Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

Abstract

סרטן הריאות (LC) הוא הגורם המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם. בדומה לתאים אחרים סרטן, מאפיין מהותי של תאים LC היא התפשטות ללא פיקוח חלוקת התא. עיכוב של התפשטות בעת עצירת התקדמות מחזור התא הוכח להיות גישה מבטיחה לטיפול בסרטן, כולל LC.

miRNA הרפוי הופיעו כמבקרי ג'ין post-transcriptional חשוב, הם יותר ויותר נחקר לשימוש בטיפול בסרטן. העבודה האחרונה, אנחנו מנוצל miRNAs שני, 143-מיר ומיר-506, כדי לווסת את התקדמות מחזור התא. תאים סרטניים (NSCLC) ריאות שאינם קטנים התא A549 היו transfected שינויים בביטוי הגנים נותחו, פעילות אפופטוטיים להיפגע עקב הטיפול ניתחנו את סוף סוף. Downregulation של kinases תלויי-cyclin (CDKs) אותרו (קרי, CDK1, CDK4 ו CDK6), והפסיקה מחזור התא על המעברים שלב G1/S ו G2/M. ניתוח מסלול הצביעו על פעילות אנטי-אנגיוגנטי פוטנציאלי של הטיפול, אשר מעניק את הגישה עם רבת פעילות. המתוארים להלן למתודולוגיות המשמש לזיהוי פעילות miRNA בדבר עיכוב מחזור התא, אינדוקציה של אפופטוזיס, ואת ההשפעות של טיפול בתאי אנדותל על ידי עיכוב של אנגיוגנזה. יש לקוות כי השיטות המובאות כאן יתמוך למחקר עתידי על miRNA הרפוי ובפעילות המתאים, כי נציג הנתונים ינחה חוקרים אחרים במהלך ניתוח ניסיוני.

Introduction

מחזור התא הוא שילוב של מספר אירועים רגולטוריות לאפשר כפילות של התפשטות ה-DNA של תאים דרך תהליך mitotic1. תלויי-cyclin kinases (CDKs) להסדיר ולקדם את מחזור התא2. ביניהם, mitotic CDK (CDK1) CDKs לאטמוספרה (CDK2, CDK4 ו CDK6) יש תפקיד מרכזי מחזור התא התקדמות3. חלבון רטינובלסטומה (Rb) הוא phosphorylated על ידי CDK4/CDK6 מורכבים כדי לאפשר התקדמות מחזור התא4, CDK1 הפעלה הוא חיוני עבור חלוקת התא מוצלחת5. יש רבים CDK מעכבי פותחה, הערכה בניסויים קליניים לאורך העשורים האחרונים, המציין את הפוטנציאל של פילוח CDKs בטיפול בסרטן. למעשה, שלושה מעכבי CDK אושרו לטיפול בסרטן השד לאחרונה6,7,8,9,10. לפיכך, CDKs, בפרט, CDK1 ו- CDK4/6, הם עניין רב בוויסות התקדמות תאי הסרטן.

miRNAs (מירס) הם קטנים, ללא קידוד RNAs הרגולטורים post-transcriptional של ביטוי גנים, ויסות כ-30% גנים אנושיים כל11. הפעילות שלהם מבוסס על הדחקה translational או השפלה של RNAs שליח (mRNAs)12. המחשה חשיבות הביולוגי שלהם, יותר מ-5,000 miRNAs זוהו, מולקולה בודדת miRNA ניתן לווסת גנים מרובים11,13. חשוב מכך, miRNA הביטוי נמצא קשור מחלות שונות ומצבים המחלה, כולל סרטן13. למעשה, miRNAs כבר שאפיינו גם oncogenic או מדכאי הגידול, להיות מסוגל לקדם או לדכא גידול פיתוח והתקדמות14,15. הביטוי יחסי תפקיד miRNAs בהתפתחות לרקמות החולות של יכול לווסת את התקדמות המחלה; לפיכך, משלוח אקסוגני של miRNAs יש הפוטנציאל הטיפולי.

סרטן הריאות הוא הגורם המוביל של מקרי מוות מסרטן, גדול יותר מאשר 60% של כל ממאירות ריאות שאינם קטנים התא ריאות סרטן16,17, עם שיעור הישרדות 5 שנים של פחות מ-20%18. השימוש של מיר-143-3 p ומיר-506-3 p הוערך לאחרונה הכוונת את מחזורי תאים תאים של סרטן ריאות11. 143-מיר ומיר-506 יש רצפי כי הם משלימים את החסר CDK1, CDK4/CDK6, ההשפעות של מירס שני אלה על תאים A549 נותחו. הפרטים ניסיוניים שהוצגו, המתוארים במסמך זה. ביטוי גנים, התקדמות מחזור התא, אפופטוזיס הוערכו באמצעות עיצובים מוטוריים שונים ו- timepoints בעקבות תרביות תאים. השתמשנו בשיטות PCR (RT-qPCR) כמותית בזמן אמת יחד עם ניתוח microarray למדוד ביטוי גנים ספציפיים, הדור הבא רצפי RNA שימשו לקביעת הכללית ג'ין dysregulation11. השיטה השנייה מזהה שפע יחסי התעתיק של ג'ין כל עם רגישות גבוהה, הפארמצבטית, בעוד אלפי גנים ניתן לנתח מתוך ניתוח ניסיוני יחיד. בנוסף, ניתוח אפופטוטיים להיפגע עקב טיפול miRNA בוצעה, מתואר כאן. ביואינפורמטיקה מצורפים ניתוח מסלול. המוצג כאן הפרוטוקולים משמשים לניתוח של טיפולית פוטנציאל של 143-מיר קומבינטורית, מיר-506.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הוא לזהות את ההשפעות של miRNAs בתאים, עם דגש על מחזור התא. מגוון רחב של טכניקות המובאת כאן span החל מפענוח הביטוי מראש (באמצעות qPCR) לפרט ותרגום הרומן טכניקות מפענוח ברמת חלבון, כגון ניתוח microarray. יש לקוות כי דו ח זה שימושי עבור חוקרים מעונינת לעבוד עם miRNAs. בנוסף, מוצגת מתודולוגיה ניתוח תזרים cytometric של מחזור התא, אפופטוזיס של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרביות תאים מיר-143 ו miR-506

התראה: השתמש כפפות גומי, מגן משקפיים, מעיל מעבדה בעת ביצוע הניסויים המתוארים. במידת הצורך, השתמש הקבינט אבטחה עם המאוורר הקבינט על, מבלי לחסום את דרכי הנשימה או להפריע את זרימת האוויר למינריות. תמיד להגדיר חלון זכוכית שיגן על הגובה המתאים, כפי שתואר על ידי היצרן.

  1. הזרע התאים NSCLC A549 בצלחת T25 ס מ2 הבקבוק/6/96 טוב בתקשורת DMEM/F12K בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (תרבות מדיה) בשכונה תרביות רקמה, דגירה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 מגשים תרביות רקמה.
  2. להשעות מחקה 143-מיר ו/או מיר-506, או לטרוף siRNA עם סוכן transfecting (2.4 µg של מיר, מעורבים עם 14 µL של סוכן transfecting; ראה טבלה של חומרים) ב- µL 500 תקנים ומדיה 1.5 מ של סרום ושל תרופתיים התקשורת DMEM/F12K ריכוז miRNA הסופי של 100 ננומטר. כמות miRNA עשויים לדרוש אופטימיזציה על תאים שונים וריכוזי. גישות מתאימות כוללות תרביות של תאים תאים עם הגדלת ריכוזים של miRNA (קרי: 50-200 ננומטר) והערכה של ביטוי downregulation של הגנים של עניין.
  3. הסר תרבות המדיה של הבקבוק/צלחת, לשטוף פעם עם 1 x PBS.
  4. להוסיף miRNA/לטרוף-transfecting מתחמי הסוכן, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 6-אייץ ' (גודל הבקבוק מגדיר האחסון הדגירה שנוספו).
  5. החלף את המדיה 4 מ"ל של תרבות התקשורת, דגירה תאים עבור 24 שעות ביממה ו/או 48 שעות.
  6. קציר transfected תאים על-ידי trypsinization, על-ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA את הבקבוק2 ס מ לכל T25, תקופת דגירה של 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 3 מ"ל של תרבות התקשורת כדי לקצור את התאים. מקם את התוכן של כל הבקבוק לתוך צינור נפרדים, מסומן, 15 מ"ל. לעבוד בשכונה תרביות רקמה.
  7. צנטריפוגה ב x 751 g למשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
    הערה: נדרש משנה זהירות במהלך הסרת supernatant, כמו עצבנות של הצינור עלול לגרום לאובדן של תאים.
  8. להוסיף 2 מ"ל של 1 x PBS, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 751 g...
  9. חזור על שלבים 7 ו-8 פעם להסיר את עקבות של התקשורת ואת תגובת שיקוע.
    הערה: בשלב זה, צינורות מדגם שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס או יכול לשמש באופן מיידי.

2. RNA החילוץ

  1. לנקות את אזור העבודה ע י ריסוס עם אלכוהול איזופרופיל 70%, RNAse טיהור פתרון.
  2. החילוץ-RNA צריכה להתבצע באמצעות של RNA המתאים קיט (ראה טבלה של חומרים).
  3. להסיר את הצינורות-80 ° C ולאפשר להם להפשיר. הוסף µL 300 של פירוק מאגר, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את קרום התא.
  4. הוסף אמצעי שווה של אתנול אולטרה טהור 100%.
  5. מערבבים היטב והניחו להפריד עמודה.
  6. צנטריפוגה בין 11 ל 16 x g עבור 30 s והסר הזרימה דרך.
  7. להוסיף 400 µL לרחוץ את המאגר, צנטריפוגה כדי להסיר את המאגר.
  8. להוסיף 5 µL של DNAse אני עם 75 µL של ה-DNA עיכול מאגר בכל מדגם, תקופת דגירה של 15 דקות.
  9. לשטוף את הדגימה. עם 400 µL מאגר ההכנה RNA.
  10. לשטוף 2 x עם מאגר שטיפת RNA.
  11. להוסיף מים נטולי נוקלאז העמודה, צנטריפוגה, ואז לאסוף את הרנ א.
  12. למדוד ריכוז ה-RNA מוחלט עם ספקטרופוטומטרים UV.

3. RT-qPCR

  1. לפני RT-qPCR, לסנתז את cDNA. מיד לאחר כימות ריכוז ה-RNA, מקום 1 µg של RNA אמצעי אחסון 20 µL הסופי של תגובה להכין cDNA צינור ה-PCR. תמיד לעבוד על ספסל נקי.
  2. כל המרכיבים הדרושים אחרים הכלולים בטבלה 1.
מרכיבים כמות (µL) / לטעום (20 µL)
מאסטר X cDNA 5 לערבב 4
dNTPs 2
Hexamers אקראי 1
RT משפר 1
אנזים פונה מיקס 1
DNase ומים חינם RNase כמות נדרשת לאחר הוספת ה-RNA כדי להפוך 20 µL

טבלה 1: חומרי cDNA סינתזה מדגימות רנ א. נדרש כמויות החומרים המתאימים כדי להכין תערובת בסיס דוגמא אחת של cDNA סינתזה.

  1. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים טמפרטורה: 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 4 ° C עד אוסף של דוגמאות.
  2. השתמש באופן מיידי ב- PCR רגיל או qPCR או לאחסן cDNA ב-20 ° C.
  3. להכין בפתרונות פריימר ואחורה DNase/RNase ללא מים-ריכוז של 10 מיקרומטר מהפתרון פריימר מניות.
  4. להכין נפרד מאסטר תערובות כל הגן להתגלות, לפי מספר דוגמאות. עבור כל דגימה cDNA (qPCR טוב), הכמות התגובה מוכן לפי טבלה 2.
מרכיבים כמות (µL) / לטעום (20 µL)
מיקס מאסטר SYBR 10
פריימר לפנים - 10 μM 2
פריימר הפוכה - 10 μM 2
DNase ומים חינם RNase 3
לדוגמה cDNA 3

בטבלה 2: חומרים עבור PCR כמותי בזמן אמת מדגימות cDNA. נדרשת כמות החומרים להכנת תערובת בסיס דוגמא אחת עבור qPCR.

  1. מקם כל מדגם הבארות בהתאמה.
  2. עיצוב פריסת הדגימה הצלחת 96 qPCR טוב. עבור כל דגימה ו ג'ין שנותחה, לבצע את התגובה ב- triplicates, או לפחות בתוך כפילויות.
  3. חותם את הצלחת היטב 96 עם מכסה שטיחות ברור דבק.
  4. מהיר-ספין הלוח כדי לאפשר את תערובת התגובה להגיע התחתון של כל טוב.
  5. הפעל RT-qPCR על פי מעבר הצבע תרמי הבאים:
    1) 50 º C למשך 2 דקות
    2) 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות
    3) 95 ° C 15 s
    4) לקחת את הקריאה
    5) 60 ° C עבור 1.5 דקות
    6) חזור על שלב 3 עבור 39 פעמים
  6. להפעיל מעבר הצבע תרמי הבאים המשכו של האמור לעיל כדי לקבוע את עקומת ההיתוך המציינת הגברה במוצר אחד.
    7) 65 מעלות צלזיוס למשך דקות 0.31
    8) +0.5 ° C/מחזור
    9) הצלחת לקרוא
    10) חוזר את שלב 8 פעמים 60 עד 95 ° C
    11) 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות

4. Agarose בג'ל כדי לאשר הגברה גנטי יחיד

  1. להכין.1% ג'ל agarose במאגר x TBE 1.
  2. להוסיף אתידיום ברומיד (EtBr) בג'ל חם (~ 50 ° C) עד להשגת ריכוז סופי של-0.2-0.5 µg/mL. EtBR נקשר עם ה-DNA ומאפשרת ניתן לאבחן תחת אולטרא סגול ב- imager ג'ל.
  3. יוצקים חם ג'ל מגש ג'ל שסופק עם קופסת ג'ל אלקטרופורזה. לצרף את המסרק שסופקו בחוזקה. למעיינות אחיד.
  4. לאפשר את הג'ל לנוח וקריר לטמפרטורת החדר (RT) ~ 30 דקות.
  5. כאשר הג'ל הוא פני השטח למוצק, למקם את ג'ל ומגש בתיבת ג'ל.
  6. למלא את תיבת ג'ל עם מאגר x TBE 1 עד הג'ל מכוסה לגמרי.
  7. למדוד את הריכוז של ה-DNA מתהליך הגברה PCR באמצעות ספקטרומטר של UV.
  8. קח ~ 15 ng של ה-DNA בשפופרת קטנה PCR, הוסף 5 µL של צבע, והוסף את הכמות הנדרשת של נוקלאז ללא מים כדי להשיג את הנפח הכולל 15 µL.
  9. לטעון את סולם הדנ א ודוגמאות לתוך הבארות.
  10. להפעיל את הג'ל ב- 100 וולט עד קו צבע הוא כ 75% - 80% למטה הג'ל.
    הערה: ודא שהג'ל מקשר בין שלילי מטען חיובי.
  11. להסיר את הג'ל ולמקם אותו םלצה ג'ל כדי להמחיש את הדנ א.

5. מחזור התא ניתוח

  1. זרע 5 x 105 תאים עבור כל דגימה בבקבוקון2 ס מ T25 ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, ואז לקצור את התאים על ידי trypsinization.
  3. להעביר את המתלים תא צינורות סטרילי 15 מ"ל, לתייג אותם כראוי.
  4. צנטריפוגה דגימות ב x 751 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. חזור על השלב כביסה עם PBS 1 x כדי להסיר מדיה שיורית.
  7. Resuspend ולשבור את צניפה על-ידי הוספת µL 200 ל- PBS קר כקרח 1 x על-ידי pipetting.
  8. לתקן את התאים על-ידי הוספת 2 מ"ל אתנול 70% קר כקרח dropwise הצינור תוך vortexing בעדינות.
  9. דגירה צינורות במשך 30 דקות ב- RT ולמקם את הצינורות ב 4 ° C עבור 1 h.
  10. הסר צינורות 4 ° C ו צנטריפוגה ב 751 x g למשך 5 דקות.
  11. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  12. להוסיף 500 µL ל- PBS x 1 עם propidium יודיד (50 µg/mL), ribonuclease (200 µg/mL)
  13. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT תוך הגנה על הדגימות מפני אור.
  14. רוכשים נתונים על זרימה cytometer. השתמש קדימה לעומת הצד פיזור (FSC לעומת האס) כדי לבחור את האוכלוסייה העיקרית של תאים, למעט פסולת שבפינה השמאלית התחתונה של FSC לעומת האס צפיפות האשכולות העלילה ותא בראש הדף-צד ימין של העלילה צפיפות FSC לעומת האס.
  15. ניתוח נתונים עבור זיהוי של אוכלוסיות תאים לכל מחזור התא הבמה עם תוכנה מתאימה.

6. אפופטוזיס assay

  1. זרע 5 x 105 תאים עבור כל דגימה בבקבוקון2 ס מ T25 ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, לקצור את התאים על ידי trypsinization.
  3. להעביר את המתלים תא צינורות סטרילי 15 מ"ל, לתייג אותם כראוי.
  4. צנטריפוגה ב x 751 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. חזור על השלב כביסה עם PBS 1 x כדי להסיר מדיה שיורית.
  7. לדלל 10 x מאגר איגוד Annexin V ל- x 1 עם קרח dH2O.
  8. להוסיף 1 מ"ל של 1 x מאגר Annexin V מחייב כל שפופרת הדגימה, resuspend בעדינות.
  9. מקום 96 µL של הבולם תא צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  10. להוסיף הצינור המכיל התליה תא µL 1 של המספר המשלים Annexin V-FITC ו- 12.5 µL של propidium יודיד (PI).
  11. דגירה התליה תא 10 דקות על קרח בחושך.
  12. להוסיף 250 µL קר כקרח 1 x Annexin V איגוד מאגר כל שפופרת הדגימה כדי לדלל.
  13. לנתח דגימות עם זרימה cytometer מיד.

7. חלבון ביטוי על ידי נוגדנים מחזור התא microarray

  1. זרע 5 x 105 תאים לכל אחד לטעום ב- T25 ס מ2 מבחנות ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, קציר תאים על-ידי trypsinization.
  3. תא המתלים להעביר צינורות 15 מ"ל, לתייג אותם בהתאם.
  4. צנטריפוגה ב x 751 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 2 מ של PBS קר כקרח 1 x, מערבולת, צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. חזור על השלב כביסה עם 1 x PBS.
  7. להוסיף 150 µL מאגר פירוק בתוספת מעכבי פרוטאז. Pipet למעלה ולמטה בעדינות כדי לשבש את קרום התא.
  8. כדי למנוע כל הפרעה מאגר של פירוק, לבצע החלפת המאגר כדי להחליף את המאגר פירוק מאגר תיוג, תוך שימוש בעמודות החלפת ממס של היצרן.
  9. לכמת את החלבון הכולל עם וזמינותו BCA.
  10. לקחת µg 70 מדגם חלבונים ולהוסיף מאגר תיוג כדי להשיג נפח סופי של 75 µL.
  11. להוסיף 100 µL של dimethylformamide (DMF) 1 מ ג של ביוטין ריאגנט (ביוטין/DMF).
  12. להוסיף 3 µL של ביוטין/DMF כל מדגם חלבון (חלבון biotinylated לדוגמה), תקופת דגירה של 2 h-RT.
  13. להוסיף µL 35 של ריאגנט stop ושילוב באמצעות vortexing.
  14. דגירה בדגימות ב RT למשך 30 דקות.
  15. הסר את השקופיות microarray מהמקרר כך הם מחממים ל RT לשעה לפני השימוש.
  16. לבצע חסימת לכריכה שאינם ספציפיים על-ידי המקננת השקופיות עם חלב יבש 3% פתרון (ריאגנט חסימה המסופקים על ידי היצרן) בצלחת פטרי ברעידות רציף למשך 45 דקות ב- RT.
  17. לשטוף את השקופיות במים2O ddH (אלא אם צוין אחרת, כביסה לוקח מקום ב- ddH2O).
  18. חזור על השלב כביסה ~ 10 x כדי להסיר לחלוטין את הפתרון חסימה של משטחים שקופיות. זה חשוב להשיג רקע אחיד ונמוך.
  19. הסר מים מופרזת משטחים שקופית והמשך לשלב הבא בלי לתת את השקופיות יבש.
  20. להכין פתרון צימוד על ידי המסת חלב יבש 3% בריאגנט צימוד.
  21. להוסיף 6 מ של הפתרון צימוד וכדי כמות מלאה של המדגם חלבון biotinylated בעבר מוכן מהשלב 7.12.
  22. שקופית אחת את המקום היטב אחד של התא צימוד שסופקו על-ידי הספק ולהוסיף ~ 6 מ"ל של חלבון צימוד לערבב את זה.
    הערה: ודא כי השקופית לגמרי שקוע חלבון צימוד תמהיל פתרון.
  23. מכסה תא צימוד, תקופת דגירה של 2 h ב- RT עם עצבנות מתמדת שייקר מסלולית.
  24. להעביר את השקופיות צלחת פטרי, להוסיף 30 מ של 1 x שטיפה מאגר. מניחים על צלחת פטרי תפקודי לב / נשימה, לנענע 10 דקות, ולמחוק את הפתרון.
  25. חזור על שלב 7.24 2 x.
  26. לשטוף את השקופיות במים2O ddH בהרחבה כפי שתואר בשלבים 7.17 ו- 7.18 והמשך לשלב הבא מיד כדי למנוע ייבוש.
  27. להוסיף 30 µL של Cy3-streptavidin (0.5 מ"ג/מ"ל) ב- 30 מ של מאגר זיהוי.
  28. מקם את השקופית בצלוחית ולהוסיף 30 מ של גילוי מאגר המכיל Cy3-streptavidin.
  29. דגירה שייקר מסלולית כעשרים דקות עם רציף רועד מוגנים מפני אור.
    הערה: Cy-3 הוא הפלורסנט. לכסות ברדיד אלומיניום או לפעול בתנאים כהה כדי לשמור על עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
  30. בצע שלבים 7.24-7.26 ולאפשר את השקופית לייבש בעזרת זרם עדין של אוויר או הנחת השקופית צינור חרוטי 50 מ ל, צנטריפוגה ב 1300 x g למשך 5-10 דקות.
  31. מקם את השקופית מחזיק שקופיות ומכסים ברדיד אלומיניום.
  32. סרוק את השקופית סורק microarray עם אורכי הגל המתאימים עירור, פליטה. במקרה של Cy3, הפסגה אורך גל עירור היא בשיא ~ 550 ננומטר, פליטה-~ 570 ננומטר.
  33. לנתח את הנתונים (ראה טבלה של חומרים) עבור התוכנה ששימשה).

8. רצפי הרנ א

  1. זרע 5 x 105 תאים לכל אחד לטעום ב- T25 ס מ2 מבחנות ולבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
  2. לאחר 24 שעות, 48 שעות, לקצור את התאים על ידי trypsinization.
  3. להעביר את המתלים תא צינורות 15 מ"ל, לתייג אותם בהתאם.
  4. תמצית ה-RNA לפי סעיף 2, השלבים 1-6.
  5. בדוק RNA איכות, כמו גם ריכוז עם bioanalyzer. RNA ניקוד (RIN) מעל שמונה ובטחונו המתאים היסטוגרמות נחוצים לאשר את איכות ה-RNA.
  6. מ- RNA הכולל, להשתמש µg ~ 2 המדגם RNA רצף (RNA שליח מן הרנ א סה כ)
  7. ברצף של הדור הבא (sequencer)11.
  8. בניהול איכות זמירה, מפה עם גנום הפניה מקבצים FASTQ המופקים את הרנ א רצף מכונת11.
  9. להעלות קבצים FASTQ וקריאה raw הנתונים הרוזן Genebank, ביצוע ההוראות של < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> באתר.
    הערה: ראה מספר גישה SRP133420 עבור תוצאות קודמות.

9. צינור היווצרות assay

  1. להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של miRNA-transfected יפתור תאי אנדותל (HUVECs) 36 h שלאחר תרביות תאים, כמתואר בסעיף 1, צעדים 1-5, באמצעות תאים HUVEC במקום A549 תאים.
  2. ברעב HUVECs עם M199 מדיה רעב במשך 4 שעות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  3. הסר מטריצה של קרום המרתף פקטורי גדילה מופחת מ-80 מעלות צלזיוס ו החנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ומאפשר מפשיר הדרגתית למנוע היווצרות בועה הפילמור.
  4. לאט ובזהירות מעיל בארות של צלחת טוב 96 עם 0.04 מ של מטריצה קרום המרתף מופחת גורם גדילה, הימנעות היווצרות בועה. בצע את ההליך כולו תחת תא למינארי.
  5. למלא הבארות הסמוכים של צלחת טוב 96 0.1 מ"ל של PBS כדי לשמור על לחות ולשמר את הטמפרטורה.
  6. דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 20 דקות כך פלמור של קרום המרתף תמצית מושגת. לא תקופת דגירה של יותר מ 1 h.
  7. Trypsinize HUVECs transfected מכל קבוצה, resuspend ב M199 בינוני-ריכוז של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל....
  8. להוסיף 0.1 מ"ל של השעיה תא כל הבארות המכיל polymerized קרום המרתף מטריקס בצלחת טוב 96.
  9. דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 ° C עם 5% CO2 בזמן ההכנה של גורמי גדילה מתקיים. הכנה של גורמי גדילה מתקיים גם מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית.
  10. לשקם גורמי גדילה (VEGF) 2 x הריכוז הסופי הרצוי (4 ננוגרם למ"ל ריכוז 2 ריכוז סופי ng/mL) ולהוסיף 0.1 מ"ל המכיל גורם הגדילה M199 רעב בינוני מעל mL 0.1 M199 רעב בינוני עם התאים. שאינם מטופלים VEGF וולס, הוסיפו 0.1 מ"ל M199 רעב בינוני מעל mL 0.1 M199 רעב בינוני עם התאים.
  11. דגירה את הצלחת היטב 96 עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2.
  12. בסוף תקופת הדגירה, להשיג כמה תמונות של כל טוב עם 4 x הגדלה, באמצעות מיקרוסקופ brightfield מחובר באמצעות מצלמה דיגיטלית.
  13. לעיבוד תמונות בעזרת תוכנת מצויד עם יישום plug-in "מנתח אנגיוגנזה"19. השתמש שלושה פרמטרים, מספר הצמתים, מספר צמתים, וכן נבט סה כ אורך, כדי להשוות את ההשפעות של טיפול miRNA על אנגיוגנזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח ביטוי גנטי באמצעות RT-qPCR וג'ל אלקטרופורזה

ניתוח ביטוי גנטי דיפרנציאלי באמצעות RT-qPCR הפגינו משמעותית downregulation של גנים יישוב CDK1, CDK4 ו- CDK6. CDK1 ו- CDK4/6 הראו להם להיות אינסטרומנטלי G2/M ומעברים G1/S, בהתאמה. בביצוע ניתוח מותר השוואה ישירה בין מירס בודדים ופעילות מיר קומבינטורית. השימוש של siRNA לטרוף עם הסוכן transfecting מותר הערכה של הפרעות ההליך ב זוהה הגן downregulation, אשר היה מינימלי. הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות דו-זנבית של סטודנט t-לבדוק, וp < 0.05 נחשב סטטיסטית (איור 1). לפני qPCR, רצפי פריימר הוערכו באמצעות פריימר-הפיצוץ < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> עבור הגברה גן בודד. זה אושר גם על ידי ניתוח של מוצרי הגברה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. להקה אחת של מוצרי ה-DNA זוהה עבור כל ג'ין שנותחה (איור 1D), המאשר הגברה גן בודד. CDK6 הגברה יחיד היה אישר (נתונים לא מוצג).

Figure 1
איור 1 : הביטוי היחסי של הגנים CDK1, CDK4 ו- CDK6 כפי שזוהה על-ידי qPCR, וניתוח ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי הגברה דנ א. תרביות תאים 143-מיר ומיר-506 של תאים A549 המושרה downregulation של downregulation CDK1 (א) CDK4 (B), CDK6 (ג) 24 שעות ביממה, תרביות תאים לאחר 48 שעות. מוצרי הגברה DNA הוערכו על ידי אלקטרופורזה בג'ל (D) כדי לאשר הגברה גן בודד. GAPDH שימש הפניה ג'ין. הממוצע ± SEM, * p < 0.05; * * p < 0.01, דו-זנבית t-מבחן. דמות זו שונתה מ et al. Hossian11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

התפלגות מחזור התא באמצעות cytometry זרימה

Propidium יודיד מכתים של חומצות גרעין הסלולר היא שיטה סטנדרטית כדי להמחיש את אוכלוסיית תאים בשלבים שונים של מחזור התא על ידי כימות של תוכן ה-DNA. לטיפול קומבינטורית 143-מיר מיר-506 עצר את מחזור התא בשני מחסומים, G0/G1 ו G2/M, כפי שמצוין באמצעות ניתוח תזרים cytometric (איור 2).

Figure 2
איור 2 : ניתוח מחזור התא של תאי A549 transfected עם 143-מיר ומיר-506 24 שעות ביממה, תרביות תאים לאחר 48 שעות. תא אחוזים אוכלוסיות של כל מחזור התא נקבעו על ידי cytometry זרימה ו- DNA מחייב propidium יודיד. הממוצע ± ב- SEM. איור זה מודפס עם שינויים מ et al. Hossian11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Annexin V/PI אפופטוזיס assay מאת cytometry זרימה

בעקבות תרביות תאים תאים A549 עם 143-מיר, מיר-506, וזמינותו אפופטוזיס בוצעה באמצעות Annexin V ו- PI cytometry מכתים וזרימה. זה זוהה כי הטיפול קומבינטורית המושרה משמעותי אפופטוזיס-timepoints 24 שעות ביממה ו- 48 h. לעומת הפקדים שלילי, אחוז השינוי של מוות תאים נקבע כפי שזוהה על-ידי תאי חיובי Annexin V, עקב טיפול מיר כפי שהוצג באיור3.

Figure 3
איור 3 : ניתוח המחשה של מוות תאים. חיתוך עם 143-מיר, מיר-506 גדל אחוז Annexin V תאים A549 חיובי. הממוצע ± ב- SEM * p < 0.05, * * p < 0.01, דו-זנבית t-מבחן. דמות זו שונתה מ et al. Hossian11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מחזור התא נוגדן microarray

ניתן לזהות תגובות מכניסטית טיפול באמצעות שינויים בביטוי חלבונים. ביטוי דיפרנציאלי הוערך ברמת חלבון של גנים הקשורים מסלול מחזור התא באמצעות microarray של נוגדנים ספציפיים מסלול. תמציות חלבונים שימשו לצורך ניתוח מתאי transfected עם מיר-143/506. הניתוח microarray המותר לניתוח כמותי למחצה של חלבונים הקשורים מחזור התא ~ 60, עם משכפל 6 עבור כל נוגדן ספציפי. הגישה מאפשרת נקודת מבט רחבה יותר של התנהגות מכניסטית בתוך מסלול ספציפי, זיהוי של מטרות מולקולריות להערכה נוספת ולאחר ביצוע של ניתוח ברמת post-translational. בשל העיקרון הכמותיים למחצה של השיטה, יש תוצאות על גנים ספציפיים צריך לאשר דרך סופג המערבי. . Indicatively, בניתוח הזה התגלה ביטוי ירידה של חלבונים הקשורים עם התקדמות מחזור התא. זה כלל את CDK1 ואת CDK4 יישוב-24 שעות ביממה וגם תקנים שאחרי 48 שעות (איור 4A), כפי שזוהו על-ידי qPCR.

Figure 4
איור 4 : ג'ין dysregulation כפי שזוהה על-ידי microarray וניתוח רצפי הרנ א. (א) Heatmap של מחזור התא ביטויים של גנים מסלול כפי שזוהה על-ידי ניתוח microarray חלבון מחלצת A549 תאים transfected עם 143-מיר ומיר-506, 24 שעות ביממה, תרביות תאים לאחר 48 שעות. (ב) לקפל שינוי של מחזור התא לשביל ג'ין ביטויים מתאי A549 transfected עם 143-מיר ומיר-506-24 שעות לאחר תקנים כפי שזוהה על-ידי רצפי RNA. (ג) מסלול פעילות כפי נותחו על ידי מסלול ניתוח תוכנה מנתונים המתקבלים רצפי RNA. איור זה שונה מ- Hossian et al. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

רצפי RNA ניתוח מסלול באמצעות תוכנת ניתוח מסלול

הדור הבא רצפי במדויק מנתחת ביטוי גנים ברמת ה-RNA. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים גנים מרובים באמצעות ניתוח יחיד (ב פרוטוקול זה, הניתוח זיהה את הביטוי של > גנים 18,000). עקב מספר רב של גנים שאותרו, ביואינפורמטיקה ניתוח שימש לקביעת יעיל של מסלול התנהגות (איור 4B). תוכנה שימש אז (ראה טבלה של חומרים) לחזות מעצרים שלב G1/S ו G2/M, את downregulation של S שלב החניכה (איור 4C). יתר על כן, ניתן להשוות את התוצאות רצפי RNA qPCR נתונים. במחקר זה, רצף הרנ א אישר את הממצאים מהניתוח qPCR, המציין את downregulation של CDK1 (48%, p < 0.001, פד ר < 0.001), CDK4 (68%, p < 0.001, פד ר < 0.001), ו- CDK6 (71%, < 0.001, פד ר < 0.001) בשל 143-מיר קומבינטורית ופעילות מיר-506. ניתוח סטטיסטי בוצעה על ידי תוכנת EdgeR משמש חישובי בביטוי הגן היחסי, חישוב ערכים p באמצעות בינומית שלילית20,21. ניתן לבצע ניתוח ביואינפורמטיקה להערכה תפקודית של פעילות miRNA, חיזוי של מטרות מולקולריות פוטנציאליים, כמופיע באיור5.

Figure 5
איור 5 : מסלול המחשה וניתוח מכניסטית כפי שהוצגו על ידי מסלול ניתוח aoftware. RNA רצף הנתונים נותחו מתאי A549 transfected עם תרביות פוסט-תאים 143-מיר ומיר-506, 24 שעות ביממה, באמצעות מסלול ניתוח תוכנה מסלולים הקנוני מזוהה עם הציון הנמוך ביותר (א) או הגבוה ביותר (ב) הפעלת. התוכנה גם סיפק החזוי פונקציות (C), נגד הזרם הרגולטורים/מטרות אפשריות (D). איור זה מודפס של Hossian et al. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

צינור אנדותל היווצרות assay

וזמינותו היווצרות צינור אנדותל במבחנה נעשה שימוש נרחב ללמוד אנגיוגנזה, והוא אמין, אוטומטית, הניתנת לכימות22. כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) הוא האנגיוגנזה ידועים פקטורי גדילה23,24 , יזם הקמת צינור אנדותל. במחקר זה, היא זוהתה לטיפול קומבינטורית 143-מיר מיר-506 abrogates הנוצרות על-ידי VEGF אנגיוגנזה. תמונות מעיד על היווצרות שפופרת ואת ההשפעות של טיפול מוצגים באיור 6.

Figure 6
איור 6 : להחליפן בתמונות של נבטים אנדותל של VEGF שטופלו לעומת HUVECs שאינם מטופלים transfected עם miRNA לטרוף, miRNA-143, miRNA-506 או שילוב שלהם. תמונות התקבלו תחת מיקרוסקופ brightfield מצויד with a מצלמה דיגיטלית מתחת לגיל 4 x הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNAs יכול לפעול טיפולים ממוקדים לטיפול בסרטן, לזהות את dysregulation של רמות ביטוי נגועים לעומת רקמות רגילה. מחקר זה שמטרתה לקבוע miRNAs זה פוטנציאל לעצור את מחזור התא התקדמות בשלבים מרובים. זה זוהה 143-מיר ומיר-506 לעצור את מחזור התא של תאים סרטניים, ואת הפרוטוקולים הציג שמטרתם להבין את הפעילות של טיפול זה miRNA קומבינטורית.

למתודולוגיות שתואר לספק הבנה העל על תפקיד miRNAs. האתגרים של הלומדים miRNAs משויכות היכולת שלהם היעד גנים מרובים, ובכך להשפיע על נתיבים מרובים. הניתוח מתואר qPCR מאפשר זיהוי של הביטוי של גנים ספציפיים של עניין, אם מטרות מוגדרות מזוהים לפני הטיפול. לדוגמה, כאן המוקד העיקרי היה הביטוי של CDK1 ו- CDK4/6 ומחזור התא.

לפיכך, ניתוח מחזור התא באמצעות פרוטוקול יודיד propidium cytometry זרימה היא גישה אמין כדי לזהות שינויים באוכלוסיות תא על-פי שלהם שלב במחזור התא. השיטה מסתמכת על העלייה מידתית של קרינה פלואורסצנטית אות על ידי החוקר, אשר נקשר ל- DNA, המתאימים לשלב של מחזור התא. בקצרה, תאים בשלב S לסנתז DNA, גרימת אותות גבוה יותר מאשר תאים בשלב G0/G1, ותאים בשלב G2 יש לשכפל את הדנ א שלהם, הפקת האות האינטנסיבי ביותר.

לצבירת ראיות מציין את החיבור של נזק מחזור התא, ומפעילה של אפופטוזיס25. השיטה cytometry זרימה באמצעות Annexin השישי/PI בעקביות שימש לצורך זיהוי המושרה אפופטוזיס בתאים טיפול כימותרפיה. Indicatively, תגובה חזקה אפופטוטיים להיפגע זוהה עקב הטיפול miRNA קומבינטורית, שהיה חזק יותר בהשוואה את miRNAs בודדים.

Microarray נוגדן חלבון חצי כמותית היא שיטה רגישה ואמינה לזיהוי החלבון ביטוי שינויים הקשורים ספציפית תגובות ביולוגיות26,27. פרוטוקול זה משמש microarray נוגדן ספציפי מסלול של מחזור התא, אשר זוהה שינויים בביטוי הגנים ~ 60 בין תאים טיפול ללא טיפול. במהלך השלבים כביסה כדי להבטיח כי התהליך בוצעה ביסודיות וכדי למזער את האות רקע נדרש משנה זהירות. בנוסף, השקופיות שלא יהפוך יבש עד לסיום הניסוי.

לעומת זאת, רצפי RNA מספק ניתוח כמותי גנטי ביטויים של גנים מרובים, ברמת שלאחר שעתוק. מספר גדול באופן משמעותי של גנים שנותחה (> 18,000 עבור ה-RNA-seq לעומת 60 microarray) מאפשרת ניתוח בו זמנית במספר משעולים, מטרות מולקולריות, ועם דיוק רב יותר. ניתוח רחב כל כך חשוב, כמו miRNA יחיד ניתן לאגד, מטרה mRNAs שונים. לעומת זאת, ניתוח מסלול של מספרים גדולים של ג'ין dysregulations הוא מטבעו מאתגר. לדוגמה, אף על פי רצף הרנ א אישר את הנתונים qPCR שלנו בנוגע downregulation CDK1 ו- CDK4/6 עקב טיפול miRNA, הניתוח גם סיפק נתונים על אלפי גנים היו גם מטה- או מוסדר למעלה. כדי לספק הקשר כדי dysregulations גנים רבים כאלה, מסלול ניתוח תוכנה שימש לקביעת הכולל אפקטים של הטיפול על מסלול שונה, תאיים. . Indicatively, התוכנה מסופקת ציונים לנציג הפעלה (ציון z חיובי) או איון (ציון z שלילי) של פונקציות ספציפיות או מסלולים, כמו גם מובהקות סטטיסטית של ניתוח (איור 5)28.

לסיכום, המחקר של פעילות miRNA הוא תהליך מאתגר. הקיבולת הטבועה של miRNAs להשפיע על גנים מרובים דורשת הניצול של מספר משוכלל ומורכב שיטות אנליטיות כדי לזהות פעילות פוטנציאליות. באופן לא מפתיע, עבודה נוספת נדרש כדי להבין באופן מלא את פעילותם של 143-מיר ומיר-506 של סרטן ריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים, הייתי רוצה להכיר את ג'ון Caskey באוניברסיטת לואיזיאנה סטייט לסיוע שלו על ניתוח מסלול של הנתונים רצפי RNA, של אוניברסיטת טקסס Southwestern Medical Center, מק'דרמט הבא הדור רצף הליבה המרכזית עבור מבצע את רצפי RNA וניתוח נתונים. מחקר זה נתמך על ידי המכללה לרוקחות, אוניברסיטת לואיזיאנה מונרו סטארט-אפ מימון במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך המכון הלאומי של כללי רפואי מדעי מענקים 5 P20 GM103424-15, GM103424 P20 3-15S1....

Acknowledgments

אין ניגודי עניינים מוצהרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21 (2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).

Tags

חקר הסרטן גיליון 145 תרביות תאים miRNA סרטן ריאות מחזור התא אפופטוזיס אנגיוגנזה רצפי RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter