Summary
Bu protokolde, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kardiyomiyosit farklılaşma ve arıtma için nasıl kullanılacağı ve daha fazla, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü ile transplantasyon verimliliğini nasıl iyileştirebileceğini gösteriyoruz. bir fare miyokard infarktüsü modelinde ön tedavi.
Abstract
Miyokard rejenerasyon için hücresel terapi etkinliğini iyileştirmek için önemli bir faktör güvenli ve verimli hücre Engraftman hızını artırmak için. Y-27632, Rho ile ilişkili, helezon-bobin içeren protein kinaz (RhoA/ROCK) ve dissosyasyon kaynaklı hücre apoptozis (anoikis) önlemek için kullanılan son derece güçlü bir inhibitörü. Biz, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (hipsc-CMS+ RI) için Y-27632 ön tedavisinin, akut miyokard infarktüsü (mı) fare modelinde bir hücre Engraftman oranı iyileştirmesinde implantasyon sonuçlarından önce olduğunu gösteriyoruz. Burada, Y-27632 ile hiPSC-CMs farklılaşma, arıtma ve hücre ön tedavi prosedürlerinin yanı sıra elde edilen hücre kasılma, kalsiyum geçici ölçümleri ve fare mı modellerinde transplantasyon gibi tam bir prosedür açıklanmaktadır. Önerilen yöntem, hücre Engraftman hızını önemli ölçüde artıran basit, güvenli, etkili ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem sadece daha fazla hücre transplantasyonu verimliliğini artırmak için diğer yöntemlerle birlikte kullanılamaz, aynı zamanda diğer kardiyak hastalıkların mekanizmalarının çalışması için de olumlu bir temel sağlar.
Introduction
Kök hücre bazlı tedaviler, mı1 'in neden olduğu kardiyak hasarlara yönelik bir tedavi olarak önemli bir potansiyel göstermiştir. Farklılaşan hiPSCs kullanımı, hiPSC-CMs2 ' nin tükenmeyen bir kaynağını sağlar ve çığır açan tedavilerin hızlı gelişimi için kapıyı açar. Ancak, implante edilen hücrelerin ciddi derecede düşük Engraftman oranının zorluk da dahil olmak üzere, terapötik çeviri için birçok sınırlama kalır.
Tripsin ile hücreleri ayırmak anoikis başlatır3, hangi sadece bu hücreler iskemik miyokard gibi sert ortamlar enjekte edildikten sonra hızlandırılmış, hipotik çevre hücre ölümü doğru kurs hızlandırır nerede. Kalan hücrelerin büyük bir oranı, implantasyon bölgesinden kan dolaşımına kadar yıkanır ve çevre boyunca yayılır. Anahtar apoptotik yollarından biri RhoA/kaya yolu4. Önceki araştırmaya dayanarak, rhoa/rock yolu hücre disfonksiyon7, 8sorumludur aktin sitroiskelet organizasyonu5,6, düzenler. Kaya inhibitörü Y-27632 yaygın olarak somatik ve kök hücre dağılma ve geçiş sırasında kullanılır, hücre yapışmasını artırmak ve hücre apoptozis azaltmak için9,10,11. Bu çalışmada, Y-27632, hipsc-CMS ' i transplantasyondan önce tedavi etmek için, hücre Engraftman hızını artırma girişimi için kullanılır.
Isı şok ve Bodrum membran matris kaplama12gibi hücre Engraftman hızını artırmaya yönelik çeşitli yöntemler kurulmuştur. Bu yöntemlerin yanı sıra, genetik teknoloji kardiyomiyosit proliferasyonu13 veya ters nonmiyokard hücrelerini kardiyomiyositlere14olarak teşvik edebilir. Biyomühendislik perspektifinden, kardiyomiyositler transplantasyon verimliliğini artırmak için biyomateryal iskele üzerine dikilir15. Ne yazık ki, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşık ve pahalıdır. Bunun aksine, burada önerilen yöntem basit, uygun maliyetli ve etkilidir ve transplantasyondan önce bazal tedavi olarak ve diğer teknolojilerle birlikte konjugasyon olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada tüm hayvan prosedürleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından Birmingham Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmış ve ulusal sağlık laboratuvarı hayvan bakımı ve kullanım kılavuzları (NıH Yayın No 85-23).
1. Kültür Medya ve kültür plakalarının hazırlanması
-
Orta hazırlık
- HiPSC orta için, mix 400 mL insan pluripotent kök hücresi (hPSC) Bazal Orta (tablo malzeme 1) ve 100 ml HPSC 5x takviyesi; karışımı 4 °C ' de saklayın.
- RPMı için 1640/B27 eksi insülin (RB-) orta, mix 500 mL RPMı 1640 ve 10 mL B27 ek eksi insülin.
- RPMI 1640/B27 (RB +) orta, mix 500 mL RPMI 1640, 10 mL B27 takviyesi, ve 5 mL penisilin-streptomisin (pen-strep) antibiyotik.
- Arıtma orta16, mix 500 ml No-GLIKOZ rpmı 1640, 10 ml B27 takviyesi, 5 ml pen-strep antibiyotik ve 1.000 μL sodyum DL-lakdamak çözeltisi (son konsantrasyon 4 mm).
- Nötralizasyon çözeltisi için, mix 200 mL RPMı 1640, 50 mL fetal sığır serumu (FBS), 2,5 mL pen-strep antibiyotik ve 50 μL Y-27632 (son konsantrasyon 10 μM).
- Donma orta, mix 9 mL FBS, 1 mL dimetil sülfoxid (DMSO), ve 10 μL Y-27632 (son konsantrasyon 10 μM).
- Ekstrasellüler matris çözeltisi (EMS) için, eşit tutarlı bir sıvı durumuna ulaşıncaya kadar yoğunlaşmış ekstrellüler matrisini (1. malzeme tablosu) 4 °c ' de çözün. Precool pipet uçları ve tüpler, her biri buz üzerinde 350 μL matris plakaya yapmadan önce ve-20 °c ' de plakaya saklayın. Plakaları kaplamadan önce, bir çözülür kısım 24 ml buz-soğuk dmem/F12 Orta (EMS) içine seyreltin; 2 haftaya kadar EMS 4 °C ' de tutun.
Not: Bodrum membran matris katılaşma önlemek için buz üzerinde tüm kaplama adımları gerçekleştirin. - Tyrode çözümü için, doku kültürü Grade su son gerekli hacminin% 90 almak, aşağıdaki reaktifler uygun miktarda eklemek ve çözünen kadar karıştırın. Daha sonra, 7,4 için pH ayarlamak için 1 N NaOH kullanın. 140 mmol/L sodyum klorür, 1 mmol/l magnezyum klorür, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L potasyum klorür, 10 mmol/L glikoz ve 1,8 mmol/L kalsiyum klorür son konsantrasyonuna ekstra su ekleyin. 0,22 μm membran kullanarak filtrasyon ile sterilize edin.
-
Hücre kültürü plaka kaplama
- HiPSC kültür plakaları için, 6-kuyu plakasının her bir kuyusu için 1 mL EMS uygulayın ve 37 °C ' de en az 1 saat boyunca plakayı inküye. Tohumlama hücrelerinden önce DMEM/F12 çözeltisi aspirate.
- Jelatin kaplama için,% 0,2 (w/v) çözeltisi yapmak için doku kültürü sınıfı suda 0,2 g jelatin tozu çözülür. 121 °C ' de otoklavlama ile sterilizasyonu, 30 dakika için 15 psi. 2 mL solüsyon ile 6-kuyu plakasının her bir kuyusu ve 37 °C ' de 1 saat boyunca inkük edin. Hücreleri geçmeden önce, solüsyonu Aspire ve plaka doku kültürü kaputu içinde oda sıcaklığında en az 1 saat kurumasına izin.
2. hiPSC bakım ve kardiyomiyosit Ddifferasyon
- HiPSC ortamında hiPSCs Kültür (bkz. Adım 1.1.1) hücreler ulaşıncaya kadar günlük orta değişim ile 80% – 90% iyi başına konfluence.
Not: Bakım amacıyla, Hıscs her 4 günde bir geçiş için genellikle hazırdır. - Hipscs geçişi için, orta Aspire ve 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile iyi 1x yıkayın. 0,5 mL kök hücre dekolmanı çözeltisi (1. malzeme tablosu) ekleyin ve 37 °c ' de 5 – 7 dakika boyunca inküye yapın.
Not: İnkübasyon süresi, hücrelerin yoğunluğuna ve mikroskop altında gözlemlenebilir olan dissociation hızına bağlıdır. - 5 μM Y-27632 ile takviye edilen 1 mL hiPSC orta ile kök hücre dekolmanı çözümünü nötralize eder. 15 mL santrifüj tüpte karışımı toplayın. 200 x g'de 5 dakika boyunca tüpü santrifüjler, hücre Pelet rahatsız etmeden süpernatant Aspire, ve daha sonra, 5 μM Y-27632 içeren hipsc orta 1 ml hücreleri pelletini.
- 1:6 ile 1:18 arasında bir oranda yeni bir EMS-kaplamalı 6-kuyu plakası üzerine hiPSCs tohum. 24 saat sonra Y27632 olmadan hiPSC orta için orta değiştirin.
- Hücreleri dondurmak için, 0,5 – 1 milyon/500 μL konsantrasyonunda çözünen hipveleri soğuk ortamda yeniden pelletini, süspansiyonu cryovials içine yerleştirin ve a-80 °c dondurucu içinde saklayın. 24 saat sonra dondurulmuş şişeler sıvı nitrojen aktarın.
- Ayırt etmek için, hiPSC Orta 2 mL RB-orta ile 10 μM GSK-3β inhibitörü CHIR99021 (CHIR)% 80-% 90 hücre-konfluence ile tamamlayıcı. 24 h sonra 3 mL RB-orta ile orta değiştirin ve ek bir 48 h (gün 3) için inküye.
- 3. gün, orta değiştirmek 3 mL RB-orta ile 10 μM WNT inhibitörü IWR1 için 48 h (gün 5), ve sonra orta yerine 3 RB-orta ve korumak için 48 h (gün 7).
- Gün 7, RB orta 3 mL ile orta değiştirmek ve her 3 gün ileri gidiyor orta değiştirin. HiPSC-CMs spontan dayak gün 7 – 10 arasında gözlemlenmelidir.
3. hiPSC-CMs arıtma ve küçük molekül ön-tedavi
Not: HiPSC-CMs ' i ayırmak için son derece saflaştırılmış, rekombinant hücreli-dissociation enzimleri (1. malzeme tablosu) kullanılmıştır.
- Hipsc-cm farklılaşma sonrası 21 gün, orta Aspire ve steril PBS ile hücreleri 1x yıkayın. 37 °C ' de 5 – 7 dakika için iyi başına 0,5 mL 'Lik hücre dağılma enzimiyle hücreleri inkübasyon yapın. Hücreleri iyice ayırmak için hücre süspansiyonunu 1 mL pipet kullanarak tekrar tekrar pipet atın.
- Hücreler kesildikten sonra, her iyi için nötralize çözüm 1 ml ekleyin, bir 15 ml santrifüj tüp içine hücre karışımı toplamak ve 3 dk için 200 x g Santrifüjü. süpernatant atmak ve nötralizasyon çözeltisi hücreleri pelletini.
- Hücreleri jelatin kaplı 6-kuyu plakaları üzerinde 2.000.000 hücrelerin yoğunluğunda yeniden bitki.
- 24 – 48 saat sonra, kültür ortamını 3 – 5 gün boyunca arıtma ortamına değiştirin.
Not: Her mikroskop görünüm alanındaki hücrelerin% 90 ' den fazlası yendiğinde arıtma tamamlanır. Kardiyomiyositlerde daha fazla zarar görmesini önlemek için, 5 gün ötesinde arıtma süresini uzatmayın. İlk turda gerekli saflık vermezse, 1 gün boyunca RB + orta ile arıtma ortamını değiştirin ve sonra arıtma ikinci bir tur tamamlayın. - Transplantasyondan önce, 10 μM Y-27632 ile takviye edilen RB + orta 12 saat tedavi grubundaki Hücreler kültür. Benzer şekilde, RB + ortamdaki hücrelerde verapamil tedavisinin 12 h (hiPSC-CMs+ ver) Için 1 μM verapamil ile gerçekleştirilmesi.
- Tedavinin ardından, hiPSC-CMs 1x 'yi PBS ile yıkayın ve hücreleri en fazla 2 dakika boyunca 0,5 mL 'Lik hücre dağılma enzimiyle inkübasyon yapın. hücreleri tamamen ayırmak için 1 mL pipet kullanarak hücre süspansiyonunu tekrar tekrar pipet. Nötralizasyon çözeltisi ile hücreleri nötralize, 15 mL santrifüj tüpte hücre karışımı toplamak ve 3 dakika için 200 x g Santrifüjü, PBS hücrelerinde 100.000 hücreler/5 μL enjeksiyon için hazırlık konsantrasyonunda Reuspend.
4. miyokard ınfarktüsü ve hücre nakli
Not: Tüm cerrahi aletler otoklav ile presterilized ve sıcak boncuk sterilizatörü (malzeme tablosu 2) ile birden fazla cerrahi sırasında aseptik durumda korunur.
- Anestezize NOD/SCID fareler (malzeme tablosu 2) inhaleli Isoflurane (% 1,5-2%). Bir ayak tutam fareler yanıtları tarafından anestezi düzeylerini izleyin. Cerrahi sırasında kuruma onları önlemek için gözler üzerine veteriner optik merhem yerleştirin.
- Tedarik 0,1 cerrahi öncesinde ağrı yönetimi için mg/kg buprenorfik subkutan.
- Pozisyon ve ısıtılmış bir çalışma masasında bir sırtüstü pozisyonda fareyi güvenli, ventral boyun bölgesi ve sol toraks bir dondurmalı krem kullanarak saç çıkarmak, cilt açığa, ve 70% alkol ile dezenfekte.
- Cerrahi makas kullanarak boyun merkezinde bir 0,5 cm kesi kes, subkutan yağ steril forseps ile ayırın ve trakea maruz. Trakeaya sözlü olarak entübasyon kanülsini tanıtın, kanülün küçük bir hayvan vantilatörü ile bağlantı kurun ve havalandırma ayarlarını yapın (100 – 150 μL 'de gelgit hacmini ayarlayın ve dk başına 100x – 150x solunum hızı).
- Fare sabitlenir sonra, sol göğüs derisinin ortasında bir 0,5 cm kesi kesti. Açık açık kas tabakası ayırmak ve göğüs boşluğu açığa çıkarmak için beşinci interkostal uzayda küçük bir kesi yapmak için forseps kullanın. Torasik boşluğu açmak ve sol inen koroner arter (LAD) bulmak için kesi içine Retraktörü yerleştirin. Bir diseksiyon cerrahi mikroskop altında, bir 8-0 ile Lad indirgeme uzman emilebilir sütür.
- Mı indüksiyon hemen ardından, 5 μL hiPSC-CMs-RI, Hipsc-CMS+ RI, hipsc-CMS-ver, hipsc-CMS+ ver, ya da her sitede fare miyokard içine PBS eşit hacimli enjekte (3 x 105 hücreler/hayvan, 1 x 105 hücreler/site), bir infarkt alanında ve iki infarkt çevresindeki alanlarda.
Not: 5 μL çok küçük bir hacimli olduğundan, doğrudan bir şırınga ile emerek ses seviyesini doğru şekilde kontrol etmek kolay değildir. Steril bir petri kapağının kapağı açılabilir ve 5 μL hücre ilk olarak bir pipet ile kapağa yatırılabilir. Yüzey gerilimi nedeniyle, yayılmaz ama küçük bir sıvı kütlesine yoğunlaşacaktır. Bu kolayca absorbe ve fare miyokard içine enjekte edilebilir. - Sıcak izotonik tuz çözeltisi ile doldurarak torasik boşlukta kalan havayı ortadan kaldırın. 6-0 emici sütür ile kaburgaları, kasları ve cildi sıralı olarak dikin. Isoflurane anestezi enjeksiyonu kapatın. Cerrahi hayvanları ısıtma yastığı üzerinde tutun ve tam bilinç kazanırken onları yakından gözlemlemek. Sonra, hayvanları temiz bir kafese yerleştirin. Onlar tamamen iyileşene kadar hayvanları diğer hayvanların şirkete iade etmeyin.
- Ameliyattan sonra, fareler intraperitoneal ile enjekte buprenorfik (0,1 mg/kg) her 12 saat için 3 ardışık gün ve onlara enjekte ibuprofen (5 mg/kg) her 12 saat bir gün. Belirtilen zaman noktalarında sonraki analiz Etüdleri gerçekleştirin.
Not: Analjezi için yerel hayvan bakım Komitesi yönergelerine uyun.
5. kalsiyum geçici ve Kontrazlık kayıt
- Otoklav 15 mm-çap kapak (Malzeme 2) ve cımbız küçük bir cam kabı 121 °c, 15 psi için 15 dk. kapak ve cımbız 4 °c ' de precool.
- Cımbız kullanarak, her lamel magazini üzerine 12-kuyu plaka ve pipet 300 μL hücre içi matris içine lamel magazini yerleştirin.
Not: Matris kaplama miktarını azaltmayı önlemek için matrisin lamel magazini kenarını aşmasına izin vermeyin. 12 kuyu plakasını 37 °C ' lik bir hücre kültüründe 1 saat boyunca kuluçk. - Saf hiPSC-CMs ile jelatin kaplı 6-well plaka orta aspirate, PBS ile 1x yıkayın, ve sonra 1,5 dk için hücre-dissociation enzimlerin 0,5 mL ile sindirmek. 1 mL pipet ile 1ml nötralizasyon çözeltisi, pipet daha fazla 5x-10X için tekrar tekrar ekleyin ve karışımı Santrifüjden 200 x g için 3 dakika.
- Kaplamalı ekstrasellüler matris coverdan aspirate. Hücre numarasını saymak ve nötralizasyon çözümdeki hücreleri 40000/300 μL konsantrasyonuna yeniden pelletini ve sonra her coverslip üzerine hücre süspansiyon 300 μL ekleyin. 37 °C ' lik kuluçte plaka kültürü.
- 24 saat sonra, yavaşça nötralize solüsyonu Aspire, 500 μL RB + orta plaka her iyi ekleyin ve 2 gün boyunca kültüre devam edin.
- Ekle Y-27632 (10 μM), Rho kinaz aktivatörü (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), ya da hiPSC-CMs kültür ortamına PBS eşit hacim, 12 saat önce kalsiyum geçici ve kontrazlık algılama.
Not: 12 h kimyasal tedavi sonrasında hücrelerin kalsiyum geçici ve kontrazlığı algılanması ek olarak, bu parametrelerin belirlenmesi de test edildi 12, 24, 48, ve 72 h kimyasal çekilmesinden sonra. - Plaka çıkarın, orta atın ve PBS ile plaka 1x yıkayın. Orta bir fenol-kırmızı-serbest dmem içeren değiştirmek 0,02% (w/v) yüzey fakant poliol (malzeme 1), 5 μm kalsiyum göstergesi (malzeme 1), ve karşılık gelen Y-27632 (10 μm), RA (100 Nm), verapamil (1 μm), ya da eşit hacim ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca plakayı inküytir.
- Supernatant atın, boya-ücretsiz DMEM orta ile hücreleri 3x yıkayın ve harita boya de-esterify için 30 dakika için orta dinlenme izin.
- Hücre-seeded lamel magazini açık bir banyo odasına yerleştirin ve bir mikrokuluçdak sistemi için dengelenmiş içine Oda yerleştirin 37 bir otomatik sıcaklık kumandası ile °c (tablo malzemeleri 2), tyrode çözümü ile serpmek, ve sürekli eklemek Perfüzyon çözeltisi için Rho kinaz inhibitörü (RI), RA veya PBS.
- Boya uyarma için 488 nm argon lazer ve 515 ± 10 Nm kullanarak bir x-t hat taraması yaparak spontan kalsiyum geçici olarak kaydetmek için ters Floresan Mikroskobu (Malzeme 2) ve lazer tarama kafası (malzeme tablosu 2) kullanın emisyon ışığı toplamak için bariyer filtresi. HiPSC-CMs ' i k i, Konfokal mikroskop (Malzeme 2) ' nin diferansiyel parazit kontrast işlevselliğini kullanarak spontan kasılma işlemini kaydedin.
Not: Kalsiyum geçici kayıtlar MATLAB R2016A yazılımı (malzeme 4) kullanılarak işlenmiş ve incelenmiştir. Hücre kasılma değişimi, ımagej yazılımı (malzeme 4 tablosu) kullanılarak yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan hipsc-CMS, Lusiferaz muhabiri geni ile insan kökeninden türetilmiştir; Bu nedenle, nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranı Bioluminesans görüntüleme (BLı)17 (Şekil 1a, B) ile tespit edildi. Histolojik kalp bölümleri için, insan spesifik kardiyak troponin T (hcTnT) ve insan nükleer antijen (HNA) çift pozitif hücreler enserted hiPSC-CMs olarak sınıflandırılmıştır (Şekil 1C). Her iki sonuç da Y-27632 ön tedavisinin hücre Engraftman hızını önemli ölçüde iyileştirmiş olduğunu belirtti. Hipsc-cm+ RI grubunun Lusiferaz aktivitesi, hipsc-cm-RI grubu (Şekil 1B) ile karşılaştırıldığında, transplantasyondan sonra 3, 7 ve 28 gün içinde yaklaşık altı kat arttı. Dahası, hcTnT/HNA ifadesi hipsc-CM+ RI grubunda yedi katına yakın, HIPSC-cm-RI grubunda (Şekil 1C) göreceli olarak artmıştır.
Sonuçlar Ayrıca, Y-27632 ön tedavi nakil hücrelerinde siteromi değişikliklerinin düzenlendiği belirtildi. 7 ve 28 transplantasyon günlerinde hiPSC-CMs+ RI , Hipsc-CMS-RI (Şekil 1D) ile karşılaştırıldığında daha büyük ve daha tanımlanmış bir çubuk şeklindeki sitasrot yapısı sergiledi.
Dahası, Y-27632 ön tedavisi, nakledilen hiPSC-CM apoptozis in vivo azaltmak için potansiyele sahiptir. TUNEL boyama, TUNEL-pozitif hücrelerin sayısının, hipsc-CM+ RI grubunda, HIPSC-cm-RI grubunda 2 gün sonra transplantasyon sonrası önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 1e).
KAYA inhibisyonu nakledilen hücrelerin yapışma teşvik ve daha fazla yönetim sitelerinde implante hücrelerin tutulumu artırmak için potansiyeli vardı. Batı leke ve kardiyak doku immünosteryonu, Y-27632 ön 'in tekrar ıntegrin β1 ve N-cadherin artan ifadesini geri çevirip phospho-miyosin ışık zinciri 2 ' nin (p-MLC2) ifadesini azalttığını önerdi (Şekil 2a, B ).
HL-1 fare hücresi Line in vitro hücre eki deneyleri için kontrol CMs seçildi. Sonuçlar, Y-27632 ön tedavisinin HL-1 ' e göre hiPSC-CM uyumunu önemli ölçüde artırdı. Bu bulguları daha da teyit etmek için, hiPSC-CMs+ RI , N-cadherin veya ıntegrin β1 antikor ile 1 saat nötralize edilmiş, daha önce görülen daha gelişmiş yapışma ile sonuçlanan (Şekil 2C).
Hipsc-CM-RI grubu ile karşılaştırıldığında, HIPSC-cm+ RI grubunda kontril kuvvet% 32 oranında düşürüldü ve Hipsc-cm+ ra grubunda (rock aktivatörü, malzeme tablosu 1ile önceden işlenmiş hipsc-CMS),% 42 oranında arttı ( Şekil 3A). Bu arada, hipsc-CM-RI grubu ile karşılaştırıldığında, HIPSC-cm+ RI grubu için en yüksek kalsiyum geçici Floresan (Peak Δf/F0)% 41 azaltıldı ve kalsiyum geçici süresi (CaTD50)% 11 düşürüldü (Şekil 3B , C). Buna karşılık, hiPSC-CM+ ra grubu için Peak Δf/f0 % 48 artırıldı ve CaTD50% 13 artırıldı (Şekil 3B, C).
Ayrıca, transplantasyondan önce 12 saat boyunca Y-27632 ile kardiyomiyositlerin ön tedavisi, her ikisi de kardiyomiyosit kasılma düzenleyen troponin (TN) alt paketleri olan cTnI ve cTnT (şekil 3D) ifadesini önemli ölçüde azaltmıştır.
Y-27632 benzer şekilde, bir verapamil ön tedavisi (1 μM, 12 h) indüklenen mı fareler hipsc-CMS Engraftman hızını önemli ölçüde arttı. Hipotez, biyoluminesans testinde (Şekil 4A) artan bir Lusiferaz sinyalinin gözlemlenmesinde ve hücre nakli sonrası 7 ve 28 gün içinde hctnt/HNA çift pozitif hücrelerin sayısını arttırdı (Şekil 4b).
Şekil 1: Y-27632 ön, mı fareler kalplerinde hipsc-CMS ' i n Engraftman oranını artırdı. (A) BLI ölçümlerinin standart eğrisi. (B) gün 3, 7 ve 28 ameliyattan sonra PBS, Hipsc-CMS-RIveya hipsc-CMS+ RI ile tedavi edilen nod/SCID farelerinde Luciferin sinyali. n = 6-9 grup başına fareler. *P < 0,05 vs PBS; • P < 0,05 vs Hipsc-CMS-RI. (C) hcTnT ve HNA için kalp kısımlarında immünostas. Ölçek çubukları = 100 μm (10X görüntüler); 20 μm (40X görüntüler). n = grup başına 5 fare. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-RI. (D) phalloidin ve hcTnT ile lekelenmiş kalp bölümlerinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 20 μm. n = grup başına 5 fare. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-RI. (E) Tunel boyama için kalp kesitlerinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 20 μm. n = 4-6 grup başına fareler. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-RI. Bu rakam Zhao ve al.18' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Y-27632, yapışma proteinlerinin ifadesini koruyarak hiPSC-CMS ' i k i yapışma artırılmıştır. (A ve B) hıh ile tedavi edilen hipsc-CMS ' d A k i ve tedavi edilmemiş hipsc-CMS. n = 5 ' in MLC2 (p-MLC2) ıntegrin ß1, N-cadherinin ve fosforilasyon ifadesinin Batı leke analizi. (C) Anti-n-cadherin (n-CAD) ve anti-ıntegrin ß1 (integ) antikorlarının ön tedavisi ile ve olmadan,-RI ve + RI hipsc-CMS ' l i hctnt immünofloresan boyama analizi. Ölçek çubukları = 100 μm. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-RI; • P < 0,05 vs hipsc-CMS+ RI. Bu rakam Zhao ve al.18' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Y-27632 Ile ön tedavi hiPSC-CMS ' i n kontrazlığını azalttı ve kardiyak troponin alt birim ifadesini aşağı doğru düzenlemis. (A) RIS ve Ra tedavisine maruz kalan hipsc-CMS ' i n kısaltılması yüzdesini ölçün. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-RI; • P < 0,05 vs hipsc-CMS+ RI. (B ve C) RIC ve Ra ile tedavi edilmemiş bir grup olan hipsc-CMS ' n i n kalsiyum geçici ölçümlerinin temsili görüntüleri ve miktarının belirlenmesi. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-RI; • P < 0,05 vs hipsc-CMS+ RI. (D) hipsc-CMS içinde kardiyak troponin alt grupları (ctnc, cTnT ve ctni) ifadesinin Batı leke analizi, RI ve Ra ile ve tedavi edilmemiş bir grupta tedavi edilmiştir. Bu rakam Zhao ve al.18' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: verapamil ön arıtma mı fareler hipsc-CMS Engraftman hızını geliştirdi. (A) gün 3, 7 ve 28 ameliyattan sonra PBS, Hipsc-CMS-verveya hipsc-CMS+ ver ile tedavi nod/scid fareler Luciferin sinyali. n = grup başına 8 fare. *P < 0,05 vs PBS; • P < 0,05 vs Hipsc-CMS-ver. (B) hcTnT ve HNA için kalp kısımlarında immünostam. 10X görüntüler için, ölçek çubukları = 100 μm (10X görüntüler); 20 μm (40X görüntüler). n = grup başına 5 fare. *P < 0,05 vs Hipsc-CMS-ver. Bu rakam Zhao ve al.18' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın temel adımları saf hiPSC-CMs elde, Y-27632 pretreatment aracılığıyla hiPSC-CMs etkinliğini geliştirmek ve son olarak, bir fare mı modeline hiPSC-CMs kesin bir miktar nakli içerir.
Burada ele önemli konular, ilk olarak, biz glikoz içermeyen arıtma yöntemleri19 optimize ve yeni bir verimli arıtma sistemi kuruldu. Sistem prosedürü, hücre dağılma enzimleri uygulama dahil, jelatin kaplı plaklarda hücreleri redikasyon, nötralizasyon ortamında hücreleri kültür 24 h yanıtladıktan sonra, ve transplantasyon önce hücrelerin sindirim süresini minimize, tüm saf kardiyomiyositler elde ederken hücrelerin en yüksek aktivite elde etmek için yapılmıştır.
İkinci olarak, hücre enjeksiyonu öncesinde 12 saat içinde Y-27632 ile hiPSC-CMs ' i n ön tedavisine devam ettik. Anoikis genellikle hücrelerin yapışma proteinlerinin değiştirilmesi ile indüklenir, örneğin ıntegrins4,20 ve N-cadherin21, apoptotik yol aktivasyonuna yol. Y-27632 ön tedavisinin, entegre β1 ve N-cadherin ifadesinin korunması yoluyla hiPSC-CMs ' in transplantasyon sitesine yapışmasını teşvik edebildiği, sitanferin değişikliklerle ilgili olan p-MLC2 ifadesinin bastırılması gerektiğini göstermiştir. Mimarlık22,23. Hipsc-cm nakli sonrası yedi gün sonra, hipsc-CMS+ RI daha büyük bir hücre Engraftman alanı, daha ince tanımlanmış çubuk şekilleri ve hipsc-CMS-RI (Şekil 1B-D) ile karşılaştırıldığında daha eksiksiz bir sitanrot organizasyonu ile sonuçlandı.
Üçüncü olarak, fare mı modellerinde yeni bir hücre içi enjeksiyon sistemi kurduk, enjeksiyon başına 5 μL, gerekli sayıda hücreyi doğru bir şekilde enjekte etmek için, aşırı enjeksiyon hacmi nedeniyle fare sağkalım oranındaki azalmayı önlemekle.
Dördüncü olarak, RI veya RA ile ön tedavi yapıldıktan sonra hiPSC-CMs hücre kasılma ve kalsiyum geçici değişikliklerin nasıl belirleneceği konusunda ayrıntılı. Biz Y-27632 ters hücre kontrazlığı ve kalsiyum geçici azaltabilir bulundu. Burada hipotezi, nakledilen hücrelerin düşük enerji gereksinimleri nedeniyle, Engraftman oranı arttı. Benzer efektler kalsiyum kanal inhibitörü verapamil kullanılarak elde edilebilir. Kontrazlık inhibisyonu sonuçlanan önerilen mekanizma Y-27632 hipsc-CMS troponin alt altbirimden cTnT ve cTnI ifadesini azaltır olmasıdır.
Ana sınırlama, Y-27632 sadece transplantasyon sırasında geçici bir rol oynadı. Daha uzun bir süre için Rho kinaz inhibe nasıl, böylece daha da hiPSC-CMs, transplantasyon verimliliği geliştirmek, gelecekte çözülmesi gereken bir sorundur. Bu yöntemin daha fazla uygulama gelince, ROCK inhibitörü sadece transplantasyon sırasında kardiyomiyositlerin etkinliğini artırmak değil, aynı zamanda diğer hücrelerin etkinliğini geliştirmek; Bu nedenle, diğer hücrelerin transplantasyon süreçlerinde ön tedavi sırasında da kullanılabilir. Dahası, burada sunulan yaklaşım kalp hastalığı hakkında daha fazla araştırma için iyi bir deneysel temel bırakır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar nazik Fluc-GFP yapı ve mükemmel teknik yardım için Dr Yanwen Liu sağlayan Dr Joseph C. Wu (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmada, Ulusal Sağlık Enstitüleri RO1 hibe HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.) ve HL121206A1 (iniş) ve bir R56 Grant HL142627 (W.Z.), bir Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma Grant tarafından desteklenmektedir 16.30410018, ve Alabama Üniversitesi Birmingham fakülte kalkınma Grant (W.Z. için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
