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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Abstract

Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.

miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.

Introduction

Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique1. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire2. Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression3. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire4et CDK1 activation est essentielle pour la division cellulaire avec succès5. Plusieurs inhibiteurs de CDK ont été développés et évalués dans des essais cliniques au cours des dernières décennies, indiquant le potentiel du ciblage cdk2 dans le traitement du cancer. En fait, trois inhibiteurs de CDK ont été approuvés pour le traitement du cancer du sein récemment6,7,8,9,10. Ainsi, cdk2, et en particulier, la CDK1 et CDK4/6, sont d’un grand intérêt dans la régulation de la progression du cancer cell.

miARN (miRs) est petites, non codantes RNAs et régulateurs post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, régulation environ 30 % de tous les gènes humains11. Leur activité est basée sur la répression traductionnelle ou dégradation des ARN messagers (ARNm)12. Illustrant leur signification biologique, plus de 5 000 miARN ont été identifiées et une molécule de miRNA seul peut régler plusieurs gènes11,13. Plus important encore, miRNA expression a été associée à différentes maladies et les statuts de la maladie, y compris le cancer13. En fait, les miARN ont été caractérisées comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur, ayant la capacité à promouvoir ou à supprimer la tumeur développement et la progression de14,15. L’expression relative des miARN dans les tissus malades peut réguler la progression de la maladie ; ainsi, la tradition exogène des miARN a potentiel thérapeutique.

Cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer et plus grande que 60 % de tous les cancers du poumon non à petites cellules16,les cancers du poumon17, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 20 %18. L’utilisation de miR-143-3 p et p miR-506-3 a été récemment évaluée afin de cibler les cycles cellulaires de cellules du cancer du poumon11. miR-143 et miR-506 ont des séquences qui sont complémentarité CDK1 et CDK4/CDK6, et les effets de ces deux miRs sur cellules A549 ont été analysés. Les détails expérimentaux sont présentés et discutés dans cet article. L’expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et l’apoptose ont été évalués à l’aide de différents protocoles expérimentaux et h après transfection. Nous avons utilisé des méthodes PCR (RT-qPCR) quantitatives en temps réel ainsi que l’analyse de microarray de mesurer l’expression de gènes spécifiques et séquençage de RNA de prochaine génération a servi à déterminer le gène global dysrégulation11. Cette dernière méthode identifie l’abondance relative de transcription de chaque gène avec la sensibilité élevée et de la reproductibilité, tandis que des milliers de gènes peuvent être analysés d’une seule analyse expérimentale. En outre, apoptotic analyse suite à un traitement miRNA a été réalisée et est décrite ici. Bio-informatique complété l’analyse de la voie. Présentées ici sont protocoles utilisés pour l’analyse de la thérapeutique potentielle de la combinatoire miR-143 et miR-506.

L’objectif principal du présent protocole est d’identifier les effets des miARN dans les cellules, en mettant l’accent sur le cycle cellulaire. La variété des techniques présentées ici qui s’étend de l’analyse de l’expression génique prétraduction (à l’aide de qPCR) chargé d’élaborer et de nouvelles techniques d’analyse de gène au niveau des protéines, telles que l’analyse microarray. Il est à espérer que ce rapport est utile pour les chercheurs intéressés à travailler avec les miARN. Par ailleurs, la méthodologie d’analyse en cytométrie en flux du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules est présenté.

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Protocol

1. transfection miR-143 et miR-506

Attention : Utilisez des gants en latex, lunettes de protection et un manteau de laboratoire tout en exécutant les expériences décrites. Au besoin, utiliser l’armoire de sécurité biologique avec le ventilateur d’armoire, sans bloquer les voies respiratoires ou de perturber le flux d’air laminaire. Toujours défini la vitre protectrice à la hauteur appropriée, telle que décrite par le fabricant.

  1. Cellules A549 NSCLC graines dans une assiette bien T25 cm2 flacon/6/96, en milieu DMEM/F12K additionné de 10 % SVF et 1 % la pénicilline-streptomycine (milieux de culture) dans une hotte de culture de tissus et incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture de tissus.
  2. Suspendre l’imite miR-143 et/ou miR-506 ou brouiller les siARN avec agent de transfection (2,4 µg de miR ont été mélangés avec 14 µL d’agent de transfection ; voir Table des matières) dans 500 µL de médias de transfection et 1,5 mL de sérum et sans antibiotique milieu DMEM/F12K à une concentration de miRNA final de 100 nM. miRNA montant peut exiger l’optimisation différentes cellules et concentrations. Des approches appropriées incluent la transfection de cellules avec une augmentation des concentrations de miRNA (c.-à-d., 50-200 nM) et l’évaluation de la diminution d’expression des gènes d’intérêt.
  3. Retirer des milieux de culture de fiole/plaque et laver une fois avec du PBS 1 x.
  4. Ajouter miRNA/scramble-transfectants des complexes agent et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 6 h (taille de ballon définit le volume ajouté d’incubation).
  5. Remplacer les médias avec 4 mL de milieu de culture et incuber les cellules pour 24h ou 48 h.
  6. Récolter les cellules transfectées par trypsinisation, en ajoutant 1 mL de trypsine-EDTA dans chaque fiole de2 cm T25, incuber pendant 5-10 min à 37 ° C et ajouter 3 mL de milieu de culture de récolter les cellules. Placez le contenu de chaque fiole dans un tube séparé, marqué 15 mL. Travailler sous une hotte de culture de tissus.
  7. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
    NOTE : Attention est nécessaire au moment du retrait de surnageant, comme de l’agitation du tube peut entraîner une perte de cellules.
  8. Ajouter 2 mL de solution 1 PBS x et centrifuger pendant 5 min à 751 x g.
  9. Répétez les étapes 7 et 8 fois pour éliminer toute trace de médias et surnageant.
    Remarque : À ce stade, tubes d’échantillons peuvent être conservés à-80 ° C ou peuvent être utilisés immédiatement.

2. extraction de l’ARN

  1. Nettoyer l’espace de travail par pulvérisation d’alcool isopropylique à 70 % et la solution de décontamination de RNAse.
  2. Extraction de l’ARN doit être effectuée à l’aide d’un ARN approprié nécessaire (voir la Table des matières).
  3. Retirer les tubes de-80 ° C et laissez-les décongeler. Ajouter 300 µL de tampon de lyse et pipette de haut en bas pour briser la membrane des cellules.
  4. Ajouter un volume égal d’éthanol ultra purs à 100 %.
  5. Bien mélanger et placer dans la colonne de séparation.
  6. Centrifuger entre 11 et 16 g pendant 30 s et supprimer les intermédiaires.
  7. Ajouter 400 µL de tampon et centrifugeuse pour retirer le tampon de lavage.
  8. Ajouter 5 µL de la DNAse I 75 µl de la digestion de l’ADN de la mémoire tampon dans chaque échantillon et incuber pendant 15 min.
  9. Laver l’échantillon avec 400 µL de tampon de préparation de RNA.
  10. Laver 2 x avec tampon de lavage RNA.
  11. Ajouter l’eau exempte de nucléase à la colonne, centrifugeuse, puis recueillir l’ARN.
  12. Mesurer la concentration d’ARN totale avec un spectrophotomètre UV.

3. RT-qPCR

  1. Avant la RT-qPCR, synthèse de l’ADNc. À la suite de quantification de RNA de concentration, placer 1 µg d’ARN dans un volume final de 20 µL de réaction pour préparer des ADNc dans un tube PCR. Toujours travailler sur un banc propre.
  2. Tous les autres ingrédients nécessaires sont inclus dans le tableau 1.
Ingrédients Quantité (µL) / (20 µL) d’échantillonnage
5 X cDNA Master mix 4
dNTPs 2
Hexamères aléatoire 1
Rehausseur de RT 1
Mélange enzymatique au verso 1
Eau libre de DNase et RNase Qté nécessaire après l’ajout de RNA pour faire 20 µL

Tableau 1 : Matériaux pour la synthèse de cDNA d’échantillons d’ARN. Besoin de quantités d’ingrédients respectifs pour préparer un mélange maître pour un échantillon de la synthèse de cDNA.

  1. Incuber dans un thermocycleur avec les conditions de température suivantes : 42 ° C pendant 30 min ; 95 ° C pendant 2 min ; 4 ° C jusqu’au prélèvement d’échantillons.
  2. Utilisez immédiatement régulière PCR ou qPCR ou stocker des ADNc à-20 ° C.
  3. Préparer les solutions d’apprêt avant et arrière avec DNase/RNase-libre eau à une concentration de 10 µM de solution stock amorce.
  4. Préparer des mélanges maîtres distincts pour chaque gène être détectée, selon le nombre d’échantillons. Pour chaque échantillon d’ADNc (qPCR bien), la quantité de réaction est établie selon le tableau 2.
Ingrédients Quantité (µL) / (20 µL) d’échantillonnage
Mix master SYBR 10
Primer avant - 10 μM 2
Reverse Primer - 10 μM 2
Eau libre de DNase et RNase 3
échantillon d’ADNc 3

Tableau 2 : matériaux pour des PCR quantitative en temps réel provenant d’échantillons de cDNA. Nécessaire la quantité des ingrédients pour préparer un mélange maître pour un échantillon de qPCR.

  1. Placer chaque échantillon dans les puits respectifs.
  2. Concevoir le schéma prédéterminé pour la plaque 96 puits qPCR. Pour chaque échantillon et gènes analysés, effectuer la réaction dans la géométrie, ou au moins en doublons.
  3. Sceller la plaque 96 puits avec un couvercle optiquement transparent adhésif.
  4. Accès rapide-spin la plaque pour permettre le mélange réactionnel atteindre le fond de chaque puits.
  5. Exécutez RT-qPCR selon le gradient thermique suivant :
    1) 50 ° C pendant 2 min
    2) 95 ° C pendant 2 min
    3) 95 ° C pendant 15 s
    4) prendre la lecture
    5) 60 ° C pendant 1,5 min
    6) Répétez l’étape 3 pour 39 fois
  6. Exécutez le gradient thermique suivant dans le prolongement de ce qui précède afin de déterminer la courbe de fusion qui indique l’amplification monoproduit.
    7) 65 ° C pour 0,31 min
    0,5 ° C/cycle
    9) lecture de plaques
    10) Répétez l’étape 8 pour 60 fois jusqu'à 95 ° C
    11) 72 ° C pendant 2 min

4. gel d’agarose pour confirmer l’amplification génique unique

  1. Préparer un gel d’agarose de 1 % dans un tampon de x TBE 1.
  2. Ajouter le bromure d’éthidium (EtBr) en gel chaud (~ 50 ° C) jusqu'à obtenir une concentration finale d’environ 0,2 à 0,5 µg/mL. Bromure d’éthidium se lie avec l’ADN et lui permet d’être visible sous les rayons dans un imageur de gel UV.
  3. Verser chaud gel dans un plateau de gel fourni avec une boîte de gel d’électrophorèse. Fixer le peigne fourni étroitement pour puits uniformes.
  4. Laisser le gel au repos et laisser refroidir à température ambiante (RT) pendant environ 30 min.
  5. Lorsque le gel est solidifié, placer le gel et la barre d’état dans la boîte de gel.
  6. Remplir la boîte gel avec 1 x TBE tampon jusqu'à ce que le gel soit complètement recouvert.
  7. Mesurer la concentration de l’ADN de processus d’amplification PCR à l’aide d’un spectromètre UV.
  8. Prendre environ 15 ng d’ADN dans un petit tube PCR, ajouter 5 µL de colorant et ajouter la quantité nécessaire d’eau exempte de nucléase afin d’obtenir un volume total de 15 µL.
  9. Charger l’échelle d’ADN et des échantillons dans les puits.
  10. Exécutez le gel à 100 V jusqu'à ce que la ligne de colorant est environ 75 à 80 % vers le bas le gel.
    Remarque : Veillez à ce que le gel relie un négatif à charge positive.
  11. Retirer le gel et le placer dans l’imageur de gel pour visualiser l’ADN.

5. analyse de cycle de cellules

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans une fiole T25 de2 cm et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, puis de récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles 15 mL et étiqueter correctement.
  4. Centrifuger les échantillons à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x pour enlever les restes de fluides.
  7. Resuspendre et briser le culot en ajoutant 200 µL de PBS glacée 1 x par pipetage.
  8. Fixer les cellules en ajoutant 2 mL d’éthanol à 70 % et glacée goutte à goutte dans le tube tout en produisant des tourbillons doucement.
  9. Incuber les tubes pendant 30 min à RT et placer les tubes à 4 ° C pendant 1 h.
  10. Retirer les tubes de 4 ° C et centrifuger à 751 x g pendant 5 min.
  11. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  12. Ajouter 500 µL de solution de 1 PBS x avec l’iodure de propidium (50 µg/mL) et de la ribonucléase A (200 µg/mL)
  13. Incuber 30 min à ta tout en protégeant les échantillons de la lumière.
  14. Acquisition de données sur le cytomètre en flux. Utiliser avant vs diffusion latérale (FSC vs SSC) pour sélectionner la principale population de cellules, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche des clusters intrigue et cellule densité FSC vs SSC en haut en haut-droite de la courbe de densité FSC vs SSC.
  15. Analyser les données pour l’identification des populations de cellules par étape du cycle de la cellule avec un logiciel approprié.

6. dosage de l’apoptose

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans une fiole T25 de2 cm et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles 15 mL et étiqueter correctement.
  4. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x pour enlever les restes de fluides.
  7. Diluer 10 x tampon de liaison annexine V à 1 x avec glacee dH2O.
  8. Ajouter 1 mL de 1 x tampon de liaison de l’annexine V dans chaque tube d’échantillon et resuspendre doucement.
  9. Suspension du lieu 96 µL des cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  10. Ajouter 1 µL de Annexin V-FITC conjugué et 12,5 µL de l’iodure de propidium (PI) dans le tube contenant la suspension cellulaire.
  11. Incuber la suspension cellulaire pendant 10 min sur la glace dans l’obscurité.
  12. Ajouter 250 µL glacée 1 x tampon de liaison Annexin V dans chaque tube d’échantillon pour diluer.
  13. Analyser des échantillons avec cytomètre en flux immédiatement.

7. expression de la protéine par anticorps cycle cellulaire microarray

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans des flacons de2 cm T25 et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transfert des suspensions cellulaires aux tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
  4. Centrifuger à 751 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 2 mL de PBS glacée 1 x, vortex et centrifuger à 751 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage avec une solution de 1 PBS x.
  7. Ajouter 150 µL de tampon de lyse additionné d’inhibiteurs de la protéase. Pipette de haut en bas doucement pour perturber les membranes cellulaires.
  8. Pour éviter toute interférence de tampon de lyse, effectuer un échange tampon pour remplacer le tampon de lyse avec tampon de marquage, à l’aide de colonnes échange solvant du fabricant.
  9. Quantifier les protéines totales avec un dosage BCA.
  10. Prenez 70 µg d’échantillon de protéine et ajouter pour obtenir un volume final de 75 µL de tampon étiquetage.
  11. Ajouter 100 µL de diméthylformamide (DMF) à 1 mg de réactif de biotine (biotine/DMF).
  12. Ajouter 3 µL de la biotine/FMM dans chaque échantillon de protéine (échantillon de protéine biotinylé) et incuber pendant 2 h à température ambiante.
  13. Ajouter 35 µL de réactif de stop et mélanger au vortex.
  14. Incuber les échantillons à RT pendant 30 min.
  15. Enlever les lames microarray du réfrigérateur pour qu’ils réchauffent à RT pendant 1 h avant utilisation.
  16. Effectuer un blocage pour les liaisons non spécifiques en incubant les lames avec une solution de lait sec 3 % (en bloquant réactif fournie par le fabricant) dans une boîte de pétri avec agitation continue pendant 45 min à température ambiante.
  17. Laver les lames avec de l’eau2O ddH (sauf indication contraire, le lavage se déroule avec FD2O).
  18. Répétez l’étape de lavage ~ 10 x pour supprimer complètement la solution de blocage des surfaces de glissement. C’est important d’obtenir un arrière-plan uniform et faible.
  19. Enlever l’eau excessive des surfaces slide et passez à l’étape suivante sans laisser les diapositives à sec.
  20. Préparer la solution de couplage en dissolvant le lait sec 3 % dans un réactif de couplage.
  21. Ajouter 6 mL de la solution de couplage et de la quantité totale de l’échantillon de protéines biotinylées préalablement préparée à l’étape 7.12.
  22. Place une diapositive dans un puits de la chambre de couplage fournis par le vendeur et ajouter environ 6 mL de protéine mélange de couplage pour elle.
    Remarque : Veiller à ce que la diapositive soit totalement immergée en protéines mélange solution de couplage.
  23. Couvrir la chambre de couplage et incuber pendant 2 heures au RT avec agitation continue dans un agitateur orbital.
  24. Transférer les lames à une boîte de Pétri et ajouter 30 mL de 1 x tampon de lavage. Placez la boîte de pétri en agitateur orbital, agiter pendant 10 min et jetez la solution.
  25. Répétez l’étape 7,24 2 x.
  26. Rincer les lames avec de l’eau2O ddH intensivement comme décrit aux étapes 7.17 et 7.18 et passez à l’étape suivante immédiatement pour éviter le séchage.
  27. Ajouter 30 µL de streptavidine-Cy3 (0,5 mg/mL) dans 30 mL de tampon de détection.
  28. Placez la diapositive dans une boîte de Pétri et ajouter 30 mL de tampon de détection contenant streptavidine-Cy3.
  29. Incuber dans un agitateur orbital pendant 20 min avec agitation continue protégée de la lumière.
    NOTE : Cy-3 est un colorant fluorescent. Couvrir avec du papier aluminium ou fonctionnent dans des conditions sombres pour maintenir l’intensité de la fluorescence.
  30. Procédez comme 7.24-7,26 et laisser la lame sécher à l’aide d’un léger courant d’air ou de la diapositive dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 1300 x g pendant 5-10 min.
  31. Placez la lame dans porte-lames et recouvrir de papier d’aluminium.
  32. Scan de la lame dans un scanner de microarray les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Dans le cas de Cy3, le pic de longueur d’onde d’excitation est à ~ 550 nm et émission maximum à ~ 570 nm.
  33. Analyser les données (voir la Table des matières) pour le logiciel utilisé).

8. séquençage de RNA

  1. Semences 5 x 105 cellules pour chaque échantillon dans des flacons de2 cm T25 et réaliser une transfection selon le protocole décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5.
  2. Après 24 h et 48 h, récolter les cellules par trypsinisation.
  3. Transférer les suspensions cellulaires aux tubes de 15 mL et étiquetez-les en conséquence.
  4. Extrait de RNA conformément à l’article 2, étapes 1-6.
  5. Vérifier la qualité de RNA ainsi que la concentration avec une bioanalyzer. Une intégrité de RNA score (RIN) supérieur à huit et échéant histogrammes sont nécessaires pour confirmer la qualité de la RNA.
  6. À partir de l’ARN total, utilisez ~ 2 µg de l’échantillon pour l’ARN (ARN messager de l’ARN total) le séquençage
  7. Séquence à l’aide d’un séquenceur de prochaine génération11.
  8. Exécuter le parage de qualité et carte avec un génome de référence de FASTQ les fichiers générés à partir de l’ARN séquençage machine11.
  9. Télécharger des fichiers FASTQ et cru lire les données de comptage à la banque de gènes, suivant les instructions de la < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> site.
    Remarque : Voir numéro SRP133420 pour les résultats antérieurs.

9. test de formation tube

  1. Évaluer le potentiel angiogénique de veine ombilicale humaine transfectées miRNA cellules endothéliales (HUVEC) 36 h après la transfection, tel que décrit à l’article 1, les étapes 1 à 5, à l’aide de cellules HUVEC au lieu de cellules A549.
  2. Affamer HUVECs avec médias famine M199 pendant 4 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  3. Supprimer le facteur de croissance réduite matrice de la membrane basale de-80 ° C et conserver à 4 ° C durant la nuit, permettant à un dégel progressif afin d’éviter la polymérisation et la formation de bulles.
  4. Soigneusement et lentement recouvrir le puits d’une plaque 96 puits en 0,04 mL de matrice de membrane basale de facteur de croissance réduite, en évitant la formation de bulles. Effectuer l’ensemble de la procédure sous une hotte à flux laminaire.
  5. Remplir les puits adjacents de la plaque 96 puits avec 0,1 mL de PBS, afin de maintenir l’humidité et protéger la température.
  6. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C pendant au moins 20 min pour que la polymérisation de l’extrait de la membrane basale est atteint. Pas incuber pendant plus de 1 heure.
  7. Trypsinize transfectées HUVECs de chaque groupe et remettre en suspension en milieu M199 à une concentration de 1 x 105 cellules/mL.
  8. Ajouter 0,1 mL de chaque suspension de cellules dans les puits contenant la matrice des membranes basales polymérisé dans la plaque 96 puits.
  9. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant que la préparation des facteurs de croissance se déroule. Préparation des facteurs de croissance se fait sous la hotte à flux laminaire.
  10. Reconstituer les facteurs de croissance (VEGF) à 2 x la concentration finale souhaitée (concentration de 4 ng/mL pour la concentration finale de 2 ng/mL) et ajouter 0,1 mL de milieu de famine M199 contenant du facteur de croissance sur le dessus de la 0,1 mL de milieu de famine M199 avec les cellules. Pour les puits non traitées VEGF, ajouter 0,1 mL de milieu famine M199 sur le dessus de la 0,1 mL de milieu de famine M199 avec les cellules.
  11. Incuber la plaque 96 puits pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  12. À la fin de la période d’incubation, obtenir des images de chaque puits avec un grossissement x 4, à l’aide d’un microscope à fond clair connecté avec un appareil photo numérique.
  13. Traiter des images avec le logiciel équipé d’un plug-in « angiogenèse analyzer »19. Trois paramètres, le nombre de nœuds, le nombre de jonctions et longueur totale sprout, permet de comparer les effets du traitement miRNA sur l’angiogenèse.

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Representative Results

Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse

Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe entre miRs individuels et activité combinatoire miR. L’utilisation de siRNA scramble avec l’agent de transfection permis évaluation des perturbations de la procédure sur détecté downregulation de gène, qui a été minime. Les données ont été analysées statistiquement à l’aide de l’élève à deux t-test, etp < 0,05 était considérée comme statistiquement significative (Figure 1). Avant qPCR, les séquences d’amorces ont été évalués à l’aide d’amorces-BLAST < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> pour l’amplification de gène unique. Cela a également été confirmée par l’analyse des produits d’amplification par électrophorèse sur gel. Une seule bande de produits d’ADN a été détectée pour chaque gène analysé (Figure 1), confirmant l’amplification génique unique. CDK6 amplification unique a été confirmée (données non présentées).

Figure 1
Figure 1 : Expression relative des gènes CDK1, CDK4 et CDK6 tel que détecté par qPCR et analyse par électrophorèse sur gel des produits d’amplification de l’ADN. miR-143 et miR-506 transfection des cellules A549 induit downregulation de downregulation CDK1 (A), B CDK4 et CDK6 (C) à 24h et de la 48 h après transfection. Produits d’amplification de l’ADN ont été évalués par électrophorèse sur gel (D) pour confirmer l’amplification génique unique. GAPDH a été utilisé comme gène de référence. Moyenne ± SEM, * p < 0,05 ; ** p < 0,01, bilatérale t-test. Ce chiffre a été modifié par Hossian et al.11s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Distribution de cycle cellulaire à l’aide de cytométrie en flux

Iodure de propidium des acides nucléiques cellulaires est une méthode standard pour visualiser la population de cellules à des stades différents du cycle cellulaire par dosage des ADN. Le traitement combinatoire de miR-143 et miR-506 interrompu le cycle cellulaire à deux points de contrôle, G0/G1 et G2/M, comme indiqué par le biais de cytométrie (Figure 2).

Figure 2
Figure 2 : Analyse du cycle cellulaire des cellules A549 transfectées avec miR-143 et miR-506 à 24 heures et transfection après 48 h. Pourcentages de populations de cellules pour chaque cycle cellulaire ont été déterminées par cytométrie en flux et l’iodure de propidium liant à l’ADN. Moyenne ± SEM. Ce chiffre est tiré avec les modifications de Hossian et al.11s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Test de l’apoptose annexin V/PI par cytométrie en flux

Après transfection des cellules A549 avec miR-143 et miR-506, un dosage de l’apoptose a effectué un annexine V et PI souillure et écoulement cytometry. On a constaté que le traitement combinatoire induit une apoptose significative à intervalles de 24 h et 48 h. Par rapport à la valeur du contrôle négatif, la variation en pourcentage de cellules apoptotiques a déterminé tel que détecté par les cellules positives annexine V, grâce au traitement de miR tel que présenté dans la Figure 3.

Figure 3
Figure 3 : Analyse illustrative des cellules apoptotic. Transection avec miR-143 et miR-506 a augmenté le pourcentage de cellules A549 Annexin V. Moyenne ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, bilatérale t-test. Ce chiffre a été modifié par Hossian et al.11s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Cycle cellulaire anticorps microarray

Mécanistes réponses au traitement peuvent être identifiés par le biais de changements dans l’expression de la protéine. Expression différentielle a été évaluée à un niveau de protéines des gènes associés à la voie du cycle cellulaire à l’aide d’un anticorps spécifique au parcours « microarray ». Extraits de protéine ont été utilisés pour l’analyse de cellules transfectées avec miR-143/506. L’analyse de microarray autorisée pour analyse semi-quantitative des protéines associées au cycle cellulaire de ~ 60, avec six réplicats pour chacun des anticorps spécifiques. L’approche permet une perspective plus large de comportements mécanistes dans une voie spécifique, l’identification des cibles moléculaires pour une évaluation approfondie et effectuer d’analyse au niveau du poteau-de translation. En raison du principe semi-quantitatif de la méthode, tous les résultats sur des gènes spécifiques doivent être confirmés par western-Blot. À titre indicatif, dans la présente analyse, une expression d’une diminution des protéines associées à la progression du cycle cellulaire a été détectée. Cela comprenait le ciblées CDK1 et CDK4 à 24h et de transfection après 48 h (Figure 4 a), tel que détecté par qPCR.

Figure 4
Figure 4 : Dérégulation du gène tel que détecté par microarray et analyse de la séquence RNA. (A) Heatmap du cycle cellulaire expressions génétiques de voie tel que détecté par l’analyse de microarray de protéine extrait de cellules A549 transfectées avec miR-143 et miR-506, à 24 heures et transfection après 48 h. (B) pli changement d’expressions de gènes voie cycle cellulaire des cellules A549 transfectées avec miR-143 et miR-506 à transfection après 24h tel que détecté par séquençage de RNA. Activité de la voie (C) tel qu’analysé par le logiciel d’analyse de parcours de données obtenues par le séquençage de RNA. Ce chiffre a été modifié de Hossian et al,. 11 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

RNA séquençage et voie analyse à l’aide du logiciel d’analyse de parcours

Séquençage de prochaine génération analyse avec précision l’expression des gènes au niveau du RNA. La méthode permet l’identification des changements multiples de gène grâce à une analyse unique (dans le présent protocole, l’analyse a détecté l’expression de > 18 000 gènes). En raison du grand nombre de gènes détectés, analyse bioinformatique a été utilisé pour un dosage efficace de comportement (Figure 4 b) de la voie. Logiciel a ensuite été utilisé (voir Table des matières) pour prédire les arrestations de phase G1/S et G2/M et la diminution de l’expression de S phase initiation (Figure 4). En outre, les résultats de séquençage de RNA peuvent être comparés à qPCR données. Dans cette étude, le séquençage de RNA a confirmé les conclusions de l’analyse de qPCR, indiquant une diminution de l’expression de CDK1 (48 %, p < 0,001, FDR < 0,001), CDK4 (68 %, p < 0,001, FDR < 0,001) et CDK6 (71 %, < 0,001, FDR < 0,001) due à combinatoire activité miR-143 et miR-506. L’analyse statistique a été réalisée par le logiciel de bordure utilisé pour le calcul de l’expression du gène relative, calculer les valeurs de p à l’aide de binomiale négative20,21. Analyse bioinformatique peut être effectuée pour l’évaluation fonctionnelle de l’activité de miRNA et la prévision de potentielles cibles moléculaires, comme illustré à la Figure 5.

Figure 5
Figure 5 : Parcours illustratif et analyse mécaniste présentée par voie analyse aoftware. Données de séquençage de l’ARN a été analysées de cellules A549 transfectées avec après transfection de miR-143 et miR-506, 24h, à l’aide de logiciels d’analyse de parcours et voies canoniques identifiés avec le score le plus bas (A) ou plus haut (B) d’activation. Le logiciel fourni également des fonctions prévues (C) et régulateurs/cibles en amont potentielles (D). Ce chiffre est tiré de Hossian et al,. 11 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Test de formation endothéliale tube

Le test de formation tube endothéliales in vitro est largement utilisé pour l’étude de l’angiogenèse et est fiable, automatisé et quantifiables22. Facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) est un promoteur de formation tube endothéliales angiogéniques célèbre facteur de croissance23,24 . Dans cette étude, on a constaté que le traitement combinatoire de miR-143 et miR-506 abroge l’angiogenèse induite par le VEGF. Images indicatives de la formation des tubes et les effets du traitement sont présentées à la Figure 6.

Figure 6
Figure 6 : Des images représentatives des pousses endothéliales de VEGF imprégnées vs non traitées HUVECs transfectées avec miRNA scramble, miRNA-143, miRNA-506 ou une combinaison des deux. Photos ont été obtenues sous un microscope à fond clair avec un appareil photo numérique moins de 4 x de grossissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.

Les méthodologies décrites fournissent une compréhension globale sur la fonction des miARN. Les défis de l’étude des miARN sont associées à leur capacité à cibler des gènes multiples et affectent donc des voies multiples. L’analyse de qPCR décrite permet d’identifier l’expression de gènes spécifiques d’intérêt, si les objectifs spécifiques sont identifiés avant le traitement. Par exemple, met ici l’accent principal a été l’expression de CDK1 et CDK4/6 et le cycle cellulaire.

Ainsi, l’analyse du cycle de la cellule à l’aide de propidium iodure et écoulement cytometry protocole est une méthode fiable pour détecter des modifications dans les populations de cellules selon leur stade du cycle cellulaire. La méthode repose sur l’augmentation proportionnelle du signal de fluorescence de la PI, qui se lie à l’ADN, correspondant à la phase du cycle cellulaire. En bref, les cellules en phase S synthétisent ADN, induisant des signaux plus élevés que les cellules en phase G0/G1 et les cellules en phase G2 ont reproduit leur ADN, produisant le signal plus intense.

Accumulation de preuves indique la connexion des dommages pour le cycle cellulaire et le déclenchement de l’apoptose,25. La méthode de cytométrie de flux en utilisant annexine VI/PI a toujours été utilisée pour l’identification de l’apoptose induite dans les cellules de traitement de chimiothérapie. À titre indicatif, une réponse apoptotique forte a été identifiée grâce à la thérapie combinatoire miRNA, qui était plus puissante par rapport à la miARN individuels.

La protéine semiquantitative anticorps « microarray » est une méthode sensible et fiable pour identifier les protéines expression des altérations des réponses biologiques concernant les lignes26,27. Ce protocole utilise un cycle cellulaire anticorps spécifique voie microarray, qui a détecté des modifications de l’expression en ~ 60 gènes entre les cellules traitées et non traitées. Attention durant les étapes de lavage pour s’assurer que le processus a été soigneusement réalisé et minimiser le signal de fond est nécessaire. En outre, les diapositives ne prenne pas secs jusqu'à la fin de l’expérience.

En revanche, séquençage de RNA analyse génétique quantitative des expressions multiples gènes, au niveau post-transcriptionnelle. Le significativement grand nombre de gènes analysés (> 18 000 pour RNA-seq vs 60 pour microarray) permet l’analyse simultanée de plusieurs voies et cibles moléculaires et avec une précision accrue. Une telle analyse large est important, car un seul miRNA peut lier à et cibler différents ARNm. En revanche, l’analyse de la voie d’un grand nombre de gène dysregulations est intrinsèquement difficile. Par exemple, bien que le séquençage de RNA confirme nos données de qPCR concernant downregulation CDK1 et CDK4/6 grâce au traitement de miRNA, l’analyse également fourni des données sur des milliers de gènes qui étaient également en baisse- ou régulée. Pour fournir un contexte à ces nombreux dysregulations gène, logiciel d’analyse de voie a été utilisé pour déterminer les effets globaux du traitement sur une voie différente et les fonctions cellulaires. À titre indicatif, le logiciel fourni représentant des scores d’activation (positive z score) ou l’inactivation (note z négative) des fonctions spécifiques ou des voies, ainsi que la signification statistique de l' analyse (Figure 5)28.

En conclusion, l’étude de l’activité de miRNA est une procédure difficile. La capacité intrinsèque des miARN d’affecter plusieurs gènes nécessite l’utilisation de plusieurs méthodes d’analyse complexes et compliqués d’identifier l’activité potentielle. Il n’est pas surprenant, travaux supplémentaires sont nécessaire pour bien comprendre les activités de miR-143 et miR-506 dans le cancer du poumon.

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Disclosures

Les auteurs aimerait remercier John Caskey à Louisiana State University pour son aide sur l’analyse de la voie des données de séquençage de l’ARN et l’Université du Texas Southwestern Medical Center, McDermott prochaine génération séquençage central pour effectuer l’analyse de données et de séquençage des RNA. Cette recherche a été financée par le collège de pharmacie, Université de la Louisiane Monroe fonds de démarrage et les National Institutes of Health (NIH) par le biais de l’Institut National de générale Medical Science subventions 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 de P20-15 s 1.

Acknowledgments

Aucun conflit d’intérêts ne sont déclarés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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Tags

Recherche sur le cancer numéro 145 transfection miRNA cancer du poumon cycle cellulaire apoptose angiogenèse séquençage de RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse
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Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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