Summary
In questo protocollo, dimostriamo ed elaboriamo su come utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per la differenziazione e la purificazione cardiomiocitati, e ulteriormente, su come migliorare la sua efficienza di trapianto con inibitore della chinasi proteica associata a Rho pretrattamento in un modello di infarzione miocardico del topo.
Abstract
Un fattore cruciale per migliorare l'efficacia della terapia cellulare per la rigenerazione miocardiale è quello di aumentare in modo sicuro ed efficiente il tasso di innesto cellulare. Y-27632 è un inibitore altamente potente della proteina chinasi (RhoA/ROCK) associata al Rho, associata a Bobina, e viene utilizzata per prevenire l'apoptosi cellulare indotta dalla dissociazione (anoikis). Dimostriamo che il pretrattamento di Y-27632 per cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CMs-RI) prima dell'impianto risultati in un miglioramento del tasso di innesto cellulare in un modello murino di infarzione miocardiale acuta (MI). Qui, descriviamo una procedura completa di differenziazione hiPSC-CMs, purificazione e pretrattamento cellulare con Y-27632, così come la contrazione cellulare risultante, le misurazioni transitorie del calcio e il trapianto in modelli MI murini. Il metodo proposto fornisce un metodo semplice, sicuro, efficace e a basso costo che aumenta significativamente il tasso di innesto cellulare. Questo metodo non può essere utilizzato solo in combinazione con altri metodi per migliorare ulteriormente l'efficienza del trapianto di cellule, ma fornisce anche una base favorevole per lo studio dei meccanismi di altre malattie cardiache.
Introduction
Le terapie basate sulle cellule staminali hanno mostrato un notevole potenziale come trattamento per danni cardiaci causati da MI1. L'uso di hiPSC differenziati fornisce una fonte inesauribile di hiPSC-CMs2 e apre le porte al rapido sviluppo di trattamenti innovativi. Tuttavia, rimangono molte limitazioni alla traduzione terapeutica, tra cui la sfida del tasso di innesto gravemente basso delle cellule impiantate.
Dissociando le cellule con trypsin avvia anoikis3, che viene accelerato solo una volta che queste cellule vengono iniettate in ambienti duri come il miocardio ischemico, dove l'ambiente ipossico accelera il percorso verso la morte cellulare. Delle cellule rimanenti, gran parte viene sbiadita dal sito di impianto nel flusso sanguigno e si diffonde in tutta la periferia. Uno dei percorsi apoptotici chiave è il percorso RhoA/ROCK4. Sulla base di ricerche precedenti, il percorso RhoA/ROCK regola l'organizzazione actin cytoskeletal5,6, che è responsabile della disfunzione cellulare7,8. L'inibitore ROCK Y-27632 è ampiamente utilizzato durante la dissociazione e il passaggio delle cellule somatiche e staminali, per aumentare l'adesione cellulare e ridurre l'apoptosi cellulare9,10,11. In questo studio, Y-27632 viene utilizzato per trattare hiPSC-CMs prima del trapianto nel tentativo di aumentare il tasso di innesto cellulare.
Sono stati stabiliti diversi metodi volti a migliorare il tasso di innesto cellulare, come lo shock termico e il rivestimento a matrice della membrana del seminterrato12. Oltre a questi metodi, la tecnologia genetica può anche promuovere la proliferazione cardiomiocita13 o invertire le cellule non miocardiche in cardiomiociti14. Dal punto di vista della bioingegneria, i cardiomiociti vengono seminato su uno scaffold biomateriale per migliorare l'efficienza dei trapianti15. Purtroppo, la maggior parte di questi metodi sono complicati e costosi. Al contrario, il metodo qui proposto è semplice, conveniente ed efficace, e può essere utilizzato come trattamento basale prima del trapianto, così come in coniugazione con altre tecnologie.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Alabama a Birmingham e si basavano sulle Linee guida per la cura e l'uso degli animali da parte del National Institutes of Health Laboratory (No- 85-23).
1. Preparazione dei mezzi di coltura e delle piastre culturali
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Preparazione media
- Per il mezzo hiPSC, mescolare 400 mL di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) mezzo basale (Tabella dei materiali 1) e 100 mL di supplemento hPSC 5x; Conservare il composto a 4 gradi centigradi.
- Per RPMI 1640/B27 meno insulina (RB-) medio, mescolare 500 mL di RPMI 1640 e 10 mL di B27 supplemento meno insulina.
- Per il mezzo RPMI 1640/B27 (RB) , mescolare 500 mL di RPMI 1640, 10 mL di supplemento B27 e 5 mL di penicillina-streptomicina (pen-streptop) antibiotico.
- Per il mezzo di purificazione16, mescolare 500 mL di RPMI 1640, 10 mL di supplemento B27, 5 mL di antibiotico pen-strep e 1.000 l di soluzione di sodio DL-lattato (a una concentrazione finale di 4 mM).
- Per una soluzione neutralizzante, mescolare 200 mL di RPMI 1640, 50 mL di siero bovino fetale (FBS), 2,5 mL di antibiotico pen-strep e 50 di Y-27632 (a una concentrazione finale di 10 M).
- Per il mezzo di congelamento, mescolare 9 mL di FBS, 1 mL di solforo dimetilo (DMSO) e 10 -L di Y-27632 (ad una concentrazione finale di 10 M).
- Per la soluzione a matrice extracellulare (EMS), scongelare la matrice extracellulare concentrata (Tabella dei materiali 1) a 4 gradi centigradi fino a quando non ha raggiunto uno stato liquido uniformemente coerente. Precool pipette punte e tubi prima di fare matrici di 350 -L ciascuno su ghiaccio, e conservare l'aliquota a -20 gradi centigradi. Prima di rivestire le piastre, diluire una aliquota scongelata in 24 mL di mezzo DMEM/F12 ghiacciato (EMS); mantenere l'EMS in 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
NOT: Eseguire tutte le fasi di rivestimento sul ghiaccio per evitare la solidificazione della matrice della membrana del seminterrato. - Per la soluzione di Tyrode, prendere il 90% del volume finale richiesto di acqua di grado di coltura dei tessuti, aggiungere la quantità appropriata dei seguenti reagenti e mescolare fino a dissoluzione. Quindi, utilizzare 1 N NaOH per regolare il pH a 7.4. Aggiungere acqua extra a una concentrazione finale di 140 mmol/L di cloruro di sodio, 1 mmol/L di cloruro di magnesio, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L di cloruro di potassio, 10 mmol/L glucosio e 1,8 mmol/cloruro di calcio. Sterilizzare per filtrazione, utilizzando una membrana di 0,22 m.
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Rivestimento piastra di coltura cellulare
- Per le piastre di coltura hiPSC, applicare 1 mL di EMS su ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra per almeno 1 h a 37 gradi centigradi. Aspirare la soluzione DMEM/F12 prima di seminare le cellule.
- Per il rivestimento della gelatina, sciogliere 0,2 g di polvere di gelatina in acqua di grado di tessuto per fare una soluzione dello 0,2% (w/v). Sterilizzare autoclaving a 121 gradi centigradi, 15 psi per 30 min. Prima di passare le cellule, aspirare la soluzione e lasciare asciugare la piastra per almeno 1 h a temperatura ambiente all'interno della cappa di coltura dei tessuti.
2. Manutenzione hiPSC e Ddifferenziazione Cardiomiocita
- Coltura gli hiPSC in supporto hiPSC (vedere il passaggio 1.1.1) con un cambiamento medio giornaliero fino a quando le cellule raggiungono 80%-90% confluenza per pozzo.
NOT: Per scopi di manutenzione, hiPSCs sono generalmente pronti per il passaggio ogni 4 giorni. - Per passare hiPSCs, aspirare il mezzo e lavare il pozzo 1x con 1x salina tampone fosfato (PBS). Aggiungere a ciascun pozzo 0,5 mL di soluzione per il distacco delle cellule staminali (Tabella dei materiali )e incubare a 37 gradi centigradi per 5-7 min.
NOT: Il tempo di incubazione dipende dalla densità delle cellule e dal tasso di dissociazione, che può essere osservato al microscopio. - Neutralizzare la soluzione di distacco delle cellule staminali con 1 mL di mezzo hiPSC integrato con 5 .M Y-27632. Raccogliere la miscela in un tubo di centrifuga di 15 mL. Centrifugare il tubo per 5 min a 200 x g, aspirare il super-atterrante senza disturbare il pellet cellulare, quindi risospendere le cellule in 1 mL di mezzo hiPSC contenente 5 .M Y-27632.
- Semina gli hiPSC su una nuova piastra a 6 pozzetti rivestita EMS con un rapporto compreso tra 1:6 e 1:18. Modificare il mezzo medio in hiPSC senza Y27632 dopo 24 h.
- Per congelare le cellule, risospendere gli hiPSC dissociati nel mezzo di congelamento ad una concentrazione di 0,5-1 milioni/500 l, posizionare la sospensione nei crioviali e conservarle in un congelatore a -80 gradi centigradi. Trasferire le fiale congelate in azoto liquido dopo 24 ore.
- Per differenziarsi, sostituire il mezzo hiPSC con 2 mL di RB- medio integrato con 10 M GSK-3 , inibitore CHIR99021 (CHIR) all'80%-90% di confluenza cellulare. Sostituire il mezzo con 3 mL di RB- medio dopo 24 h e incubare per ulteriori 48 h (giorno 3).
- Il giorno 3, sostituire il mezzo a 3 mL di RB- medio con 10 M Wnt inibitore IWR1 per 48 h (giorno 5), quindi sostituire il mezzo con 3 mL di RB- medio e mantenere per 48 h (giorno 7).
- Il giorno 7, sostituire il supporto con 3 mL di RB medium e cambiare il mezzo ogni 3 giorni in futuro. Il battito spontaneo degli hiPSC-CMs deve essere osservato tra i giorni da 7 a 10.
3. Depurazione hiPSC-CMs e pretrattamento delle piccole molecole
NOT: Per dissociare gli hiPSC-CM, sono stati utilizzati enzimi altamente purificati e ricombinanti di dissociazione cellulare (Tabelladei materiali1).
- Il giorno 21 dopo la differenziazione hiPSC-CM, aspirare il mezzo e lavare le cellule 1x con PBS sterile. Incubare le cellule con 0,5 mL di enzimi di dissociazione cellulare per bene per 5-7 min a 37 gradi centigradi. Ripetutamente pipette la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da 1 mL al fine di dissociare accuratamente le cellule.
- Dopo che le cellule sono dissociate, aggiungere 1 mL di soluzione neutralizzante ad ogni pozzo, raccogliere la miscela di cellule in un tubo di centrifugazione da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 3 min.
- Ripiantare le cellule su lastre di 6 pozzetti rivestiti di gelatina ad una densità di 2 milioni di cellule per pozzo.
- Dopo 24-48 h, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di purificazione per 3-5 giorni.
NOT: La purificazione è completa quando più del 90% delle cellule in ogni campo visivo al microscopio batte. Per evitare ulteriori danni ai cardiomiociti, non estendere la durata della purificazione oltre 5 giorni. Se il primo round non produce la purezza necessaria, sostituire il supporto di purificazione con il supporto RB per 1 giorno, quindi completare un secondo ciclo di purificazione. - Prima del trapianto, le cellule del gruppo di trattamento vengono coltivate per 12 h nel mezzo RBs, integrate con 10 .M Y-27632. Allo stesso modo, eseguire il trattamento in verapamil sulle cellule del mezzo RB , con 1 : M verapamil per 12 h (hiPSC-CMs- VER).
- Dopo il trattamento, lavare l'hiPSC-CMs 1x con PBS e incubare le cellule con 0,5 mL di enzimi di dissociazione cellulare per pozzo per un massimo di 2 min. Ripetutamente pipette la sospensione cellulare, utilizzando una pipetta da 1 mL, per dissociare accuratamente le cellule. Neutralizzare le cellule con soluzione di neutralizzazione, raccogliere la miscela di cellule in un tubo di centrifuga di 15 mL e centrifugare a 200 x g per 3 min. Risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di 0,1 milioni di cellule/5L in preparazione per l'iniezione.
4. Infarto miocardico e trapianto di cellule
NOT: Tutti gli strumenti chirurgici sono presterilizzati con autoclave e sono mantenuti in condizioni asettiche durante più interventi chirurgici tramite uno sterilizzatore di perline caldo (Tabella dei Materiali 2).
- Anestetizza noD/scid topi (Tabella dei materiali 2) con isoflurane inalato (1,5%-2%). Monitorare i livelli di anestesia dalle risposte dei topi a un pizzico di dita dei dei dei diici. Posizionare l'unguento ottico veterinario sugli occhi per evitare che si annidano durante l'intervento chirurgico.
- Fornire 0,1 mg/kg di buprenorfine sottocutanea mente per la gestione del dolore prima dell'intervento chirurgico.
- Posizionare e fissare il mouse in una posizione supina su un tavolo operatorio riscaldato, rimuovere i capelli dalla regione del collo ventrale e il torace sinistro utilizzando una crema depilatoria, esporre la pelle e disinfettarla con il 70% di alcol.
- Tagliare un'incisione di 0,5 cm al centro del collo utilizzando forbici chirurgiche, separare il grasso sottocutaneo con pinze sterili ed esporre la trachea. Introdurre per via orale la cannula dell'intubazione nella trachea, collegare la cannula a un piccolo ventilatore animale e regolare le impostazioni di ventilazione (impostare il volume di marea a 100–150 - l e la frequenza respiratoria a 100x–150x per min).
- Dopo che il mouse si stabilizza, tagliare un'incisione di 0,5 cm al centro della pelle sinistra del torace. Utilizzare pinze per separare senza mezzi termini lo strato muscolare e fare una piccola incisione nel quinto spazio intercostale per esporre la cavità toracica. Posizionare il retrattore nell'incisione per aprire la cavità toracica e individuare l'arteria coronaria discendente sinistra (LAD). Sotto un microscopio chirurgico sezionato, silegi il LAD con un sutura non assorbibile.
- Immediatamente dopo l'induzione di MI, iniettare 5 - L di hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs , o un volume uguale di PBS nel miocardio del mouse in ogni sito (3 x 105 celle/animale, 1 x 105 celle/sito), una nell'area infarto e due nelle aree intorno all'infarto.
NOT: Dal momento che 5 l è molto piccolo volume, non è facile controllare con precisione il volume succhiandolo direttamente con una siringa. Il coperchio di una parabola Petri sterile può essere capovolto, e 5 -L delle cellule possono essere prima depositati sul coperchio con una pipetta. A causa della tensione superficiale, non si diffonderà ma si condensa in una piccola massa liquida. Questo può essere facilmente assorbito e iniettato nel miocardio del mouse. - Eliminare l'aria residua nella cavità toracica riempiendola con soluzione salina isotonica calda. Stitch le costole, muscoli, e la pelle in sequenza con una sutura assorbibile 6-0. Spegnere l'iniezione di anestesia isoflurana. Tenere gli animali chirurgici sul pad di riscaldamento e osservarli da vicino mentre riacquistano piena consapevolezza. Quindi, posizionare gli animali in una gabbia pulita. Non restituire gli animali alla compagnia di altri animali fino a quando non sono completamente recuperati.
- Dopo l'intervento chirurgico, iniettare i topi intraperitonealmente con buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 12 h per 3 giorni consecutivi e iniettare loro ibuprofene (5 mg/kg) ogni 12 h per un giorno. Eseguire studi di analisi successivi in punti temporali specificati.
NOT: Segui le linee guida del tuo comitato locale per la cura degli animali per l'analgesia.
5. Calcio Transitorio e Contrattiglio Registrazione
- Autoclave 15 mm-diametrocoverslips (Tavolo dei materiali 2) e pinzette in un piccolo bicchiere di vetro a 121 gradi centigradi, 15 psi per 15 min. Precool i copricoproeni e pinzette a 4 gradi centigradi.
- Utilizzando le pinzette, posizionare il coperchio in una piastra da 12 pozzetti e una pipetta 300 -L di matrice extracellulare su ogni coverslip.
NOT: Non lasciare che la matrice superi il bordo della coverslip per evitare di ridurre la quantità di rivestimento a matrice. Incubare la piastra da 12 pozze in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi per 1 h. - Aspirare il mezzo nella piastra a 6 pozzetti rivestita di gelatina con hiPSC-CMs purificate, lavarlo 1x con PBS, quindi digerirlo con 0,5 mL di enzimi di dissociazione cellulare per 1,5 min. e centrifugare la miscela a 200 x g per 3 min.
- Aspirare la matrice extracellulare rivestita dai copricapi. Contare il numero di cellulare e sospendere nuovamente le celle nella soluzione di neutralizzazione fino a una concentrazione di 40.000/300 l, quindi aggiungere 300 l della sospensione cellulare su ogni coverll. Cultura la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi.
- Dopo 24 h, aspirare delicatamente la soluzione neutralizzata, aggiungere 500 L di mezzo RB a ogni pozzetto della piastra, e continuare a coltura per 2 giorni.
- Aggiungere Y-27632 (10 m), Rho kinase activator (RA, 100 nM), verapamil (1 M), o un volume uguale di PBS nel mezzo di coltura degli hiPSC-CMs, 12 h prima del rilevamento transitorio e di contrattilità.
NOT: Oltre al rilevamento del transitorio di calcio e della contrattilità delle cellule dopo 12 h di trattamento chimico, il rilevamento di questi parametri è stato testato anche a 12, 24, 48 e 72 h dopo il ritiro chimico. - Estrarre la piastra, scartare il mezzo e lavare la piastra 1x con PBS. Modificare il mezzo in un DMEM senza fenoliglio contenente lo 0,02% (w/v) di pololosto surfactant (Tabella dei materiali 1), indicatore di calcio di 5 M ( Tabella dei materiali1) e il corrispondente Y-27632 (10 M), RA (100 nM), verapam verail (1 M), o un volume uguale PBS, e incubare la piastra per 30 min a 37 gradi centigradi.
- Scartare il supernatante, lavare le cellule 3x con il mezzo DMEM senza coloranti e lasciare riposare il mezzo per 30 min per disidratare il colorante di mappatura.
- Collocare il coperchio dei semi cellulari in una camera da bagno aperta e inserire la camera in un sistema di microincubazione con 37 gradi con un regolatore di temperatura automatico (Tabella dei materiali2), perfuso con la soluzione di Tyrode e Inibitore della chinasi Rho (RI), RA o PBS alla soluzione perfusione.
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita (Tabella dei materiali 2) e una testa di scansione laser ( Tabella dei materiali 2 ) per registrare il transitorio spontaneodelcalcio impiegando una scansione line-t x-t, utilizzando un laser argon 488 nm per l'eccitazione del colorante e un barriera per raccogliere la luce di emissione. Registrare la contrazione spontanea di hiPSC-CMs utilizzando la funzionalità Differential Interference Contrast del microscopio confocale (Tabella dei materiali 2).
NOT: Le registrazioni transitorie di calcio sono state elaborate e analizzate utilizzando il software MATLAB R2016A (Tabella dei materiali 4). I saggi di cambiamento di contrazione cellulare sono stati eseguiti utilizzando il software ImageJ (Tabella dei materiali 4).
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Representative Results
Gli hiPSC-CM utilizzati in questo studio sono stati derivati dall'origine umana con il gene del reporter luciferasi; pertanto, il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate in vivo è stato rilevato dalla bioluminescenza imaging (BLI)17 (Figura 1A, B). Per le sezioni itologiche cardiache, la troponina cardiaca T (hcTnT) specifica dell'uomo e l'antigene nucleare umano (HNA) le cellule doppio-positive sono state classificate come engrafted hiPSC-CMs (Figura 1C). Entrambi i risultati hanno indicato che il pretrattamento di Y-27632 ha migliorato significativamente il tasso di innesto cellulare. L'attività luciferasi del gruppo hiPSC-CM-RI è stata aumentata di circa sei volte nei giorni 3, 7 e 28 dopo il trapianto, rispetto a quella del gruppo hiPSC-CM-RI (Figura 1B). Inoltre, l'espressione hcTnT/HNA è aumentata di quasi sette volte nel gruppo hiPSC-CM-RI, rispetto a quella del gruppo hiPSC-CM-RI (Figura 1C).
I risultati hanno anche indicato che il pretrattamento di Y-27632 regolava i cambiamenti citoscheletrici nelle cellule trapiantate. Nei giorni 7 e 28 del trapianto, gli hiPSC-CMs-RI hanno mostrato una struttura citoscheletrica più grande e più definita a forma di asta rispetto agli hiPSC-CMs-RI (Figura 1D).
Inoltre, il pretrattamento Y-27632 ha il potenziale per ridurre l'apoptosi trapiantata in vivo. La colorazione TUNEL ha mostrato che il numero di cellule TUNEL-positive è stato significativamente diminuito nel gruppo hiPSC-CM-RI rispetto a quello del gruppo hiPSC-CM-RI il giorno 2 dopo il trapianto (Figura 1E).
L'inibizione di ROCK ha promosso l'adesione delle cellule trapiantate e ha avuto il potenziale per aumentare ulteriormente la ritenzione delle cellule impiantate nei siti di somposizione. L'immunostaining del tessuto cardiaco e delle macchie occidentali ha suggerito che il pretrattamento di Y-27632 ha promosso in modo reversibile l'aumento dell'espressione dell'integrina 1 e N-cadherin e ha diminuito l'espressione della catena luminosa fosforo-miosina 2 (p-MLC2) (Figura 2A, B ).
La linea di cellule del mouse HL-1 è stata selezionata come CMs di controllo per gli esperimenti di associazione in vitro. I risultati hanno indicato che il pretrattamento di Y-27632 ha aumentato significativamente l'aderenza hiPSC-CM rispetto all'HL-1. Per confermare ulteriormente questi risultati, l'hiPSC-CMsè stato incubato con anticorpo neutralizzante N-cadherin o integrin n. 1 per 1 h, con conseguente scomparsa dell'adesione migliorata osservata in precedenza (Figura2C).
Rispetto al gruppo hiPSC-CM-RI, la forza contrattuale nel gruppo hiPSC-CM-RI è stata ridotta del 32%, e nel gruppo hiPSC-CM-RA (hiPSC-CMs pretrattate con l'attivatore ROCK, Table of Materials 1), è aumentata del 42% ( Figura 3A). Nel frattempo, rispetto al gruppo hiPSC-CM-RI, il picco di fluorescenza transitoria del calcio di calcio (Peak - F0) per il gruppo hiPSC-CM-RI è stato ridotto del 41%, e la durata transitoria del calcio (CaTD50) è stata ridotta dell'11% (Figura 3B) (Figura 3B) (Figura 3B) (Figura 3B) (Figura 3B) è stata ridotta dell'11% (Figura3B) ,C). Al contrario, il picco di picco F/F0 per il gruppo hiPSC-CM-RA è stato aumentato del 48% e CaTD50 è stato aumentato del 13% (Figura 3B,C).
Inoltre, un pretrattamento dei cardiomiociti con Y-27632 per 12 h prima del trapianto ha ridotto significativamente l'espressione di cTnI e cTnT (Figura 3D),entrambi dei quali sono sottounità troponina (Tn) che regolano la contrazione cardiomiocita.
Simile a Y-27632, un pretrattamento di verapamil (1 M, 12 h) ha aumentato significativamente il tasso di innesto di hiPSC-CMs in topi MI indotti. L'ipotesi è stata confermata dall'osservazione di un aumento del segnale di luciferasi nel test di bioluminescenza (Figura 4A) e dall'aumento del numero di cellule doppio-positivo hcTnT/HNA nei giorni 7 e 28 dopo il trapianto di cellule (Figura 4B).
Figura 1: Y-27632 pretrattamento ha aumentato il tasso di innesto di hiPSC-CMs nei cuori dei topi MI. (A) Curva standard delle misurazioni BLI. (B) Segnale Luciferino in topi NOD/scid trattati con PBS, hiPSC-CMs-RI, o hiPSC-CMs nei giorni 3, 7 e 28 dopo l'intervento chirurgico. n - 6-9 topi per gruppo. P < 0,05 rispetto a PBS; . . . P < 0,05 vs hiPSC-CMs-RI. (C) Immunostaining delle sezioni cardiache per hcTnT e HNA. Barre di scala: 100 m (10 volte le immagini); 20 m (40x immagini). n - 5 topi per gruppo. P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-RI. (D) Immagini rappresentative di sezioni cardiache macchiate di phalloidin e hcTnT. Barra di scala: 20 m. n e 5 topi per gruppo. P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-RI. (E) Immagini rappresentative delle sezioni cardiache per la colorazione TUNEL. Barra di scala: 20 m. n - 4-6 topi per gruppo. P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-RI. Questa cifra è stata modificata da18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Y-27632 ha migliorato l'adesione di hiPSC-CMs mantenendo l'espressione delle proteine di adesione. (A e B) Analisi commerciale dell'espressione dell'integrin 1, dell'N-cadherin e del fosforolazione di MLC2 (p-MLC2) in hiPSC-CMs trattati con RI e in hiPSC-CMs non trattati. (C) hcTnT immunofluorescenza colorazione di -RI e -RI hiPSC-CMs con e senza un pretrattamento di anticorpi anti-N-caderin (N-Cad) e antiintegranti -1 (Integ). Barre di scala : 100 m. ,P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-RI; . . . P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs. Questa cifra è stata modificata da18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il pretrattamento con Y-27632 ha ridotto la contrattilità degli hiPSC-CMs e ha regolato in basso l'espressione delle sottounità di troponina cardiaca. (A) Quantificazione della percentuale di accorciamento degli hiPSC-CMs esposti al trattamento ri e RA. P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-RI; . . . P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs. (B e C) Immagini rappresentative e quantificazione delle misurazioni transitorie del calcio di hiPSC-CM trattate con RI e RA e di un gruppo non trattato. P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-RI; . . . P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs. (( D) Analisi commerciale delle macchie dell'espressione di sottounità di troponina cardiaca (cTnC, cTnT e cTnI) in hiPSC-CMs trattate con RI e RA e in un gruppo non trattato. Questa cifra è stata modificata da18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il pretrattamento di Verapamil ha migliorato il tasso di innesto di hiPSC-CMs nei topi MI. (A) Segnale Luciferina in topi NOD/scid trattati con PBS, hiPSC-CMs-VERo hiPSC-CMs nei giorni 3, 7 e 28 dopo l'intervento chirurgico. n - 8 topi per gruppo. P < 0,05 rispetto a PBS; . . . P < 0,05 vs hiPSC-CMs-VER. (B) Immunostaining delle sezioni cardiache per hcTnT e HNA. Per le immagini 10x, barre di scala : 100 m (10 volte le immagini); 20 m (40x immagini). n - 5 topi per gruppo. P < 0,05 rispetto a hiPSC-CMs-VER. Questa cifra è stata modificata da18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passaggi chiave di questo studio includono l'ottenimento di hiPSC-CMs puri, il miglioramento dell'attività di hiPSC-CMs attraverso il pretrattamento Y-27632 e, infine, il trapianto di una quantità precisa di hiPSC-CMs in un modello di MI del topo.
Le questioni chiave affrontate qui sono state che, in primo luogo, abbiamo ottimizzato i metodi di purificazione senza glucosio19 e stabilito un nuovo sistema di purificazione efficiente. La procedura di sistema ha incluso l'applicazione di enzimi di dissociazione cellulare, il repianto delle cellule in piastre rivestite di gelatina, la coltura delle cellule nel mezzo di neutralizzazione per 24 h dopo la replatazione e la riduzione del tempo di digestione delle cellule prima del trapianto, di cui sono stati eseguiti per ottenere la più alta attività delle cellule, ottenendo cardiomiociti puri.
In secondo luogo, abbiamo elaborato il pretrattamento di hiPSC-CMs con Y-27632 a 12 h prima dell'iniezione cellulare. L'anoikis è solitamente indotto dalla modifica delle proteine di adesione delle cellule, come integrins4,20 e N-cadherin21, che portano all'attivazione del percorso apoptotico. Abbiamo dimostrato che il pretrattamento di Y-27632 potrebbe promuovere l'adesione di hiPSC-CMs al sito di trapianto mantenendo l'espressione dell'integrina 1 e della N-cadherin, sopprimendo l'espressione di p-MLC2, che è correlata ai cambiamenti nel citoscheletro architettura22,23. Sette giorni dopo il trapianto di hiPSC-CM, l'hiPSC-CMsha portato a una maggiore area di innesto cellulare, a forme di asta definite più fini e a un'organizzazione citoscheletrica più completa rispetto agli hiPSC-CMs-RI (Figura1B-D).
In terzo luogo, abbiamo istituito un nuovo sistema di iniezione intracellulare nei modelli MI del topo, con 5 -L per punto di iniezione per iniettare con precisione il numero richiesto di cellule, evitando al contempo una diminuzione del tasso di sopravvivenza del topo a causa del volume di iniezione eccessivo.
Quarto, abbiamo elaborato su come determinare i cambiamenti nella contrazione cellulare e nel calcio transitorio negli hiPSC-CMs dopo il pretrattamento con RI o RA. Abbiamo scoperto che Y-27632 può ridurre reversibilmente la contrattilità cellulare e il calcio transitorio. L'ipotesi qui è che a causa del minor fabbisogno energetico delle cellule trapiantate, il tasso di innesto è aumentato. Effetti simili possono essere ottenuti utilizzando l'inibitore del canale di calcio verapamil. Il meccanismo proposto che ha portato all'inibizione della contrattiglia è che Y-27632 riduce l'espressione delle sottounità troponina cTnT e cTnI in hiPSC-CMs.
La limitazione principale è che Y-27632 ha svolto un ruolo transitorio solo durante il trapianto. Come inibire Rho chinasi per un periodo più lungo, migliorando così ulteriormente l'efficienza dei trapianti di hiPSC-CMs, è un problema da risolvere in futuro. Per quanto riguarda più applicazioni di questo metodo, inibitore ROCK può non solo migliorare l'attività dei cardiomiociti durante il trapianto, ma anche migliorare l'attività di altre cellule; pertanto, può essere utilizzato anche durante il pretrattamento nei processi di trapianto di altre cellule. Inoltre, l'approccio qui presentato pone una buona base sperimentale per ulteriori ricerche sulle malattie cardiache.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) per aver gentilmente fornito il costrutto Fluc-GFP e il Dr. Yanwen Liu per un'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (per J.) e HL121206A1 (a Los Angeles) e una sovvenzione R56 HL142627 (per W.) 16SDG30410018, e l'Università dell'Alabama a Birmingham Faculty Development Grant (a W. .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
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