Summary
Drosophila cellinjer är viktigt reagenser för både grundläggande och biomedicinsk forskning. Den här artikeln innehåller protokoll för upptining, subculturing och Frysförvaring av vanliga Drosophila cellinjer att hjälpa forskare att innefattar användning av reagenserna i sin forskning.
Abstract
Det finns för närvarande över 160 olika Drosophila cellinjer som distribueras av Drosophila genomik Resource Center (DGRC). Med genomet engineering förväntas antalet roman cellinjer öka. DGRC syftar till att bekanta forskare med använda Drosophila cellinjer som en experimentell tool att komplettera och driver deras forskningsprojekten. Procedurer för att arbeta med en mängd Drosophila cellinjer med tydliga kännetecken som, inklusive protokoll för upptining, odling och bevarandet cellinjer. Viktigast av allt, visar denna publikation de bästa metoderna som krävs för att arbeta med Drosophila cellinjer att minimera risken för föroreningar från oavsiktlig mikroorganismer eller andra cellinjer. Forskare som blivit förtrogna med dessa förfaranden kommer att kunna gräva i de många program som använder Drosophila odlade celler inklusive biokemi, cellbiologi och funktionsgenomik.
Introduction
Användning av Drosophila odlade celler kompletterar Invivo flyga genetisk analys och fungerar som en primär förfrågan verktyg för att hantera många grundläggande biologiska frågor1,2,3. Drosophila cell lines erbjuder unika homogen populationer av celler som härrör från olika vävnad källor med olika genetiska bakgrunder. Cellinjer som passar många applikationer inklusive transgena genuttryck, genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik, hög genomströmning RNA interferens (RNAi) skärmar, cellbiologi och mikroskopi. Ännu viktigare, underlättar karakterisering av de omedelbara temporal Svaren till kända stimuli av Drosophila cellodling. Drosophila cellkultur är dessutom mottagliga för CRISPR-Cas9 genomet redigering, vilket gör det relativt enkelt att skapa nya cellinjer med specifika genomet ändringar4,5,6, 7.
Drosophila genomik Resource Center (DGRC) fungerar som en lagringsplats och distribution center för Drosophila cellinjer. En av DGRC mål är att hjälpa medlemmar av forskarsamhället i använda Drosophila cell kultur resurser. Denna artikel presenterar grundläggande protokoll för hantering av Drosophila cellinjer. Det kompletterar befintliga resurser för att hjälpa forskarna att bli bekväm med att hantera Drosophila cellkulturer och uppnå en nivå av självständighet i deras experiment1,2,8,9 ,10.
De vanligaste Drosophila cellinjer är: Schneider fodrar11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginal skiva och centrala nervsystemet (CNS) fodrar13,14, Milner laboratorium imaginal skiva linjer 15, de vuxna cystor cell linjer16,17och de Ras linjer18 (tabell 1). Schneider och Kc167 raderna är allmänt allrengöringsmedel cellinjer för användning i biokemi, rekombinant transgena genuttryck och omvänd genetiska skärmar. Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) raderna härleddes från larval imaginal skivor eller centrala nervsystemet (CNS) och de har varit användbar för studier relaterade till neurosecretion, transkription förordning och RNA bearbetning. Milner (CME) skiva raderna har varit viktiga för att studera signaltransduktion. De fGS/OSS cellinjer som härstammar från mutant vuxen äggstockar kvar viktiga reagenser att studera effekterna av icke-kodande små RNA-biologi i bakteriecellen underhåll och differentiering17,19. Slutligen är de Ras linjerna unik eftersom dessa cellinjer som härstammar från embryon som ectopically uttrycker det Ras onkogen. De har transkriptionell undertecknandet av föregångare muskelceller och uttrycker aktiva piRNA maskiner20. Senaste översiktsartiklar och bokkapitel täcka tillämpningar av dessa populära cellinjer med mer detaljer2,3,9.
Alla dessa cellinjer kan subkultiveras och fryst. I området i närheten finns det liten men viktig olika krav för hur varje cellinje upprätthålls och förberett för frysförvaring. Exempelvis kräver olika cellinjer olika media och kosttillskott (tabell 1). Linjerna också variera i ytan följsamhet egenskaper, morfologier (figur 1 och figur 2), genotyp och fördubbling tid (tabell 2). Vi presenterar grundläggande protokoll och markera skillnaderna för hantering av de olika allmänt använda Drosophila cellinjer.
Protocol
1. upptining och återuppliva frysta Drosophila cellinjer
- Sterilisera huven genom att torka arbetsytor med 70% etanol. Dosera 5 mL lämpligt medium (tabell 1) i en 25 cm2 T-kolv (T-25).
- Ta bort cryovial/ampullen från vätska N2 eller torris. Torka cryovial med 70% etanol, försiktigt lossa och unseal ampullen.
- Med en Pasteur-pipett, dra upp 1 mL av rumstemperatur (RT) media från T-25 kolven. Tillsätt långsamt media i cryovial och blanda försiktigt för att Tina upp de frusna celler, säkerställa att cellsuspensionen inte svämma över.
- Över hela volymen av den tinade cellsuspensionen från ampullen i T-25 kolven. Upprepa för att säkerställa cellsuspensionen har överförts helt.
- Placera kolven i en inkubator i 25 ° C, vilket gör att cellerna att bosätta sig och följa för minst 2 h. undersöka cellerna i Mikroskop för att säkerställa att de flesta celler har bosatt sig på odlingsytan. Försiktigt bort gamla medier och ersätta med 5 mL färsk media. Tillbaka kolven in i inkubatorn.
- Följande dag, försiktigt bort de gamla mediet och ersätta med 5 mL färsk media. Returnera kulturen till inkubatorn.
2. upptining och återuppliva frysta Drosophila cellinjer (alternativ)
- I en steril huva, Tina cellerna genom omblandning frysta pelleten med 1 mL av RT media. Överföra alla upptinade cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör.
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g för 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 mL färsk media.
- Överför hela volymen av cellsuspensionen till en T-25 kolv och inkubera kulturen vid 25 ° C.
- 1 till 2 h senare, undersöka cellerna i Mikroskop för att se till att de flesta celler har bosatt sig på odlingsytan. Följande dag, ersätta det gamla mediet med 5 mL färsk media och återgå kulturen till inkubatorn.
3. subculturing semi vidhäftande celler odlade i 100 mm kultur plattor
- Sterilisera huven genom att torka med 70% etanol. Sätta de sterila material för subculturing i huven, inklusive media flaskor, Pipetter, pipett stöd och kultur plattor.
- Undersöka morfologi och sammanflödet av kultur under ett Mikroskop. Leta efter tydliga tecken på microorganismal föroreningar i kulturen. Avgöra om cellerna är redo att vara överförda, baserat på egenskaperna hos kulturen: cell densiteten och fördubbling tid, inklusive förra gången de var subkultiveras.
- Om kulturen visas mycket konfluenta (figur 1), avgöra cell densiteten. I steril huven, rubba cellerna från odlingsytan genom pipettering upp till 10 mL av medium från plattan och fördela det över cellerna. Upprepa några gånger, garanterar inte för att skapa skum, tills växande ytan blir tydlig. Bestämma cell densiteten med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk partikelräknare (avsnitt 5, figur 3). Subkultur cellerna om cell densiteten är mellan 5 x 106 och 1 x 107 celler/mL.
Obs: Gör inte subkultur Drosophila cellinjer till en celldensitet under 1 x 106 celler/mL. -
Späd med detta med hjälp av ett lämpligt medium sådd koncentration på minst 1 x 106 celler/mL cellsuspension.
- För rutinmässiga passaging och underhåll, lägga till en lämplig volym av cellsuspensionen till en förutbestämd volym av mediet i en ny kultur plattan att uppnå önskad sådd cell densiteten.
- För skalning upp en kultur, överföra alla cellsuspensionen i en stor kolv. Späd cellsuspensionen till önskad cell densiteten med en lämplig volym av medium. Fördela lika stora volymer av utspädda cellsuspensionen till nya plattor. Denna metod minimerar variationerna i cell densiteten mellan plattorna.
- Täcka och etiketten plattorna med operatörens initialer, datum, delningsfaktorn, sådd cell densiteten, cell linje identifierare, media, passage nummer och media tillägg såsom antibiotika.
- Placera plattorna i en plastbehållare och återgå rutan till inkubatorn.
Obs: tabell 3 listar de odlingskärl som vanligen används för odling Drosophila cellinjer och de associerade arbetande volymerna.
4. lossnar vidhäftande celler odlade i 100 mm kultur plattor
- Överför alla medium från plattan till en ny steril kolv. Spara mediet.
- Skölj celler genom långsamt att tillsätta 1 mL 0,05% trypsin-EDTA till plattan. Snurra försiktigt för att säkerställa trypsin lösningen täcker hela tillväxten ytan. Kassera trypsin lösningen.
- Varsamt tillsätt 1 mL 0,05% trypsin-EDTA till plattan. Inkubera plattan vid 25 ° C mellan 3−10 min medan övervakning för synliga tecken på den cell lager du lossar och glidning av odlingsytan.
- Lägga till 9 mL av sparade medium till plattan att stoppa trypsin aktivitet. Blanda cellsuspensionen för att dissociera cell klumpar. När alla celler har varit rubbas, odlingsytan blir klar.
Obs: Användning av matsmältningsenzymer som trypsin aids i passaging starkt vidhäftande cellinjer. Trypsin är en blandning av proteaser som ofta härstammar från svin bukspottkörteln och är kommersiellt tillgängliga i olika grader av renhet.
5. manuell Cell räknar med cellen Neubauer räknar Slide
- Förbered hemocytometer bild och täckglas genom att torka av ytan med 70% alkohol.
- Blanda cellsuspensionen och fördela 15 µL av cellsuspensionen i den räfflade kanten av hemocytometer (figur 3A) för att fylla den första kammaren av hemocytometer. Fyll i hemocytometer andra avdelning. Cellsuspensionen kommer dras in i räknande kammaren genom kapillärkraft.
- Med en 10 x Mikroskop mål, räkna cellerna inom området 1 mm2 mitt i rutnätet bunden av de parallella linjerna (figur 3 c,D). För att undvika dubbletter räkna, räkna cellerna som overlay övre och vänstra gränser, men inte celler som överskrider högra och nedre gränserna för de 200 µm2 rutorna. Räkna mellan 100−200 celler. Upprepa räkningen med andra kammaren.
- Beräkna medelvärdet för de två punkter och avgöra cell densiteten enligt följande formel: Cell densiteten (celler/mL) = genomsnittligt celltal (n1 + n2/2) x 104.
Obs: Cellernas viabilitet uttrycks som en procentsats av viabla celler över totala celler. För att avgöra cellernas viabilitet, blanda cellsuspension med en lika stor volym av trypan blå (0,4%) lösningen före manuell eller automatisk cell räknar. Levande celler tar inte upp färgen, medan döda celler kommer att färgas blå.
6. Frysförvaring av Drosophila cellinjer
- Kontrollera kulturen för friska morfologi, tillväxt och avsaknaden av kontaminering. Skörda kulturerna från den mitten till sent-log tillväxtfas (steg 3.3 eller avsnitt 4). För många Drosophila cellinjer är det ungefär mellan 4 x 106 celler/mL till 8 x 106 celler/mL.
- Över hela cellen till en 15 mL eller 50 mL koniska rör. Samla in cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i en volym av frysning medium (tabell 4) som kommer att resultera i en sista cell densiteten på minst 4 x 107 celler/mL.
- Tillsätt droppvis lämplig mängd av den frysskyddmedel dimetyl sulfoxid (DMSO) i cellsuspension så att den slutliga DMSO-koncentrationen är 10%. Blanda försiktigt cellsuspension.
- Noga dosera 0,5 mL cellsuspension i alikvoter av den pre märkt cryovials (~ 2 x 107 celler/injektionsflaska). Placera ampuller i en frysning behållare fylld med isopropanol (figur 4A). Överför behållaren frysning till-80 ° C frys över natten så att temperaturen på cryovials sjunka långsamt (-1 ° C/min) till frys temperatur.
- Ta ut den frysta cryovials och snabbt bifoga dem till käppar (figur 4B). Infoga de käppar som innehåller cryovials i en kanister (figur 4 c). Alternativt placera frysta cryovials inuti en nedkylda frysning låda (figur 4 d). Förvaras fryst cryovials i den flytande fasen av N2 frysar (figur 4E,F).
Obs: När du använder frysning media innehållande DMSO, är en fördröjning på upp till 30 min vid RT inte skadar cellerna.
Representative Results
Det är viktigt att Tina fryst Drosophila celler snabbt och kultur dem på en cell densiteten som ger kulturen tillbaka i tillväxtfasen. Om förfarandena för frysförvaring och upptining följs, cell densiteten i T-25 kolven kommer att vara minst 4 x 106 celler/mL. En till två timmar efter upptining, börjar de flesta Drosophila cellinjer att fästa odlingsytan. Under de omständigheter där de flesta av cellerna inte har fäst på odlingsytan inom två timmar efter upptining, rekommenderas det att Inkubera cellerna över natten innan du ändrar media.
Målet med subculturing är att behålla cellerna i den friska exponentiella log-fasen av tillväxtkurvan. Kriterierna för subculturing beror på synliga bristen på microorganismal kontaminering, cell densiteten och behovet av att upprätta ett regelbundet underhållsschema. Det är viktigt att först bedöma hälsa av cellerna och fastställa frånvaro av oavsiktliga föroreningar före frysning. De flesta bakteriell och fungal föroreningar är lätt att upptäcka genom visuella inspektioner. Kontaminerade kulturer kan identifieras genom en ökning i media grumlighet. Under mikroskopet, kan föroreningar visas som bakteriell stavar, kocker, knoppande jästceller eller sträng-liknande svamp hyfer. Andra källor till förorening som den icke-cytopatisk mycoplasma kan inte identifieras visuellt och kan testas rutinmässigt av PCR-baserade analyser21.
Sammanflödet av en cellinje kan fastställas visuellt (figur 1). Snabbt växande cellinjer nå sammanflödet tidigt och måste vara överförda regelbundet. Sådana linjer är subkultiveras upp till två gånger i veckan. Långsamt växande celler är däremot anpassade minst en gång varannan vecka eller längre. Cellerna behöver dock matas färska media varje vecka. Detta är att förhindra media utmattning och späd metaboliska slaggprodukter från cellerna. Cellinjer härrör från varierande vävnad källor skiljer sig åt i deras morfologi (figur 2), följsamhet egenskaper, media krav (tabell 1) och fördubbling tid (tabell 2). Tabell 5, tabell 6, tabell 7och tabell 8 lista recept på olika Drosophila cell kultur media.
Cell räknar säkerställer en korrekt sådd täthet och en förutsägbar rutin för subculturing. För kvantitativa försök är cell räknar viktigt. Celler räknas antingen med hjälp av en hemocytometer (figur 3A) eller en automatiserad partikelräknare (figur 3B). Om du använder en automatiserad räknare, följ tillverkarens anvisningar. Räkna cellerna manuellt är med hjälp av en hemocytometer ekonomiskt och lätt. Antalet celler inneslutna i mellersta Neubauer rutnäten räknas och cell densiteten beräknas; Till exempel, n = 214 celler, vilket resulterar i en cell densiteten av 2.14 x 106 celler/mL (figur 3D).
Cellsuspension från två 100 mm plattor, vardera innehållande 10 mL cellsuspension på 4 x 106 celler/mL samlas in och resuspended i 2 mL frysning media att uppnå en densitet på 4 x 107 celler/mL. Varje fryst cryovial med 0,5 mL cellsuspension innehåller 2 x 107 celler. Detta kommer att resultera i en kultur med 4 x 106 celler/mL när tinats enligt protokollet avsnitt 1.
Figur 1 : Representativa bilder av tre olika Drosophila cellinjer vid olika sammanflödet och cell tätheter. (A) S2-DGRC kultur på 1 x 106 celler/mL. (A') S2-DGRC kultur på 4,5 x 106 celler/mL. (B) ML-BG2-c2 kultur på 2 x 106 celler/mL. (B) ML-BG2-c2 kultur på 8 x 106 celler/mL där cellerna är pålning och aggregering som foci. (C), OSS kultur på 1 x 106 celler/mL. (C') OSS kultur på 4 x 106 celler/mL. Celler i suspension fångas inte på samma fokalplan. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av åtta distinkta Drosophila cellinjer. (A) runda embryo-derived S2-DGRC. (B) runda embryo-derived Kc167. (C) runda larval CNS-derived ML-BG2-c2. (D) runda larval spolformad ML-BG3-c2. (E) CME L1, en cellinje som härrör från larval ben imaginal skivorna, är mindre och har runda/spolformade morfologi. (F) OSS, en cellinje som härrör från vuxna äggstockar, visar spolformad morfologi. (G), spolformad RasV12 cellinje uttrycker aktiveras Ras. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), en cell fodrar uttrycker aktiveras Ras och dubbelsträngat RNA inriktning tumör suppressor vårtor (wts), visar epitelial egenskaper. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Cell densiteten kan räknas manuellt med hjälp av en hemocytometer eller automatiskt en automatiserad partikelräknare. (A) A hemocytometer med två kammare. (B) en automatiserad cell räknare visar utdata från en cell sammanräkning. (C) förbättrad Neubauer cellen räknar rutnät tittade på under ett 10 x mål. Räkna celler som bunden av 0,1 mm3 centrala rutnätet (röd streckad linje square). (D) centrala rutnätet på hemocytometer fylld med celler för inventering. Skalstapeln = 1 mm (C). 0,2 mm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Utrustning för frysförvaring. (A) A frysning behållare butiker i ampuller i upprätt läge för långsam frysning. (B) en metall sockerrör för att hålla frusna ampuller. (C), en behållare för att hålla käppar. (D) ett frysning plastlåda (cryobox). (E) A kapseln håller flera käppar infogas i en vätska N2 ackumulatortank. (F), en flytande N2 ackumulatortank. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cell stam | Media | Följsamhet | Trypsin |
| Schneider linjer | M3 + BPYE + 10% fetalt kalvserum (FCS), pH 6,6 | Semi anhängare | Nej |
| (S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11 | |||
| Schneiders media+ + 10% FCS | |||
| KC linjer (Kc167, Kc7E10)21,22 | M3 + BPYE + 5% FCS, pH 6,6 | Semi anhängare | Nej |
| Hyclone-CCM3, pH 6,2 | |||
| Imaginal skiva och CNS linjer (ML-linjer)13,14 | M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6,6 | Semi anhängare | Nej |
| 10 µg/mL insulin | |||
| Milner imaginal skiva linjer (CME-linjer)15 | M3 + 2% FCS | Semi anhängare | Nej |
| 5 µg/mL insulin | |||
| 2,5% flyga extrakt | |||
| fGS/OSS16 | M3 + 10% FCS, pH 6,8 | Anhängare | * |
| 10 µg/mL insulin | |||
| 1 mg/mL C5H8KNO4 | |||
| 0,5 mg/mL KHCO3 | |||
| 0,6 mg/mL glutation | |||
| 10% flyga extrakt | |||
| RasV12 linjer18 | M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6,6 | Anhängare | Ja |
Tabell 1: Kraven på boenden och media i olika Drosophila cellinjer. Olika isolat av semi vidhäftande Schneider linjer inklusive S2R + S2-Drosophila RNAi Screening Center (DRSC), S2-Drosophila genomik Resource Center (DGRC) och Sg4 är vanliga cellinjer som föröka sig kraftfullt när odlade i M3 media + Bactopetone jästextrakt (BPYE) kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS). Alternativt, Schneiders media (pH 6,7-6,8) används ofta i stället för M3 + BPYE. Kc raderna föröka i antingen M3 + BPYE (5% FCS) eller serumfritt CCM3 media. ML imaginal skivan och centrala nervsystemet (CNS) linjer kräver insulin tillskott för spridning. Milner imaginal skiva raderna kräver både insulin och flyga utdrag tillskott. Vidhäftande fGS/OSS cellinjer kräver insulin, en högre koncentration av flyga extrakt samt glutation för tillväxt. Vidhäftande RasV12 linjer växer bra i M3 + BPYE (10% FCS). Trypsin används för att få bort fastsittande cellinjer från tillväxt ytan.
| Cellinje (lager nr) | Genotyp | Fördubbling tid (h) * | Vävnaden källa |
| S2R + (150) | OreR | 39 | Sen embryon |
| S2-DGRC (6) | OreR | 23 | Sen embryon |
| S2-DRSC (181) | OreR | 46 | Sen embryon |
| Kc167 (1) | e/se | 22 | 6−12 h embryon |
| ML-BG2-c2 (53) | y v f mal | 48 | 3rd instar larval CNS |
| ML-BG3-c2 (68) | y v f mal | 104 | 3rd instar larval CNS |
| ML-DmD8 (92) | y v f mal | 66 | 3rd instar larval wing skiva |
| CME W1 Cl.8+ (151) | OreR | 46 | 3rd instar larval wing skiva |
| CME L1 (156) | OreR | 47 | 3rd instar larval ben skiva |
| OSS (190) | bamD86 | 45 | Adult bam mutant äggstockarna |
| RasV12 linjer | UAS-GFP; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 | 41−65 | Embryo |
Tabell 2: Genotyp, fördubbling tid, och vävnad källor av allmänt används Drosophila cellinjer. Vävnaden genotyp, källan och populationsfördubblingstid vanliga cellinjer presenteras. Fördubbling tid bygger på tillväxt i rekommenderad media vid 25 ° C.
| Kultur fartyg | Volymen av media (mL) |
| 12,5 cm2 T-kolv | 2.5 |
| 25 cm2 T-kolv | 5 |
| 75 cm2 T-kolv | 15 |
| 35 mm tallrik | 1 |
| 60 mm tallrik | 4 |
| 100 mm tallrik | 10 |
| 384-väl plattan * | 0,04 per brunn |
| 96-väl plattan * | 0,1/brunn |
| 48-väl plattan * | 0,3 per brunn |
| 24-väl plattan * | 0,5/brunn |
| 12-well plate | 1.0/brunn |
| 6-well plate | 2.0/brunn |
Tabell 3: kultur fartyg och rekommenderade media volymerna. Odlingskärl i olika storlekar finns tillgängliga för odling Drosophila celler. Lämpliga medier volymerna (mL) rekommenderas för varje fartyg. Försegla plattor med flera som innehåller mindre än 0,5 mL cellsuspension med paraffin film att minska media förluster genom avdunstning.
| Volym | |
| M3 + BPYE, pH 6,6 | 70 mL |
| Värme inaktiverat FCS | 20 mL |
| Sterila filtrerade DMSO * | 10 mL |
Tabell 4: recept för att förbereda 100 mL frysning medium (M3 + BPYE, 20% FCS, 10% DMSO). Förbereda frysning media som behövs och undvika att lagra frysning media innehållande DMSO under längre tid.
| M3 + BPYE medium | Belopp |
| Sköldar och sjöng M323 | 1 flaska |
| KHCO3 | 0,5 g |
| Välj jästextrakt | 1,0 g |
| Bactopeptone | 2,5 g |
| Sterila renat vatten | 1000 mL |
Tabell 5: Recept för att förbereda 1 L M3 + BPYE vävnad odlingsmedium. Justera pH till 6,6. Sterilisera genom att passera mediet genom ett 0,22 µm filter.
| Bas M3 medium för fGS/OSS cellinje | Belopp |
| Sköldar och sjöng M3 | 1 flaska |
| KHCO3 | 0,5 g |
| C5H8KNO4 | 1,0 g |
| Sterila renat vatten | 1000 mL |
Tabell 6: Recept på 1 L av fGS/OSS M3 bas medium. Justera pH till 6,8. Sterilisera genom att passera mediet genom ett 0,22 µm filter.
| Hyclone-CCM3 | Belopp |
| CCM3 pulver | 28,6 g |
| NaHCO3 | 0.35 g |
| 10 N NaOH | 2,5 mL |
| CaCl2 | 0,5 g |
| Sterila renat vatten | 1000 mL |
Tabell 7: Recept på 1 L Hyclone-CCM3 vävnad odlingsmedium. Justera pH till 6,2. Sterilisera genom att passera mediet genom ett 0,22 µm filter.
| M3 + BPYE + 10% FCS | Miyake skiva och CNS linjer medium | Milner skiva linjer medium | fGS/OSS komplett medium | |
| M3 + BPYE, pH 6,6 | 90 mL | 90 mL | - | - |
| Värme inaktiverat FCS * | 10 mL | 10 mL | 2 mL | 10 mL |
| Insulin (10 mg/mL) | - | 100 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Flyga extrakt | - | - | 2,5 mL | 10 mL |
| Glutation (60 mg/mL) | - | - | 1 mL | |
| M3, pH 6,6 | - | - | 97,5 mL | - |
| fGS/OSS M3, pH 6,8 | - | - | 79 mL |
Tabell 8: Recept för att förbereda 100 mL olika gemensamma Drosophila cell odlingsmedier. Inkubera FCS vid 56 ° C i 1 h och skaka var femte minut för att värme-inaktivera komplement proteiner.
Discussion
Drosophila cellkulturer är primära reagenser för hög genomströmning cellbaserade skärmar. Deras användning också kompletterar Invivo genetisk forskning med en homogen population av celler som är lämplig för biokemi, snabb testning av transgena konstruktioner innan injicera in flugor, cellbiologi, Mikroskopi och mer nyligen somatisk genetisk manipulationer av genomet redigering1,2,3,8,9,10.
Livskraft och återvinning av frysta Drosophila celler är känslig för drastiska svängningar även vid låga temperaturer. DGRC lagrar frysta cellinjer i den flytande fasen av N2 (-196 ° C) och transporterar dem i torr-is (-78,5 ° C). Fryst ampuller som har transporterats i torris bör inte överföras tillbaka till vätska N2 eller en-80 ° C frys för förvaring. Istället bör de frusna cellerna vara tinade, nämligen på en hög cell densiteten så snart som möjligt vid ankomsten (protokoll avsnitt 1) och odlade för de avsedda ändamålen (protokoll avsnitt 3). Om cellinjer inte utnyttjas omedelbart för experiment, cellen linjer bör vara fryst tillstånd (protokollenheten 6) tills de är redo för användning.
Vissa cellinjer, såsom raderna ML-BG2-c2 och Ras måste flera dagar att återhämta sig från effekterna av att återupplivas av frysförvarade staten. En betydande mängd cellulära skräp medföljer dessa cellinjer som de första dagarna efter upptining. Lämnas ostörda, kommer att cellerna återhämta sig och föröka. Många Drosophila cellinjer på DGRC har anpassats till växa i M3 baserade media22. För cellinjer som är långsamma att återhämta sig från effekterna av upptining, vara användning av konditionerat media användbar. Konditionerat media sannolikt innehåller tillväxtfaktorer som utsöndras av celler i media som kan uppmuntra återvinning och spridning av celler efter upptining.
Cellinjer följer i allmänhet en stereotypa tillväxtkurva bestående av en eftersläpning fas, exponentiell fas, plateau fas och en försämring fas. Många Drosophila cellinjer föröka i log-fas tillväxt när de odlas på en densitet mellan 1 x 106 och 1 x 107 celler/mL vid 25 ° C. Det är viktigt att cellinjer är anpassade så att de är alltid i exponentiella tillväxtfasen.
Sammanflödet av en kultur, uttryckt i procent, beskriver det tillväxt yta som täcks av celler. Cell sammanflödet för en cell fodrar beror på dess cell form och storlek. Skilda cellinjer har olika morfologier och följsamhet egenskaper. Som ett resultat, kanske olika cellinjer på ungefär liknande confluence oerhört distinkta cell densiteten (figur 1). Kultur sammanflödet kanske inte en idealisk indikator för passaging Drosophila cellkulturer eftersom Drosophila cellinjer fortsätta att föröka antingen genom att stapla ovanpå varandra som foci eller i suspension även efter tillväxt ytan har varit omfattas (figur 1). Användare erfarna med specifika cellinjer kan dock ofta använda sammanflödet som en snabb visuell guide för när att subkultur.
Det är möjligt att odla Drosophila linjer på omgivande RT mellan 19−25 ° C, rekommenderas det inte eftersom omgivande temperaturvariationer kan påverka andelen spridning. Användning av en dedikerad 25 ° C inkubator rekommenderas. Inkubatorn för Drosophila cellkulturer behöver inte underlätta CO2 gasutbyte eftersom Drosophila cell kulturmassmedia inte använder CO2 för buffring. Fuktigheten inuti inkubatorn för odling av cellinjer är en viktig faktor för att inte förbises när odling av celler i plattor. Beroende på vilken typ på inkubatorn och arbetsmiljö, kan det nödvändigt att placera en bägare sterilt vatten inuti inkubatorn. För att minimera media avdunstning, Använd slutna T-kolven eller förvara kultur plattor i en tätt försluten plastbehållare medan inuti inkubatorn.
Det är viktigt att utveckla ett schema för subculturing Drosophila cellinjer. För att uppskatta tillväxt takt och övervaka samstämmigheten, är det praktiskt att subkultur vid en även geometriska förhållande (split baserat på 1:2, 1:4, 1:8). Kc167 celler på 8 x 106 celler/mL 10 mL konfluenta tallrik kan exempelvis delas upp på 1:8 förhållandet att uppnå en sådd täthet på 1 x 106 celler/mL (1,25 mL cellsuspension utspädd till 8,75 mL färsk media). I 72 h förväntas Kc167 kulturer att föröka till en densitet på 8 x 106 celler/mL, ges dess fördubbling tid av 24 h. Delningsfaktorn bestäms därför att underlätta en bekväm subkultur rutin av upp till två gånger i veckan, att säkerställa att cellerna odlas alltid i sin exponentiella log fas av tillväxt. Detta möjliggör ett regelbundet schema för subculturing cellerna så att tiden till sammanflödet är varken för kort eller för lång. Om tiden till sammanflödet är för kort, är cellerna subkultiveras på en lägre cell densiteten (högre split ratio). Likaså, om tiden för att nå sammanflödet är för lång, cellerna är subkultiveras på en högre cell densiteten (lägre split ratio). Det är viktigt att notera att de flesta Drosophila cellinjer är mycket känslig för lågt tätheter (< 1 x 105 celler/mL), i vilka celler knappast föröka sig och kan så småningom dö.
Drosophila cellinjer varierar i tillväxt egenskaper och morfologi. Cellinjer med distinkta egenskaper kanske därför behandlas annorlunda. De flesta Drosophila cellinjer är semi vidhäftande. Vid lägre celldensitet, de följer starkare tillväxt ytan och som kulturen blir konfluenta, cellerna blir mindre vidhäftande och enkelt lossa. Denna gradvisa förändring i cell följsamhet underlättar lätt subculturing av mest använda Drosophila cellinjer (Schneider, Kc linjer, imaginal skiva och CNS linjer) eftersom det tillåter operatören att enkelt fördela media över den cell enskiktslager rubba dem från tillväxt ytan när kulturen är tät. För linjer som är ytan anhängare som de kvinnliga könsceller-stammen/cystor somatiska slida (fGS/OSS) och Ras linjer, det är viktigt att Inkubera cellerna i trypsin under en kort tid till stöd i lossa cellerna från tillväxt ytan.
Media tillägg för de flesta Drosophila cellinjer inkluderar fetalt kalvserum (FCS). Insulin och vuxen fluga extrakt (FEX) krävs för vissa specifika rader. FEX innehåller odefinierad beståndsdelar tillväxten av specifika larval imaginal skiva linjer och de vuxna cystor cellinjer. DGRC förbereder, och gör tillgängliga vuxna FEX härrör från 1 vecka gamla Oregon-R-modENCODE flugor (RRID: BDSC_25211) i 2,5 mL och 10 mL alikvoter. DGRC innehåller också instruktioner för liten skala FEX förberedelse på sin webbplats < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. FEX förberedelse, dock är tidskrävande och kräver en stor mängd vuxna flugor.
Frysförvaring av Drosophila cellinjer sparar tid och reagenser för underhåll av cellinjer inte i omedelbar användning. Frysförvaring uppnås genom långsamt fryser ner cellerna (-1 ° C/min) till-80 ° C i ett medium innehållande DMSO, en cryoprotective agent. Det långsamma kyla steget är avgörande för framgångsrik frysförvaring. I-80 ° C frys kyls ampullen av celler med en hastighet av-1 ° C/min när den placeras i en frysning behållare fylld med isopropanol. Start vid 25 ° C omgivningstemperatur, tar det upp till 2 h för temperaturen i de ampuller till-80 ° C. Det rekommenderas att lämna de ampuller att frysa över natten.
Fryst ampuller måste sedan snabbt överföras till den flytande fasen av kväve för långvarig lagring. Vid rumstemperatur, cryovial kommer att värma snabbt vid cirka 10 ° C/min och lönsamhet kommer att äventyras på över-50 ° C23. För att hålla överföringen snabb, hantera ampuller i små partier att minimera exponeringen för omgivningstemperatur. Alternativt placera den frysta cryovials på torris samtidigt förbereda för deras överföring till vätska N2. Om flytande kväve inte är tillgänglig, kan cellerna lagras i-80 ° C frys, men med risk för betydande försämring med tiden.
Cell densiteten är avgörande för framgångsrik frysförvaring och efterföljande återupplivandet av cellinjer. I allmänhet nya cell linjer bör frysas för att skapa ursprungliga frysa (1−3 ampuller) så snart som ett överskott av celler blir tillgängliga. När cellinje har varit ytterligare odlade stabilt, bör ett fryst lager av 10−20 ampuller skapas. Detta lager är sedan Tinas att leta efter frysningen cell återvinning och livskraft, varefter det sprids för experimenterande eller ersätta beståndet när antalet fryst lager ampuller understiger fem. Slutligen är det viktigt att validera att de upptinade cellerna behåller egenskaperna av dess föräldrabeståndet cellinjer är känt att utvecklas3,24.
Avslutningsvis presenterar denna artikel en primer för att arbeta med Drosophila cellkulturer av lämna grundläggande uppgifter om de olika linjerna, bästa praxis och audiovisuella protokoll för grundläggande hantering av Drosophila cellinjer. Denna tillgänglig resurs är tänkt att smidigt lätta introduktion till arbetar med odlade Drosophila celler och komplettera befintliga utbildning guider på alla forskningslaboratorium.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) och forskarvärlden för att utnyttja de olika D. melanogaster DNA/vector/cell resurserna kurator på DGRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
| 25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
| 35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
| Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
| Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
| Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
| Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
| Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
| Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
| Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
| Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
| Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
| L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
| Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
| Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
| Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
| Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
| Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |
References
- Baum, B., Cherbas, L. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Dahmann, C. 420, Humana Press. Ch. 25 391-424 (2008).
- Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
- Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
- Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
- Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
- Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
- Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
- Echalier, G. Drosophila Cells in Culture. , Academic Press. (1997).
- Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. Drosophila cells in culture. 2nd edition. , Elsevier. (2017).
- Cherbas, L., Cherbas, P. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 10, 2nd, Oxford University Press. 319-346 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
- Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
- Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
- Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
- Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
- Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
- Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
- Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
- Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , Wiley Blackwell. (2016).
- Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).
