Summary
En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.
Abstract
Un factor crucial en la mejora de la eficacia de la terapia celular para la regeneración miocárdica es aumentar de forma segura y eficiente la tasa de injerto celular. Y-27632 es un inhibidor muy potente de Rho-asociado, bobina enrollada-que contiene proteína quinasa (RhoA/ROCK) y se utiliza para prevenir la disociación inducida por la apoptosis celular (anoikis). Demostramos que el pretratamiento Y-27632 para cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-MC+RI)antes de la implantación da como resultado una mejora de la tasa de injerto celular en un modelo de ratón de infarto agudo de miocardio (MI). Aquí, describimos un procedimiento completo de diferenciación hiPSC-CM, purificación y pretratamiento celular con Y-27632, así como la contracción celular resultante, mediciones transitorias de calcio y trasplante en modelos MI de ratón. El método propuesto proporciona un método simple, seguro, eficaz y de bajo costo que aumenta significativamente la tasa de injerto celular. Este método no sólo puede utilizarse junto con otros métodos para mejorar aún más la eficiencia del trasplante de células, sino que también proporciona una base favorable para el estudio de los mecanismos de otras enfermedades cardíacas.
Introduction
Las terapias basadas en células madre han demostrado un potencial considerable como tratamiento para el daño cardíaco causado por MI1. El uso de hiPSC diferenciados proporciona una fuente inagotable de hiPSC-CP2 y abre la puerta al rápido desarrollo de tratamientos innovadores. Sin embargo, siguen existiendo muchas limitaciones a la traducción terapéutica, incluido el desafío de la tasa de injerto severamente baja de las células implantadas.
La disociación de células con trippsina inicia anoikis3, que sólo se acelera una vez que estas células se inyectan en ambientes hostiles como el miocardio isquémico, donde el ambiente hipóxico acelera el curso hacia la muerte celular. De las células restantes, una gran proporción se lava desde el sitio de implantación en el torrente sanguíneo y se extiende por toda la periferia. Una de las vías apoptoticas clave es la vía RhoA/ROCK4. Basado en investigaciones previas, la vía RhoA/ROCK regula la organización citoesquelética actina5,6, que es responsable de la disfunción celular7,8. El inhibidor DE ROCK Y-27632 es ampliamente utilizado durante la disociación somática y de célulasmadre y el passaging, para aumentar la adhesión celular y reducir la apoptosis celular 9,10,11. En este estudio, Y-27632 se utiliza para tratar hiPSC-CM antes del trasplante en un intento de aumentar la tasa de injerto celular.
Se han establecido varios métodos destinados a mejorar la tasa de injerto celular, como el choque térmico y el recubrimiento de matriz de membrana de sótano12. Aparte de estos métodos, la tecnología genética también puede promover la proliferación de cardiomiocitos13 o revertir las células no miocárdicas en cardiomiocitos14. Desde la perspectiva de la bioingeniería, los cardiomiocitos se asintan en un andamio biomaterial para mejorar la eficiencia del trasplante15. Desafortunadamente, la mayoría de estos métodos son complicados y costosos. Por el contrario, el método propuesto aquí es simple, rentable y eficaz, y se puede utilizar como tratamiento basal antes del trasplante, así como en conjugación con otras tecnologías.
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Protocol
Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham y se basaron en los Institutos Nacionales de Guías de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Salud (NIH Publication No 85-23).
1. Preparación de medios de cultivo y placas de cultura
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Preparación media
- Para el medio hiPSC, mezclar 400 mL de célula madre pluripotente humana (hPSC) medio basal (Tablade Materiales 1) y 100 mL de suplemento hPSC 5x; almacenar la mezcla a 4oC.
- Para RPMI 1640/B27 menos medio de insulina (RB-), mezclar 500 ml de RPMI 1640 y 10 mL de suplemento B27 menos insulina.
- Para rpmI 1640/B27 (RB+) medio, mezclar 500 ml de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27, y 5 mL de penicilina-estreptomicina (pen-strep) antibiótico.
- Para el medio de purificación16, mezclar 500 ml de RPMI sin glucosa 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico de pluma-estreptococo, y 1.000 ml de solución de DL-lactato de sodio (a una concentración final de 4 mM).
- Para la solución neutralizante, mezcle 200 ml de RPMI 1640, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), 2,5 ml de antibiótico de pluma y estreptococo y 50 ml de Y-27632 (a una concentración final de 10 m).
- Para medio de congelación, mezcle 9 ml de FBS, 1 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) y 10 ml de Y-27632 (a una concentración final de 10 m).
- Para la solución de matriz extracelular (EMS), descongelar la matriz extracelular concentrada (Tablade Materiales 1) a 4 oC hasta que haya alcanzado un estado líquido uniformemente consistente. Preenfriar las puntas y tubos de la pipeta antes de hacer alícuotas de matriz de 350 ol cada una en hielo, y almacenar las alícuotas a -20 oC. Antes de recubrir las placas, diluir una alícuota descongelada en 24 ml de medio DMEM/F12 helado (EMS); mantener el SME en 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
NOTA: Realice todos los pasos de recubrimiento en hielo para evitar la solidificación de la matriz de membrana del sótano. - Para la solución de Tyrode, tome el 90% del volumen final requerido de agua de grado de cultivo tisular, agregue la cantidad adecuada de los siguientes reactivos y revuelva hasta que se disuelva. A continuación, utilice 1 NNaOH para ajustar el pH a 7.4. Añadir agua extra a una concentración final de cloruro de sodio de 140 mmol/L, cloruro de magnesio de 1 mmol/L, HEPES de 10 mmol/L, cloruro de potasio de 5 mmol/L, glucosa de 10 mmol/L y cloruro de calcio de 1,8 mmol/L. Esterilizar por filtración, utilizando una membrana de 0,22 m.
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Recubrimiento de placas de cultivo celular
- Para placas de cultivo hiPSC, aplicar 1 ml de EMS a cada pocal de una placa de 6 pocillos e incubar la placa durante al menos 1 h a 37 oC. Aspirar la solución DMEM/F12 antes de la sembración de células.
- Para el recubrimiento de gelatina, disolver 0,2 g de gelatina en polvo en agua de grado de cultivo tisular para hacer una solución de 0,2% (p/v). Esterilizar mediante autoclave a 121oC, 15 psi durante 30 min. Cubrir cada pocil de una placa de 6 pocillos con 2 ml de la solución e incubar durante 1 h a 37oC. Antes de pasar las células, aspirar la solución y dejar que la placa se seque durante al menos 1 h a temperatura ambiente dentro de la campana de cultivo de tejido.
2. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación de cardiomiocitos
- Cultivo de los hiPSC en medio hiPSC (ver paso 1.1.1) con un cambio medio diario hasta que las células alcancen 80%–90% de confluencia por pozo.
NOTA: Para fines de mantenimiento, los hiPSC generalmente están listos para el paso cada 4 días. - Para pasar hiPSCs, aspirar el medio y lavar el pozo 1x con 1x salina con fosfato (PBS). Añadir 0,5 ml de solución de desprendimiento de células madre (Tablade materiales 1) a cada poca y incubar a 37 oC durante 5-7 min.
NOTA: El tiempo de incubación depende de la densidad de las células y de la tasa de disociación, que se puede observar bajo un microscopio. - Neutralizar la solución de desprendimiento de células madre con 1 ml de medio hiPSC complementado con 5 M Y-27632. Recoger la mezcla en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrifugar el tubo durante 5 min a 200 x g, aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, y luego, resuspender las células en 1 ml de medio hiPSC que contiene 5 M Y-27632.
- Sofitee los hiPSC en una nueva placa de 6 pocillos recubierta de EMS en una relación entre 1:6 y 1:18. Cambie el medio a medio hiPSC sin Y27632 después de las 24 h.
- Para congelar las células, resuspenda los hiPSC disociados en medio de congelación a una concentración de 0,5–1 millones/500 l, coloque la suspensión en crioviales y guárdelas en un congelador de -80 oC. Transfiera los viales congelados a nitrógeno líquido después de 24 h.
- Para diferenciar, sustituya el medio hiPSC por 2 ml de medio RB- complementado con 10 m de inhibidor de GSK-3 ( inhibidor CHIR99021 (CHIR) en 80%–90% de confluencia celular. Sustituya el medio por 3 ml de medio RB después de 24 h e incubar durante 48 h adicionales (día 3).
- En el día 3, cambie el medio a 3 ml de rb-medio con 10 M Wnt inhibidor IWR1 durante 48 h (día 5), y luego reemplace el medio con 3 ml de RB- medio y manténgalo durante 48 h (día 7).
- En el día 7, sustituya el medio por 3 ml de medio RB y cambie el medio cada 3 días en el futuro. Se deben observar golpes espontáneos de hiPSC-CP entre los días 7–10.
3. Purificación de hiPSC-CMs y pretratamiento de moléculas pequeñas
NOTA: Se utilizaron enzimas de disociación celular altamente purificadas y recombinantes (Tablade Materiales1) para disociar hiPSC-CP.
- El día 21 después de la diferenciación hiPSC-CM, aspirar el medio y lavar las células 1x con PBS estéril. Incubar las células con 0,5 ml de enzimas de disociación celular por pozo durante 5-7 min a 37 oC. Pipetear repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de 1 ml para disociar completamente las células.
- Después de disociar las células, añadir 1 ml de solución neutralizante a cada pocil, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en una solución neutralizante.
- Replantar las células en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina a una densidad de 2 millones de células por pozo.
- Después de 24–48 h, reemplace el medio de cultivo por medio de purificación durante 3-5 días.
NOTA: La purificación se completa cuando más del 90% de las células en cada campo de visión del microscopio están latiendo. Para evitar más daños a los cardiomiocitos, no extienda la duración de la purificación más allá de 5 días. Si la primera ronda no produce la pureza necesaria, sustituya el medio de purificación por el medio RB+ durante 1 día y, a continuación, complete una segunda ronda de purificación. - Antes del trasplante, el cultivo de las células en el grupo de tratamiento durante 12 h en medio RB+ complementado con 10 M Y-27632. Del mismo modo, realizar tratamiento con verapamilo en las células del medio RB+ con 1 m de verapamilo durante 12 h (hiPSC-CP+VER).
- Después del tratamiento, lavar los HIPSC-CMs 1x con PBS e incubar las células con 0,5 ml de enzimas de disociación celular por pozo durante un máximo de 2 min. Pipeteo repetidamente la suspensión celular, utilizando una pipeta de 1 ml, para disociar completamente las células. Neutralizar las células con solución neutralizante, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Resuspender las células en PBS a una concentración de 0,1 millones de células/5 ml en preparación para la inyección.
4. Infarto de miocardio y trasplante celular
NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos se preesterilizan con autoclave y se mantienen en condiciones asépticas durante múltiples cirugías a través de un esterilizador de cuentas calientes (Tablade materiales 2).
- Anestetizar ratones NOD/scid (Tablade Materiales 2) con isoflurano inhalado (1,5%–2%). Supervise los niveles de anestesia mediante las respuestas de los ratones a un pellizco del dedo del dedo del dedo del sol. Coloque la pomada óptica de la venta en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.
- Suministro por vía subcutánea de 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para el tratamiento del dolor antes de la cirugía.
- Coloque y asegure el ratón en posición supina sobre una mesa de operación calentada, retire el cabello de la región del cuello ventral y el tórax izquierdo usando una crema depilatoria, exponga la piel y desinfecte con 70% de alcohol.
- Cortar una incisión de 0,5 cm en el centro del cuello con tijeras quirúrgicas, separar la grasa subcutánea con fórceps estériles y exponer la tráquea. Introducir oralmente la cánula de intubación en la tráquea, conectar la cánula a un respirador animal pequeño y ajustar los ajustes de ventilación (establecer el volumen de marea en 100-150 l y la velocidad de respiración en 100x–150x por min).
- Después de que el ratón se estabilice, corte una incisión de 0,5 cm en el centro de la piel del pecho izquierdo. Utilice fórceps para separar sin rodeos la capa muscular y hacer una pequeña incisión en el quinto espacio intercostal para exponer la cavidad torácica. Coloque el retractor en la incisión para abrir la cavidad torácica y localizar la arteria coronaria descendente izquierda (LAD). Bajo un microscopio quirúrgico disección, ligar el LAD con un 8-0 sutura inabsorbible.
- Inmediatamente después de la inducción de MI, inyectar 5 l de hiPSC-CP-RI, hiPSC-CP+RI, hiPSC-CP-VER, hiPSC-CP+VER,o un volumen igual de PBS en el miocardio del ratón en cada sitio (3 x 105 celdas/animal, 1 x 105 células/sitio), una en el área del infarto y dos en las áreas alrededor del infarto.
NOTA: Dado que 5 l es un volumen muy pequeño, no es fácil controlar con precisión el volumen succionándolo directamente con una jeringa. La tapa de una placa estéril de Petri se puede girar, y 5 l de las células se pueden depositar primero en la tapa con una pipeta. Debido a la tensión superficial, no se extenderá, sino que se condensará en una pequeña masa líquida. Esto se puede absorber e inyectar fácilmente en el miocardio del ratón. - Elimine el aire residual en la cavidad torácica llenándolo con solución salina isotónica caliente. Coser las costillas, los músculos y la piel en secuencia con una sutura absorbible 6-0. Apague la inyección de anestesia con isoflurano. Mantenga a los animales de cirugía en la almohadilla de calentamiento y observen de cerca mientras recuperan la plena conciencia. Luego, coloque a los animales en una jaula limpia. No devuelva los animales a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.
- Después de la cirugía, inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 12 h durante 3 días consecutivos e inyectarles ibuprofeno (5 mg/kg) cada 12 h durante un día. Realice estudios de análisis posteriores en puntos de tiempo especificados.
NOTA: Siga las pautas de su comité local de cuidado de animales para la analgesia.
5. Grabación transitoria y contractilidad del calcio
- Autoclave cubiertas de 15 mm de diámetrolips (Tablade Materiales 2) y pinzas en un vaso de vidrio pequeño a 121 oC, 15 psi durante 15 min. Preenfríe los labios de las cubiertas y pinzas a 4 oC.
- Con las pinzas, coloque el cubreobjetos en una placa de 12 pocillos y una pipeta de 300 ml de matriz extracelular en cada cubreobjetos.
NOTA: No deje que la matriz exceda el borde de la cubierta para evitar la reducción de la cantidad de recubrimiento de la matriz. Incubar la placa de 12 pocillos en una incubadora de cultivo celular de 37oC durante 1 h. - Aspirar el medio en la placa de 6 pocillos recubierto de gelatina con hiPSC-CP purificados, lavarlo 1x con PBS, y luego digerirlo con 0,5 ml de enzimas de disociación celular durante 1,5 min. Añadir 1 ml de solución neutralizadora, pipeta repetidamente para no más de 5x–10x con una pipeta de 1 ml , y centrifugar la mezcla a 200 x g durante 3 min.
- Aspirar la matriz extracelular recubierta de los labios de las cubiertas. Cuente el número de celda y resuspenda las células de la solución neutralizante a una concentración de 40.000/300 l, y luego agregue 300 s de la suspensión celular a cada cubreobjetos. Cultivar la placa en una incubadora de 37oC.
- Después de 24 h, aspirar suavemente la solución neutralizada, añadir 500 ml de medio RB+ a cada pocal de la placa, y continuar a cultivar durante 2 días.
- Añadir Y-27632 (10 m), activador Rho quinasa (RA, 100 nM), verapamilo (1 m), o un volumen igual de PBS en el medio de cultivo de los CPDe, 12 h antes de que el calcio sea transitorio y la detección de contractilidad.
NOTA: Además de la detección del calcio transitorio de las células y la contractilidad después de 12 h de tratamiento químico, la detección de estos parámetros también se probó a 12, 24, 48 y 72 h después de la retirada química. - Saque la placa, deseche el medio y lave la placa 1x con PBS. Cambiar el medio a un DMEM libre de fenol-rojo que contenga 0,02% (p/v) de poliol tensioactivo (Tablade materiales 1), indicador de calcio de 5 m (Tablade materiales 1), y el correspondiente Y-27632 (10 m), RA (100 nM), verapamilo (1 m) o un volumen igual de PBS, e incubar la placa durante 30 min a 37 oC.
- Deseche el sobrenadante, lave las células 3veces con medio DMEM sin tinte y deje reposar el medio durante 30 minutos para desestalificar el tinte cartográfico.
- Coloque la cubierta de la célula en una cámara de baño abierta e inserte la cámara en un sistema de microincubación equilibrado a 37 oC con un controlador automático de temperatura (Tablade materiales 2perfus), einsertarla con la solución de Tyrode, y añadir continuamente Inhibidor de Rho quinasa (RI), RA, o PBS a la solución de perfusión.
- Utilice un microscopio de fluorescencia invertida (Tablade materiales 2) y un cabezal de escaneo láser (Tablade materiales 2) para registrar un transitorio espontáneo de calcio mediante el uso de un escáner de línea x-t, utilizando un láser de argón de 488 nm para excitación de tinte y un 515 x 10 nm filtro de barrera para recoger la luz de emisión. Registrar la contracción espontánea de hiPSC-CM utilizando la funcionalidad de contraste de interferencia diferencial del microscopio confocal (Tablade materiales 2).
NOTA: Las grabaciones transitorias de calcio se procesaron y analizaron utilizando el software MATLAB R2016A (Tablade materiales 4). Los ensayos de cambio de contracción celular se realizaron utilizando el software ImageJ (Tablade materiales 4).
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Representative Results
Los hiPSC-CM utilizados en este estudio se derivaron de origen humano con el gen reportero de luciferasa; por lo tanto, la tasa de supervivencia de las células trasplantadas in vivo se detectó mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI)17 (Figura 1A,B). Para las secciones histológicas del corazón, las células dobles positivas de la troponina cardíaca T (hcTnT) y del antígeno nuclear humano (HNA) se clasificaron como hiPSC-CM injertadas (Figura1C). Ambos resultados indicaron que el pretratamiento Y-27632 mejoró significativamente la tasa de injerto celular. La actividad luciferasa del grupo hiPSC-CM+RI se incrementó aproximadamente seis veces en los días 3, 7 y 28 después del trasplante, en comparación con la del grupo hiPSC-CM-RI (Figura1B). Además, la expresión hcTnT/HNA aumentó casi siete veces en el grupo hiPSC-CM+RI, en relación con la del grupo hiPSC-CM-RI (Figura1C).
Los resultados también indicaron que el pretratamiento Y-27632 reguló los cambios citoesqueléticos en las células trasplantadas. En los días 7 y 28 del trasplante, los hiPSC-CP+RI exhibieron una estructura citoesquelética más grande y definida en forma de varilla en comparación con hiPSC-CP-RI (Figura1D).
Además, el pretratamiento Y-27632 tiene el potencial de reducir la apoptosis in vivo de hiPSC-CM trasplantada. La tinción TUNEL mostró que el número de células positivas de TUNEL disminuyó significativamente en el grupo hiPSC-CM+RI en relación con el del grupo hiPSC-CM-RI en el día 2 después del trasplante (Figura1E).
La inhibición de ROCK promovió la adhesión de células trasplantadas y tuvo el potencial de aumentar aún más la retención de células implantadas en los sitios de administración. La inmunomancha occidental y la inmunomancha cardíaca sugirieron que el pretratamiento Y-27632 promovía de manera reversible el aumento de la expresión de la integrina n.o 1 y la n-cadherina y disminuyó la expresión de la cadena de luz de fosfomiosina 2 (p-MLC2) (Figura2A,B ).
La línea de celda del ratón HL-1 fue seleccionada como los CMs de control para experimentos de fijación de células in vitro. Los resultados indicaron que el pretratamiento Y-27632 aumentó significativamente la adherencia hiPSC-CM en relación con HL-1. Para confirmar aún más estos hallazgos, los hiPSC-CMs+RI se incubaron con anticuerpo neutralizante N-cadherin o integrina n.o 1 durante 1 h, lo que dio lugar a una desaparición de la adhesión mejorada vista anteriormente (Figura2C).
En comparación con el grupo hiPSC-CM-RI, la fuerza contráctela en el grupo hiPSC-CM+RI se redujo en un 32%, y en el grupo hiPSC-CM+RA (hiPSC-CM pretratados con activador ROCK, Tabla de Materiales1), se incrementó en un 42% ( Figura 3A). Mientras tanto, en comparación con el grupo hiPSC-CM-RI, la fluorescencia transitoria de calcio pico (Pico -F/F0) para el grupo hiPSC-CM+RI se redujo en un 41%, y la duración transitoria del calcio (CaTD50) se redujo en un 11% (Figura 3B) (Figura3B) ,C). Por el contrario, el pico F/F0 para el grupo hiPSC-CM+RA se incrementó en un 48%, y CaTD50 se incrementó en un 13% (Figura 3B,C).
Además, un pretratamiento de los cardiomiocitos con Y-27632 durante 12 h antes del trasplante redujo significativamente la expresión de cTnI y cTnT (Figura3D),ambas subunidades de troponina (Tn) que regulan la contracción de cardiomiocitos.
Al igual que el Y-27632, un pretratamiento verapamilo (1 M, 12 h) aumentó significativamente la tasa de injerto de hiPSC-CP en ratones MI inducidos. La hipótesis se confirmó mediante la observación de un aumento de la señal de luciferasa en el ensayo de bioluminiscencia (Figura4A)y un mayor número de células dobles positivas hcTnT/HNA en los días 7 y 28 después del trasplante de células (Figura4B).
Figura 1: El pretratamiento Y-27632 aumentó la tasa de injerto de hiPSC-CM en corazones de ratones MI. (A) Curva estándar de mediciones BLI. (B) Señal de luciferina en ratones NOD/scid tratados con PBS, hiPSC-CP-RIo hiPSC-CP+RI los días 3, 7 y 28 después de la cirugía. n 6-9 ratones por grupo. *P < 0.05 contra PBS; • P < 0,05 frente a hiPSC-CMs-RI. (C) Inmunomanchación de secciones cardíacas para hcTnT y HNA. Barras de escala a 100 m (imágenes de 10x); 20 m (imágenes de 40x). 5 ratones por grupo. *P < 0.05 frente a hiPSC-CMs-RI. (D) Imágenes representativas de las secciones del corazón manchadas con faloidina y hcTnT. Barra de escala de 20 m. n 5 ratones por grupo. *P < 0.05 frente a hiPSC-CMs-RI. (E) Imágenes representativas de las secciones del corazón para la tinción TUNEL. Barra de escala de 20 m. n a 4-6 ratones por grupo. *P < 0.05 frente a hiPSC-CMs-RI. Esta figura ha sido modificada de Zhao et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Y-27632 mejoró la adhesión de hiPSC-CM manteniendo la expresión de proteínas de adhesión. (A y B) Análisis de la mancha occidental de la expresión de integrina n.o 1, n-cadherina y fosforilación de MLC2 (p-MLC2) en hiPSC-CP tratados con RI y en hiPSC-CP no tratados. n a 5 réplicas por grupo. (C) análisis de tinción de inmunofluorescencia hcTnT de -RI y +RI hiPSC-CP con y sin pretratamiento de anticuerpos anti-N-cadherina (N-Cad) y antiintegrina n.o 1 (Integ). Barras de escala a 100 m. *P < 0,05 frente a hiPSC-CMs-RI; • P < 0,05 frente a hiPSC-CMs+RI. Esta figura ha sido modificada de Zhao et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El pretratamiento con Y-27632 redujo la contractilidad de los hiPSC-CM y reguló la expresión de subunidades de troponina cardíaca. (A) Cuantificación del porcentaje de acortamiento de los hiPSC-CP expuestos al tratamiento con RI y RA. *P < 0.05 frente a hiPSC-CMs-RI; • P < 0,05 frente a hiPSC-CMs+RI. (B y C) Imágenes representativas y cuantificación de mediciones transitorias de calcio de hiPSC-CP tratados con RI y RA y de un grupo no tratado. *P < 0.05 frente a hiPSC-CMs-RI; • P < 0,05 frente a hiPSC-CMs+RI. (D) Análisis de la mancha occidental de la expresión de subunidades de troponina cardíaca (cTnC, cTnT y cTnI) en hiPSC-CP tratados con RI y RA y en un grupo no tratado. Esta figura ha sido modificada de Zhao et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El pretratamiento de Verapamil mejoró la tasa de injerto de hiPSC-CM en ratones MI. (A) Señal de Luciferina en ratones NOD/scid tratados con PBS, hiPSC-CP-VERo hiPSC-CP+VER los días 3, 7 y 28 después de la cirugía. n 8 ratones por grupo. *P < 0.05 contra PBS; • P < 0,05 frente a hiPSC-CP-VER. (B) Inmunomanchación de secciones cardíacas para hcTnT y HNA. Para imágenes de 10x, barras de escala de 100 m (imágenes de 10x); 20 m (imágenes de 40x). 5 ratones por grupo. *P < 0.05 frente a hiPSC-CMs-VER. Esta figura ha sido modificada de Zhao et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos clave de este estudio incluyen la obtención de hiPSC-CM puros, la mejora de la actividad de los hiPSC-CM a través del pretratamiento Y-27632 y, por último, el trasplante de una cantidad precisa de hiPSC-CM en un modelo de MI de ratón.
Las cuestiones clave que se abordaron aquí fueron que, en primer lugar, optimizamos los métodos de purificación sin glucosa19 y establecimos un novedoso sistema de purificación eficiente. El procedimiento del sistema incluyó la aplicación de enzimas de disociación celular, la replantación de células en placas recubiertas de gelatina, el cultivo de las células en el medio de neutralización durante 24 horas después de la replacación, y minimizar el tiempo de digestión de las células antes del trasplante, todos de los cuales se realizaron para lograr la mayor actividad de las células mientras se obtenían cardiomiocitos puros.
En segundo lugar, profundizamos en el pretratamiento de hiPSC-CP con Y-27632 a las 12 h antes de la inyección celular. Los anoikis son generalmente inducidos por la modificaciónde las proteínas de adhesión de las células, tales como integrinas 4,20 y N-cadherina21,que conducen a la activación de la vía apoptotica. Demostramos que el pretratamiento Y-27632 podría promover la adhesión de hiPSC-CP al sitio de trasplante mediante el mantenimiento de la expresión de integrina 1 y N-cadherina, suprimiendo la expresión de p-MLC2, que está relacionada con cambios en el citoesquelético arquitectura22,23. Siete días después del trasplante de hiPSC-CM, los HIPSC-CM+RI dieron como resultado un área de injerto celular mayor, formas de varilla definidas más finas y una organización citoesquelética más completa en comparación con los hiPSC-CM-RI (Figura1B-D).
En tercer lugar, establecimos un novedoso sistema de inyección intracelular en modelos MI de ratón, con 5 l por punto de inyección para inyectar con precisión el número requerido de células, evitando al mismo tiempo una disminución en la tasa de supervivencia del ratón debido al volumen de inyección excesivo.
En cuarto lugar, explicamos cómo determinar los cambios en la contracción celular y el calcio transitorio en los hiPSC-CP después del pretratamiento con RI o RA. Encontramos que Y-27632 puede reducir de forma reversible la contractilidad celular y el calcio transitorio. La hipótesis aquí es que debido a los menores requisitos de energía de las células trasplantadas, la tasa de injerto aumentó. Efectos similares se pueden lograr utilizando el inhibidor del canal de calcio verapamil. El mecanismo propuesto que da lugar a la inhibición de la contractilidad es que Y-27632 reduce la expresión de subunidades de troponina cTnT y cTnI en hiPSC-CP.
La principal limitación es que el Y-27632 sólo desempeñó un papel transitorio durante el trasplante. Cómo inhibir Rho quinasa durante un período más largo, mejorando así la eficiencia del trasplante de hiPSC-CMs, es un problema a resolver en el futuro. En cuanto a más aplicaciones de este método, inhibidor de ROCK no sólo puede mejorar la actividad de los cardiomiocitos durante el trasplante, sino también mejorar la actividad de otras células; por lo tanto, también se puede utilizar durante el pretratamiento en los procesos de trasplante de otras células. Además, el enfoque presentado aquí sienta una buena base experimental para una mayor investigación sobre las enfermedades del corazón.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Joseph C. Wu (Universidad de Stanford) por proporcionar amablemente la construcción Fluc-GFP y al Dr. Yanwen Liu por su excelente asistencia técnica. Este estudio cuenta con el apoyo de las becas HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), y HL121206A1 (a L.Z.), y una beca R56 HL142627 (a W.Z.), una Asociación Americana de Desarrollo del Corazón, una Beca de Desarrollo del Corazón 16SDG30410018, y la Universidad de Alabama en Birmingham Faculty Development Grant (a W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
