Multi-Locus variabel-nummer tandem-REPEAT analys (MLVA) analysen presenteras här möjliggör billig, robust och bärbar högupplöst genotypning av den fisk-patogena bakterien yersinia ruckeri. Med utgångspunkt från rena kulturer använder analysen Multiplex PCR och kapillärelektrofores för att producera tio loci MLVA-profiler för nedströms applikationer.
Yersinia ruckeri är en viktig patogen av odlade laxfiskar över hela världen, men enkla verktyg som lämpar sig för epizootiologiska undersökningar (infektions spårning, etc.) av denna bakterie har saknats. En multi-Locus variabel-nummer tandem-REPEAT analys (MLVA) analysen utvecklades därför som ett lätt åtkomligt och entydigt verktyg för högupplöst genotypning av återvunna isolat. För MLVA analysen presenteras här, är DNA utvinns ur odlade Y. ruckeri prover genom att koka bakterieceller i vatten, följt av användning av supernatanten som mall för PCR. Primer-par inriktning tio variabel-nummer tandem-REPEAT (VNTR) loci, varvad i hela Y. ruckeri arvsmassan, fördelas lika mellan 2 5-Plex PCR-reaktioner som körs under identiska cyklings förhållanden. Framåtprimers är märkta med antingen tre fluorescerande färgämnen. Efter amplikon bekräftelse av gel elektrofores, PCR-produkter späds ut och utsätts för kapillärelektrofores. Från de resulterande elektropherogramprofilerna, toppar som representerar var och en av VNTR loci är storlek-kallas och används för att beräkna VNTR upprepa räknas i silico. Resulterande tiosiffriga MLVA-profiler används sedan för att generera minsta Spanning träd som möjliggör epizootiologisk utvärdering genom klusteranalys. Den mycket portabla utgångsinformationen, i form av numeriska MLVA-profiler, kan snabbt jämföras mellan labb och placeras i en spatiotemporal kontext. Hela förfarandet från odlade kolonin till epizootiologisk utvärdering kan slutföras för upp till 48 Y. ruckeri isolat inom en enda arbetsdag.
Yersinia ruckeri, en gramnegativ bakterie och medlem av familjen yersiniaceae, orsakar yersinios i odlad laxfisk i hela världen1. Det är lätt diagnostiseras från smittade fiskar genom odling på många typer av agar media, men tills nyligen, föga var känt om befolkningsstrukturen och epizootiologi av Y. ruckeri över hela världen och i olika livsmiljöer (värdarter, etc.). Befintliga serotypningssystem för Y. ruckeri är oförenliga, saknar ömsesidig kompatibilitet och erbjuder låg epidemiologisk upplösning. Vissa molekylära studier på bakterien har utförts, med tekniker som multilocus sekvens Typing (mlst), pulsad-fält gel elektrofores (PFGE) eller hela-genomsekvens (WGS) analys2,3,4 ,5. Men MLST ger inte en tillräckligt hög upplösning för rutinmässig infektions spårning, medan PFGE är arbetskrävande och ger resultat som inte är lätt bärbara över Labs. Även om WGS-analysen skulle ge en nära slutlig upplösning skulle inrättandet och genomförandet av sådana analyser vara en nödvändig teknisk-och bioinformatikkapacitet som ännu är begränsad till ett relativt litet antal laboratorier.
Multi-Locus variabel-nummer tandem-REPEAT analys (MLVA) representerar ett enkelt och lättillgängligt molekylära skrivverktyg, som erbjuder en genetisk upplösning i vissa fall nästan matchning av WGS analys6,7. Tekniken bygger på upprepad variation i vald variabel-nummer tandem-REPEAT (VNTR) loci, vilket resulterar i utdata som är mycket transportabla, vilket gör jämförelsen av profilerade isolat mot online-databaser och över Labs okomplicerat. Även om mlst förblir guldmyntfot för epidemiologisk typning av många bakteriella patogener, ett ökande antal studier identifiera en betydligt högre diskriminerande effekt av MLVA8,9,10. Flera protokoll har också publicerats med inriktning på fisk-patogena bakterier, såsom Francisella noatunensis, edwardsiella piscicida och renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Den ten-loci MLVA protokoll som presenteras här, som nyligen utgjorde grunden för en omfattande Y. ruckeri befolkning studie14, innebär utvinning av DNA från agar-odlade KOLONIER, Multiplex PCR och kapillär ELEKTROFORES (CE), följas av nedströms i silico-tillämpningar. För varje undersökt isolat, två multiplex-PCRs, som båda innehåller fem fluorescerande märkta primer-par (6FAM, NED eller VIC) som vardera riktar sig till enskilda VNTR-regioner, körs parallellt under identiska förhållanden. Efter verifiering av PCR-amplikoner genom gelelektrofores (GE) späds PCR-produkter ut före CE-analysen, och toppar som representerar respektive VNTR loci är storleks kallade från de resulterande elektrofonigramfilerna. Tillsammans med Locus-specifika formler som står för mindre sekvensspecifika avvikelser i CE-migrationsmönster används sedan VNTR CE-anrop för att beräkna VNTR-upprepningsantal som sammanfoges till tiosiffriga MLVA-profiler. Dessa används som indata för epizootiologiska utvärderingar (t. ex. genom klusteranalys i minimala spanning tree-diagram (MST)).
Både multiplex PCRs presenteras här har dykt upp relativt robust i ansiktet av dålig mall DNA-kvalitet, men avsaknaden av PCR amplifiering var ändå ibland observerats vid användning av mallar med extremt höga DNA-koncentrationer. Dessa frågor löstes lätt genom att späda mallarna före PCR. Andra metoder för DNA-extraktion än den som används här kan också användas (t. ex. kommersiella Kit).
Även om fem amplikonerna förväntas från varje Multiplex PCR-reaktion, fem visuellt distinguishable band bör inte alltid förväntas från ge, som vissa (annorlunda märkta) vntr loci inom samma reaktion har överlappande storleksintervall. Den slutliga PCR-förlängningstid på 60 min kan förkortas om så krävs, men kommer sannolikt att resultera i ökad förekomst av Split toppar i efterföljande CE-elektroftalogram (se nedan). Särskilt, eftersom syftet med GE-steget är enbart för kvalitativ verifiering av PCR-amplikoner, kan bearbetningstiden, spänningen och/eller gel-receptet justeras som önskat. Om särskilt svaga band observeras av GE kan det vara tillrådligt att reducera utspädningsfaktorn för dessa prover före CE.
Medan CE-protokollet som beskrivs här kördes på en särskild kommersiell kapillär elektrofores apparat (se tabell över material), olika CE-system kan ha olika prov krav, som i sin tur kan uppmana några ändringar av protokollet . Se bruksanvisningen för respektive CE-systemtillverkare för anvisningar om lämpliga reagenser/utrustningar, kalibrering etc. för fragmentanalys. Det finns också en möjlighet att de partiska amplikon mobilitets mönstren observerade under CE kan skilja sig, relativt, mellan CE-system och/eller maskiner, som tidigare har dokumenterats för andra MLVA protokoll15,16. Om det sker i en omfattning där slutgiltiga (avrundade) VNTR-repeteringsvärden påverkas, innebär detta att de Locus-specifika variablerna s och i (tabell 1), som används för att bestämma upprepningsantalet för vntr, måste kalibreras om. Detta innebär linjär regression på tomter jämföra exakta sekvens storlekar kontra CE storlek samtal, som beskrivs av gulla et al. 201814.
Split toppar och stammar toppar, både kända artefakter i CE-baserade MLVA skriva17, kan observeras i elektropherograms under storlek ringer (figur 4). Även om stammar toppar bör ignoreras, bör den längre topp konsekvent väljas för nedströms program när det gäller Split toppar åtskilda av ett enda bas par. Dessutom är frånvarande toppar som indikerar brist på särskilt VNTR loci sällsynta, men kan förekomma, i vilket fall en upprepad räkning av “0” bör tilldelas. Om den startkultur från vilken DNA utvinns inte är ren (dvs. innehåller mer än en Y. ruckeri -undertyp), kan flera höga toppar som motsvarar olika alleler av samma Locus/loci OBSERVERAS efter CE. Sekundära odlingar måste sedan utföras från enstaka kolonier före ny DNA-extraktion för omskrivning.
Som anges i protokollet, bör mall DNA för PCR som standard extraheras från rena kulturer av Y. ruckeri. I ett fåtal fall, dock, ägg-vätska prover testa positivt för Y. ruckeri av qPCR (CT-värden < 27) framgångsrikt MLVA skrivit direkt, utan föregående odling, med hjälp av en ökad mängd genomisk DNA (extraheras med kommersiell Kit) som mall. Även om detta tillvägagångssätt inte har testats i stor utsträckning eller verifierats, visar det potentialen för denna MLVA-analys för undersökning av komplexa biologiska matriser som innehåller DNA från en rad olika organismer förutom Y. ruckeri.
Hela MLVA-typförfarandet som presenteras här, från DNA-extraktion till epizootiologisk utvärdering, kan slutföras under en enda arbetsdag. Antalet undersökta prover är dock i ett sublinjärt förhållande med den tid som krävs för DNA-extraktion, PCR och CE, och metoden är därför mycket mer tidseffektiv när flera prover körs samtidigt. Detta är dock fallet för de flesta Lab-baserade metoder, och som ett verktyg för epidemiologisk subtypning av Y. ruckeri, kombinationen av hög upplösning, enkelhet och bärbarhet gör detta MLVA assay överlägsen tidigare publicerade protokoll4 ,5. Det har också använts för att kontrollera den begränsade epidemiologiska relevansen av Y. ruckeri serotypning14.
Genom en omfattande MLVA-baserad populationsstudie med 484 Y. ruckeri isolat återhämtade sig från en rad spatiotemporal ursprung och livsmiljöer (värd fisk, miljö, etc.), vår förståelse om epizootiologi och befolknings strukturera av denna viktiga fiskpathogen ökades väsentligen14. MLVA skriva möjliggjorde spårning av kloner sprids antropogent under årtionden, förmodligen genom transport av fisk, samt identifiering av lokalt slutna stammar. Även om vissa klonala komplex av bakterien uppenbarligen skulle kunna associeras med sjukdomen i synnerhet fisk värdar (regnbåge och atlantlax), återhämtade sig andra endast från miljö källor och/eller kliniskt opåverkade fisk Exemplar. Metodens tillämplighet är således inte bara begränsad till infektions spårning, eftersom den också kan ge information om potentiell relevans, till exempel för vaccinutveckling, riskbedömning och upprätthållande av nationell biosäkerhet. Det är för närvarande i aktiv användning vid det norska Veterinärinstitutet som ett verktyg för att undersöka Y. ruckeri diagnoser i norsk vattenbruk.
The authors have nothing to disclose.
Den nuvarande studien finansierades av norska skaldjurs forskningsfonden, FHF (projekt nr 901119 och 901505). Vi vill tacka alla bidragsgivare av bakteriella isolat och prover som används under metodutveckling.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |