Summary
Farelerde deneysel ajanlar intratracheal (It) yönetimi genellikle distal akciğerlere asimetrik teslim sonuçlanır. Bu raporda, her akciğeri operatif olmayan canlı fareler içinde cannulate için doğrudan intrabronchial (ıB) yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, bir akciğer için seçici olarak ajanlar yönetmek için kullanılabilir ya da her iki akciğerde simetrik Ajan teslim geliştirmek için adapte olabilir.
Abstract
Deneysel ajanların intratracheal (It) yönetimi, bleomisin kaynaklı pulmoner fibrozis gibi differe akciğer hastalıklarının duvar modellerinde temel bir tekniktir. Ancak, intratracheally uygulanan ajanlar distal fare akciğerine dağılımı genellikle asimetrik, akciğer parankimal konsantrasyonları daha küçük artar (ama eşit erişilebilir) fare sol akciğer. Bu raporda açıklanan bir roman intrabronchial (ıB) yaşam fareleri sol ve/veya sağ akciğerleri olmayan operatively kanüle yaklaşımı. Aynı zamanda bu yaklaşım seçici bir akciğer veya adapte ajanlar yönetmek için nasıl kullanılacağı gösterilmiştir (yoluyla doz-ayarlanmış IB teslimat) deneysel ajanlar akciğer teslim sol-sağ simetri geliştirmek için, böylece differ modelleri iyileştirilmesi pulmoner fibrozis gibi akciğer hastalığı.
Introduction
Farelerde deneysel ajanlar doğrudan pulmoner uygulanması akciğer immün tepkiler çalışması için izin verir, akut akciğer hasarı, ve akciğer fibrozis. Doğrudan pulmoner yönetim, daha önce1,2,3olarak açıklandığı gibi intratrakeal (It) instıtasyon yoluyla genellikle gerçekleştirilir. Ancak, bu yaklaşım seçici olmayan, hem akciğerleri hedefsiz ve genellikle asimetrik bir biçimde etkileyen. Akciğer yaralanması deneysel modelleme bir kontrol olarak kontralateral akciğer kullanımı için izin, seçici bir belirli akciğer hedef yeteneği yararlanabilir. Tersine, insan diffik akciğer hastalıkları doğru modelleme bilateral akciğer parankime deneysel ajanlar simetrik dağılımı yararlanır.
Bu raporun genel amacı, deneysel ajanlar bir fare sol veya sağ akciğer seçici teslimat için bir yöntem açıklamak için (Şekil 1). Bu intrabronchial (ıB) yönetim yaklaşımı bir fare akciğer tek taraflı tedavi sağlar ve kolayca bilateral mainstem bronşi bir ajan eşit teslim sağlamak için adapte edilebilir. Daha küçük sol akciğere (yani doz ayarlı ıB yönetimi) daha büyük sağ akciğer ve daha küçük hacimler için deneysel ajanlar daha büyük dozlarda sunmak için ıB yönetimini kullanarak, bu raporda gösterilen pulmoner homojenlik bir gelişme Deneysel ajanlar teslim, fareler diffuzu akciğer hasarı modelini optimize. Bu nedenle, bu rapor ya tek taraflı olarak farelere deneysel ajanlar yönetmek veya her iki akciğerde ilaç birikimi simetri geliştirmek isteyen müfettişlerin değeri tutabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Colorado Denver kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler (Bölüm 4 – 7) hem erkek hem de kadın C57BL/6 fareler kullanılarak optimize edilmiştir. Bu yaklaşım, vücut ağırlığı 19 – 40 g arasında değişen fareler kullanılarak doğrulandı.
1. ıB yönetimi için platformun oluşturulması
- Defter ucunu, bazal kanat ile ayakta kanat arasındaki orijinal 90 ° açıyla 70 ° (Şekil 2a) eğilin.
- Metal bağlayıcının 'in ayakta kanadının orta kısmında bir delik açın (Şekil 2a).
- Plastik tahta ilgili konumda aynı boyutta bir delik matkap. İki küçük deliği inferiora ve yanal olarak matkap (Şekil 2a).
- Plastik tahta içinde bu küçük delikler arasında bir 4:0 ipek dikiş Drape (Şekil 2a).
- Kanca ve döngü bandı plastik tahta kenarına yerleştirin (Şekil 2a).
- Plastik tahtayı vida ile metal kitap ucuna birleştirin (Şekil 2B). Gerekirse, açı ayarlaması için izin verirken vida-somun pozisyon kurulu tutmak için yeterince sıkı olduğundan emin olun.
- Plastik kurulunun dönme saati saat yönünün tersine, serbestçe hareket etmesini sağlayın.
Not: Saat yönünde hareket bu raporda (+) derece döndürme olarak temsil edilir ve saat yönünün tersine bir (-) derece döndürme olarak temsil edilir. - Plastik tahtasını + 30 °, + 86 °,-30 ° ve-74 ° ' ye konumlandırmak için bir açı protraktörü kullanın ve bunları sırasıyla kitap ucuna işaretleyin.
2. ıB Agent yönetimi için genişletilmiş kateterler oluşturulması
- Orijinal 22 G kateter (25 mm, bkz. malzeme tablosu) ucunda keskin bir bıçak ile doğru açı kesilebilir (Şekil 3, adım 1a).
- Eğimli (~ 50 ° – 60 °) diğer orijinal kateter (25 mm) ucu bıçağla, sonra hub 'dan sağ açıyla kesilir (Şekil 3, adım 1B).
- Tutkal iki kateter kendi künt uçları biraz daha az 180 ° açı ile (Şekil 3, adım 2).
- Düşük sıcaklık koter ile erime tarafından eğimli ucu Blunt ( malzeme tablosunabakın).
- Genişletilmiş kateter, yapıştırılmış alanda "0" boyutunda zımpara ve genişletilmiş kateter eğimli ucu ile parlatın (Şekil 3, adım 3).
- 25 mm, 30 mm ve 35 mm (Şekil 3, adım 3) farklı renklerle genişletilmiş kateter üzerinde işaretle.
- Hub 'ı Marker ile etiketleyerek uzatılmış kateterin eğim tarafını belirtin.
- Uzatılmış kateteri,% 70 etanol ile kateter içinde yıkayarak, dı suyuyla durulayın. Kateteri hava kurutun.
- Kullanmadan önce 10 dakika boyunca UV ışığı ile sterilize edin.
3. ön prosedür hazırlığı
- Tüm yönetilen ajanlar steril tekniği altında biyolojik bir güvenlik kaputu olun.
- 70% etanol ile çalışma alanını temizleyin.
- % 70 etanol ile tüm cerrahi aletleri sterilize edin.
- İş platformunun tabanına hemen araştırmacının önündeki bankta, C-kelepçeleri kitap tabanının bazal kanadına sabitleyerek düzelt.
- Fareler içinde gelgit hava akımı tespiti için izin verecek cihazlar olan birkaç derme çatma spirometre, oluşturun. Kısaca, mevduat 60 μL sterilize tuz 1 ml şırınga içine (piston kaldırıldı) bir jel yükleme ucu ile.
Not: salın yatırılan damlası varil okcludes ve yukarı ve aşağı hareket ederken gelgit havalandırma3maruz. - 22 G uzatılmış kateterin hub 'ını, derme çatma spirometreye gevşek bir şekilde takın.
- Erişim kolaylığı için her bir cam damlası platformun her tarafına yerleştirin.
- İzofluran indüksiyon odasını, izofluran uyumlu biyolojik Güvenlik kabininde kemirgen anestezi makinesine (bkz. malzeme tablosuna) bağlayın.
4. non-operatif It entübasyon yaklaşımı
- Anestezize bir C57BL/6 fare (erkek veya kadın, 8 – 10 hafta, ~ 25 g) ile oksijen (2 L/dak) ve 5% izofluran (bkz. malzeme tablosu) bir indüksiyon odasında 4 dakika.
- (Örneğin, Evans mavi boya veya FITC-dextran, Şekil 4' te gösterildiği gibi) İki pipet içine teslim edilecek deneysel Ajan aspirate, sonra sedasyon sırasında platformun her tarafına yerleştirin.
- Fare anestezi indüksiyon odasından çıkarmadan önce yaklaşık 24 – 30 nefes/dakika bir solunum hızı sağlamak.
Not: Isoflurane anestezi genellikle tüm ıB prosedürleri için yeterli 4 dakika sürmektedir. Operatör tekniği ile yetkin değilse, ketamin/xylazine (80 mg/kg ve 10 mg/kg intraperitoneally, bkz: malzeme tablosu) daha uzun süreli anestezi için kullanılabilir. - Fareyi, süpürme pozisyonunda bulunan drapeli dikiş çizgisinin üzerindeki Kesici taşları ile askıya alın. İki ile üç parça kanca ve döngü bant gevşek, havalandırma kısıtlama kaçınarak fare güvenli.
- LED fiber optik aydınlatıcıyı açın (bkz. malzeme tablosu, Şekil 2C).
- Operatör platformu (dorsal fare) arkasına konumlandırın.
- Aydınlatıcıyla ilgili Gooseneck 'i, böylece ciltte larinks alanını aydınlatır. Fare ve ışık kaynağı arasındaki mesafe 2 – 3 cm 'dir (Şekil 2C).
- Aşağıdaki tüm prosedürleri yapmadan önce bir ayak/pençe tutam ile anestezi derinliği onaylayın.
- Steril forseps baskın el ile tutun, sonra forseps ile ağız boşluğunun dilini dışarı çizin.
- Nondominant el ile steril depressor tutun, daha sonra yaygın orofarenks ortaya çıkarmak için depressor ile dilin kökünü düzleştirmek. Forseps sonra serbest bırakılabilir, baskın el serbest.
- Genişletilmiş kateteri ağız boşluğu yoluyla trakeaya intübate etmek için baskın eli kullanın (Şekil 2C).
- Şırıngadaki balonu her nefes ile yukarı ve aşağı hareket ederse gözlemleyerek yerleşimi onaylayın.
- BT entübasyon ek detayları daha önce yayınlandı3. Anestezi hariç toplam prosedür süresi, iyi eğitimli bir operatör için 10 – 15 s sürer.
5. non-operatif ıB entübasyonu ve teslim yaklaşımlar
- Distal sağ akciğerin seçici lober kanülasyon için IB yaklaşımı
- BT kanülasyon yaptıktan sonra (adım 4,11), plastik Pano Döndür + 30 ° (Şekil 4A).
- Kateterin hub 'ını tutun ve fare orta çizgisinin paralel olarak doğal olarak kılavuzluk et, Tablo 1' de açıklandığı gibi ağırlık bazlı derinliklere genişletin.
Not: bu derinliklerdeki direnç unutulmamalıdır. Bu noktada, fare biraz tachypneic olacak, temsili sonuçlarında açıklandığı gibi. Deneyimli bir operatör için, yaklaşık 90% girişimleri başarılı bir şekilde sağ akciğer cannulate (Takipne ile belirtilmiştir). - Jel yükleme ucu ile% 20 μL 0,3% Evans mavi boya (EBD, bkz. malzeme tablosu) sunun.
- Cam damlalar kullanarak hava 1 – 2 plakaya (0,1 ml her) dispense.
Not: Bu, kalan EBD çözeltisi (veya deneysel ajanlar) kateterin içinden temizlenmesini sağlar. - Kateter çekin, sonra 30 s için fare konumunu korumak.
- Bu bilinç geri gelene kadar hayvan bir ısınma Battaniye yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
- Distal Sol akciğer seçici segmental kanülasyon ıB yaklaşımı
- BT kanülasyon yaptıktan sonra (adım 4,11), plastik tahta Döndür-74 ° (Şekil 4b).
- Kateterin hub 'ını tutun ve kateteri sola doğru bronş içine ilerlemek için nazik basınç uygulayın, hem aşağı doğru (90 °) hem de kitap ucunda mütevazı bir basınç yerleştiriniz. Tablo 1' de belirtilen derinliklerde, operatör sol akciğerin alt segmentleri meşgul olduğu için direnci dikkat etmelidir. Takipne oluşursa, kateteri 20 – 25 mm konumuna çekin ve yeniden deneyin.
- Sol alt akciğer segmentleri yazık sonra, pozisyon değişikliği Ajan yönetimi için yerçekimi yardımı sağlamak için gereklidir. Plastik panosu Döndür-30 ° (Şekil 4b).
- Jel yükleme ucu ile% 0,3 EBD 40 μL sunun.
Not: Sol akciğer sadece bir lob olduğundan daha büyük bir birim aracı sunmak için mümkündür. - Cam damlalar kullanarak hava 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) dispense.
Not: Bu, kateterin içinden herhangi bir kalıntı EBD (veya deneysel ajanların) temizlenmesini sağlar. - Kateter çekin, sonra 30 s için fare konumunu korumak.
- Bu bilinç geri gelene kadar hayvan bir ısınma Battaniye yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
- IB yönetiminin sol veya sağ akciğerin tamamının teslimatını sağlamak için adaptasyon
Not: operatör, belirli bir sağ akciğer lob veya Sol akciğer segmentine değil, tüm akciğer (sağ veya Sol akciğer) için ajanlar teslim etmek istiyor, kateter aşağıdaki gibi, ilgili mainstem bronş biraz çekilmelidir.-
Sağ tüm akciğer yönetimi
- Adım 4,11 sonra, plastik tahta döndürmek + 30 ° (Şekil 5A).
- Kateterin merkezini tutun ve fare orta çizgisine paralel olarak doğal olarak yönlendirin ve sağ taraflı distal lober kanülasyon için gerekli derinliklere ulaşır (Tablo 1).
- Takipne tabelası görünümünü onaylayın.
- Ajan teslimi için yerçekimi yardımını etkinleştirmek için fare-74 ° çevirin (Şekil 5B).
- Kateteri sağ mainstem bronşın kalkışa karşılık gelen bir pozisyona çekin (Tablo 1). Kateterin eğimi aşağı doğru yüzmesini sağlayın (Şekil 5B).
- Sağ akciğere jel yükleme ucu ile% 0,3 EBD% 30 μL sunun.
- Dispense 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) bir cam damlalar kullanarak hava.
- Kateteri çekin, ardından 30 s için fare pozisyonunu koruyun. hayvanı bir ısınma battaniyesi üzerine yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
-
Sol tüm akciğer yönetimi
- Adım 4,11 sonra, plastik tahta döndürmek-74 ° (Şekil 6a). Alternatif olarak, adım 5.3.1.8 sonra, kateter trakea 'ya geri çekilerek, bilateral ıB ajanı yönetimini sağlayarak rotasyon ortaya çıkabilir.
- Kateterin hub 'ını tutun ve kateteri sola doğru kateter içine ilerlemek için nazik basınç uygulayın, hem aşağı doğru (90 °) hem de kitap ucunda mütevazı bir basınç yerleştiriniz. Entübasyon derinliği Tablo 1tarafından yönlendirilir.
- Hiçbir Takipne işaretini onaylayın.
- Aracı yönetimi ile yerçekimi yardımı için izin fare + 86 ° döndürün.
- Kateteri sola doğru soluna geri çekin (sağ akciğerle aynı mesafeler yeterli, Tablo 1) ve kateterin eğimi aşağı dönük olarak döndürün (Şekil 6B).
- Sol akciğere jel yükleme ucu ile% 0,3 EBD 30 μL sunun.
- Dispense 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) bir cam damlalar kullanarak hava.
- Kateteri çekin, ardından 30 s için fare pozisyonunu koruyun. hayvanı bir ısınma battaniyesi üzerine yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
-
Sağ tüm akciğer yönetimi
6. her akciğere doz ayarlı hacimleri sunmak için sıralı ıB kanülasyon yaklaşımlarının kullanımı
-
BT yönetim grubu
- 4.1 – 4.11 adımda açıklandığı gibi BT kanülasyonu gerçekleştirin.
- Jel yükleme ucu ile 60 μL% 0,05% FITC-dextran (bkz. malzeme tablosu) sunun (Şekil 1B).
- Cam damlalar kullanarak hava 1 – 2 plakaya (0.1-0.3 ml her) dispense.
- 60 s için pozisyon tutun ve yukarıda açıklandığı gibi fare kurtarma için izin verin.
-
Simetrik bilateral ıB yönetimi
- 5.3.1.1 adımları gerçekleştirin – 5.3.1.8 (sağ akciğer) ve adımlar 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (Sol akciğer).
- Akciğer her tarafı için 0,05% FITC-dextran (veya deneysel bir ajan) eşit birimler (30 μL) yönetin.
-
Doz ayarlı bilateral ıB yönetimi
- Adım 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (sağ akciğer) ve adımlar 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (Sol akciğer) gerçekleştirin.
- Daha büyük hacim (40 μL) yönetmek 0,05% FITC-dextran daha büyük sağ akciğer, ve daha küçük bir hacim (20 μL)% 0,05 FITC-dextran için küçük sol akciğer. FITC-dextran yerine deneysel bir ajan uygulanabilir.
7. tek doz bleomisin (BLM) indüklenen akciğer yaralanması simetri geliştirmek için doz ayarlı ıB yönetiminin kullanımı
-
BLM yönetim grupları
- Doz ayarlı ıB-BLM (1,2 mg/kg, bkz. malzeme tablosu) yönetim grubu: 60 μL (Sol akciğer Için 20 μl ve sırasıyla sağ akciğer Için 40 ΜL) BLM çözeltisi farelere teslim edildi (n = 5). Kontroller (n = 5) benzer miktarlarda tuz alındı.
Not: 5.3.1 ve 5.3.2 adımlarına bakın. - BT yönetim grubu: 60 BT yönetim teknikleriyle fareler için μL BLM çözeltisi teslim edildi.
Not: adım 6.1.1 – 6.1.4 bakın.
- Doz ayarlı ıB-BLM (1,2 mg/kg, bkz. malzeme tablosu) yönetim grubu: 60 μL (Sol akciğer Için 20 μl ve sırasıyla sağ akciğer Için 40 ΜL) BLM çözeltisi farelere teslim edildi (n = 5). Kontroller (n = 5) benzer miktarlarda tuz alındı.
-
Akciğer fonksiyon ölçümü
- Günde 21 BLM veya tuzlu sonra, bir intraperitoneal (IP) ketamin enjeksiyonu (160 mg/kg) ve xylazine (32 mg/kg) ile anestezize fareler.
- Pençe/ayak tutam ile anestezinin derinliğini onayladıktan sonra, 18 G kanül ile bir trakheostomi gerçekleştirin (bkz. malzeme tablosu).
- Daha önce açıklanan4, ventilatöre fareler bağlayın ve solunum mekaniği ölçmek.
-
Akciğer dokusu toplama ve işleme
- Pulmoner mekaniği ölçümü takiben, kardiyak delinme tarafından anestezize fareler ötenize.
- Göğüs duvarını açın ve bilateral pnömotorasları teşvik et.
- Akciğerleri% 1 düşük Melt agaroz (40 °c)5 ' te PBS 'de tutarlı bir basınçla (42 cm H2O) şişirin.
- Uzun eksen boyunca akciğer dört ila beş adet kesim transversely,% 10 formalin düzeltmek ve parafin katıştırmak.
- 5 μm bölüm kesip kolajen biriktirme görselleştirmek için Masson 's trikrom ile leke.
8 Post-usul bakım
- Hayatta kalma prosedürleri sonunda, bilinçlendirme kadar hayvan bir ısınma Battaniye üzerine yerleştirin. Kurtarma genellikle 2 dakika içinde tamamlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seçmeli ıB entübasyon belirli lobları (sağ akciğer) veya baziler segmentlerini (Sol akciğer) hedefler.
EBD 'nin sağ akciğere IB yönetimi, 5,1 bölümünde açıklandığı şekilde gerçekleştirildi. Denemenin tamamlandıktan sonra fareler ölümcül dozda intraperitoneal ketamin/xylazine uygulanmıştır ve akciğer EBD dağılımı gösterimi için hasat edildi (Şekil 4A, sağ). Akciğerin brüt görünümü, girişimleri% 90 sağ akciğer küçük posterior lob kanüllü gösterir, ancak girişimleri% 10 inferior lob hedeflenen. Bu lobların küçük hacimlerinin distal kanülasyon sırasında Mouse 'un telafi edici Takipne açıklar (kateter üzerinden dakika havalandırma korumak için) spekülasyonlarla.
EBD 'nin sol akciğere ait ıB yönetimi, 5,2 bölümünde açıklandığı şekilde gerçekleştirildi. girişimlerin% 100 ' i sol akciğerin inferior segmentlerini hedef aldı (Şekil 4b). Sağ taraflı intübasyonun aksine, bu nişan ile, daha büyük Sol akciğer segmentlerinin entübasyonu (ve havalandırmayı) yansıtan hiçbir Takipne oluşmaz.
Seçici ıB kanülasyon tekniğinin adaptasyon tüm sol veya sağ akciğer hedef olabilir.
IB kanülasyon yapıldıktan sonra, ıB kateteri çekilmesi (ve Bölüm 5,3 'de ayrıntılı olarak fare konumlandırma değişiklikleri), ajanların sağ akciğerin tüm loblara (ve sol akciğerin tüm segmentlerine) teslimatını iyileştirmek için kullanılabilir. EBD çözeltinin sağ akciğere (Bölüm 5.3.1) ınbrilasyonu, Şekil 5c'de gösterildiği gibi tüm sağ lobları başarıyla hedeflenmiştir. EBD çözeltisi sol akciğere (Bölüm 5.3.2) başarılı bir şekilde hedef alınan tüm sol segmentler (Şekil 6C).
BT yönetimi veya SIMETRIK IB yönetimi asimetrik akciğer verir IB doz ayarlaması ile düzeltilebilir olan parankimal Ajan konsantrasyonları.
Fareler, sol akciğere 30 μL 0,05% FITC-dextran ve Bölüm 6,2 ' de açıklandığı gibi sağ akciğere 30 μL 0,05% FITC-dextran ile bilateral yönetim uygulandı. Alternatif olarak, fareler aldı 60 μL 0,05% FITC-dextran intratracheally Bölüm 6,1 başına. Denemenin sonunda, fareler Terminal anestezisi aşırı doz (ketamin/xylazine) ile ötenize edildi. Akciğerler hemen hasat edilmiş ve homojenize edildi. FITC-floresans (optik yoğunluğa göre nicelik) 96-Well plaka okuyucusu ile ölçülmüştür. Tarih, iki grup karşılaştırmalar için öğrencinin t-testi ile analiz edildi.
Şekil 7' de ayrıntılı olarak, hem It (şekil 7a) hem de simetrik IB yönetimi (şekil 7b) fitc-dextran ASIMETRIK akciğer parankimal fitc floresans yol açtı, daha fazla bağıl konsantrasyonlarda (ağırlığa normalleştirilmiş) Sol akciğer. Bu, BT yönetiminden sonra deneysel ajanlar asimetrik akciğer teslim her mainstem bronş bu ajanlar asimetrik sunumu bir sonucu olmadığını göstermektedir. Bunun yerine, bu eşit mainstem teslimat (simetrik ıB yönetimi tarafından sağlanmış olduğu gibi) akciğer ağırlıkları/kitle farklılıkları ile seyreltilmiş olduğunu hipotez, Tablo 2gözlenen.
Simetrik teslim bu farklılıkları aşmak için 40 μL 0,05% FITC-dextran daha büyük sağ akciğer ve 20 μL daha küçük sol akciğer, Bölüm 6,3 başına olarak uygulandı. Bu "doz ayarlı ıB yönetimi" akciğer parankimal Ajan teslim simetri geliştirdi (Şekil 8A). Ancak bu düzeltmelere rağmen, sağ akciğerin farklı lobları içinde kalıcı heterojenliği gözlemledik (Şekil 8B).
Farklı teslimat sistemlerinde BLM kaynaklı akciğer hasarı:
Deneysel ajanlar doz ayarlı IB yönetiminin diffün akciğer hastalığının modelleme artırabilir göstermek için, biz BLM (fibrozan akciğer hasarı bir fare modeli) ya intratracheally veya doz-ayarlanmış IB yönetimi yoluyla, bölüm başına olarak uygulandı 7. bu yaralanma modeli ile beklendiği gibi, hem It ve ıB enjeksiyonları BLM akciğer hasarı ve sistemik hastalığa yol açtı (kilo kaybı ile). Bu sistemik hastalık 7 gün içinde çözüldü. BT grubunda 21 günlük mortalite% 20 (1/5), doz ayarlı ıB grubunda% 0 (0/5) idi.
It-veya ıB-BLM yönetiminin 21 gün sonra, fareler akciğer histolojisi için hasat edildi. Temsili histolojik görüntülerde gösterildiği gibi (Şekil 9a),
Fibrotik akciğer yaralanması için bu geliştirilmiş sol-sağ homojenliğin fizyolojik olarak alakalı olup olmadığını belirlemek için, BLM 'nin doz ayarlı ıB yönetiminin daha tutarlı bir inspiratuar kapasite kaybını (ıC) ve solunum sistemi uyumluluğunu onayladı (CRS), hem de solunum sistemi elasttance (ERS) (Şekil 9B) uyumlu bir artış.
Şekil 1: fare hava yolu kanülasyon anatomisi. (A) bir fare hava yolu döküm silikon elastomer ile bir fare akciğer (25 g fare hasat) şişirme tarafından yapılmıştır. (B) standart BT yönetimi için kateter yerleştirme. (C) IB yönetimi için kateter yerleştirme. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: iş platformu Için kurulum. (A) bir metal bağlayıcının (90 ° açı) 70 ° ' ye bükülmüş. Bir vida deliği taşınabilir (80 mm x 150 mm) çapa için üst orta çizgi yerleştirilir. Kanca ve döngü bandı ve askıya sütür gemide bir anestezize fare konumlandırma izin yerleştirilir. (B) plastik tahta metal Bookend üzerinde bir vida ile demirlemiş. Vida, kurula saat yönünde (+) veya saat yönünün tersine (-) yönde dönüşü sağlamak için yeterince gevşek. (C) bir anestezize fare, BT/IB Aracısı yönetimi için kanca ve döngü bandı (0,75 "W) ile birlikte konumlandırılır. Bir dikiş kafa stabilizasyonu izin fare kesici altında geçirilir. Operatör fare dorsal yönüyle konumlandırılmış ve boyun bir kaz boyun lambası ile aydınlatılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: IB yönetimi için özelleştirilmiş kateterler oluşturulması. (Adım 1) Kateter bronşların meşgul olmasını sağlamak için, iki kateterler birleştirilir. (Adım 2) Kateterler hafif bir açıyla bağlanır, mainstem bronşlarda seçici entübasyon kolaylaştırır. (Adım 3) Ayrıca distal kateter ucu eğimli olup, hava yolu ınbrilasyonu daha iyi yönde kontrol sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: seçici sağ/sol akciğer lober kanülasyonu ve yönetimi için yaklaşım. (A) sağ akciğeri hedef almak için, plastik tahta döndürülebilir + 30 °, seçici doğru mainstem bronş çekici kolaylığı iyileştirilmesi. Kateter, sağ taraflı lob 'lar seçmek için ( Tablo 1' de önerilen mesafeler başına) gelişmiş. 20 μL 0,3% EBD yönetiliyordu. Girişimlerinin ~ 90%, posterior lob kanüle edilir. Girişimlerinin kalan% 10 inferior lob meşgul. (B) sol akciğeri hedef almak için, plastik tahta ilk döndürülmüş-74 ° sol mainstem nişan için. Kateterin başarılı bir şekilde intübasyon işleminden sonra rotasyon daha sonra-30 ° ' ye düşer ve yerçekimi Ajan teslimine yardımcı olur. Sol tarafı seçici nişan kanıtlamak için, 40% 0,3 EBD μL teslim edildi. Bu yaklaşım sürekli (100% girişimleri) Sol akciğer bazılar segmentleri hedeflenen. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: simetrik yönetim yaklaşımı tek taraflı olarak tüm sağ akciğere ajanlar teslim. (A) sağ taraftaki IB entübasyonu + 30 ° ' de, seçici sağ akciğer lober kanülasyonu ile aynıdır (Şekil 4A). (B) plastik tahta, Ajan yönetimi sırasında yerçekimi yardımına izin vermek için-74 ° ' ye döndürüldü. Sonra kateter ucu, sağ mainstem bronşa karşılık gelen Tablo 1' de ayrıntılı derinliklere geri çekilecektir. Ucun eğim kateter hub 'ı döndürerek aşağı doğru konumlandırılır. (C) 30 ΜL EBD-74 ° ' de teslim edildi ve EBD 'nin differe sağ akciğer yönetimini kanıtlamış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Simetrik yönetim yaklaşımı tüm Sol akciğer ajanları tek taraflı olarak yönetmek için . (A) Sol taraflı IB entübasyon-74 °, seçici Sol akciğer lober kanülasyonu (Şekil 4b) ile aynıdır. (B) başarılı bir entübasyon sonrasında plastik tahta, Ajan yönetimi sırasında yerçekimi yardımına izin vermek için + 86 ° döndürüldü. Kateter ucu, Tablo 1' de ayrıntılı olarak derinlemesine geri çekilecektir. Ucunun eğim kateter hub döndürerek aşağı doğru kaydırılır. (C) 30 ΜL EBD jel yükleme ucu ile teslim edildi, EBD difüzor Sol akciğer yönetimi kanıtlayan. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: deneysel ajanların BT yönetimi aynı şekilde mainstem bronşlarına da teslim edilir, ancak farklı akciğer parankimal konsantrasyonlara yol açar. (A) 0,05% fitc-dextran (60 μL) yönetimi, sol akciğerde daha yüksek floresans verilerek, teslim edilen ajanın düzensiz akciğer konsantrasyonlarını düşündürmektedir. (B) bu eşit olmayan akciğer parankimal floresans her mainstem bronş için% 0,05 fitc-dextran (30 μL) eşit miktarlarda uygulandığında bile devam eder. Bu kalıcı parankimal dengesizlik, eşit sağ/sol ilem teslimine rağmen, akciğer maddesi konsantrasyonlarındaki farklılıkların büyük sağ akciğerde seyreltme yansıttığını göstermektedir (grup başına n = 10). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 8: doz AYARLı IB tarafından Ajan birikimi geliştirilmiş homojenlik Yönetim. (A) daha büyük sağ akciğer ve daha az sayıda Ajan (20 μl% 0,05% fitc-dextran) daha küçük sol akciğer için (40 μl 0,05% fitc-dextran) Ajan daha büyük bir oranı uygulandığında akciğer parankimal teslim asimetri geliştirilmiştir. (B) Bu geliştirilmiş sol-sağ simetriye rağmen, Ajan biriktirme lober heterojenlik kalır (siyah: üstün lob; sarı: Orta lob; mavi: inferior lob; yeşil: posterior lob; kırmızı: Sol akciğer). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 9: doz AYARLı IB yönetimini kullanarak fare BLM kaynaklı akciğer fibrozis modelinin geliştirilmesi. (A) BLM 'nin (1,2 mg/kg 60 μL çözeltisi) yönetimi, sol taraftaki baskın akciğer hasarı/fibrozis 21 gün sonra, bu küçük akciğerde daha yüksek akciğer konsantrasyonlarıyla tutarlı bir şekilde indükler. Sol-sağ simetri, akciğer her tarafına BLM hacmi ayarlayarak geliştirir: 40 μL çözeltinin daha büyük sağ akciğere uygulanır ve 20 μL çözeltinin daha küçük sol akciğere uygulanır. I: inferior lob, M: Orta lob, S: üstün lob, P: posterior LOB. Görüntüler tek bir temsilci fare lob temsil eder. (B) dağılım gelişmiş simetri ile tutarlı, blm doz ayarlı IB yönetimi akciğer fibrozinin fizyolojik modelleme geliştirir, solunum sistemi elasttance daha temsili artışlarla (ERS) ve azalır (ıC) ve dinamik solunum sistemi uyumluluğu (CRS). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Vücut ağırlığı (g) | Test edilen fareler sayısı | Kateter derinliği (mm) Seçici kanülasyon için |
Tüm akciğer kanülasyon için kateter derinliği (mm) | |
| Sağ akciğer | Sol akciğer | |||
| 15 - 19 | 17 | 37 | 38 | 26 |
| 20 - 25 | 22 | 38 | 39 | 27 |
| 25 - 30 | 29 | 39 | 40 | 28 |
| 30 > | 11 | 40 | 41 | 31 |
Tablo 1: kateter ekleme derinliği önerilir. Distal ve proksimal akciğerleri seçici olarak cannulate için gerekli öngörülen kateter derinlikleri, çeşitli ağırlıkların C57BL/6 fareler kullanılarak ampirik olarak belirlenir (Toplam = 79 fare).
| Vücut ağırlığı (g) | Test edilen fareler sayısı | Akciğer ağırlıklarının oranı |
| 14 - 10 | 25 | 2,01 ± 0,16 |
| 20 - 25 | 35 | 1,88 ± 0,27 |
| 25 - 30 | 15 | 1,88 ± 0,27 |
| 30 > | 6 | 2,03 ± 0,09 |
Tablo 2: sağ: Sol akciğer ağırlığı oranları. 81 C57BL/6 farelerde gözlenen akciğer ağırlıklarının farklılıkları, düzeltilmiş ıB ilaç yönetimi için mantık göstermektedir. Akciğerler disseke ve ketamin ve xylazine ölümcül bir doz sonra tartıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akciğer hasarı klasik olarak BLM6gibi ZARARLı ajanlar BT yönetimini kullanarak kemirgenler modellenmiştir. Böyle bir BT yönetimi, ancak, sadece bu yaklaşım ile akciğer teslimat hedefsiz doğası yansıtan, yamalı yaralanma yol açar7. Akciğer yaralanması modelleme bu sınırlamalar ilaçlar, siRNA veya hücresel tedaviler gibi non-zararlı deneysel ajanlar, It teslim çalışırken karşılaştığı öğretici zorluklar vardır.
Bu raporda, deneysel ajanların doğrudan ıB yönetimini tarif ediyoruz. Bu yaklaşım, BT yönetimine Klasik yaklaşımlar üzerinde iki farklı avantaj sunar. Öncelikle, yaklaşım bir akciğere seçici tek taraflı yönetim sağlar, kontralateral akciğer koruyucu için izin. Bu yaklaşım, uyuşturucular için tek taraflı yaralı bir akciğer (örn. iskemi-reperfüzyon yaralanması8), yaralanmamış akciğerde spesifik olmayan etkilere neden olan seçici yönetim için yararlıdır. Ayrıca, tümör hücrelerinin yönlendirilmiş yönetimi kontralateral primer tümör büyümesini ayırt etmek için kullanılabilir, metastatik yayılma9,10.
İkincisi, rapor, ıB yönetiminin daha önce tanınmayan bir yararını ayrıntılarıyla bildirir. Şekil 7a' da ayrıntılı olarak, BT yönetimi daha küçük sol akciğer içinde deneysel ajanlar nispeten yoğunlaşır. Bu asimetri, daha büyük sağ akciğere (Tablo 2) daha büyük bir birim birimi yöneterek, küçük sol akciğere daha küçük bir hacim sağlayarak düzeltilebilir (Şekil 8A). Bu doz ayarlı ıB yönetiminin BLM kaynaklı fibrotik akciğer yaralanmasına alaka derecesi burada gösterildi. Doz ayarı sol akciğerde yaralanmayı azaltır (daha az BLM aldı), sağ akciğerde yaralanmayı artırırken (Şekil 9a). Bu artmış simetri, pulmoner fonksiyon ölçümleri ile nicelik olarak, akciğer yaralanması azalan değişkenlik ile çakışmaktadır (Şekil 9B).
Protokolde, hayvan konumlandırma (yani, dönme) kolayca ve art arda değiştiren bir stand olması gerek dahil olmak üzere birkaç kritik adımlar vardır. Daha kritik olan seçici akciğer kanülasyon ne zaman elde edildiğini belirlemek için yeteneğidir. 4,12 bölümünde açıklandığı gibi, bir spirometrenin kullanımı (bir su sütununun gelgit havalandırma gösterir) başarılı trakeal kanülasyon sağlar3. Fare Takipne gözlem distal sağ akciğer segment kanülasyon ile tutarlı, dispne yokluğunda (kateter ekleme ile direnç hissi rağmen) Sol akciğer kanülasyon önerdi. Bu operatif olmayan yerelleştirme tekniklerini kullanarak operatörün ıB kanülasyon ve deneysel Ajan birikimi doğru şekilde kılavuzluk edebilmesi gerekir.
Bu yaklaşım, çeşitli sınırlamalar vardır. Agent teslim BT modeli basitlik çekici. Vasıflı bir operatör hala Isoflurane anestezi penceresi içinde bu tekniği gerçekleştirmek olsa da, orta derecede uygulama ve teknik beceri gerektirir. Ancak, gerekli ek teknik beceri/uygulama, ancak, seçici Ajan/siRNA/hücre teslim veya Ajan biriktirme artan homojenliği öncelik deneyler bu yaklaşım yararına kolayca ofset olabilir. Bu yöntem için ek bir sınırlama kateter ekleme uzunluğu ile ilgili belirsizlik olduğunu. Tablo 1' de ayrıntılı olarak, 79 erkek ve dişi fareler seçici IB kanülasyon için gerekli kateter ekleme derinliğini tahmin etmek için ölçülmüştür. Bu veriler operatörün protokolünü gerçekleştirmek için rehberlik etmek için bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Ancak, biz güvenli bir şekilde diğer fare suşları (nakavt fareler dahil) veya moralli obez fareler için kaynak tahmin olamaz. Ayrıca, hava alanı hacminde (lobar, segmental) farklılık varsa, ağırlığa göre değişen ölçülere sahip değiliz. Bu nedenle, büyük fareler ıB yönetimi ile büyük instilasyon hacimleri karşılamak mümkün olabilir. Bu nedenle, operatör bir ilk optimizasyon/sorun giderme adımı gerçekleştirmelidir (EBD instıtasyon kullanarak) bizim tekniği istenen fare modeline iyi adapte olduğundan emin olmak için.
Özetle, bu raporda, deneysel ajanlar tek bir akciğer veya her iki akciğer boyunca simetrik dağılım sağlamak için adapte seçmeli olarak yönetmek için kullanılabilecek bir roman ıB tekniği açıklanmaktadır. Bu avantajlar standart BT tekniklerine kıyasla karmaşıklığı marjinal artış haklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma tarafından finanse edildi NHLBı Grant HL125371 için E.P.S. ve DOD tarafından (CDMRP) Grant W81XWH-17-1-0051 için Y.Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G shielded IV Catheter | BD | 381423 | |
| Bleomycin | Enzo life sciences | BML-AP302-0010 | |
| Compact Mini rodent anesthesia machine | DRE Veterinary | 9280 | |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC | |
| LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-30W | |
| Low temperature cautery with fine tip | Bovie | AA02 | |
| Precisionglide needle, 18G x 1" | BD | 305195 | Beveled tip, 12 mm in length |
| Xylazine | AKORN | NDC 59399-110-20 | |
| Zatamine | VetOne | NDC 13985-702-10 | Ketamine |
References
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
- Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
- Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
- Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).
