Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59459
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Drosophila Genomics Resource Center, Department of Biology, Indiana University Bloomington

Summary

Drosophila linjer er viktig reagensene både grunnleggende og biomedisinsk forskning. Denne artikkelen inneholder protokoller for tining, subculturing og kryonisk bevaring av brukte Drosophila linjer å hjelpe forskere omfatter bruk av disse reagensene i sin forskning.

Abstract

Det finnes over 160 distinkte Drosophila cellelinjer distribuert av Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Med genom engineering, er antall romanen cellelinjer forventet å øke. DGRC som mål å gjøre kjent forskere bruke Drosophila linjer som en eksperimentell verktøy å utfylle og drive sin forskning agenda. Prosedyrene for å arbeide med en rekke Drosophila linjer med adskilt kjennetegnene tilbys, inkludert protokoller for tining dyrking og cryopreserving linjer. Viktigere, beskriver denne publikasjonen beste praksis nødvendig å arbeide med Drosophila linjer å minimere risikoen for forurensing fra adventivskudd mikroorganismer eller andre linjer. Forskere som blir kjent med disse prosedyrene kan i dybden de mange programmene som bruker Drosophila kultivert cellene biokjemi, cell biology og funksjonell genomforskning.

Introduction

Bruk av Drosophila kultivert celler utfyller i vivo fly genetisk analyse og fungerer som en primær forespørsel verktøy for å løse mange grunnleggende biologisk spørsmål1,2,3. Drosophila cellelinjer tilbyr unike homogen bestander av cellene stammer fra ulike vev kilder med forskjellige genetisk bakgrunn. Linjer er egnet for mange søknadene inkluderer transgene genuttrykk, genomikk, transcriptomics, Proteomikk, metabolomics, høy gjennomstrømning RNA forstyrrelser (RNAi) skjermer, cellebiologi og mikroskopi. Viktigere, forenkler bruken av Drosophila cellekultur karakterisering av umiddelbar timelige svar kjent stimuli. Videre er Drosophila cellekultur mottakelig for CRISPR-Cas9 genomet redigering, gjør det relativt enkelt å opprette nye linjer med bestemte genom endringene4,5,6, 7.

Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) fungerer som et oppbevaringssted og distribusjon senter for Drosophila linjer. En av målene for DGRC er å hjelpe medlemmer av forskningen fellesskapet bruker Drosophila celle kultur ressurser. Denne artikkelen presenterer grunnleggende protokoller for håndtering av Drosophila linjer. Det utfyller eksisterende ressurser for å hjelpe forskere blir komfortable med håndtering Drosophila cellekulturer og oppnå en grad av uavhengighet i sine eksperimenter1,2,8,9 ,10.

De mest brukte Drosophila linjene er: Schneider linjer11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginal plate og sentralnervesystemet (CNS) linjer13,14, Milner laboratorium imaginal plate linjer 15, voksen ovarian cellen linjer16,17og Ras linjer18 (tabell 1). Schneider og Kc167 linjene er generelt Universal cellelinjer for bruk i biokjemi, rekombinant transgene genuttrykk og omvendt genetisk skjermer. Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) linjene var avledet fra enten larver imaginal plater eller sentralnervesystemet (CNS) og de har vært nyttig for studier knyttet til neurosecretion, transkripsjon regulering og RNA behandling. Milner (CME) plate linjene har vært viktig for å studere signaltransduksjon. De erstattet/OSS linjene fra mutant voksen eggstokkene fortsatt viktig reagenser å studere virkningen av ikke-koding liten RNA biologi i bakterie celle vedlikehold og differensiering17,19. Til slutt, Ras linjene er unike fordi disse er cellelinjer avledet fra embryo ectopically uttrykke Ras-oncogene. De har transcriptional signatur forløper muskelceller og uttrykker aktive piRNA maskiner20. Siste review-artikler og bokkapitler dekker programmene i disse populære linjer med flere detaljer2,3,9.

Alle disse linjer kan subcultured og frosset. Det er liten, men viktig ulike krav til hvordan hver celle linje vedlikeholdes og forberedte kryonisk bevaring. For eksempel krever forskjellige cellelinjer forskjellige medier og kosttilskudd (tabell 1). Linjene også variere i overflaten tilslutning egenskaper, morphologies (figur 1 og figur 2), undersøke og dobling tid (tabell 2). Vi presenterer grunnleggende protokoller og utheve unike forskjellene for håndtering av de ulike brukte Drosophila celle linjene.

Protocol

1. tining og gjenopplive frosset Drosophila linjer

  1. Sterilisere panseret av tørke arbeidsgruppen overflaten med 70% etanol. Dispensere 5 mL av aktuelle mediet (tabell 1) i en 25 cm2 T-kolbe (T-25).
  2. Fjern cryovial/ampule fra væsken N2 eller tørris. Tørk cryovial med 70% etanol, nøye løsne og fjerne forseglingen på ampule.
  3. Bruker en Pasteur pipette, trekke 1 mL av romtemperatur (RT) media fra T-25 kolbe. Sakte legger mediet i cryovial og bland forsiktig for å tine frosne celler, slik at cellen suspensjon ikke fører til overflyt.
  4. Overføre hele volumet av tinte celle suspensjon fra ampule til T-25 kolbe. Gjenta for å sikre celle suspensjon er overført helt.
  5. Plasser flasken i en 25 ° C inkubator, slik at cellene å bosette seg og overholde for minst 2 h. undersøke cellene under et mikroskop for å sikre at de fleste cellene har avgjort på voksende overflaten. Forsiktig fjerne gamle medier og erstatte med 5 mL av fersk media. Tilbake kolbe i inkubator.
  6. Dagen, forsiktig fjerne den gamle mediet og erstatte med 5 mL av fersk media. Tilbake kulturen til inkubator.

2. tining og gjenopplive frosset Drosophila linjer (alternativ)

  1. I sterilt hette, tine cellene ved resuspending det frosset pellet med 1 mL av RT media. Overføre alle tinte celle suspensjon i en 15 mL konisk rør.
  2. Pellets cellene med sentrifugering 1000 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 5 mL av fersk media.
  3. Overføre hele volumet av cellen suspensjon i en T-25 kolbe og Inkuber kulturen på 25 ° C.
  4. 1-2 h senere, undersøke cellene under mikroskop for å sikre at de fleste cellene har avgjort på voksende overflaten. Dagen, erstatte den gamle mediet med 5 mL av fersk media og tilbake kulturen til inkubator.

3. subculturing semi tilhenger celler dyrket i 100 mm kultur plater

  1. Sterilisere panseret ved å tørke med 70% etanol. Bringe sterile materialet for subculturing i panseret, inkludert media flasker, Pipetter, pipette bistand og kultur plater.
  2. Undersøke morfologi og samløpet av kulturen under et mikroskop. Se etter klare tegn til microorganismal forurensing i kulturen. Fastslå om cellene er klar til å være passaged, basert på egenskapene til kultur: tetthet og dobling tid, inkludert sist de var subcultured.
  3. Hvis kulturen vises svært confluent (figur 1), bestemme cellen tetthet. I sterilt panseret, fjerne celler fra voksende overflaten av pipettering opptil 10 mL av mediet plate og dispensing det over cellene. Gjenta et par ganger, sikre ikke for å opprette skum, inntil voksende overflaten blir klart. Bestemme cellen tettheten ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisk partikkel teller (seksjon 5, Figur 3). Subkultur cellene hvis cellen tetthet er mellom 5 x 106 og 1 x 107 celler/mL.
    Merk: Gjør ikke subkultur Drosophila linjer til en celle tetthet under 1 x 106 celler/mL.
  4. Fortynne celle suspensjon følgelig benytter et passende medium å en final seeding konsentrasjon av minst 1 x 106 celler/mL.
    1. Rutinemessig passaging og vedlikehold, legge til en riktig volum på cellen suspensjon et forhåndsbestemt antall medium i en ny kultur plate å oppnå den ønskede seeding celle tettheten.
    2. For skalering en kultur, overføre alle cellen suspensjon i en stor kolbe. Fortynne celle suspensjon til ønsket celle tetthet med et riktig volum av mediet. Distribuere like mengder utvannet celle suspensjon til nye plater. Denne metoden reduserer variasjoner i cellen tetthet mellom platene.
  5. Dekk og etiketten plater med operatøren initialene, dato, delt forholdet, seeding celle tetthet, celle linje identifikator, media, passasjen tall og media tillegg som antibiotika.
  6. Plasser platene i en plastbeholder og tilbake boksen til inkubator.
    Merk: tabell 3 viser kultur fartøyene brukte for dyrking Drosophila linjer og tilknyttede arbeider volumer.

4. dislodging tilhenger celler dyrket i 100 mm kultur plater

  1. Overføre alle mediet fra platen til en ny sterilt kolbe. Lagre medium.
  2. Skyll celler av sakte legger 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA til platen. Virvel forsiktig for å sikre trypsin løsningen dekker hele vekst overflaten. Kast trypsin løsningen.
  3. Forsiktig legge 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA til platen. Inkuber platen ved 25 ° C mellom 3−10 min mens overvåking for synlige tegn på cellen lag frakobling og skyve av voksende overflaten.
  4. Legge til 9 mL av lagrede mediet plate stoppe trypsin aktivitet. Bland celle suspensjon å distansere celle klumper. Når alle celler har vært forskyves, voksende overflaten vil bli klart.
    Merk: Bruk av fordøyelsesenzymer som trypsin aids i passaging sterkt tilhenger linjer. Trypsin er en blanding av proteaser hentes fra svin bukspyttkjertelen og er kommersielt tilgjengelig i ulike graderinger av renhet.

5. manuell celle teller med Neubauer-cellen teller lysbildet

  1. Forberede hemocytometer lysbilde og dekkglassvæske ved å tørke overflaten med 70% alkohol.
  2. Bland celle suspensjon og dispensere 15 µL av cellen suspensjon i riflet kanten av hemocytometer (figur 3A) å fylle det første kammeret i hemocytometer. Fyll det andre kammeret i hemocytometer. Cellen suspensjon vil bli trukket inn i telling kammeret av kapillær handling.
  3. Bruker en 10 x mikroskop mål, telle celler innen 1 mm2 i rutenettet bundet av det parallelle linjene (Figur 3 c,D). For å unngå dupliserte teller, telle cellene som overlegg øverst og venstre grenser, men ikke celler som krysser høyre og nedre grensene for 200 µm2 rutene. Telle mellom 100−200 celler. Gjenta telle med det andre kammeret.
  4. Beregne gjennomsnittet av de to tellinger og bestemme cellen tettheten i henhold til følgende formel: celle tetthet (celler/mL) = gjennomsnittlig celletall (n1 + n2/2) x 104.
    Merk: Cellen levedyktighet uttrykkes som prosent levedyktige cellers over totalt celler. For å bestemme cellen levedyktighet, bland celle suspensjon med en lik mengde trypan blå (0,4%) løsning før manuell eller automatisk telling. Levende celler vil ikke ta opp fargestoff, mens døde celler vil bli farget blå.

6. kryonisk bevaring av Drosophila linjer

  1. Sjekk kultur for sunn morfologi, vekst og mangel på forurensning. Høste kulturer fra i midten til slutten-Logg vekstfase (trinn 3.3 eller avsnitt 4). For mange Drosophila linjer er det ca mellom 4 x 106 celler/mL til 8 x 106 celler/mL.
  2. Overføre hele cellen suspensjon i en 15 mL eller 50 mL konisk rør. Samle cellene med sentrifugering 1000 x g i 5 min og forkaste nedbryting.
  3. Resuspend celle pellet i et volum på frysing medium (Tabell 4) som vil resultere i en siste celle tetthet på minst 4 x 107 celler/mL.
  4. Legge til dropwise riktig mengde kryoprotektant dimethyl sulfoxide (DMSO) i celle suspensjon slik at siste DMSO konsentrasjonen er 10%. Bland forsiktig celle suspensjon.
  5. Nøye dispensere 0,5 mL av cellen suspensjon i dele den forhåndsinnstilte merket cryovials (~ 2 x 107 celler/medisinglass). Plass ampuller i en fryser container fylt med isopropanol (figur 4A). Overføre fryse beholderen til en-80 ° C fryseren over natten slik at temperaturen på cryovials å slippe sakte (-1 ° C/min) til fryseren temperatur.
  6. Ta ut den frosne cryovials og raskt knytte dem til canes (figur 4B). Sett inn canes som inneholder cryovials i en boks (figur 4C). Alternativt sted frosset cryovials i en pre-avkjølt frysing boks (Figur 4 d). Butikken frossen cryovials i flytende fase av N2 frysere (figur 4E,F).
    Merk: Når du bruker frysing media med DMSO, er en forsinkelse på opptil 30 min på RT ikke skadelig for cellene.

Representative Results

Det er viktig å tine frosne Drosophila celler raskt og kultur dem på en celle tetthet som bringer kulturen tilbake i vekstfase. Hvis fremgangsmåtene for kryonisk bevaring og tining følges, vil cellen tettheten i T-25 kolbe minst like 4 x 106 celler/mL. En til to timer etter tining, vil de fleste Drosophila linjer begynne å legge til voksende overflaten. Under omstendigheter der de fleste av cellene ikke har festet på voksende overflaten innen to timer etter tining, anbefales det å ruge cellene over natten før du endrer media.

Målet med subculturing er å opprettholde celler i den sunne eksponentielle Logg-fasen av vekstkurve. Kriteriene for subculturing avhenger av synlig mangelen på microorganismal forurensning, celle tetthet og behovet for å etablere en regelmessig vedlikeholdsplan. Det er viktig å først vurdere helsen til cellene og bestemme fravær av adventivskudd forurensninger før frysing. De fleste bakterier og sopp forurensninger er lett å oppdage ved visuelle inspeksjoner. Forurenset kulturer kan identifiseres av en økning i media turbiditet. Under mikroskopet vises forurensninger som bakteriell stenger, cocci, spirende gjærceller eller string-aktig fungal hyfer. Andre kilder til forurensning som den ikke-cytopathic mycoplasma kan ikke oppdages visuelt og rutinemessig kan testes av PCR-baserte analyser21.

Av en celle linje kan bestemmes visuelt (figur 1). Raskt voksende cellelinjer nå samløpet tidlig og må være passaged regelmessig. Slike linjer er subcultured til to ganger i uken. Derimot er langsom voksende celler passaged minst en gang hver to uker eller lenger. Cellene må imidlertid fôres frisk media hver uke. Dette er å forebygge media utmattelse og fortynne metabolske avfallsprodukter fra cellene. Cellelinjer avledet fra ulike vev kildene avviker i deres morfologi (figur 2), tilslutning egenskaper, media krav (tabell 1) og dobling tid (tabell 2). Tabell 5, tabell 6, Tabell 7og tabell 8 liste oppskrifter for ulike Drosophila celle kultur medier.

Cellen teller sikrer en nøyaktig seeding tetthet og en forutsigbar rutine for subculturing. For kvantitative eksperimenter er celle teller viktig. Celler telles enten ved å bruke en hemocytometer (figur 3A) eller en automatisert partikkel teller (figur 3B). Hvis bruker en automatisert teller, følg produsentens instruksjoner. Telle celler manuelt er ved hjelp av en hemocytometer enkelt og økonomisk. Antall celler i midten Neubauer rutenettene telles og celle tetthet beregnes; For eksempel, n = 214 celler, som resulterer i en celle tetthet av 2.14 x 106 celler/mL (figur 3D).

Cellen suspensjon fra to 100 mm plater, hver med 10 mL av cellen suspensjon på 4 x 106 celler/mL er samlet og resuspended i 2 mL frysing mediene til å oppnå en tetthet på 4 x 107 celler/mL. Hver frosne cryovial med 0,5 mL celle suspensjon inneholder 2 x 107 celler. Dette vil resultere i en kultur med 4 x 106 celler/mL når tint i henhold til protokollen avsnitt 1.

Figure 1
Figur 1 : Representant bilder av tre distinkte Drosophila cellelinjer på forskjellige samløpet og celle tettheter. (A) S2-DGRC kultur på 1 x 106 celler/mL. (A') S2-DGRC kultur på 4.5 x 106 celler/mL. (B) ML-BG2-c2 kultur på 2 x 106 celler/mL. (B') ML-BG2-c2 kultur på 8 x 106 celler/mL der celler er spuntveggstål og aggregering som foci. (C) OSS kultur på 1 x 106 celler/mL. (C') OSS kultur på 4 x 106 celler/mL. Celler i suspensjon blir ikke tatt opp samme fokalplanet. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Representant bilder av de åtte forskjellige Drosophila cellelinjer. (A) runde embryo-avledet S2-DGRC. (B) runde embryo-avledet Kc167. (C) runde larver CNS-avledet ML-BG2-c2. (D) runde larver spindel-formet ML-BG3-c2. (E) CME L1, en celle linje fra larver etappe imaginal skiven, er mindre og har runde/fusiform morfologi. (F) OSS, en celle linje fra voksen eggstokkene, viser spindel-formet morfologi. (G) spindel-formet RasV12 celle linje uttrykke aktivert Ras. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), en celle linje uttrykke aktivert Ras og double-strandet RNA målretting tumor suppressor vorter (wts), viser epithelial egenskaper. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Cellen tetthet kan telles manuelt ved hjelp av en hemocytometer, eller automatisk med en automatisert partikkel teller. (A) A hemocytometer med to kamre. (B) en automatisert celle teller viser resultatet av en celletall. (C) forbedret Neubauer cellen teller rutenettet vises under et 10 x mål. Telle celler bundet av 0,1 mm3 sentrale rutenettet (rød stiplede firkanten). (D) sentrale rutenettet i hemocytometer fylt med celler for opptelling. Skala bar = 1 mm (C); 0.2 mm (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Utstyr for kryonisk bevaring. (A) A frysing beholder butikker ampuller stående for treg frysing. (B) en metall rør for å holde frosne ampuller. (C) en canister for å holde canes. (D) en frysing plasteske (cryobox). (E) A canister holde flere canes i en flytende N2 lagring tank. (F) en flytende N2 lagring tank. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cellen belastning Media Etterlevelse Trypsin
Schneider linjer M3 + BPYE + 10% fosterets kalv serum (FCS), pH 6.6 Semi tilhenger nei
(S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11
Schneider's media+ + 10% FCS
KC linjer (Kc167, Kc7E10)21,22 M3 + BPYE + 5% FCS, pH 6.6 Semi tilhenger nei
Hyclone-CCM3, pH 6.2
Imaginal plate og CNS linjer (ML-linjer)13,14 M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6.6 Semi tilhenger nei
10 µg/mL insulin
Milner imaginal plate linjer (CME-linjene)15 M3 + 2% FCS Semi tilhenger nei
5 µg/mL insulin
2,5% fly ekstrakt
Erstattet/OSS16 M3 + 10% FCS, pH 6.8 Tilhenger *
10 µg/mL insulin
1 mg/mL C5H8KNO4  
0,5 mg/mL KHCO3 
0.6 mg/mL glutation
10% fly ekstrakt
RASV12 linjer18 M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6.6 Tilhenger ja

Tabell 1: Kravene til egenskaper og media i ulike Drosophila cellelinjer. Forskjellige isolater av semi tilhenger Schneider linjer inkludert S2R + S2-Drosophila RNAi Screening Center (DRSC), S2-Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) og Sg4 er vanlige linjer som sprer robust når kultivert i M3 media + Bactopetone gjærekstrakt (BPYE) med 10% fosterets kalv serum (FCS). Alternativt er Schneider's media (pH 6,7-6.8) ofte brukt i stedet for M3 + BPYE. Kc linjene sprer på enten M3 + BPYE (5% FCS) eller serum-free CCM3 media. ML imaginal plate og sentralnervesystemet (CNS) linjer krever insulin tilskudd for spredning. Milner imaginal plate linjene krever både insulin og fly ekstra kosttilskudd. Cellelinjer tilhenger erstattet/OSS krever insulin, en høyere konsentrasjon av fly ekstrakt samt glutation for vekst. Tilhenger RasV12 linjer vokse godt i M3 + BPYE (10% FCS). Trypsin brukes å dislodge tilhenger linjer fra vekst overflaten.

Celle linje (lager #) Genotype Dobling tid (h) * Vev kilde
S2R + (150) OreR 39 Sen embryo
S2-DGRC (6) OreR 23 Sen embryo
S2-DRSC (181) OreR 46 Sen embryo
Kc167 (1) e/se 22 6−12 h embryo
ML-BG2-c2 (53) y v f mal 48 3rd skikkelsen larver CNS
ML-BG3-c2 (68) y v f mal 104 3rd skikkelsen larver CNS
ML-DmD8 (92) y v f mal 66 3rd skikkelsen larver fløyen plate
CME W1 Cl.8+ (151) OreR 46 3rd skikkelsen larver fløyen plate
CME L1 (156) OreR 47 3rd skikkelsen larver Ben plate
OSS (190) bamD86 45 Voksen bam mutant eggstokkene
RASV12 linjer UAS-GFP; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 41−65 Embryo

Tabell 2: Genotype, dobling tid, og vev kilder til mye brukt Drosophila cellelinjer. Vev genotype, kilden og befolkningen dobling tid brukte cellelinjer presenteres. Dobling tid er basert på vekst i anbefalte media på 25 ° C.

Kultur fartøy Volumet av media (mL)
12,5 cm2 T-kolbe 2.5
25 cm2 T-kolbe 5
75 cm2 T-kolbe 15
35 mm plate 1
60 mm plate 4
100 mm plate 10
384-vel plate * 0,04/godt
96-brønns plate * 0.1/godt
48-vel plate * 0,3/godt
24-vel plate * 0,5/godt
12-vel plate 1.0/godt
6-vel plate 2.0/godt

Tabell 3: kultur fartøy og anbefalt utskriftsmateriale volumene. Kultur skip av forskjellige størrelser er tilgjengelige for dyrking Drosophila celler. Egnede medier volumene (mL) anbefales for hver fartøy. Forsegle multi bra plater som inneholder mindre enn 0,5 mL av cellen suspensjon med parafin film å redusere media tap på grunn av fordampning.

Volum
M3 + BPYE, pH 6.6 70 mL
Varme inaktivert FCS 20 mL
Sterile filtrert DMSO * 10 mL

Tabell 4: oppskrift for å utarbeide 100 mL frysing medium (M3 + BPYE, 20% FCS, 10% DMSO). Forberede frysing media behov og unngå lagring frysing media med DMSO for langtidslagring.

M3 + BPYE medium Beløp
Skjold og Sang's M323 1 flaske
KHCO3 0,5 g
Velg gjærekstrakt 1.0 g
Bactopeptone 2.5 g
Sterilt renset vann 1000 mL

Tabell 5: Oppskrift for å utarbeide 1 L M3 + BPYE vev kultur medium. Justere pH til 6.6. Sterilisere av mediet passerer filtere 0.22 µm.

Base M3 medium for erstattet/OSS cellen linje Beløp
Skjold og Sang M3 1 flaske
KHCO3 0,5 g
C5H8KNO4   1.0 g
Sterilt renset vann 1000 mL

Tabell 6: Oppskrift på 1 L erstattet/OSS M3 base medium. Justere pH til 6.8. Sterilisere av mediet passerer filtere 0.22 µm.

Hyclone-CCM3 Beløp
CCM3 pulver 28.6 g
NaHCO3 0,35 g
10 N NaOH 2,5 mL
CaCl2 0,5 g
Sterilt renset vann 1000 mL

Tabell 7: Oppskrift på 1 L Hyclone-CCM3 vev kultur medium. Justere pH til 6.2. Sterilisere av mediet passerer filtere 0.22 µm.

M3 + BPYE + 10% FCS Miyake plate og CNS linjer medium Milner plate linjer medium Erstattet/OSS fullstendig medium
M3 + BPYE, pH 6.6 90 mL 90 mL - -
Varme inaktivert FCS * 10 mL 10 mL 2 mL 10 mL
Insulin (10 mg/mL) - 100 ΜL 50 ΜL 100 ΜL
Fly ekstrakt - - 2,5 mL 10 mL
Glutathione (60 mg/mL) - - 1 mL
M3, pH 6.6 - - 97.5 mL -
Erstattet/OSS M3, pH 6.8 - - 79 mL

Tabell 8: Oppskrift for å utarbeide 100 mL ulike felles Drosophila celle kultur medier. Inkuber FCS ved 56 ° C i 1 time og rist hvert femte minutt til varme-Deaktiver supplement proteiner.

Discussion

Drosophila cellekulturer er primære reagensene høy gjennomstrømning cellebasert skjermer. Deres bruk også utfyller i vivo genetisk forskning ved å tilby en homogen populasjon av celler egnet for biokjemi, rask testing av transgene konstruksjoner før injisere inn fluer, cellebiologi, mikroskopi og nylig somatisk cell genetisk manipulasjoner av genomet redigering1,,2,,3,,8,,9,,10.

Levedyktighet og utvinning av frosne Drosophila celler er følsom for drastisk svingninger ved lave temperaturer. DGRC lagrer frosne cellelinjer i flytende fase av N2 (-196 ° C) og transporterer dem i tørris (-78.5 ° C). Frosne ampuller som har vært transportert i tørris bør ikke bli overført til flytende N2 eller-80 ° C fryser for lagring. I stedet bør de frosne cellene være tint, reseeded på en høyt tetthet snarest ved ankomst (protocol del 1) og kultivert for sine tiltenkte formål (protocol avsnitt 3). Hvis cellen linjene ikke er umiddelbart brukes for eksperimenter, cryopreserved cellen linjer skal (protokollen inndelingen 6) til de er klare til bruk.

Noen linjer, som ML-BG2-c2 og Ras linjene må flere dager å gjenopprette fra virkningene av å bli gjenopplivet fra cryopreserved staten. En betydelig mengde mobilnettet rusk følger disse cellelinjer de første dagene etter tining. Venstre uforstyrret, vil cellene gjenopprette og sprer. Mange Drosophila linjer på DGRC er tilpasset å vokse i M3 basert media22. For cellelinjer som er trege til å gjenopprette fra effekter av tine, kan bruk av betinget media være nyttig. Betinget media trolig inneholde vekstfaktorer utskilles av cellene i media som kan oppmuntre utvinning og spredning av cellene etter tining.

Cellelinjer generelt følger en stereotype vekstkurve bestående av en lag fase, eksponentiell fase, platå fase og en forverring fase. Mange Drosophila cellelinjer sprer i logg-fasen av vekst når de er kultivert på en tetthet mellom 1 x 106 og 1 x 107 celler/mL på 25 ° C. Det er viktig at linjer er passaged slik at de er alltid i eksponensiell vekstfase.

Av en kultur, uttrykt som en prosentandel, beskriver vekst arealet som dekkes av celler. Cellen der en celle linje, avhengig av sin celle form og størrelse. Tydelige linjer har ulike morphologies og etterlevelse egenskaper. Som et resultat, kan forskjellige linjer på omtrent samme samløpet ha vesentlig forskjellige celle tetthet (figur 1). Kultur der kan ikke være en ideell indikator for passaging Drosophila cellekulturer fordi Drosophila cellelinjer fortsette å spre enten ved spuntveggstål oppå hverandre som foci eller i suspensjon selv etter vekst overflaten er dekket (figur 1). Men kan brukere erfaring med bestemte linjer ofte bruke samløpet som en rask visuell guide for når å subkultur.

Mens det er mulig å vokse Drosophila linjer på ambient RT mellom 19−25 ° C, anbefales det ikke fordi Omgivelses temperatur kursbevgelsene kan påvirke prisen spredning. Bruk av en dedikert 25 ° C inkubator anbefales. Inkubator for Drosophila cellekulturer trenger ikke å lette CO2 gassutveksling fordi Drosophila celle kultur medier ikke bruker CO2 for bufring. Humidity innenfor inkubator for dyrking linjer er en viktig faktor ikke kan overses når dyrking celler i plater. Avhengig inkubator og arbeidsmiljøet, kan det være nødvendig å plassere et beger sterilt vann i inkubator. For å minimere media fordampning, bruke lukket T-kolbe eller lagrer kultur plater i en tett forseglet plast container inni inkubator.

Det er viktig å utvikle en plan for subculturing Drosophila linjer. For å beregne veksten rate og skjermen konsistens, er det praktisk å subkultur på en selv geometriske ratio (dele forholdet 1:2, 1:4, 1:8). En 10 mL confluent plate av Kc167 celler på 8 x 106 celler/mL kan for eksempel deles på 1:8 forholdet å oppnå en seeding tetthet av 1 x 106 celler/mL (1,25 mL av cellen suspensjon fortynnet i 8.75 mL av fersk media). 72 h, er Kc167 kulturer ventet å spre seg til en tetthet på 8 x 106 celler/mL, gitt sin dobling tid på 24 timer. Delt forholdet derfor bestemmes å lette en praktisk subkultur rutine av opp til to ganger i uken, sikrer at cellene er alltid kultivert i deres eksponentiell Logg vekstfase. Dette gir regelmessig for subculturing cellene slik at tiden til samløpet er verken for kort eller for lang. Hvis den samløpet er for kort, er cellene subcultured på lavere celle tetthet (høyere delt ratio). Tilsvarende, hvis tid til å nå samløpet er for lang, cellene er subcultured på en høyere celle tetthet (lavere delt ratio). Det er viktig å merke seg at de fleste Drosophila linjer er svært følsomme for lav celle tettheter (< 1 x 105 celler/mL), hvilke celler knapt sprer og kan til slutt dø.

Drosophila cellelinjer varierer i vekst egenskaper og morfologi. Resultatet må cellelinjer med forskjellige egenskaper behandles annerledes. De fleste Drosophila linjer er halvt tilhenger. Ved lavere celle tetthet, de holde fast sterkere vekst overflaten og som kulturen blir confluent, cellene blir mindre tilhenger og enkelt koble. Denne gradvise endringen i cellen tilslutning muliggjør enkel subculturing av mest brukte Drosophila linjer (Schneider, Kc linjene, imaginal plate og CNS) som gjør det mulig for operatøren å bare kvitte media over cellen monolayer å fjerne dem fra vekst overflaten når kulturen er tett. For linjer som overflaten tilhenger som den kvinnelige bakterie-line stammen/ovarian somatiske skjede (erstattet/OSS) og Ras linjer, er det viktig å ruge cellene i trypsin for en kort varighet som hjelp til å koble cellene fra vekst overflaten.

Media inkluderer for de fleste Drosophila cellelinjer fosterets kalv serum (FCS). Insulin og voksen fly ekstrakt (ligger) kreves for noen bestemt linjer. Fex fil inneholder udefinert komponenter avgjørende for veksten av bestemte larver imaginal disken linjene og de voksen ovarian cellen. DGRC forbereder, og gjør tilgjengelig voksen ligger avledet fra 1 uke gamle Oregon-R-modENCODE fluer (RRID: BDSC_25211) i 2,5 mL og 10 mL dele. DGRC gir også instruksjoner for småskala ligger forberedelse på sin hjemmeside < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. LIGGER forberedelse, men er tidkrevende og krever en stor mengde voksen fluer.

Kryonisk bevaring av Drosophila cellelinjer sparer tid og reagenser for vedlikehold av cellelinjer ikke i bruk. Kryonisk bevaring oppnås ved sakte frysing cellene (-1 ° C/min)-80 ° c i et medium som inneholder DMSO en cryoprotective agent. Det langsomme avkjøling trinnet er avgjørende for vellykket kryonisk bevaring. I-80 ° C fryser, er ampule av celler avkjølt frekvensen av-1 ° C/min når plassert i en fryser container fylt med isopropanol. Starter på Omgivelses temperatur på 25 ° C, vil det ta opptil 2 timer for temperaturen i ampuller å nå-80 ° C. Det anbefales å forlate ampuller fryse over natten.

Frosne ampuller må deretter raskt overført i flytende fase av nitrogen for langvarig lagring. Cryovial vil oppvarmer raskt på ca 10 ° C/min omgivelsestemperatur og levedyktighet blir kompromittert på over-50 ° C23. For å holde overføring rask, håndtere ampuller i små grupper for å redusere eksponering for Omgivelses temperatur. Eventuelt plassere den frosne cryovials på tørris klargjøring for at deres overføring til væske N2. Hvis flytende nitrogen ikke er tilgjengelig, kan cellene lagres i-80 ° C fryser, selv med fare for betydelig forringelse over tid.

Cellen tetthet er avgjørende for vellykket kryonisk bevaring og etterfølgende gjenoppliving av linjer. Generelt, nye cellen linjer skal fryses for å opprette første fryse (1−3 ampuller) så snart et overskudd av celler blir tilgjengelig. Når cellen linjen har blitt ytterligere kulturperler stabilt, opprettes en frossen lager av 10−20 ampuller. Dette lager er så tint å sjekke etter fryse celle utvinning og livskraft, hvoretter det overføres for experimentations eller erstatte aksjen når antallet frosne lager ampuller faller under fem. Til slutt, er det viktig å validere at tinte cellene beholde egenskapene til sine foreldre aksjer som linjer er kjent for å utvikle3,24.

I konklusjonen, presenterer denne artikkelen en primer for å arbeide med Drosophila cellekulturer ved å gi grunnleggende informasjon på ulike linjer, beste praksis og audiovisuelle protokoller for enkel håndtering av Drosophila linjer. Denne tilgjengelig ressurs er ment å jevnt lette innføringen arbeider med kulturperler Drosophila celler og for å utfylle eksisterende guider på noen forskningslaboratorium.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) og forskningen fellesskapet for å benytte ulike D. melanogaster DNA/vektor/mobiltelefon ressursene kuratert på DGRC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, B., Cherbas, L. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Dahmann, C. 420, Humana Press. Ch. 25 391-424 (2008).
  2. Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
  3. Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
  4. Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
  5. Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
  6. Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
  7. Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
  8. Echalier, G. Drosophila Cells in Culture. , Academic Press. (1997).
  9. Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. Drosophila cells in culture. 2nd edition. , Elsevier. (2017).
  10. Cherbas, L., Cherbas, P. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 10, 2nd, Oxford University Press. 319-346 (1998).
  11. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
  12. Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
  13. Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
  14. Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
  15. Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
  16. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
  17. Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
  18. Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
  19. Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
  20. Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
  21. Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
  22. Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
  23. Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , Wiley Blackwell. (2016).
  24. Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 146 Drosophila celle kultur kryonisk bevaring kultur medier celle linje beste praksis
Tiner dyrking og Cryopreserving <em>Drosophila</em> linjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts,… More

Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter