Summary
I detta protokoll visar och utvecklar vi hur man använder humana inducerade pluripotenta stamceller för kardiomyocyte differentiering och rening, och vidare, om hur man kan förbättra sin transplantation effektivitet med Rho-associerad proteinkinashämmare förbehandling i en mus hjärtinfarkt modell.
Abstract
En avgörande faktor för att förbättra cellulära terapi effektivitet för myokardiell förnyelse är att säkert och effektivt öka cell inympning hastighet. Y-27632 är en mycket potent hämmare av Rho-associerade, lindade-Coil-innehållande proteinkinas (RhoA/ROCK) och används för att förhindra dissociation-inducerad Cell apoptos (Anoikis). Vi visar att Y-27632 förbehandling för humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs+ RI) före implantation resulterar i en cell engrafations hastighet förbättring i en musmodell av akut hjärtinfarkt (mi). Här beskriver vi ett komplett förfarande av hiPSC-CMs differentiering, rening, och cell förbehandling med Y-27632, samt den resulterande cellkontraktion, kalcium övergående mätningar, och transplantation till mus MI modeller. Den föreslagna metoden ger en enkel, säker, effektiv och låg kostnad metod som avsevärt ökar cell inympningsgraden. Denna metod kan inte bara användas tillsammans med andra metoder för att ytterligare förbättra cell transplantations effektiviteten utan ger också en gynnsam grund för studiet av andra hjärtsjukdomar.
Introduction
Stamcells-baserade terapier har visat stor potential som en behandling för hjärtskador orsakade av MI1. Användningen av differentierade hiPSCs ger en outtömlig källa av hiPSC-CMs2 och öppnar dörren för den snabba utvecklingen av genombrott behandlingar. Emellertid, många begränsningar till terapeutisk översättning kvarstår, inklusive utmaningen att den kraftigt låga inympningar graden av implanterade celler.
Separera celler med trypsin initierar Anoikis3, som bara accelereras när dessa celler injiceras i hårda miljöer som den ischemiska myocardium, där hypoxisk miljö accelererar kursen mot celldöd. Av de kvarvarande cellerna tvättas en stor del ut från implantationsstället in i blodomloppet och sprids i periferin. En av de viktigaste apoptotiska vägar är RhoA/ROCK Pathway4. Baserat på tidigare forskning, den RhoA/rock Pathway reglerar aktin cytoskeletala organisationen5,6, som ansvarar för cell dysfunktion7,8. Berg hämmaren Y-27632 används flitigt under somatiska och stamcells dissociation och passaging, för att öka celladhesion och minska Cell apoptos9,10,11. I denna studie, Y-27632 används för att behandla hiPSC-CMs före transplantation i ett försök att öka cell inympning hastighet.
Flera metoder som syftar till att förbättra cell inympnings frekvens, såsom värme chock och basalmembran matris beläggning12, har fastställts. Bortsett från dessa metoder, genetisk teknik kan också främja kardiomyocyte proliferation13 eller omvänd nonmyokardiserade celler i kardiomyocyter14. Ur bioteknik perspektiv, kardiomyocyter är seedade på en biomaterial byggnadsställning för att förbättra transplantationen effektivitet15. Tyvärr är de flesta av dessa metoder komplicerade och kostsamma. Tvärtom, den metod som föreslås här är enkel, kostnadseffektiv och effektiv, och den kan användas som en basal behandling före transplantation, liksom i konjugering med andra tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök i denna studie godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Alabama i Birmingham och baserades på National Institutes of Health laboratorium djurskötsel och riktlinjer för användning (NIH publikation nr 85-23).
1. förberedelse av kultur medier och kultur skyltar
-
Medelstora preparat
- För hiPSC medium, blanda 400 mL av humant pluripotenta stamcells (hPSC) basal medium (tabell över material 1) och 100 ml av hpsc 5x tillägg; Förvara blandningen vid 4 ° c.
- För RPMI 1640/B27 minus insulin (RB-) medium, blanda 500 mL RPMI 1640 och 10 mL B27 tillägg minus insulin.
- För RPMI 1640/B27 (RB +) medium, blanda 500 mL RPMI 1640, 10 mL av B27 tillägg, och 5 mL av penicillin-streptomycin (Pen-STREP) antibiotika.
- För rening medium16, blanda 500 ml No-glukos rpmi 1640, 10 ml av B27 tillägg, 5 ml penna-STREP antibiotika, och 1 000 μl natrium dl-laktat lösning (vid en slutlig koncentration av 4 mm).
- För neutraliserande lösning, blanda 200 mL RPMI 1640, 50 mL av fetalt bovint serum (FBS), 2,5 mL Pen-STREP-antibiotika och 50 μL av Y-27632 (vid en slutkoncentration på 10 μM).
- För frys medium, blanda 9 mL FBS, 1 mL dimetylsulfoxid (DMSO) och 10 μL Y-27632 (vid en slutkoncentration på 10 μM).
- För extracellulär matrix lösning (EMS), Tina koncentrerad extracellulär matris (tabell över material 1) vid 4 ° c tills den har nått ett jämnt konsekvent flytande tillstånd. Precool pipettspetsar och rör innan du gör Matrix alikvoter av 350 μL vardera på is, och lagra alikvoter vid-20 ° c. Späd ut plattorna med en upptinad delmängd i 24 mL iskall DMEM/F12-medium (EMS) innan de lackeras. Håll EMS i 4 ° c i upp till 2 veckor.
Anmärkning: Utför alla beläggning steg på isen för att förhindra basalmembran Matrix stelning. - För Tyrodes lösning, ta 90% av den slutliga erforderliga volymen av vävnad kultur grade vatten, Tillsätt lämplig mängd av följande reagenser, och rör om tills upplöst. Använd sedan 1 N NaOH för att justera pH till 7,4. Tillsätt extra vatten till en slutlig koncentration av 140 mmol/L natriumklorid, 1 mmol/L magnesiumklorid, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L kaliumklorid, 10 mmol/L glukos, och 1,8 mmol/L kalciumklorid. Sterilisera genom filtrering med ett membran på 0,22 μm.
-
Beläggning av cell odlings plåt
- För hiPSC kultur plattor, applicera 1 mL EMS till varje brunn av en 6-brunn tallrik och inkubera plattan i minst 1 h vid 37 ° c. Aspirera DMEM/F12 lösning innan sådd celler.
- För gelatin beläggning, Lös 0,2 g Gelatinpulver i vävnad kultur grade vatten för att göra en 0,2% (w/v) lösning. Sterilisera genom autoklav vid 121 ° c, 15 psi i 30 min. Täck varje brunn på en 6-brunn tallrik med 2 mL av lösningen och inkubera i 1 h vid 37 ° c. Före passaging cellerna, aspirera lösningen och låt plattan torka i minst 1 h vid rumstemperatur inne i vävnaden kultur huva.
2. hiPSC underhåll och Kardiomyocyte Ddifferentiering
- Odla hipscs i hipsc medium (se steg 1.1.1) med en daglig medium förändring tills cellerna når 80% – 90% sammanflödet per brunn.
Anmärkning: För underhållsändamål är hiPSCs i allmänhet klara för passage var 4: de dag. - För passage hiPSCs, aspirera mediet och tvätta brunnen 1x med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 0,5 mL lösning för avlossning av stamceller (tabell över material 1) till varje brunn och inkubera vid 37 ° c i 5 – 7 minuter.
Anmärkning: Inkubationstiden beror på tätheten av cellerna och graden av dissociation, som kan observeras under ett mikroskop. - Neutralisera stamcells avlossning med 1 mL hiPSC-medium kompletterat med 5 μM Y-27632. Samla upp blandningen i ett 15 mL centrifugertub. Centrifugera röret i 5 min vid 200 x g, Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten, och sedan, Omsuspendera cellerna i 1 ml hipsc-medium som innehåller 5 μm Y-27632.
- Utsäde hiPSCs på en ny EMS-belagda 6-brunn plattan i ett förhållande mellan 1:6 till 1:18. Ändra mediet till hiPSC medium utan Y27632 efter 24 h.
- För att frysa cellerna, Omsuspendera den separerade hiPSCs i frys medium vid en koncentration av 0.5-1 miljoner/500 μL, placera suspensionen i kryovials, och förvara dem i en-80 ° c frys. Överför de frusna flaskorna till flytande kväve efter 24 h.
- För att differentiera, Byt ut hiPSC-mediet med 2 mL RB-medium kompletterat med 10 μM GSK-3β-hämmare CHIR99021 (CHIR) vid 80% – 90% cell-Confluence. Byt ut mediet mot 3 mL RB-medium efter 24 timmar och inkubera i ytterligare 48 h (dag 3).
- På dag 3, ändra mediet till 3 mL RB-medium med 10 μM WNT-hämmare IWR1 för 48 h (dag 5), och sedan ersätta mediet med 3 mL RB-medium och underhålla för 48 h (dag 7).
- På dag 7, Byt ut mediet med 3 mL RB-medium och ändra mediet var tredje dag framöver. Spontan misshandel av hiPSC-CMs ska observeras mellan dag 7 – 10.
3. hiPSC-CMs rening och liten molekyl förbehandling
Anmärkning: Mycket renade, rekombinanta cell-dissociationsenzymer (tabell över material 1) användes för att separera Hipsc-CMS.
- På dag 21 efter hiPSC-CM differentiering, aspirera mediet och tvätta cellerna 1x med steril PBS. Inkubera cellerna med 0,5 mL cell-dissociationsenzymer per brunn för 5 – 7 min vid 37 ° c. Pipettera upprepade gånger cellsuspensionen med en 1 mL pipett för att grundligt separera cellerna.
- Efter att cellerna dissocierats, tillsätt 1 mL neutraliserande lösning till varje brunn, samla in cell blandningen i ett 15 mL centrifugrör och centrifugera vid 200 x g i 3 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i neutraliserande lösning.
- Plantera om cellerna på gelatin-belagda 6-well plattor med en densitet av 2 000 000 celler per brunn.
- Efter 24 – 48 h, Ersätt odlingsmediet med renings medium i 3 – 5 dagar.
Anmärkning: Rening är klar när mer än 90% av cellerna i varje Mikroskop synfält fält slår. För att förhindra ytterligare skador på kardiomyocyter, inte förlänga renings tiden efter 5 dagar. Om den första omgången inte ger den nödvändiga renhet, ersätta renings mediet med RB + medium för 1 dag, och sedan slutföra en andra omgången av rening. - Före transplantation, kultur cellerna i behandlingsgruppen för 12 h i RB + medium kompletteras med 10 μM Y-27632. Likaså, utföra verapamil behandling på cellerna i RB + medium med 1 μM verapamil för 12 h (hiPSC-CMs+ ver).
- Efter behandling, tvätta hiPSC-CMs 1x med PBS och inkubera cellerna med 0,5 mL cell-dissociationsenzymer per brunn för högst 2 min. Pipettera upprepade gånger cellsuspensionen med en 1 mL pipett för att grundligt separera cellerna. Neutralisera cellerna med neutraliserande lösning, samla cell blandningen i en 15 mL Centrifugera röret, och centrifugera vid 200 x g för 3 min. Omsuspendera CELLERNA i PBS vid en koncentration av 100 000 celler/5 μl som förberedelse för injektion.
4. hjärtinfarkt och cell transplantation
Anmärkning: Alla kirurgiska instrument är försteriliserade med autoklav och bibehålls i aseptiskt tillstånd under flera operationer via en varm pärla autoklav (tabell över material 2).
- Anesthetize NOD/scid möss (tabell över material 2) med inhalerade isofluran (1.5% – 2%). Övervaka anestesi nivåer av mössen svar på en tå nypa. Placera vet optisk salva på ögonen för att förhindra dem från torkning under kirurgi.
- Tillförsel 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant för smärt Lind ledning före kirurgi.
- Placera och säkra musen i liggande läge på en uppvärmd operationsbord, ta bort håret från ventrala halsen regionen och vänster bröstkorg med en hårborttagnings kräm, utsätta huden, och desinficera den med 70% alkohol.
- Skär en 0,5 cm snitt i mitten av halsen med hjälp av kirurgiska saxar, separera underhudsfettet med sterila tång, och exponera luftstrupen. Introducera oralt intubation kanyl i luftstrupen, Anslut kanyl till en liten djur ventilator, och justera ventilations inställningarna (Ställ in tidvatten volymen vid 100-150 μL och andningsfrekvens på 100x-150x per min).
- Efter att musen stabiliseras, skär en 0,5 cm snitt i mitten av den vänstra bröstet huden. Använd pinkoppar att rakt på sak separera muskellagret och göra ett litet snitt i den femte interkostal utrymme för att exponera bröstet hålighet. Placera upprullningsdonet i snittet för att öppna brösthålan och lokalisera vänster fallande kranskärlssjukdom (LAD). Under en dissekera kirurgiska Mikroskop, ligera pojken med en 8-0 nonresorberbara suturen.
- Omedelbart efter mi Induction, injicera 5 μl av hipsc-CMS-RI, hipsc-CMS+ RI, hipsc-CMS-ver, hipsc-CMS+ ver, eller en lika mängd PBS i musens hjärtmuskeln på varje plats (3 x 105 celler/djur, 1 x 105 celler/plats), en i-infarct området och två i områdena runt om infartten.
Anmärkning: Eftersom 5 μL är mycket liten volym, är det inte lätt att exakt Kontrollera volymen genom att direkt suga den med en spruta. Locket på en steril petriskål kan vändas, och 5 μL av cellerna kan först sättas in på locket med en pipett. På grund av ytspänningen kommer den inte att spridas utan kommer att kondensera till en liten vätske massa. Detta kan lätt absorberas och injiceras i musens myocardium. - Eliminera kvarvarande luft i brösthålan genom att fylla den med varm isoton saltlösning. Sy revbenen, musklerna och huden i sekvens med en 6-0 resorberbar sutur. Stäng av isofluran anestesi injektion. Håll kirurgi djuren på värmeplattan och noga följa dem medan de återfå fullt medvetande. Placera sedan djuren i en ren bur. Återlämna inte djuren till företaget med andra djur förrän de är helt återhämtade.
- Efter operationen, injicera möss intraperitonealt med buprenorfin (0,1 mg/kg) varje 12 h för 3 dagar i följd och injicera dem med ibuprofen (5 mg/kg) varje 12 h för en dag. Utföra efterföljande analys studier vid specificerade tidpunkter.
Anmärkning: Följ din lokala djurvård kommitténs riktlinjer för smärtlindring.
5. kalcium övergående och kontraktilitet inspelning
- Autoklav 15 mm-diameter täckband (tabell över material 2) och pincett i en liten glasbägare vid 121 ° c, 15 psi i 15 min. precool täckglas och pincett vid 4 ° c.
- Använd pincetten och placera täckplattan i en 12-brunn-platta och Pipettera 300 μL av den extracellulära matrisen på varje täckslip.
Anmärkning: Låt inte matrisen överstiga kanten på täckslip för att förhindra att minska matrixbeläggnings mängden. Inkubera 12-brunnen plattan i en 37 ° c cellodling inkubator för 1 h. - Aspirera mediet i gelatin-belagda 6-brunn plattan med renad hiPSC-CMs, tvätta den 1x med PBS, och sedan smälta den med 0,5 mL av cell-dissociation enzymer för 1,5 min. Tillsätt 1 mL neutraliserande lösning, Pipettera upprepade gånger för högst 5x – 10X med en 1 mL pipett och centrifugera blandningen vid 200 x g i 3 min.
- Aspirera den belagda extracellulära matrisen från täckglas. Räkna cellnumret och Omsuspendera cellerna i den neutraliserande lösningen till en koncentration av 40000/300 μL, och tillsätt sedan 300 μL av cellsuspensionen på varje täckslip. Odla plattan i en inkubator på 37 ° c.
- Efter 24 h, försiktigt aspirera den neutraliserade lösningen, tillsätt 500 μL av RB + medium till varje brunn av plattan, och fortsätta att kulturen i 2 dagar.
- Tillsätt Y-27632 (10 μm), Rho Kinas Activator (ra, 100 nm), verapamil (1 μm) eller en lika stor volym PBS i odlingsmediet hipsc-CMS, 12 h före kalcium övergående och kontraktilitetsdetektion.
Anmärkning: Förutom upptäckten av cellernas kalcium övergående och kontraktilitet efter 12 h av kemisk behandling, upptäckten av dessa parametrar testades också vid 12, 24, 48, och 72 h efter kemisk abstinens. - Ta ut plattan, kassera mediet och tvätta plattan 1x med PBS. Byt medium till en fenol-röd-fri DMEM som innehåller 0,02% (w/v) tensid polyol (tabell över material 1), 5 μm kalcium indikator (tabell över material 1) och motsvarande Y-27632 (10 μm), ra (100 nm), verapamil (1 μm) eller en lika stor volym av PBS och inkubera plattan i 30 min vid 37 ° c.
- Kassera supernatanten, tvätta cellerna 3x med Dye-fri DMEM medium, och låt mediet vila i 30 min för att de-Esterify kartläggning färgämne.
- Placera cell-seedade täckslip i en öppen bad kammare och sätt in kammaren i ett microinkubations system skakad till 37 ° c med en automatisk temperaturregulator (tabell över material 2), parfymera den med tyrodes lösning, och kontinuerligt lägga till (RI), RA eller PBS till per fusions lösningen.
- Använd ett inverterat fluorescensmikroskop (tabell över material 2) och ett Laser skanningshuvud (tabell över material 2) för att spela in spontan kalcium övergående genom att använda en x-t-linjeskanning med hjälp av en 488 nm argon-laser för färg excitation och en 515 ± 10 nm barriär filter för att samla upp utsläpps ljus. Spela in den spontana sammandragningen av hiPSC-CMs med differential interferens kontrast funktion i det konfokala mikroskopet (tabell över material 2).
Anmärkning: Kalcium transienta inspelningar bearbetades och analyserades med hjälp av MATLAB R2016A Software (tabell över material 4). Cell sammandragning förändring analyser utfördes med hjälp av ImageJ programvara (tabell över material 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den hipsc-CMS som används i denna studie härstammar från mänskligt ursprung med luciferas reporter Gene; överlevnadsfrekvensen för de transplanterade cellerna in vivo upptäcktes därför av Mareld Imaging (bli)17 (figur 1a, B). För histologiska hjärt avsnitt klassificerades Human-specifika hjärttroponin T (hcTnT) och humana nukleära antigen (HNA) dubbel positiva celler som inympade hiPSC-CMs (figur 1c). Båda resultaten visade att Y-27632 förbehandling avsevärt förbättrat cell inympelse hastighet. Luciferasaktiviteten i gruppen hiPSC-CM+ RI ökade ungefär sexfaldigt på dag 3, 7 och 28 efter transplantationen, jämfört med den i HIPSC-cm-RI- gruppen (figur 1b). Dessutom ökade hcTnT/HNA uttrycket nära Sevenfold i hiPSC-CM+ RI -gruppen, i förhållande till den i HIPSC-cm-RI- gruppen (figur 1c).
Resultaten visade också att Y-27632 förbehandling reglerade cytoskeletala förändringar i transplanterade celler. På dag 7 och 28 av transplantation uppvisade hiPSC-CMs+ RI en större och mer definierad stavformad cytoskeletala struktur jämfört med Hipsc-CMS-RI (figur 1d).
Dessutom, Y-27632 förbehandling har potential att minska transplanterade hiPSC-CM apoptos in vivo. TUNEL-färgning visade att antalet TUNEL-positiva celler minskade signifikant i gruppen hiPSC-CM+ RI i förhållande till den i HIPSC-cm-RI- gruppen dag 2 efter transplantation (figur 1e).
ROCK hämning främjade vidhäftning av transplanterade celler och hade potential att ytterligare öka retention av implanterade celler vid administrerings ställen. Western blot och hjärtvävnad immunofärgning föreslog att Y-27632 förbehandling reversibelt främjade det ökade uttrycket av integrin β1 och N-cadherin och minskade uttrycket av Phospho-myosin ljus kedja 2 (p-MLC2) (figur 2A, B ).
Musen cellinjer HL-1 valdes som kontroll CMs för in vitro-cell bilagor experiment. Resultaten indikerade att Y-27632 förbehandling signifikant ökade hiPSC-CM följsamhet i förhållande till HL-1. För att ytterligare bekräfta dessa fynd, var hiPSC-CMs+ RI inkuberas med N-cadherin eller integrin β1 neutraliserande antikropp för 1 h, vilket resulterar i en försvinnande av den förbättrade adhesionen som setts tidigare (figur 2C).
Jämfört med hiPSC-CM-RI gruppen reducerades kraften i HIPSC-cm+ ri gruppen med 32%, och i Hipsc-cm+ ra -gruppen (hipsc-CMS förbehandlade med rock Activator, tabell över material 1), det ökades med 42% ( Figur 3a). Under tiden, jämfört med hiPSC-CM-RI- gruppen, var topp kalcium transitorisk fluorescens (Peak δf/f0) för gruppen hipsc-cm+ RI reducerad med 41%, och kalciumövergående duration (CaTD50) reducerades med 11% (figur 3b , C). Peak ΔF/F0 för gruppen HIPSC-cm+ ra ökade däremot med 48%, och CaTD50 ökades med 13% (figur 3b, C).
Dessutom, en förbehandling av kardiomyocyter med Y-27632 för 12 h före transplantationen minskade signifikant uttrycket av cTnI och cTnT (figur 3D), som båda är Troponin (TN) subenheter som reglerar kardiomyocyte kontraktion.
I likhet med Y-27632 ökade en verapamil-förbehandling (1 μM, 12 h) signifikant den inympande frekvensen av hiPSC-CMs hos inducerade MI-möss. Hypotesen bekräftades genom observation av en ökad luciferassignal i Mareld-analysen (figur 4a) och ett ökat antal dubbel positiva hctnt/HNA-celler på dag 7 och 28 efter celltransplantation (figur 4b).
Figur 1: Y-27632 förbehandling ökade den engraftelse hastighet hiPSC-CMS i mi möss hjärtan. A) standard kurva för bli-mätningar. (B) Luciferin signal i nod/scid möss som behandlats med PBS, Hipsc-CMS-RI, eller hipsc-CMS+ RI på dag 3, 7 och 28 efter operationen. n = 6-9 möss per grupp. *P < 0,05 vs PBS; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI. C) immunofärgning av hjärt sektioner för hcTnT och HNA. Skalstreck = 100 μm (10X bilder); 20 μm (40x bilder). n = 5 möss per grupp. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI. D) representativa bilder av hjärt sektioner som färgats med phalloidin och hcTnT. Scale bar = 20 μm. n = 5 möss per grupp. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI. Erepresentativa bilder av hjärt sektioner för FÄRGNING av Tunel. Scale bar = 20 μm. n = 4-6 möss per grupp. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI. Denna siffra har modifierats från Zhao et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Y-27632 förbättrade vidhäftningen av hiPSC-CMS genom att bibehålla uttrycket av vidhäftnings proteiner. (A och B) Western blot analys av uttrycket av integrin ß1, N-cadherin, och fosforylering av MLC2 (p-MLC2) i hipsc-CMS behandlas med RI och i nonbehandlad hipsc-CMS. N = 5 replikat per grupp. C) hctnt-färgning av immunofluorescensanalys av-RI och + RI hipsc-CMS med och utan förbehandling av anti-n-cadherin (N-CAD) och anti-integrin ß1 (integ) antikroppar. Skala staplar = 100 μm. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI; † P < 0,05 vs. hipsc-CMS+ RI. Denna siffra har modifierats från Zhao et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förbehandling med Y-27632 minskade kontraktilitet av hiPSC-CMS och Down-reglerade uttrycket av hjärt Troponin subunits. Akvantifiering av den procentuella förkortning av hipsc-CMS som EXPONERATS för RI-och ra-behandling. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI; † P < 0,05 vs. hipsc-CMS+ RI. B och C) representativa bilder och kvantifiering av kalcium transienta mätningar av hipsc-CMS som behandlats med RI och ra och av en icke-behandlad grupp. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI; † P < 0,05 vs. hipsc-CMS+ RI. (D) västerländsk blot-analys av uttrycket av hjärttroponinsubenheter (Ctnc, ctnt och ctni) i hipsc-CMS som behandlats med RI och ra och i en icke-behandlad grupp. Denna siffra har modifierats från Zhao et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: verapamil förbehandling förbättrade engraftfrekvensen för hiPSC-CMS i mi-möss. (A) Luciferin signal i nod/scid möss som behandlats med PBS, Hipsc-CMS-ver, eller hipsc-CMS+ ver på dag 3, 7 och 28 efter operationen. n = 8 möss per grupp. *P < 0,05 vs PBS; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-ver. B) immunofärgning av hjärt sektioner för hcTnT och HNA. För 10X bilder, skala staplar = 100 μm (10X bilder); 20 μm (40x bilder). n = 5 möss per grupp. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-ver. Denna siffra har modifierats från Zhao et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste stegen i denna studie inkluderar att få ren hiPSC-CMs, förbättra aktiviteten av hiPSC-CMs genom Y-27632 förbehandling, och slutligen, transplantation en exakt mängd hiPSC-CMs i en mus MI modell.
De viktigaste frågorna som togs upp här var att vi först optimerade de glukos fria renings metoderna19 och upprättade ett nytt effektivt reningssystem. Systemet förfarande ingår tillämpa cell-dissociation enzymer, återplantering celler i gelatin-belagda plattor, odling av cellerna i neutraliseringsmediet för 24 h efter att ha återfått, och minimera digestionstid av cellerna före transplantation, alla av vilka utfördes för att uppnå den högsta aktiviteten av cellerna samtidigt få ren kardiomyocyter.
För det andra, vi utarbetade på förbehandling av hiPSC-CMs med Y-27632 vid 12 h före cell injektion. Den Anoikis är oftast induceras av modifiering av cellernas vidhäftnings proteiner, såsom integriner4,20 och N-cadherin21, som leder till aktiveringen av den apoptotiska vägen. Vi visade att Y-27632 förbehandling skulle kunna främja vidhäftning av hiPSC-CMs till transplantations platsen genom att bibehålla uttrycket av integrin β1 och N-cadherin, undertrycka uttrycket av p-MLC2, som är relaterat till förändringar i cytoskelett arkitektur22,23. Sju dagar efter hiPSC-CM transplantation, hiPSC-CMs+ RI resulterade i en större cell engrafations område, finare definierade spö former, och en mer komplett cytoskeletala organisation jämfört med Hipsc-CMS-RI (figur 1b-D).
För det tredje etablerade vi ett nytt intracellulärt insprutningssystem i mus MI-modeller, med 5 μL per injektion punkt för att exakt injicera erforderligt antal celler, samtidigt som man undviker en minskning av mus överlevnaden på grund av överdriven injektionsvolym.
För det fjärde, vi utarbetade om hur man bestämmer förändringar i cellkontraktion och kalcium övergående i hiPSC-CMs efter förbehandling med RI eller RA. Vi fann att Y-27632 kan reversibelt minska cell kontraktilitet och kalcium övergående. Hypotesen här är att på grund av de lägre energibehoven hos de transplanterade cellerna ökade engraftgraden. Liknande effekter kan uppnås med hjälp av kalcium kanal hämmaren verapamil. Den föreslagna mekanismen resulterar i kontraktilitet hämning är att Y-27632 minskar uttrycket av troponin subenheter ctnt och ctni i hipsc-CMS.
Den största begränsningen är att Y-27632 endast spelade en övergående roll under transplantationen. Hur man hämmar Rho Kinas under en längre period, vilket ytterligare förbättra transplantationen effektivitet hipsc-CMS, är ett problem som ska lösas i framtiden. När det gäller fler tillämpningar av denna metod, kan ROCK inhibitor inte bara förbättra aktiviteten av kardiomyocyter under transplantation utan också förbättra aktiviteten hos andra celler; Därför, det kan också användas under förbehandling i transplantation processer av andra celler. Dessutom, den strategi som presenteras här lägger en bra experimentell grund för mer forskning om hjärtsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Joseph C. Wu (Stanford University) för vänligt tillhandahållande av Fluc-GFP konstruera och Dr Yanwen LiU för utmärkt tekniskt bistånd. Denna studie stöds av National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (till J.Z.), och HL121206A1 (till L.Z.), och en R56 Grant HL142627 (till W.Z.), en amerikansk hjärt förening vetenskapsman Development Grant 16SDG30410018, och University of Alabama vid Birmingham fakultetens Utvecklingsstipendium (till W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
