en la línea media superior para anclar un móvil (80 mm x 150 mm). La cinta de gancho y bucle y una sutura de suspensión se colocan para permitir el posicionamiento de un ratón anestesiado en la placa. (B) La placa de plástico está anclada con un tornillo en la punta de libro de metal. El tornillo está lo suficientemente suelto para permitir la rotación de la placa en el sentido de las agujas del reloj (+) o en el sentido contrario a las agujas del reloj (-). (C) Un ratón anestesiado se coloca utilizando cinta de gancho y bucle (0,75" W) para la administración del agente it/IB. Una sutura se pasa debajo de los incisivos del ratón para permitir la estabilización de la cabeza. El operador se coloca en el aspecto dorsal del ratón, y el cuello se ilumina a través de una lámpara de cuello de ganso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Creación de catéteres personalizados para la administración del IB. (Paso 1) Para permitir que la longitud suficiente del catéter atraiga los bronquios del tronco principal, se combinan dos catéteres. (Paso 2) Los catéteres están conectados en un ángulo leve, facilitando la intubación selectiva a los bronquios del tronco principal. (Paso 3) Además, la punta del catéter distal se bisela, lo que permite un mejor control direccional de la instilación de las vías respiratorias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Enfoque para la cannulación y administración selectivas de la barra de lobar pulmonar derecha/izquierda. (A) Para apuntar al pulmón derecho, la placa de plástico se gira +30o, mejorando la facilidad de enganche selectivo del bronquio del tronco principal correcto. El catéter está avanzado (según las distancias propuestas en la Tabla1) para enganchar selectivamente los lóbulos del lado derecho. Se administró 20 l de 0,3% de EBD. En el 90 % de los intentos, el lóbulo posterior se puede canular. El 10% restante de los intentos se enfrentan al lóbulo inferior. (B) Para apuntar al pulmón izquierdo, la placa de plástico se gira primero -74o para el enganche del tronco principal izquierdo. Después de la intubación exitosa del catéter, la rotación se reduce a -30o para permitir que la gravedad ayude con la entrega del agente. Para demostrar el compromiso selectivo del lado izquierdo, se entregó 40 ml de EBD al 0,3%. Este enfoque consistentemente (100% de los intentos) se dirigió a segmentos de basilar pulmonar izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Enfoque de administración simétrica para entregar unilateralmente agentes a todo el pulmón derecho. (A) La intubación del IB del lado derecho se realizó a +30o, idéntica a la canlaculación selectiva de la lobar pulmonar derecha (Figura4A). (B) La placa de plástico se giró a -74o para permitir la asistencia de gravedad durante la administración del agente. La punta del catéter se retira a las profundidades detalladas en la Tabla1, correspondiente al bronquio del tronco principal derecho. El bisel de la punta se coloca hacia abajo girando el cubo del catéter. (C) 30 l de EBD se administró a -74o, lo que demuestra la administración pulmonar derecha difusa de EBD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Enfoque de administración simétrica para administrar unilateralmente agentes a todo el pulmón izquierdo . (A) La intubación del IB del lado izquierdo se realizó a -74o, idéntica a la canlaculación selectiva de la barra de loser pulmonar izquierdo (Figura4B). (B) Después de una intubación exitosa, la placa de plástico se giró +86o para permitir la asistencia de gravedad durante la administración del agente. La punta del catéter se retira a la profundidad detallada en la Tabla1. El bisel de la punta se desplaza hacia abajo girando el cubo del catéter. (C) 30 l de EBD se administró con punta de carga de gel, lo que demuestra la administración difusa del pulmón izquierdo de EBD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: La administración de agentes experimentales se administra igualmente a los bronquios del tronco principal, pero conduce a diferentes concentraciones parénquimas pulmonares. (A) La administración de TI de 0,05% de FITC-dextran (60 l) impartió una fluorescencia más alta en el pulmón izquierdo, lo que sugiere concentraciones pulmonares desiguales de agente entregado. (B) Esta fluorescencia parénquimas pulmonar desigual persiste incluso cuando se administran volúmenes iguales de 0,05% FITC-dextran (30 l) a cada bronquio del vástago principal. Este desequilibrio parénquimal persistente, a pesar de la misma administración del tronco principal derecho/izquierdo, sugiere que las diferencias en las concentraciones de agentes pulmonares reflejan la dilución en el pulmón derecho más grande (n a 10 por grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Mejora de la homogeneidad de la deposición del agente por IB ajustado a la dosis administración. (A) La asimetría de la administración parénquimal pulmonar se mejora cuando se administra una mayor proporción de agente (40 ml de 0,05% FITC-dextran) al pulmón derecho más grande y a una proporción menor de agente (20 ml de 0,05% DE FITC-dextran) al pulmón izquierdo más pequeño. (B) A pesar de esta mejora de la simetría izquierda-derecha, sigue habiendo heterogeneidad lobar de la deposición del agente (negro: lóbulo superior; amarillo: lóbulo medio; azul: lóbulo inferior; verde: lóbulo posterior; rojo: pulmón izquierdo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Mejora del modelo de fibrosis pulmonar inducida por BLM utilizando la administración del IB ajustada a la dosis. (A) La administración de BLM (1,2 mg/kg en solución de 60 l) induce una lesión pulmonar predominante en el lado izquierdo/fibrosis 21 días después, de conformidad con mayores concentraciones pulmonares de agente en este pulmón más pequeño. La simetría izquierda-derecha mejora ajustando el volumen de BLM a cada lado del pulmón: 40 s de la solución se administra al pulmón derecho más grande y 20 sl de la solución se administra al pulmón izquierdo más pequeño. I: lóbulo inferior, M: lóbulo medio, S: lóbulo superior, P: lóbulo posterior. Las imágenes representan lóbulos de un único ratón representativo. (B) De acuerdo con la mejora de la simetría de distribución, la administración del IB ajustada por dosis de BLM mejora el modelado fisiológico de la fibrosis pulmonar, con aumentos más representativos en la elastance del sistema respiratorio (Ers) y disminuciones en capacidad inspiratoria (IC) y cumplimiento dinámico del sistema respiratorio (Crs). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Peso corporal (g) Número de ratones analizados Profundidad del catéter (mm)
para la cannulación selectiva		 Profundidad del catéter (mm) para la cámula pulmonar entera
Pulmón derecho Pulmón izquierdo
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

Tabla 1: Profundidad sugerida de la inserción del catéter. Las profundidades preprevistas del catéter necesarias para canalizar selectivamente los pulmones distales y proximales se determinaron empíricamente utilizando ratones C57BL/6 de varios pesos (total de 79 ratones).

Peso corporal (g) Número de ratones analizados Relación de pesos pulmonares
14 - 10 25 2,01 a 0,16
20 - 25 35 1,88 a 0,27
25 - 30 15 1,88 a 0,27
> 30 6 2,03 a 0,09

Tabla 2: Relación de peso pulmonar izquierdo derecha. Las diferencias en el peso pulmonar observadas en 81 ratones C57BL/6 demuestran razones para la administración de fármacos del IB corregido. Los pulmones se diseccionaron y pesaron después de una dosis letal de ketamina y xilazina.

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Discussion

La lesión pulmonar se ha modelado clásicamente en roedores queutilizan la administración de TI de agentes perjudiciales como BLM 6. Sin embargo, esta administración de TI sólo conduce a lesiones irregulares, lo que refleja la naturaleza no específica del parto pulmonar con este enfoque7. Estas limitaciones de modelar lesiones pulmonares son desafíos instructivos que se enfrentan al intentar la entrega de TI de agentes experimentales no lesivos, como medicamentos, siRNA o terapias celulares.

En este informe, describimos la administración directa del IB de agentes experimentales. Este enfoque ofrece dos beneficios distintos sobre los enfoques clásicos para la administración de TI. En primer lugar, el enfoque permite la administración unilateral selectiva a un pulmón, lo que permite la preservación del pulmón contralateral. Este enfoque es útil para la administración selectiva de fármacos en un pulmón herido unilateralmente(por ejemplo, lesión por isquemia-reperfusión 8), evitando efectos inespecíficos en el pulmón lesionado. Además, la administración dirigida de células tumorales se puedeutilizar para distinguir el crecimiento tumoral primario de la propagación contralateral y metastásica 9,10.

En segundo lugar, el informe detalla un beneficio previamente no reconocido de la administración del IB. Como se detalla en la Figura 7A,la administración de TI concentra relativamente agentes experimentales dentro del pulmón izquierdo más pequeño. Esta asimetría se puede corregir administrando un volumen relativamente mayorde agente al pulmón derecho más grande (Tabla 2), mientras que la entrega de un volumen menor al pulmón izquierdo más pequeño (Figura8A). La relevancia de esta administración del IB ajustada a la dosis para la lesión pulmonar fibrosa inducida por BLM se demostró aquí. El ajuste de la dosis mitiga la lesión en el pulmón izquierdo (que recibió menos BLM), al tiempo que aumenta la lesión en el pulmón derecho (Figura9A). Este aumento de la simetría coincide con la disminución de la variabilidad de la lesión pulmonar, cuantificada por las mediciones de la función pulmonar (Figura9B).

Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluyendo la necesidad de tener un soporte capaz de alterar fácil y repetidamente el posicionamiento de los animales (es decir, la rotación). Más crítica es la capacidad de determinar cuándo se ha logrado la cámula pulmonar selectiva. Como se describe en la sección 4.12, el uso de un espirómetro (en el que una columna de agua demuestra ventilación de marea) garantiza una connulación traquealexitosa 3. La observación de la taquipnea del ratón es consistente con la cannulación distal del segmento pulmonar derecho, mientras que la ausencia de disnea (a pesar de la sensación de resistencia con la inserción del catéter) sugiere la cannulación del pulmón izquierdo. Utilizando estas técnicas de localización no operativas, el operador debe ser capaz de guiar con precisión la cannulación del IB y la deposición del agente experimental.

Este enfoque tiene varias limitaciones. El modelo de TI de entrega de agentes es atractivo en su simplicidad. Requiere un grado moderado de práctica y habilidad técnica, aunque un operador experto todavía puede realizar rápidamente esta técnica dentro de la ventana de la anestesia de isoflurano. Sin embargo, la habilidad/práctica técnica adicional requerida puede compensarse fácilmente con el beneficio de este enfoque en experimentos que priorizan la entrega selectiva de agentes/siRNA/células o una mayor homogeneidad de la deposición del agente. Una limitación adicional a este método es la incertidumbre con respecto a la longitud de la inserción del catéter. Como se detalla en la Tabla1, se midieron 79 ratones macho y hembra para estimar la profundidad de inserción del catéter necesaria para la cannulación selectiva del IB. Estos datos sirven como un recurso para guiar al operador a realizar nuestro protocolo. Sin embargo, no podemos extrapolar con confianza nuestro recurso a otras cepas de ratón (incluidos ratones knockout) o ratones con obesidad mórbida. Además, no hemos medido si hay diferencias en el volumen del espacio aéreo (lobar, segmentario) que varían en función del peso. Como tal, es posible que los ratones grandes puedan acomodar grandes volúmenes de instilación con la administración del IB. Por lo tanto, el operador debe realizar un paso inicial de optimización/solución de problemas (mediante la instanción EBD) para asegurarse de que nuestra técnica está bien adaptada al modelo de ratón deseado.

En resumen, este informe describe una novedosa técnica del IB que puede utilizarse para administrar selectivamente agentes experimentales a un solo pulmón o adaptada para garantizar la distribución simétrica en ambos pulmones. Estos beneficios justifican el aumento marginal de la complejidad en comparación con las técnicas de TI estándar.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la subvención de NHLBI HL125371 a E.P.S. y por el DEPARTAMENTO de Dinada (CDMRP) a La concesión W81XWH-17-1-0051 a Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
  5. Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
  6. Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
  7. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).

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Medicina Número 147 Instilación intratraal instilación intrabronquial fibrosis pulmonar bleomicina ratón lesión pulmonar
Administración intrabronquial directa para mejorar la deposición selectiva del agente dentro del pulmón del ratón
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Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt,… More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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