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Cancer Research

कोशिका चक्र और वाहिकजनन को विनियमित करने के लिए Combinatorial मिर्ना उपचार का विश्लेषण

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

मिरना चिकित्सा विज्ञान कैंसर प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण क्षमता है । यहां प्रदर्शित विश्लेषणात्मक सेल चक्र और angiogenesis रोकने में एक मिश्रित मिरना उपचार की गतिविधि की पहचान के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण हैं ।

Abstract

फेफड़ों का कैंसर (LC) दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण है । अन्य कैंसर कोशिकाओं के समान, नियंत्रण रेखा कोशिकाओं की एक बुनियादी विशेषता अनियमित प्रसार और कोशिका विभाजन है. सेल चक्र प्रगति रोक द्वारा प्रसार के निषेध को कैंसर के इलाज के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण, नियंत्रण रेखा सहित दिखाया गया है ।

miRNA चिकित्सा विज्ञान के रूप में महत्वपूर्ण पोस्ट-transअपंग जीन नियामकों उभरा है और तेजी से कैंसर के इलाज में उपयोग के लिए अध्ययन किया जा रहा है । हाल के काम में, हम दो मिरनास, मीर-१४३ और मीर-५०६ का उपयोग किया, सेल चक्र प्रगति को विनियमित करने के लिए । A549 गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (nsclc) कोशिकाओं transfected थे, जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का विश्लेषण किया गया, और अपोप्तोटिक उपचार के कारण गतिविधि अंत में विश्लेषण किया गया । (CDK1, CDK4 और CDK6), और जी1/एस और जी2/एम चरण संक्रमण पर सेल चक्र रोक दिया गया था, cyclin-आश्रित kinases (CDKs) के डाउनरेगुलेशन का पता लगाया गया था । मार्ग विश्लेषण में उपचार के संभावित antiangiogenic गतिविधि, जो बहुआयामी गतिविधि के साथ दृष्टिकोण endows संकेत दिया । यहां, वर्णित करने के लिए सेल चक्र निषेध के बारे में मिरना गतिविधि की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं, apoptosis के प्रेरण, और एन्डोजेनेसिस की निषेध द्वारा endothelial कोशिकाओं पर उपचार के प्रभाव । यह आशा की जाती है कि यहां प्रस्तुत तरीकों miRNA चिकित्सा विज्ञान और इसी गतिविधि पर भविष्य के अनुसंधान का समर्थन करेंगे और कि प्रतिनिधि डेटा प्रयोगात्मक विश्लेषण के दौरान अंय शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन करेंगे ।

Introduction

सेल चक्र कई नियामक घटनाओं का संयोजन है जो मिटिक प्रक्रिया1के माध्यम से डीएनए और कोशिका प्रसार के दोहराव की अनुमति देते हैं । Cyclin-निर्भर kinases (CDKs) को विनियमित और सेल चक्र को बढ़ावा देने के2। उनमें से एक है, मिटिक cdk (CDK1) और अंतरावस्था cdk (CDK2, CDK4, और CDK6) सेल चक्र प्रगति3में एक निर्णायक भूमिका है । रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (आरबी) CDK4/CDK6 परिसर द्वारा फॉस्फोरिलेटेड कोशिका चक्र प्रगति4की अनुमति है, और CDK1 सक्रियण सफल सेल प्रभाग5के लिए आवश्यक है । पिछले कुछ दशकों के दौरान नैदानिक परीक्षणों में अनेक CDK अवरोधकों का विकास और मूल्यांकन किया गया है, जो कैंसर के उपचार में Cdk को लक्षित करने की क्षमता दर्शाते हैं । वास्तव में, हाल ही में6,7,8,9,10स्तन कैंसर के उपचार के लिए तीन cdk अवरोधकों को अनुमोदित किया गया है । इस प्रकार, CDKs, और विशेष रूप से, CDK1 और CDK4/6, कैंसर सेल प्रगति को विनियमित करने में बहुत रुचि के हैं ।

मिरनास (Mirnas) छोटे हैं, गैर कोडिंग RNAs और पोस्ट-जीन अभिव्यक्ति के transअपंग नियामकों, सभी मानव जीन11के लगभग 30% को विनियमित । उनकी गतिविधि शोधों दमन या दूत rnas के क्षरण पर आधारित है (mrnas)12। उनके जैविक महत्व के तराने ५,००० से अधिक मिर्नाओं की पहचान की गई है और एक भी मिर्ना अणु कई जीन11,13को विनियमित कर सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि मिरना एक्सप्रेशन13कैंसर सहित विभिन्न रोगों और रोग स्थितियों से जुड़ा हुआ है । वास्तव में, मिरनास अर्बुदीय या ट्यूमर दमन के रूप में विशेषता है, या तो बढ़ावा देने या ट्यूमर के विकास और14प्रगति को दबाने में सक्षम किया जा रहा है,15। रोगग्रस्त ऊतकों में मिरनास की सापेक्ष अभिव्यक्ति रोग प्रगति को विनियमित कर सकते हैं; इस प्रकार, मिरनास के बहिर्जात प्रसव चिकित्सकीय क्षमता है ।

फेफड़ों के कैंसर कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण है और सभी फेफड़ों द्रोह के ६०% से अधिक है गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर16,17, एक 5 साल से कम 20%18की जीवित रहने की दर के साथ । मीर-143-3p और मीर-506-3p का उपयोग हाल ही में फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं11में सेल चक्र को लक्षित करने के लिए मूल्यांकन किया गया था । मीर-१४३ और मीर-५०६ का अनुक्रम है कि CDK1 और CDK4/CDK6 के पूरक हैं, और A549 कोशिकाओं पर इन दो miRs के प्रभाव का विश्लेषण किया गया । प्रयोगात्मक विवरण प्रस्तुत कर रहे है और इस पत्र में चर्चा की । जीन अभिव्यक्ति, कोशिका चक्र प्रगति, और apoptosis विभिंन प्रायोगिक डिजाइन और transfection निंनलिखित timepoints का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । हम विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए microarray विश्लेषण के साथ वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) तरीकों का इस्तेमाल किया, और अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण वैश्विक जीन dysregulation11निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता था । उत्तरार्द्ध विधि उच्च संवेदनशीलता और reproducibility के साथ प्रत्येक जीन की प्रतिलिपि के सापेक्ष बहुतायत की पहचान है, जबकि जीन के हजारों एक प्रायोगिक विश्लेषण से विश्लेषण किया जा सकता है । साथ ही, मिरना उपचार के कारण अपोप्टोटिक विश्लेषण किया गया था और यहां वर्णित है । जैव सूचना विज्ञान ने मार्ग विश्लेषण को पूरक किया । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मिश्रित मीर-१४३ और मीर-५०६ की चिकित्सकीय क्षमता के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य कोशिकाओं में मिर्नास के प्रभाव की पहचान करने के लिए, सेल चक्र पर ध्यान देने के साथ है । तकनीक की विविधता यहां प्रस्तुत जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पूर्व अनुवाद (qPCR का उपयोग करके) प्रोटीन स्तर पर जीन विश्लेषण के लिए विस्तृत और उपंयास तकनीकों के लिए, जैसे microarray विश्लेषण के रूप में । यह आशा की जाती है कि यह रिपोर्ट मिरनास के साथ काम करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए मददगार है । इसके अतिरिक्त, कोशिका चक्र के प्रवाह cytometric विश्लेषण और कोशिकाओं के apoptosis के लिए पद्धति प्रस्तुत की है ।

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Protocol

1. मीर-१४३ और मीर-५०६ ट्रांसफेक्शन

चेतावनी: उपयोग लेटेक्स दस्ताने, सुरक्षात्मक चश्मा, और एक प्रयोगशाला कोट के दौरान वर्णित प्रयोगों प्रदर्शन । जब आवश्यक हो, पर कैबिनेट के प्रशंसक के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करें, वायुमार्ग को अवरुद्ध या लैबिनार airflow परेशान बिना । हमेशा के लिए उपयुक्त ऊंचाई कांच की रक्षा खिड़की सेट, के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित है ।

  1. बीज NSCLC A549 कोशिकाओं में एक T25 cm2 flask/6/96 खैर थाली में DMEM/F12K मीडिया 10% fbs और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (संस्कृति मीडिया) में एक ऊतक संस्कृति हुड के साथ पूरक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते में 5% CO2 के साथ एक ऊतक संस्कृति इनयूबेटर में ।
  2. निलंबित मीर-१४३ और/या मीर-५०६ mimics, या transfecting एजेंट के साथ हाथापाई siRNA (मीर के २.४ μg transfecting एजेंट के 14 μL के साथ मिलाया गया; सामग्री की तालिकादेखें) transfecting मीडिया के ५०० μl में और सीरम और एंटीबायोटिक से मुक्त dmem/F12K मीडिया के एक १०० एनएम की अंतिम मिरना एकाग्रता । मिरना राशि विभिंन कोशिकाओं और सांद्रता पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । उपयुक्त दृष्टिकोण मिरना की सांद्रता बढ़ाने के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक शामिल है (यानी, 50-200 एनएम) और अभिव्यक्ति का मूल्यांकन ब्याज की जीन के downregulation ।
  3. flask/थाली से संस्कृति मीडिया निकालें और 1x PBS के साथ एक बार धो लें ।
  4. मिरना/हाथापाई-transfecting एजेंट परिसरों और 5% सह2 के लिए 6 एच के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते जोड़ें (flask आकार जोड़ा ऊष्मायन मात्रा को परिभाषित करता है) ।
  5. संस्कृति मीडिया के 4 मिलीलीटर और 24 एच और/या ४८ एच के लिए सेते कोशिकाओं के साथ मीडिया बदलें ।
  6. फसल trypsinization द्वारा transfected कोशिकाओं, प्रत्येक T25 cm2 flask में TRYPSIN-edta के 1 मिलीलीटर जोड़कर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए सेते, और संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए फसल कोशिकाओं । एक अलग, 15 मिलीलीटर ट्यूब के रूप में चिह्नित में प्रत्येक कुप्पी की सामग्री प्लेस । एक ऊतक संस्कृति हुड में काम करते हैं ।
  7. 5 मिनट के लिए ७५१ एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें ।
    नोट: supernatant हटाने के दौरान सावधानी की आवश्यकता है, के रूप में ट्यूब के आंदोलन कोशिकाओं के नुकसान का कारण हो सकता है ।
  8. ७५१ एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 1x PBS के 2 मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें ।
  9. मीडिया और सुपरनैंट के किसी भी अंश को हटाने के लिए 7 और 8 बार चरण दोहराएं ।
    नोट: इस स्तर पर, नमूना ट्यूबों-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. ७०% isopropyl अल्कोहल और rnase विसंदूषण समाधान के साथ छिड़काव द्वारा कार्य क्षेत्र को साफ करें ।
  2. आरएनए निष्कर्षण एक उचित RNA किट का उपयोग किया जाना चाहिए ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  3. से ट्यूबों निकालें-८० डिग्री सेल्सियस और उंहें गल अनुमति देते हैं । सेल झिल्ली को तोड़ने के लिए lysis बफर और पिपेट ऊपर और नीचे की ३०० μL जोड़ें ।
  4. १००% अल्ट्रा-शुद्ध इथेनॉल की एक बराबर मात्रा में जोड़ें ।
  5. अच्छी तरह मिलाएं और कॉलम को अलग करने में लगाएं ।
  6. 30 एस के लिए 11 और 16 x जी के बीच सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह के माध्यम से हटा दें ।
  7. बफर को हटाने के लिए ४०० μL धोने बफर और सेंट्रीफ्यूज के जोड़ें ।
  8. प्रत्येक नमूने में डीएनए पाचन बफर के ७५ μL के साथ मैं DNAse के 5 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए सेते ।
  9. RNA prep बफ़र के ४०० μL के साथ नमूना धो लें ।
  10. आरएनए वॉश बफर के साथ 2x धो लें ।
  11. कॉलम, सेंट्रीफ्यूज, तो आरएनए इकट्ठा करने के लिए नाभिक मुक्त पानी जोड़ें ।
  12. एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कुल आरएनए एकाग्रता को मापने ।

3. आरटी-qPCR

  1. RT-qPCR से पहले, cDNA संश्लेष्ट करें । आरएनए एकाग्रता परिमाणन के बाद, एक पीसीआर ट्यूब में cDNA तैयार करने के लिए प्रतिक्रिया की एक 20 μL अंतिम मात्रा में आरएनए के 1 μg जगह । हमेशा क्लीन बेंच पर काम करते हैं ।
  2. अन्य सभी आवश्यक सामग्री तालिका 1में शामिल हैं ।
सामग्री मात्रा (μL)/नमूना (20 μL)
5X cDNA मास्टर मिक्स 4
dNTPs 2
यादृच्छिक hexamers 1
RT बढ़ाने 1
वर्सो एंजाइम मिश्रण 1
दनासे और ऄनसे मुक्त पानी 20 μL बनाने के लिए आरएनए जोड़ने के बाद आवश्यक qty

तालिका 1: आरएनए नमूनों से cDNA संश्लेषण के लिए सामग्री । cDNA संश्लेषण के लिए एक नमूना के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए संबंधित अवयवों की आवश्यक मात्रा ।

  1. निम्नलिखित तापमान स्थितियों के साथ एक थर्मल cycler में सेते: 30 मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस; 4 ° c नमूनों का संग्रह तक.
  2. नियमित पीसीआर या qPCR में तुरंत का प्रयोग करें, या-20 डिग्री सेल्सियस पर cDNA स्टोर ।
  3. शेयर प्राइमर समाधान से 10 μM की एकाग्रता पर DNase/RNase मुक्त पानी के साथ आगे और रिवर्स प्राइमर समाधान तैयार करें ।
  4. नमूनों की संख्या के अनुसार, पता लगाया जा करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए अलग मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें । प्रत्येक cDNA नमूना (qPCR कूप) के लिए, अभिक्रिया मात्रा सारणी 2के अनुसार तैयार की जाती है ।
सामग्री मात्रा (μL)/नमूना (20 μL)
SYBR मास्टर मिक्स 10
फॉरवर्ड प्राइमर-10 μM 2
रिवर्स प्राइमर-10 μM 2
दनासे और ऄनसे मुक्त पानी 3
cDNA नमूना 3

तालिका 2: cDNA नमूनों से मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए सामग्री । qPCR के लिए एक नमूना के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए सामग्री की आवश्यक मात्रा ।

  1. प्रत्येक नमूने को संबंधित कुओं में रखें ।
  2. ९६ अच्छी तरह qPCR प्लेट के लिए नमूना लेआउट डिजाइन । प्रत्येक नमूने के लिए और विश्लेषण किया जीन, triplicates में प्रतिक्रिया प्रदर्शन, या कम से कम डुप्लिकेट में.
  3. एक ऑप्टिकली स्पष्ट चिपकने वाला कवर के साथ ९६ अच्छी तरह से थाली सील ।
  4. त्वरित-प्लेट स्पिन प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे तक पहुँचने की अनुमति.
  5. निम्न थर्मल ग्रेडिएंट के अनुसार RT-qPCR चलाएँ:
    1) 2 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस
    2) 2 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस
    3) ९५ ° c के लिए 15 s
    4) पढ़ ले
    5) ६० ° c के लिए १.५ मिनट
    6) ३९ बार के लिए चरण 3 दोहराएँ
  6. एक उत्पाद प्रवर्धन इंगित करता है जो पिघलने वक्र का निर्धारण करने के लिए ऊपर की निरंतरता में निम्नलिखित थर्मल ढाल चलाएँ.
    7) ६५ ° c के लिए ०.३१ मिनट
    8) + ०.५ ° c चक्र/
    9) थाली पढ़ें
    10) ६० बार के लिए कदम 8 ९५ ° c तक पहुंचने तक दोहराएं
    11) 2 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस

4. एकल जीन प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए एगेरोज़ जेल वैद्युतक

  1. 1x tbe बफर में 1% ऐगेरोस जेल तैयार करें ।
  2. इथिडियम ब्रोमाइड (EtBr) गर्म (~ ५० डिग्री सेल्सियस) जेल में लगभग 0.2-0.5 μg/मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने तक जोड़ें । etbr डीएनए के साथ बांधता और यह एक जेल imager में यूवी प्रकाश के तहत कल्पना होने की अनुमति देता है ।
  3. एक जेल ट्रे में गर्म जेल डालो एक ट्रो जेल बॉक्स के साथ आपूर्ति की । प्रदान की गई कंघी कसकर वर्दी कुओं के लिए देते हैं ।
  4. आराम करने के लिए जेल की अनुमति दें और कमरे के तापमान को शांत ~ 30 मिनट के लिए (आरटी) ।
  5. जब जेल जम जाता है तो जेल बॉक्स में जेल और ट्रे लगाएं ।
  6. जेल बॉक्स को 1x TBE बफर के साथ भरें जब तक जेल पूरी तरह से कवर किया है ।
  7. एक यूवी स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया से डीएनए की एकाग्रता को मापने.
  8. एक छोटी सी पीसीआर ट्यूब में डीएनए के ~ 15 एनजी लो, डाई के 5 μL जोड़ें, और एक 15 μL कुल मात्रा को प्राप्त करने के लिए nuclease मुक्त पानी की आवश्यक राशि जोड़ें ।
  9. डीएनए सीढ़ी और नमूनों को कुओं में लोड करें ।
  10. १०० वी पर जेल भागो जब तक डाई लाइन लगभग 75%-८०% नीचे जेल है ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि जेल सकारात्मक चार्ज करने के लिए एक नकारात्मक से चलाता है ।
  11. जेल निकालें और यह जेल इमेजर में जगह डीएनए कल्पना ।

5. सेल चक्र विश्लेषण

  1. बीज एक T25 cm2 कुप्पी में प्रत्येक नमूने के लिए 5 x 105 कोशिकाओं और एक अभिकर्मक करने के अनुसार प्रोटोकॉल अनुभाग 1 में वर्णित, कदम 1-5 ।
  2. 24 एच और ४८ एच के बाद, तो trypsinization द्वारा कोशिकाओं फसल ।
  3. सेल निलंबन 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और उन्हें ठीक से लेबल.
  4. 5 मिनट के लिए ७५१ x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने और supernatant त्यागने ।
  5. 2 मिलीलीटर बर्फ की ठंड 1x PBS, भंवर, और ७५१ x g पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए जोड़ें । अधिनतांत त्यागें ।
  6. दोहराएं 1x PBS के साथ धुलाई कदम अवशिष्ट मीडिया को दूर करने के लिए ।
  7. रीसपेंड और गोली को तोड़ने के २०० μL बर्फ के जोड़कर-ठंड 1x पीबीएस द्वारा pipetting.
  8. धीरे vortexing जबकि ट्यूब के लिए ७०% बर्फ के 2 मिलीलीटर ठंडा इथेनॉल बिंदुश: जोड़कर कोशिकाओं को ठीक ।
  9. आरटी में 30 मिनट के लिए इनसेबेट ट्यूब और 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों जगह ।
  10. 5 मिनट के लिए ७५१ x g पर 4 डिग्री सेल्सियस और सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों निकालें ।
  11. 2 मिलीलीटर बर्फ की ठंड 1x PBS, भंवर, और ७५१ x g पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए जोड़ें । अधिनतांत त्यागें ।
  12. प्रोपिडियम आयोडाइड (५० μg/mL) और राइबोन्यूक्लीस ए (२०० μg/एमएल) के साथ 1x PBS के ५०० μL जोड़ें
  13. आरटी में 30 मिनट के लिए इनसेबेट जबकि प्रकाश से नमूनों की रक्षा ।
  14. प्रवाह cytometer पर डेटा प्राप्त । आगे बनाम साइड स्कैटर (FSC vs. SSC) का उपयोग करें, fsc बनाम ssc घनत्व प्लॉट और FSC बनाम ssc घनत्व प्लॉट के शीर्ष-दाईं ओर शीर्ष पर कक्ष क्लस्टरों के नीचे बाएं कोने में मलबे को छोड़कर, कोशिकाओं की मुख्य आबादी का चयन करने के लिए ।
  15. उचित सॉफ्टवेयर के साथ सेल चक्र चरण प्रति सेल आबादी की पहचान के लिए डेटा का विश्लेषण ।

6. अपोप्टोसिस परख

  1. बीज एक T25 cm2 कुप्पी में प्रत्येक नमूने के लिए 5 x 105 कोशिकाओं और एक अभिकर्मक करने के अनुसार प्रोटोकॉल अनुभाग 1 में वर्णित, कदम 1-5 ।
  2. 24 के बाद एच और ४८ एच, फसल trypsinization द्वारा कोशिकाओं ।
  3. सेल निलंबन 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और उन्हें ठीक से लेबल.
  4. 5 मिनट के लिए ७५१ एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्यागने ।
  5. 2 मिलीलीटर बर्फ की ठंड 1x PBS, भंवर, और ७५१ x g पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए जोड़ें । अधिनतांत त्यागें ।
  6. दोहराएं 1x PBS के साथ धुलाई कदम अवशिष्ट मीडिया को दूर करने के लिए ।
  7. पतला 10x एनेकिन V बाध्यकारी बफर 1x करने के लिए बर्फ के साथ शीत dH2हे ।
  8. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए 1x एनेक्सीन V बाइंडिंग बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से resuspend ।
  9. एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन की जगह ९६ μL ।
  10. सेल सस्पेंशन युक्त ट्यूब के लिए एनेकिन वी-फिटेक संयुग्मी और १२.५ μL के प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का 1 μL जोड़ें ।
  11. अंधेरे में बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन इनसेबेट ।
  12. पतला करने के लिए प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए २५० μL आइस-कोल्ड 1x एनेकिन V बाइंडिंग बफर जोड़ें ।
  13. तुरंत प्रवाह cytometer के साथ नमूनों का विश्लेषण ।

7. एंटीबॉडी सेल चक्र microarray द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. बीज 5 x 105 कोशिकाओं में प्रत्येक नमूने के लिए T25 cm2 बोतल है और एक अभिकर्मक प्रदर्शन प्रोटोकॉल के अनुसार खंड 1 में वर्णित, कदम 1-5.
  2. 24 h और ४८ h के बाद, trypsinization द्वारा फसल कोशिकाओं ।
  3. स्थानांतरण सेल निलंबन 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए और उंहें तदनुसार लेबल ।
  4. 5 मिनट के लिए ७५१ एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्यागने ।
  5. 5 मिनट के लिए ७५१ x g पर आइस-कोल्ड 1X pbs, भंवर और सेंट्रीफ्यूज के 2 मिलीलीटर जोड़ें । अधिनतांत त्यागें ।
  6. 1x PBS के साथ धुलाई कदम दोहराएं ।
  7. प्रोटेज़ अवरोधकों के साथ lysis बफ़र पूरक के १५० μL जोड़ें । सेल झिल्ली को बाधित करने के लिए धीरे ऊपर और नीचे पिपेट ।
  8. किसी भी lysis बफ़र हस्तक्षेप को रोकने के लिए, निर्माता के विलायक विनिमय स्तंभों का उपयोग करते हुए lysis बफ़र लेबलिंग बफ़र के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए एक बफ़र exchange निष्पादित करें ।
  9. एक बीसीए परख के साथ कुल प्रोटीन Quantify ।
  10. प्रोटीन नमूना के ७० μg ले लो और ७५ μL की एक अंतिम मात्रा को प्राप्त करने के लिए लेबलिंग बफर जोड़ें ।
  11. १०० μl dimethylformamide (dmf) के 1 मिलीग्राम बायोटिन अभिकर्मक (बायोटिन/dmf) के लिए जोड़ें ।
  12. प्रत्येक प्रोटीन नमूना (biotinylated प्रोटीन नमूना) और आर टी पर 2 एच के लिए सेते के लिए biotin/DMF के 3 μL जोड़ें ।
  13. रोकने के अभिकर्मक और vortexing द्वारा मिश्रण के ३५ μL जोड़ें ।
  14. 30 मिनट के लिए आरटी में नमूने सेते ।
  15. microarray स्लाइड रेफ्रिजरेटर से निकालें ताकि वे उपयोग करने से पहले 1 h के लिए RT करने के लिए गर्म ।
  16. 3% सूखी दूध समाधान (निर्माता द्वारा प्रदान की अभिकर्मक अवरुद्ध में) के साथ एक पेट्री डिश में ४५ मिनट के लिए निरंतर मिलाते हुए आरटी के साथ स्लाइड इनयूबटिंग द्वारा गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के लिए ब्लॉकिंग प्रदर्शन ।
  17. ddH2ओ पानी के साथ स्लाइड धोने (जब तक अंयथा निर्दिष्ट, धोने ddh2ओ के साथ जगह लेता है) ।
  18. स्लाइड सतहों से अवरोध समाधान को पूरी तरह निकालने के लिए वाशिंग चरण ~ 10x दोहराएं । यह एक समान और कम पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  19. स्लाइड सतहों से अत्यधिक पानी निकालें और स्लाइड् स को सूखने दिए बिना अगले चरण पर जाएं ।
  20. एक युग्मन अभिकर्मक में 3% सूखी दूध भंग द्वारा युग्मन समाधान तैयार करते हैं ।
  21. युग्मन समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ें और कदम ७.१२ से पहले से तैयार biotinylated प्रोटीन नमूने की पूरी मात्रा के लिए ।
  22. विक्रेता द्वारा प्रदान की युग्मन चैंबर के एक अच्छी तरह से एक स्लाइड प्लेस और यह करने के लिए प्रोटीन युग्मन मिश्रण के ~ 6 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि स्लाइड प्रोटीन युग्मन मिश्रण समाधान में पूरी तरह से जलमग्न है ।
  23. एक कक्षीय शेखर में निरंतर आंदोलन के साथ आर टी पर 2 एच के लिए युग्मन कक्ष और सेते कवर ।
  24. एक पेट्री डिश के लिए स्लाइड स्थानांतरण और 1x धोने बफर के 30 मिलीलीटर जोड़ें । कक्षीय शेखर में पेट्री डिश प्लेस, 10 मिनट के लिए हिला, और समाधान त्यागें ।
  25. दोहराएं चरण ७.२४ 2x ।
  26. ddH2ओ पानी के साथ स्लाइड कुल्ला बड़े पैमाने पर के रूप में कदम ७.१७ और ७.१८ में वर्णित है और अगले कदम के लिए तुरंत सूखने से बचने के लिए आगे बढ़ना ।
  27. 30 μL Cy3-streptavidin (०.५ मिलीग्राम/एमएल) का पता लगाने बफर के 30 मिलीलीटर में जोड़ें ।
  28. एक पेट्री डिश में स्लाइड प्लेस और Cy3-streptavidin युक्त का पता लगाने बफर के 30 मिलीलीटर जोड़ें ।
  29. 20 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर में लगातार मिलाते हुए प्रकाश से संरक्षित के साथ सेते ।
    नोट: Cy-3 एक फ्लोरोसेंट डाई है । एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर या प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाए रखने के लिए अंधेरे शर्तों के तहत काम करते हैं ।
  30. कदम 7.24-7.26 प्रदर्शन और स्लाइड हवा की एक कोमल स्ट्रीम का उपयोग कर या एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में 5-10 मिनट के लिए १३०० एक्स जी में स्लाइड रखकर सूखी अनुमति देते हैं ।
  31. स्लाइड होल्डर और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर में स्लाइड प्लेस ।
  32. उपयुक्त उत्तेजन और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक microarray स्कैनर में स्लाइड स्कैन । Cy3 के मामले में, उत्तेजन तरंगदैर्घ्य शिखर ~ ५७० एनएम पर ~ ५५० एनएम और उत्सर्जन शिखर पर है ।
  33. डेटा का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिकादेखें) उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के लिए) ।

8. आरएनए अनुक्रमण

  1. बीज 5 x 105 कोशिकाओं में प्रत्येक नमूने के लिए T25 cm2 बोतल है और एक अभिकर्मक प्रदर्शन प्रोटोकॉल के अनुसार खंड 1 में वर्णित, कदम 1-5.
  2. 24 के बाद एच और ४८ एच, फसल trypsinization द्वारा कोशिकाओं ।
  3. सेल निलंबन 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और उंहें तदनुसार लेबल ।
  4. निकालें आरएनए धारा 2 के अनुसार, कदम 1-6 ।
  5. RNA गुणवत्ता के साथ ही एक bioanalyzer के साथ एकाग्रता की जांच करें । आरएनए गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए आठ और उपयुक्त histograms से ऊपर एक RNA अखंडता स्कोर (RIN) आवश्यक हैं ।
  6. कुल आरएनए से, का उपयोग करें ~ 2 μg RNA अनुक्रमण के लिए नमूना के (कुल आरएनए से दूत आरएनए)
  7. अनुक्रम एक अगली पीढ़ी sequencer11का उपयोग कर ।
  8. RNA अनुक्रमण मशीन11से उत्पन्न fastq फ़ाइलों से एक संदर्भ जीनोम के साथ गुणवत्ता trimming और नक्शा चलाएँ.
  9. FASTQ फ़ाइलों को अपलोड करें और raw, < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> वेबसाइट के निर्देशों का पालन करते हुए गणना डेटा को वंशावबैंक में पढ़ें.
    नोट: पिछले परिणामों के लिए परिग्रहण संख्या SRP133420 देखें ।

9. ट्यूब गठन परख

  1. A549 कोशिकाओं के बजाय HUVECS कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, के रूप में धारा 1, कदम 1-5, में वर्णित के रूप में मिरना-transfected मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) ३६ एच के एंकोजेनिक क्षमता का आकलन करें ।
  2. 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए M199 भुखमरी मीडिया के साथ भूखे HUVECs ।
  3. कम वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से निकालें-८० ° c और स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात, बुलबुला गठन और polymerization से बचने के लिए क्रमिक विगलन की अनुमति.
  4. ध्यान से और धीरे से एक ९६ अच्छी थाली के कुओं कोट कम वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के ०.०४ मिलीलीटर के साथ, बुलबुला गठन से परहेज । एक लैबिनर फ्लो हुड के तहत पूरी प्रक्रिया को पूरा करें ।
  5. नमी बनाए रखने और तापमान की रक्षा करने के लिए PBS के ०.१ मिलीलीटर के साथ ९६ कुआं थाली के आसंन कुओं भरें ।
  6. ९६ कूप प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 20 मिनट के लिए सेटे ताकि तहखाने झिल्ली निकालने का बहुलकीकरण प्राप्त किया जा सके । 1 से अधिक एच के लिए सेते मत करो ।
  7. ट्रिपसिनीज प्रत्येक समूह और 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर मध्यम M199 में resuspend से स्थानांतरण HUVECs ।
  8. ९६ कूप थाली में polymerized तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स युक्त कुओं को प्रत्येक सेल निलंबन के ०.१ मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. ९६ कूप प्लेट को 5% सह2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जबकि विकास कारकों की तैयारी होती है । विकास कारकों की तैयारी भी लेमिनर फ्लो हुड के तहत जगह लेता है ।
  10. 2x में विकास कारकों (VEGF) को पुनर्गठित करना (2 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता के लिए 4 एनजी/एमएल एकाग्रता) और कोशिकाओं के साथ M199 भुखमरी माध्यम के ०.१ मिलीलीटर के शीर्ष पर विकास कारक M199 युक्त भुखमरी मध्यम की ०.१ मिलीलीटर जोड़ें । गैर VEGF-इलाज कुओं के लिए, कोशिकाओं के साथ M199 भुखमरी माध्यम के ०.१ मिलीलीटर के शीर्ष पर M199 भुखमरी मध्यम की ०.१ मिलीलीटर जोड़ें ।
  11. 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 6 एच के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली सेते ।
  12. ऊष्मायन अवधि के अंत में, एक डिजिटल कैमरा के साथ जुड़ा एक brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, 4x आवर्धन के साथ एक अच्छी तरह की छवियों को प्राप्त करते हैं ।
  13. 19में एक "angiogenesis विश्लेषक" प्लग के साथ सुसज्जित सॉफ्टवेयर के साथ प्रक्रिया छवियों । तीन मापदंडों का प्रयोग करें, नोड्स की संख्या, जंक्शनों की संख्या, और कुल अंकुर लंबाई, angiogenesis पर मिरना उपचार के प्रभाव की तुलना करने के लिए ।

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Representative Results

जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण RT-qPCR और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग

अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण RT-qPCR का उपयोग लक्षित जीन CDK1, CDK4, और CDK6 के महत्वपूर्ण downregulation का प्रदर्शन किया । CDK1 और CDK4/6 को क्रमशः G2/M और G1/S संक्रमणों के लिए सहायक सिद्ध किया गया । प्रदर्शन विश्लेषण व्यक्तिगत mirs और मिश्रित मीर गतिविधि के बीच प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति दी । transfecting एजेंट के साथ हाथापाई सिरना का उपयोग पता लगाया जीन downregulation पर प्रक्रिया से किसी भी हस्तक्षेप के मूल्यांकन की अनुमति दी है, जो ंयूनतम था । आंकड़ों सांख्यिकीय एक दो-पूंछ छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया, औरपी < ०.०५ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था (चित्रा 1) । qPCR से पहले, प्राइमर दृश्यों प्राइमर-ब्लास्ट < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> एकल जीन प्रवर्धन के लिए का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । यह भी जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के माध्यम से प्रवर्धन उत्पादों का विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई थी । डीएनए उत्पादों का एक एकल बैंड प्रत्येक विश्लेषण जीन (चित्रा 1 डी), एकल जीन प्रवर्धन की पुष्टि के लिए पाया गया था । CDK6 एकल प्रवर्धन की पुष्टि की गई (डेटा नहीं दिखाया गया) ।

Figure 1
चित्रा 1 : qpcr द्वारा पता लगाया के रूप में CDK1, CDK4, और CDK6 जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति, और जेल डीएनए प्रवर्धन उत्पादों के ट्रो विश्लेषण। मीर-१४३ और मीर-५०६ A549 कोशिकाओं के अभिकर्मक CDK1 के downregulation प्रेरित (क), CDK4 (ख), और CDK6 (ग) 24 एच और ४८ एच पोस्ट-अभिकर्मक पर डाउनरेगुलेशन । डीएनए प्रवर्धन उत्पादों जेल वैद्युतीकरण द्वारा मूल्यांकन किया गया (घ) एक जीन प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए । गप्ध का प्रयोग संदर्भ जीन के रूप में किया गया. औसत ± SEM, * p < ०.०५; * * पी < ०.०१, दो पूंछ टीपरीक्षण । इस आंकड़े कोइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया हॉसियन एट अल.11से संशोधित किया गया है ।

प्रवाह cytometry का उपयोग कर सेल साइकिल वितरण

प्रोपिडियम आयोडाइड सेलुलर न्यूकोलिक अम्लों का धुंधला होना एक मानक विधि है जो कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों में कोशिका की संख्या को डीएनए सामग्री की मात्रा के हिसाब से चित्रित करने के लिए है । मीर के मिश्रित उपचार-१४३ और मीर-५०६ प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 2) के माध्यम से संकेत के रूप में दो चौकियों, G0/G1 और G2/M पर सेल चक्र रोक दिया ।

Figure 2
चित्रा 2 : A549 कोशिकाओं के सेल चक्र विश्लेषण मीर-१४३ और मीर-५०६ 24 एच और ४८ एच के बाद-transfected के साथ स्थानांतरित । प्रत्येक कोशिका चक्र के लिए कोशिका जनसंख्या प्रतिशतता प्रवाह कोशिकामिति और डीएनए-बाइंडिंग प्रोपिडियम आयोडाइड द्वारा निर्धारित की गई थी । औसत ± SEM. इस आंकड़ेको इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें हुसैन एट अल.11से संशोधनों के साथ पुनर्मुद्रित है ।

प्रवाह cytometry द्वारा एनेकिन V/

मीर के साथ A549 कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद-१४३ और मीर-५०६, एक apoptosis परख एनेकिन वी और PI धुंधला और प्रवाह cytometry का उपयोग किया गया था । यह पहचान की गई कि मिश्रित उपचार 24 एच और ४८ एच timepoints पर महत्वपूर्ण apoptosis प्रेरित किया । नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में, प्रतिशत-अपोप्टोटिक कोशिकाओं के परिवर्तन के रूप में निर्धारित किया गया था एनेकिन V सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा पता चला, के कारण मीर उपचार के रूप में चित्रा 3में प्रस्तुत किया ।

Figure 3
चित्रा 3 : अपोप्टोटिक कोशिकाओं के उदाहरण विश्लेषण । मीर के साथ Transection-१४३ और मीर-५०६ एनेकिन V positive A549 कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ा. औसत ± SEM. * p < ०.०५, * * p < ०.०१, दो-पुच्छ t-test. इस आंकड़े कोइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया हॉसियन एट अल.11से संशोधित किया गया है ।

कोशिका चक्र एंटीबॉडी माइक्रोसरणी

उपचार के लिए यंत्रवत प्रतिक्रियाओं को प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के माध्यम से पहचाना जा सकता है । विभेदक अभिव्यक्ति एक मार्ग विशिष्ट एंटीबॉडी microarray का उपयोग कर कोशिका चक्र मार्ग के साथ जुड़े जीन का एक प्रोटीन स्तर पर मूल्यांकन किया गया था. प्रोटीन निष्कर्षों मीर-143/506 के साथ transfected कोशिकाओं से विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया । ~ ६० सेल चक्र से जुड़े प्रोटीन के अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति दी microarray विश्लेषण, छह प्रत्येक विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए प्रतिकृति के साथ । दृष्टिकोण एक विशेष मार्ग के भीतर यंत्रवत व्यवहार के एक व्यापक परिप्रेक्ष्य, आगे मूल्यांकन के लिए आणविक लक्ष्यों की पहचान, और बाद translational स्तर पर विश्लेषण के प्रदर्शन की अनुमति देता है । इस विधि के अर्द्ध मात्रात्मक सिद्धांत के कारण, विशिष्ट जीन पर किसी भी परिणाम के लिए पश्चिमी blotting के माध्यम से पुष्टि की जरूरत है । इसके अलावा, इस विश्लेषण में, कोशिका चक्र प्रगति से जुड़े प्रोटीन की घटी हुई अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था । यह दोनों 24 एच और ४८ एच के बाद transfection (चित्रा 4a), के रूप में qpcr द्वारा पता लगाया में लक्षित CDK1 और CDK4 शामिल थे ।

Figure 4
चित्रा 4 : जीन dysregulation के रूप में microarray और RNA अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा पता चला । (क) A549 कोशिकाओं से प्रोटीन के अर्क में माइक्रोव्यूह विश्लेषण द्वारा खोजे गए के रूप में सेल चक्र मार्ग जीन एक्सप्रेशन का हीटमैप, जो मीर-१४३ और मीर-५०६ के साथ, 24 एच और ४८ एच के पोस्ट-ट्रांसफेक्शन में पाया जाता है । (ख) आरएनए अनुक्रमण द्वारा खोजे गए के रूप में 24 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन पर मीर-१४३ और मीर-५०६ से A549 प्रकोष्ठों से सेल चक्र मार्ग जीन अभिव्यक्तियों के परिवर्तन को मोड़ना । (ग) आरएनए अनुक्रमण से प्राप्त आंकड़ों से मार्ग विश्लेषण साफ्टवेयर द्वारा विश्लेषित मार्ग क्रियाकलाप । यह आंकड़ा हॉसियन एट अल से संशोधित किया गया है। 11 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आरएनए अनुक्रमण और मार्ग विश्लेषण मार्ग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग

अगली पीढ़ी अनुक्रमण सही आरएनए स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है । विधि एक एकल विश्लेषण के माध्यम से कई जीन परिवर्तन की पहचान के लिए अनुमति देता है (इस प्रोटोकॉल में, विश्लेषण > 18000 जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाया). पता लगाया जीन की बड़ी संख्या के कारण, जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण मार्ग व्यवहार के कुशल निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 4B) । तब सॉफ्टवेयर का प्रयोग किया गया था ( सामग्री की सारणीदेखें) G1/s और G2/M चरण की गिरफ्तारी और एस चरण दीक्षा के downregulation की भविष्यवाणी करने के लिए (चित्रा 4c) । इसके अलावा, आरएनए अनुक्रमण परिणाम qpcr डेटा की तुलना में किया जा सकता है । इस अध्ययन में, आरएनए अनुक्रमण ने qPCR विश्लेषण से निष्कर्षों की पुष्टि की, CDK1 (४८%, पी < ०.००१, एफडीआर < ०.००१), CDK4 (६८%, पी < ०.००१, एफडीआर < ०.००१), और CDK6 (७१%, < ०.००१, एफडीआर < ०.००१) का डाउनरेगुलेशन दर्शाने के कारण मिश्रित मीर-१४३ और मीर-५०६ गतिविधि । सांख्यिकीय विश्लेषण edger रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति की गणना के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर द्वारा किया गया था, नकारात्मक द्विपद20,21का उपयोग कर पी मूल्यों की गणना । Bioinformatics विश्लेषण मिरना गतिविधि के कार्यात्मक मूल्यांकन और संभावित आणविक लक्ष्यों के पूर्वानुमान के लिए किया जा सकता है, के रूप में चित्रा 5में सचित्र ।

Figure 5
चित्रा 5 : उदाहरण मार्ग और यंत्रवत विश्लेषण के रूप में मार्ग विश्लेषण aoftware द्वारा प्रस्तुत किया । आरएनए अनुक्रमण डेटा A549 मीर-१४३ और मीर-५०६, 24 एच बाद transfected, मार्ग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और सबसे कम (ए) या उच्चतम (बी) सक्रियण स्कोर के साथ विहित रास्ते की पहचान के साथ transfected कोशिकाओं से विश्लेषण किया गया था । इस सॉफ्टवेयर में पूर्वानुमानित कार्य (सी) और संभावित अपस्ट्रीम नियामकों/ यह आंकड़ा हॉसियन एट अल से रीप्रिंटेड है। 11 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Endothelial ट्यूब गठन परख

इन विट्रो endothelial ट्यूब गठन परख व्यापक रूप से वाहिकाजनन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और विश्वसनीय, स्वचालित है, और quantifiable22। संवहनी endothelial विकास कारक (vegf) एक अच्छी तरह से ज्ञात angiogenic विकास कारक23,24 और endothelial ट्यूब गठन प्रमोटर है । इस अध्ययन में, यह पहचान की गई कि मीर-१४३ और मीर-५०६ के मिश्रित उपचार vegf प्रेरित वाहिकजनन को रद्द कर दिया । ट्यूब गठन की सांकेतिक छवियों और उपचार के प्रभाव चित्रा 6में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Figure 6
चित्रा 6 : VEGF के endothelial अंकुर के प्रतिनिधि छवियां-इलाज बनाम गैर इलाज HUVECs हाथापाई मिरना, mirna-१४३, mirna-५०६, या उसके संयोजन के साथ transfected । चित्र एक brightfield 4x आवर्धन के तहत एक डिजिटल कैमरा से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

miRNAs कैंसर के इलाज के लिए लक्षित चिकित्सा के रूप में काम कर सकते हैं, रोगग्रस्त बनाम सामांय ऊतकों में अभिव्यक्ति के स्तर के dysregulation पहचानने । इस अध्ययन के लिए miRNAs निर्धारित है कि संभावित कई चरणों के दौरान सेल चक्र प्रगति को रोकने के उद्देश्य से । यह पहचान की थी कि मीर-१४३ और मीर-५०६ कैंसर कोशिकाओं के सेल चक्र पड़ाव, और प्रस्तुत इस मिश्रित मिर्ना उपचार की गतिविधि को समझने के उद्देश्य से प्रोटोकॉल ।

वर्णित तरीके miRNAs के समारोह पर एक व्यापक समझ प्रदान करते हैं । मिर्नास के अध्ययन की चुनौतियों उनकी क्षमता के साथ जुड़े रहे है एकाधिक जीन को लक्षित करने और इस प्रकार कई रास्ते प्रभावित करते हैं । वर्णित qPCR विश्लेषण ब्याज के विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की पहचान की अनुमति देता है, अगर विशिष्ट लक्ष्यों को उपचार से पहले की पहचान कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, यहां मुख्य फोकस CDK1 और CDK4/6 और सेल चक्र की अभिव्यक्ति थी ।

इस प्रकार, कोशिका चक्र विश्लेषण propidium आयोडाइड और प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल का उपयोग सेल चक्र में उनकी अवस्था के अनुसार सेल आबादी में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण है । विधि PI द्वारा प्रतिदीप्ति संकेत के आनुपातिक वृद्धि पर निर्भर करता है, जो डीएनए को बांधता है, सेल चक्र के चरण के अनुरूप । संक्षेप में, एस चरण में कोशिकाओं डीएनए synthesize, G0/G1 चरण में कोशिकाओं की तुलना में उच्च संकेतों उत्प्रेरण, और G2 चरण में कोशिकाओं अपने डीएनए डुप्लिकेट है, सबसे तीव्र संकेत उत्पादन.

सबूत जमा कोशिका चक्र को नुकसान का कनेक्शन इंगित करता है और अपोप्टोसिस के ट्रिगर25। एनेकिन VI/पीआई का उपयोग करते हुए प्रवाह कोशिकामिति पद्धति का उपयोग कीमोथेरेपी उपचार से कोशिकाओं में प्रेरित अपोप्टोसिस की पहचान के लिए लगातार किया जाता रहा है । इंडिकेटिव, एक मजबूत अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया मिश्रित मिर्ना चिकित्सा, जो व्यक्ति मिरनास की तुलना में अधिक शक्तिशाली था के कारण की पहचान की गई थी ।

अर्ध-मात्रात्मक प्रोटीन एंटीबॉडी माइक्रोसरणी विशिष्ट जैविक प्रतिक्रियाओं से संबंधित प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक संवेदनशील और विश्वसनीय विधि है26,27. इस प्रोटोकॉल में एक कोशिका चक्र मार्ग-विशिष्ट एंटीबॉडी माइक्रोसरणी का उपयोग किया गया है, जो व्यवहार और अनुपचारित कोशिकाओं के बीच ~ ६० जीन में अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता चला । सावधानी धोने कदम के दौरान आवश्यक है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया पूरी तरह से किया गया है और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए । साथ ही, स्लाइड प्रयोग के पूरा होने तक सूखी नहीं होना चाहिए ।

इसके विपरीत, आरएनए अनुक्रमण एक से अधिक जीन के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शन स्तर पर मात्रात्मक जीन अभिव्यक्तियां विश्लेषण प्रदान करता है । विश्लेषण किया जीन की काफी बड़ी संख्या (> के लिए 18000 आरएनए seq माइक्रोसरणी के लिए बनाम ६०) कई रास्ते और आणविक लक्ष्य के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, और वृद्धि की सटीकता के साथ. इस तरह के व्यापक विश्लेषण महत्वपूर्ण है, के रूप में एक एकल miRNA के लिए बाध्य कर सकते है और विभिंन mRNAs लक्ष्य । इसके विपरीत, जीन dysregulations की बड़ी संख्या का मार्ग विश्लेषण स्वाभाविक रूप से चुनौतीपूर्ण है । उदाहरण के लिए, यद्यपि आरएनए अनुक्रमण ने मिरना उपचार के कारण CDK1 और CDK4/6 डाउनरेगुलेशन के बारे में हमारे qPCR डेटा की पुष्टि की है, विश्लेषण में उन हजारों जीन पर भी डाटा उपलब्ध कराया गया है जो नीचे या ऊपर विनियमित थे । इस तरह के कई जीन dysregulations को संदर्भ प्रदान करने के लिए, मार्ग विश्लेषण सॉफ्टवेयर विभिंन मार्ग और सेलुलर कार्यों पर उपचार के समग्र प्रभाव निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस सॉफ़्टवेयर ने सक्रियण (सकारात्मक जेड स्कोर) या inactivation (नकारात्मक जेड स्कोर) के विशिष्ट कार्यों या रास्ते, और साथ ही विश्लेषण के सांख्यिकीय महत्व (चित्रा 5)28के लिए स्कोर प्रतिनिधि प्रदान की है ।

निष्कर्ष में, मिरना गतिविधि का अध्ययन एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है । कई जीन को प्रभावित करने के लिए मिरनास की अंतर्निहित क्षमता के लिए संभावित गतिविधि की पहचान करने के लिए कई विस्तृत और जटिल विश्लेषणात्मक विधियों के उपयोग की आवश्यकता होती है । आश्चर्य नहीं, आगे काम करने के लिए पूरी तरह से मीर की गतिविधियों को समझने की आवश्यकता है-१४३ और मीर-५०६ फेफड़ों के कैंसर में ।

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Disclosures

लेखकों को RNA अनुक्रमण डेटा के मार्ग विश्लेषण पर उनकी सहायता के लिए लुइसियाना राज्य विश्वविद्यालय में जॉन Caskey स्वीकार करना चाहते हैं, और टेक्सास पश्चिमी मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय, McDermott केंद्र अगली पीढ़ी अनुक्रमण कोर के लिए RNA अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण प्रदर्शन कर रहा है । इस शोध फार्मेसी के कॉलेज, लुइसियाना मुनरो के विश्वविद्यालय के वित्त पोषण शुरू करने के लिए, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंस अनुदान के माध्यम से समर्थित किया गया था 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 ।

Acknowledgments

हितों का टकराव नहीं घोषित किया जाए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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References

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कैंसर अनुसंधान मुद्दा १४५ transfection मिरना फेफड़ों के कैंसर सेल चक्र apoptosis वाहिकजनन आरएनए अनुक्रमण

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Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

कोशिका चक्र और वाहिकजनन को विनियमित करने के लिए Combinatorial मिर्ना उपचार का विश्लेषण
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Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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