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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.

Abstract

Il cancro del polmone (LC) è la causa principale delle morti legate al cancro in tutto il mondo. Simile ad altre cellule di cancro, una caratteristica fondamentale delle cellule LC è proliferazione non regolamentata e la divisione cellulare. Inibizione della proliferazione di arrestare la progressione del ciclo cellulare ha dimostrato di essere un promettente approccio per il trattamento del cancro, tra cui LC.

terapeutica di miRNA sono emerse come regolatori di genico post-trascrizionale importante e sempre più stanno studiandi per uso nel trattamento del cancro. In recenti lavori, abbiamo utilizzato due Mirna, miR-143 e miR-506, per regolare la progressione del ciclo cellulare. Transfected le cellule A549 non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC), modificazioni dell'espressione genica sono stati analizzati e attività apoptotica dovuta al trattamento infine è stato analizzato. Downregulation di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) sono stati rilevati (cioè, CDK1, CDK4 e CDK6), e ciclo cellulare fermato presso le transizioni di fase di G1/S e G2/M. Analisi del percorso indicano potenziali attività antiangiogenica del trattamento, che conferisce l'approccio multiforme attività. Qui, le metodologie utilizzate per identificare l'attività di miRNA per quanto riguarda l'inibizione del ciclo cellulare, induzione di apoptosi e gli effetti del trattamento sulle cellule endoteliali tramite inibizione dell'angiogenesi sono descritti. Si spera che i metodi presentati qui sosterrà la ricerca futura su miRNA terapeutica e attività corrispondente e che i dati rappresentativi guiderà altri ricercatori durante analisi sperimentali.

Introduction

Il ciclo cellulare è una combinazione di più eventi normativi che consentono la duplicazione del DNA e la proliferazione cellulare attraverso il processo mitotico1. Chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) regolare e promuovere il ciclo cellulare2. Tra questi, il CDK mitotica (CDK1) e interfase CDKs (CDK2, CDK4 e CDK6) hanno un ruolo fondamentale nel ciclo cellulare progressione3. Proteina del retinoblastoma (Rb) è fosforilata da CDK4/CDK6 complessi per consentire il ciclo cellulare progressione4, e l'attivazione CDK1 è essenziale per la divisione cellulare successo5. Numerosi inibitori delle CDK sono stati sviluppati e valutati in studi clinici negli ultimi decenni, che indica il potenziale di targeting CDKs nel trattamento del cancro. Infatti, tre inibitori delle CDK sono stati approvati per il trattamento di cancro al seno recentemente6,7,8,9,10. Così, CDKs, e in particolare, CDK1 e CDK4/6, sono di grande interesse nella regolazione della progressione del cancro delle cellule.

Mirna (miRs) sono piccole, non-codificazione RNAs e regolatori post-trascrizionale dell'espressione genica, circa il 30% di tutti i geni umani11di regolazione. Loro attività è basata sulla repressione traduzionale o degradazione del RNA messaggero (mRNA)12. Indicativo del loro significato biologico, sono stati identificati più di 5.000 Mirna e una molecola di miRNA singolo può regolare più geni11,13. Ancora più importante, espressione dei miRNA è stata associata con diverse malattie e Stati di malattia, compreso cancro13. Infatti, i miRNA sono stati caratterizzati come oncogeni o soppressori tumorali, essendo in grado di promuovere o sopprimere tumore sviluppo e progressione di14,15. L'espressione relativa di Mirna in tessuti malati può regolare la progressione di malattia; così, consegna esogeno di Mirna ha potenziale terapeutico.

Cancro del polmone è la principale causa di decessi per cancro e più grande di 60% di tutti i tumori maligni del polmone non a piccole cellule16,i cancri del polmone17, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 20%18. L'uso di miR-143-3 p e miR-506-3 p recentemente è stata valutata per il targeting i cicli delle cellule nel polmone cancro cellule11. miR-143 e miR-506 hanno sequenze di complementarità CDK1 e CDK4/CDK6, e sono stati analizzati gli effetti di questi due miRs sulle cellule A549. I dati sperimentali sono presentati e discussi in questa carta. Espressione genica, progressione del ciclo cellulare e apoptosi sono stati valutati usando diversi disegni sperimentali e punti temporali dopo trasfezione. Abbiamo usato metodi quantitativi in tempo reale di PCR (RT-qPCR) insieme con l'analisi di microarray per misurare l'espressione di specifici geni, e sequenziamento di RNA di nuova generazione è stato usato per determinare di disregolazione genica globale11. Quest'ultimo metodo identifica l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene con alta sensibilità e riproducibilità, mentre migliaia di geni possa essere analizzati da una singola analisi sperimentale. Inoltre, analisi apoptotiche dovuto il trattamento di miRNA è stata eseguita e viene descritto qui. Bioinformatica ha completato l'analisi dei percorsi. Presentato qui sono protocolli utilizzati per l'analisi di terapeutico potenziale della combinatoria miR-143 e miR-506.

Lo scopo principale di questo protocollo è quello di identificare gli effetti dei miRNA nelle cellule, con un focus sul ciclo cellulare. La varietà delle tecniche qui presentate spaziano dalla analisi di espressione genica romanzo e pretraduzione (utilizzando qPCR) di elaborare tecniche per l'analisi del gene a livello proteico, come ad esempio l'analisi di microarray. Si spera che questo rapporto è utile per i ricercatori interessati a lavorare con Mirna. Inoltre, la metodologia per l'analisi cytometric di flusso del ciclo cellulare e apoptosi delle cellule è presentato.

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Protocol

1. miR-143 e miR-506 transfezione

Attenzione: Utilizzare un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in lattice durante l'esecuzione di esperimenti descritti. Quando richiesto, è possibile utilizzare l'armadio di sicurezza biologica con il ventilatore su, senza bloccare le vie respiratorie o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di vetro proteggente all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.

  1. Le cellule A549 NSCLC seme in una piastra T25 cm2 pallone/6/96 ben in DMEM/F12K media completati con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina (terreni di coltura) in una cappa di coltura del tessuto e incubare per una notte a 37 ° C con 5% CO2 in un incubatore di coltura del tessuto.
  2. Sospendere imita miR-143 e/o miR-506 o rimescolare siRNA con agente di transfezione (2,4 µ g di miR sono stati mescolati con 14 µ l di agente trasfettando; Vedi Tabella materiali) in 500 µ l di transfezione media e 1,5 mL di siero e senza antibiotico DMEM/F12K media presso un concentrazione di miRNA finale di 100 nM. quantità di miRNA possono richiedere ottimizzazione su cellule diverse e concentrazioni. Approcci appropriati includono la transfezione delle cellule con l'aumento delle concentrazioni di miRNA (vale a dire, 50-200 nM) e valutazione di espressione downregulation dei geni di interesse.
  3. Rimuovere i mezzi di coltura dalla boccetta/piastra e lavare una volta con PBS 1X.
  4. MiRNA/scramble-trasfezione complessi agente ed incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 6 h (dimensioni della muffola definisce il volume aggiunto incubazione).
  5. Sostituire il supporto con 4 mL di terreno di coltura e incubare le cellule per 24 h e/o 48 h.
  6. Vendemmia transfected le cellule a trypsinization, aggiungendo 1 mL di tripsina-EDTA in ciascuna beuta,2 cm T25, incubare per 5-10 min a 37 ° C e aggiungere 3 mL di terreno di coltura per raccogliere le cellule. Inserire il contenuto di ciascuna beuta in un tubo separato, contrassegnato da 15 mL. Lavorare in una cappa di coltura del tessuto.
  7. Centrifugare a 751 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
    Nota: Attenzione è richiesta durante la rimozione del surnatante, come agitazione del tubo può causare la perdita delle cellule.
  8. Aggiungere 2 mL di 1X PBS e centrifugare per 5 min a 751 x g.
  9. Ripetere i passaggi 7 e 8 una volta per rimuovere eventuali tracce di media e surnatante.
    Nota: In questa fase, provette dei campioni possono essere conservati a-80 ° C o possono essere utilizzati immediatamente.

2. estrazione del RNA

  1. Pulire l'area di lavoro spruzzando con alcool isopropilico al 70% e soluzione di decontaminazione di RNAsi.
  2. Estrazione del RNA deve essere eseguita utilizzando un appropriato RNA kit (Vedi Tabella materiali).
  3. Rimuovere i tubi da-80 ° C e lasciarli scongelare. Aggiungere 300 µ l di tampone di lisi e pipetta su e giù per rompere la membrana cellulare.
  4. Aggiungere un volume equivalente di etanolo ultra-puro al 100%.
  5. Mescolare bene e mettere in colonna di separazione.
  6. Centrifugare tra 11 e 16 x g per 30 s e Rimuovi il flusso continuo.
  7. Aggiungere 400 µ l di tampone e centrifugare per rimuovere il tampone di lavaggio.
  8. Aggiungere 5 µ l di dnasi I con 75 µ l di digestione del DNA nel buffer in ogni campione e incubare per 15 min.
  9. Lavare il campione con 400 µ l di tampone di preparazione di RNA.
  10. Lavare 2 volte con tampone di lavaggio di RNA.
  11. Aggiungere acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifuga, quindi raccogliere il RNA.
  12. Misurare la concentrazione di RNA totale con uno spettrofotometro UV.

3. RT-qPCR

  1. Prima del RT-qPCR, sintetizzare il cDNA. A seguito di quantificazione di concentrazione di RNA, posto 1 µ g di RNA in un volume finale di 20 µ l di reazione per preparare cDNA in un tubo PCR. Lavorare sempre su un banco pulito.
  2. Tutti gli altri ingredienti necessari sono inclusi in tabella 1.
Ingredienti Quantità (µ l) / (20 µ l) di campione
5 X cDNA Master mix 4
dNTP 2
Esameri casuali 1
Rinforzatore di RT 1
Mix di enzima verso 1
Acqua gratuita DNasi e RNasi Qty richiesto dopo l'aggiunta di RNA per rendere 20 µ l

Tabella 1: Materiali per la sintesi di cDNA da campioni di RNA. Necessaria quantità di rispettivi ingredienti per preparare un mix master per un esemplare per la sintesi del cDNA.

  1. Incubare in un termociclatore con le seguenti condizioni di temperatura: 42 ° C per 30 min; 95 ° C per 2 min; 4 ° C fino al prelievo di campioni.
  2. Utilizzare immediatamente in normale PCR o qPCR, o conservare cDNA a-20 ° C.
  3. Preparare soluzioni primer forward e reverse con privo di DNasi e RNasi acqua ad una concentrazione di 10 µM dalla soluzione stock primer.
  4. Preparare il mix master separati per ogni gene essere rilevato, in base al numero di campioni. Per ogni campione di cDNA (qPCR bene), la quantità di reazione è preparata secondo la tabella 2.
Ingredienti Quantità (µ l) / (20 µ l) di campione
Mix master SYBR 10
Forward Primer - 10 μM 2
Reverse Primer - 10 μM 2
Acqua gratuita DNasi e RNasi 3
campione di cDNA 3

Tabella 2: materiali per PCR quantitativa in tempo reale dai campioni di cDNA. Necessaria quantità di ingredienti per preparare un mix master per un esemplare per qPCR.

  1. Ogni campione viene posto nei rispettivi pozzetti.
  2. Progettare il layout di esempio per la piastra di qPCR ben 96. Per ogni campione e gene analizzato, eseguire la reazione in triplici copie, o almeno in duplicati.
  3. Sigillare la piastra ben 96 con un coperchio adesivo otticamente trasparente.
  4. Rapido-spin la piastra per consentire la miscela di reazione raggiungere il fondo dei pozzetti.
  5. Eseguire RT-qPCR secondo il seguente gradiente termico:
    1) 50 ° C per 2 min
    2) 95 ° C per 2 min
    3) 95 ° C per 15 s
    4) prendere la lettura
    5) 60 ° C per 1,5 minuti
    6) Ripetere il passaggio 3 per 39 volte
  6. Eseguire il seguente gradiente termico in continuazione di cui sopra per determinare la curva di fusione che indica amplificazione del singolo prodotto.
    7) 65 ° C per min 0,31
    0,5 ° C/ciclo
    9) piatto Leggi
    10) Ripetere il passaggio 8 per 60 volte fino a 95 ° C
    11) 72 ° C per 2 min

4. elettroforesi su gel di agarosio per confermare l'amplificazione del gene singolo

  1. Preparare il gel di agarosio 1% in 1 tampone di x TBE.
  2. Aggiungere etidio bromuro (EtBr) nel gel caldo (~ 50 ° C) fino ad ottenere una concentrazione finale di circa 0.2-0.5 µ g/mL. EtBR lega con DNA e consente di essere visualizzato sotto la luce in un imager di gel UV.
  3. Versare il gel caldo in un cassetto del gel fornito con un contenitore di elettroforesi del gel. Attaccare il pettine fornito strettamente per pozzi uniforme.
  4. Consentire il gel al resto e raffreddare a temperatura ambiente (TA) per ~ 30 min.
  5. Quando il gel è solidificato, collocare il gel e il vassoio nella finestra di gel.
  6. Riempire la vaschetta del gel con 1 x TBE buffer fino a quando il gel è completamente coperto.
  7. Misurare la concentrazione del DNA dal processo di amplificazione di PCR utilizzando uno spettrometro UV.
  8. Prendere ~ 15 ng di DNA in un piccolo tubo PCR, aggiungere 5 µ l di colorante e aggiungere la quantità necessaria di acqua priva di nucleasi a raggiungere un volume totale di 15 µ l.
  9. Caricare il DNA ladder e campioni nei pozzetti.
  10. Esegua il gel a 100 V fino a quando la linea di tintura è circa il 75-80% giù il gel.
    Nota: Assicurarsi che il gel viene eseguito da un negativo a carica positiva.
  11. Rimuovere il gel e inserirlo nel gel imager per visualizzare il DNA.

5. analisi del ciclo cellulare da

  1. Cellule5 seme 5 x 10 per ciascun campione in un matraccio da2 cm di T25 ed eseguire una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
  2. Dopo 24 h e h 48, quindi raccogliere le cellule di trypsinization.
  3. Trasferire le sospensioni cellulari per provette sterili da 15 mL ed etichettarle correttamente.
  4. Centrifugare i campioni a 751 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  5. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
  6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS per rimuovere media residua.
  7. Risospendere e rompere il pellet con l'aggiunta di 200 µ l di PBS 1X ghiacciata di pipettaggio.
  8. Fissare le cellule con l'aggiunta di 2 mL di etanolo al 70% ghiacciata goccia a goccia per il tubo mentre nel Vortex delicatamente.
  9. Incubare le provette per 30 min a RT e posizionare i tubi a 4 ° C per 1 h.
  10. Rimuovere tubi da 4 ° C e centrifugare a 751 x g per 5 min.
  11. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
  12. Aggiungere 500 µ l di 1X PBS con ioduro di propidio (50 µ g/mL) e ribonucleasi A (200 µ g/mL)
  13. Incubare per 30 min a RT, proteggendo i campioni dalla luce.
  14. Acquisire dati sul citometro a flusso. Utilizzare avanti vs dispersione laterale (FSC e SSC) per selezionare la principale popolazione di cellule, ad eccezione di detriti nell'angolo sinistro inferiore dei cluster FSC vs SSC densità trama e cella nella parte superiore verso l'alto-lato destro della trama di densità del FSC e SSC.
  15. Analizzare i dati per l'identificazione di popolazioni cellulari per ogni fase del ciclo cellulare con il software appropriato.

6. apoptosi dosaggio

  1. Cellule5 seme 5 x 10 per ciascun campione in un matraccio da2 cm di T25 ed eseguire una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
  2. Dopo 24 h e 48 h, è possibile raccogliere le cellule dal trypsinization.
  3. Trasferire le sospensioni cellulari per provette sterili da 15 mL ed etichettarle correttamente.
  4. Centrifugare a 751 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  5. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
  6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS per rimuovere media residua.
  7. Diluire 10 x buffer obbligatorio Annexin V a 1x con gelida dH2O.
  8. Aggiungere 1 mL di tampone di Annexin V che lega 1x per ogni provetta e Risospendere delicatamente.
  9. Sospensione di cellule posto 96 µ l in una microcentrifuga da 1,5 mL.
  10. Aggiungere 1 µ l di coniugato di Annexin V-FITC e 12,5 µ l di ioduro di propidio (PI) nella provetta contenente la sospensione cellulare.
  11. Incubare la sospensione cellulare per 10 min sul ghiaccio al buio.
  12. Aggiungere 250 µ l 1 ghiacciata x buffer obbligatorio di Annexin V per ogni provetta per diluire.
  13. Analizzare immediatamente i campioni con citometro a flusso.

7. espressione di proteina di microarray dell'anticorpo ciclo cellulare

  1. Seme 5 x 105 celle per ogni campione preparato in boccette di T25 cm2 e realizzare una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
  2. Dopo 24 h e 48 h, è possibile raccogliere le cellule di trypsinization.
  3. Trasferimento di sospensioni cellulari per provette da 15 mL e con l'etichetta di conseguenza.
  4. Centrifugare a 751 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  5. Aggiungere 2 mL di PBS 1X ghiacciata, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 min, scartare il surnatante.
  6. Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS.
  7. Aggiungere 150 µ l di tampone di lisi completati con inibitori della proteasi. Dispensare su e giù delicatamente di distruggere le membrane cellulari.
  8. Per evitare qualsiasi interferenza di tampone di Lisi, eseguire uno scambio di buffer per sostituire il tampone di lisi con etichettatura buffer, utilizzando colonne di scambio solvente del produttore.
  9. Quantificare la proteina totale con un saggio BCA.
  10. Prendere 70 µ g di campione della proteina e aggiungere per ottenere un volume finale di 75 µ l di tampone d'etichettatura.
  11. Aggiungere 100 µ l di dimetilformammide (DMF) a 1 mg di reagente di biotina (biotina/DMF).
  12. 3 µ l di biotina/DMF in ciascun campione di proteina (biotinylated campione della proteina) ed incubare per 2 h a TA.
  13. Aggiungere 35 µ l di reagente di stop e mescolare nel Vortex.
  14. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 min.
  15. Rimuovere le diapositive di microarray dal frigorifero in modo che riscaldano a RT per 1 h prima dell'uso.
  16. Eseguire il blocco per legame non specifico incubando le diapositive con soluzione di latte in polvere 3% (nel Reagente Bloccante fornito dal produttore) in una capsula di Petri con agitazione continua per 45 minuti a TA.
  17. Lavare i vetrini con ddH2O acqua (se non diversamente specificato, il lavaggio si svolge con ddH2O).
  18. Ripetere la fase di lavaggio ~ 10 x per rimuovere completamente la soluzione bloccante dalle superfici di scorrimento. Questo è importante per ottenere uno sfondo uniforme e basso.
  19. Rimuovere l'acqua eccessiva dalle superfici di scorrimento e procedere al passaggio successivo senza lasciare che le diapositive a secco.
  20. Preparare la soluzione di accoppiamento sciogliendo il latte secco 3% in un reagente di accoppiamento.
  21. Aggiungere 6 mL della soluzione di accoppiamento e l'intero quantitativo del campione proteine biotinilate precedentemente preparato dal passaggio 7.12.
  22. Posto una diapositiva in un pozzetto della camera del giunto del fornitore e aggiungere ~ 6 mL di proteina mix di accoppiamento ad esso.
    Nota: Assicurarsi che la diapositiva è completamente immersa nella proteina mix soluzione di accoppiamento.
  23. Coprire la camera di accoppiamento e incubare per 2 h a temperatura ambiente con agitazione continua in un agitatore orbitale.
  24. Trasferire i vetrini in una capsula di Petri e aggiungere 30 mL di 1x tampone di lavaggio. Posizionare la piastra di Petri nell'agitatore orbitale, agitare per 10 min e scartare la soluzione.
  25. Ripetere il passaggio 7,24 2 x.
  26. Sciacquare i vetrini con acqua2O ddH estesamente come descritto nei passaggi 7,17 e 7,18 e procedere al passaggio successivo immediatamente per evitare la disidratazione.
  27. Aggiungere 30 µ l di Cy3-streptavidina (0,5 mg/mL) in 30 mL di tampone di rilevamento.
  28. Collocare il vetrino in una capsula di Petri e aggiungere 30 mL di tampone di rilevamento contenente Cy3-streptavidina.
  29. Incubare in un agitatore orbitale per 20 min con continua agitazione protetto dalla luce.
    Nota: Cy-3 è una tintura fluorescente. Coprire con carta stagnola, oppure operare in condizioni di oscurità per mantenere l'intensità di fluorescenza.
  30. Eseguire i passaggi 7,24-7,26 e lasciar asciugare con un leggero getto d'aria o mettendo la diapositiva in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 1.300 x g per 5-10 min.
  31. Porre il vetrino in portavetrini e coprire con carta stagnola.
  32. Eseguire la scansione della diapositiva in uno scanner per microarray con le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione appropriate. Nel caso di Cy3, il picco di lunghezza d'onda di eccitazione è al ~ 550 nm ed emissione di picco a ~ 570 nm.
  33. Analizzare i dati (Vedi Tabella materiali) per il software utilizzato).

8. RNA 16s

  1. Seme 5 x 105 celle per ogni campione preparato in boccette di T25 cm2 e realizzare una transfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, punti 1-5.
  2. Dopo 24 h e 48 h, è possibile raccogliere le cellule dal trypsinization.
  3. Trasferire le sospensioni cellulari per provette da 15 mL e con l'etichetta di conseguenza.
  4. Estrarre RNA ai sensi dell'articolo 2, punti 1-6.
  5. Verifica qualità di RNA come pure la concentrazione con un bioanalyzer. Un'integrità di RNA Punteggio ottenuto (RIN) di sopra di otto e caso istogrammi sono necessari per confermare la qualità di RNA.
  6. Da RNA totale, utilizzare ~ 2 µ g del campione di RNA (RNA messaggero da RNA totale) di sequenziamento
  7. Sequenza utilizzando un sequenziatore di nuova generazione11.
  8. Eseguire il taglio di qualità e mappa con un genoma di riferimento dal file FASTQ generati dal RNA sequenziamento macchina11.
  9. Caricare file FASTQ e read raw i dati di conteggio in Genebank, seguendo le istruzioni dei < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> sito Web.
    Nota: Vedere il numero di accessione SRP133420 per risultati precedenti.

9. analisi di formazione tubo

  1. Valutare il potenziale angiogenico della post-transfezione di vena ombelicale umana miRNA-transfected le cellule endoteliali (HUVECs) 36 h, come descritto nella sezione 1, punti 1-5, utilizzando cellule HUVEC invece cellule A549.
  2. Morire di fame HUVECs con M199 media di inedia per 4 h a 37 ° C con 5% CO2.
  3. Rimuovere il ridotto fattore di crescita di matrice della membrana basale da-80 ° C e conservare a 4 ° C durante la notte, che permette lo scongelamento graduale evitare la polimerizzazione e la formazione di bolle.
  4. Lentamente e con cautela cappotto pozzetti di una piastra ben 96 con 0,04 mL di matrice della membrana basale di fattore di crescita ridotta, evitando la formazione di bolle. Eseguire l'intera procedura sotto cappa a flusso laminare.
  5. Riempire adiacenti pozzetti della piastra ben 96 con 0,1 mL di PBS per mantenere umidità e mantengono la temperatura.
  6. Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C per almeno 20 min affinché polimerizzazione dell'estratto della membrana dello scantinato è raggiunto. Non Incubare per più di 1 h.
  7. Tripsinizzano trasfettate HUVECs da ciascun gruppo e risospendere in medium M199 ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL.
  8. Aggiungere 0,1 mL di sospensione ogni cella dei pozzetti contenenti matrici polimerizzata della membrana dello scantinato della piastra ben 96.
  9. Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C con 5% CO2 mentre avviene la preparazione dei fattori di crescita. Preparazione dei fattori di crescita avviene anche sotto la cappa a flusso laminare.
  10. Ricostituire i fattori di crescita (VEGF) in 2 x la concentrazione finale desiderata (concentrazione di 4 ng/mL per la concentrazione finale di 2 ng/mL) e aggiungere 0,1 mL di fattore di crescita-contenente di M199 inedia terreno in cima il 0,1 mL di mezzo di inedia M199 con le cellule. Per fonti di non-VEGF-trattati, aggiungere 0,1 mL di mezzo di inedia M199 in cima il 0,1 mL di mezzo di inedia M199 con le cellule.
  11. Incubare la piastra ben 96 per 6 h a 37 ° C con 5% CO2.
  12. Alla fine del periodo d'incubazione, ottenere immagini di ciascun pozzetto con ingrandimento 4x, usando un microscopio a campo chiaro collegato con una fotocamera digitale.
  13. Elaborazione delle immagini con software è dotato di un plug-in "analizzatore di angiogenesi"19. Utilizzare tre parametri, il numero di nodi, numero di giunzioni e lunghezza totale germoglio, per confrontare gli effetti del trattamento di miRNA sull'angiogenesi.

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Representative Results

Analisi dell'espressione genica tramite RT-qPCR ed elettroforesi su gel

Analisi di espressione genica differenziale usando RT-qPCR dimostrato significativi downregulation dei geni mirati CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 sono stati indicati per essere strumentale per il G2/M e transizioni G1/S, rispettivamente. Le analisi eseguite ha permesso il confronto diretto tra miRs individuale e attività di miR combinatoria. L'uso di scramble siRNA con l'agente trasfettando consentito la valutazione di eventuali interferenze da parte della procedura su rilevato downregulation di gene, che è stato minimo. I dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando di uno studente a due code t-prova, ep < 0,05 è stato considerato statisticamente significativa (Figura 1). Prima del qPCR, le sequenze dell'iniettore sono state valutate usando primer-BLAST < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> per singola amplificazione del gene. Ciò è stato confermato anche analizzando i prodotti di amplificazione tramite l'elettroforesi del gel. Una singola banda di prodotti del DNA è stata rilevata per ciascun gene analizzato (Figura 1), confermando l'amplificazione del gene singolo. CDK6 singola amplificazione è stato confermato (dati non mostrati).

Figure 1
Figura 1 : Espressione relativa dei geni CDK1, CDK4 e CDK6 come rilevato da qPCR e analisi di elettroforesi del gel dei prodotti di amplificazione di DNA. miR-143 e miR-506 trasfezione di cellule A549 indotto downregulation del downregulation CDK1 (A), CDK4 (B) e CDK6 (C) a 24 h e post-transfezione 48h. I prodotti di amplificazione di DNA sono stati valutati mediante elettroforesi su gel (D) per confermare l'amplificazione del gene singolo. GAPDH è stato utilizzato come gene di riferimento. Media ± SEM, * p < 0.05; * * p < 0.01, due code t-test. Questa figura è stata modificata da Penny et al.11Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Distribuzione del ciclo cellulare mediante citometria a flusso

Ioduro di propidio degli acidi nucleici cellulari è un metodo standard per visualizzare la popolazione delle cellule in diversi stadi del ciclo cellulare dalla quantificazione del contenuto di DNA. Il trattamento combinatorio di miR-143 e miR-506 interrotto il ciclo cellulare a due posti di blocco, G0/G1 e G2/M, come indicato tramite l'analisi cytometric di flusso (Figura 2).

Figure 2
Figura 2 : Analisi del ciclo cellulare delle cellule A549 transfected con miR-143 e miR-506 a 24 h e post-transfezione 48 h. Le percentuali di popolazioni di cellule per ogni ciclo cellulare sono state determinate mediante citometria a flusso e ioduro di propidio DNA-legantesi. Media ± SEM. Questa figura è ristampata con modifiche da Penny et al.11Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dosaggio di apoptosi Annexina V/PI tramite flusso cytometry

A seguito di transfezione delle cellule A549 con miR-143 e miR-506, un saggio di apoptosi è stato effettuato usando Annexin V e PI che macchia e flusso cytometry. È stato identificato che il trattamento combinatorio ha indotto il apoptosis significativo timepoints h 24 e 48 h. Rispetto ai controlli negativi, la variazione percentuale delle cellule apoptotiche è stata determinata come rilevato dalle cellule Annessina V positive, a causa del trattamento di miR come presentato nella Figura 3.

Figure 3
Figura 3 : Analisi illustrativa delle cellule apoptotiche. Transection con miR-143 e miR-506 aumentato la percentuale di cellule A549 positive Annessina V. Media ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01, due code t-test. Questa figura è stata modificata da Penny et al.11Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ciclo cellulare anticorpo microarray

Meccanicistiche risposte al trattamento possono essere identificate attraverso i cambiamenti nell'espressione della proteina. Espressione differenziale è stata valutata a livello di proteina di geni associati con il pathway di ciclo cellulare utilizzando un percorso specifico anticorpo microarray. Gli estratti proteici sono stati utilizzati per l'analisi da cellule trasfettate con miR-143/506. L'analisi di microarray ammessi per analisi semi-quantitativa di proteine ~ 60 ciclo cellulare, con sei repliche per ogni anticorpo specifico. L'approccio consente una prospettiva più ampia del comportamento meccanicistico all'interno di un percorso specifico, identificazione di bersagli molecolari per ulteriore valutazione e l'esecuzione di analisi a livello post-traduzionale. A causa del principio semi-quantitativa del metodo, qualsiasi risultati su geni specifici devono essere confermati mediante western blot. Indicativamente, in questa analisi, è stata rilevata una diminuita espressione di proteine associate con la progressione del ciclo cellulare. Questo comprendeva la mirata CDK1 e CDK4 sia a 24 h e post-transfezione 48h (Figura 4A), come rilevato da qPCR.

Figure 4
Figura 4 : Disregolazione genica come rilevato da microarray e l'analisi di sequenziamento di RNA. (A) Heatmap delle espressioni di gene di ciclo cellulare via come rilevato da analisi di microarray di proteine estratti dalle cellule A549 trasfettate con miR-143 e miR-506, a 24 h e post-transfezione 48h. (B) fold cambio di espressioni geniche di ciclo cellulare via dalle cellule A549 transfected con miR-143 e miR-506 a post-transfezione 24h, come rilevato dal sequenziamento di RNA. Attività di (C) via come analizzati dal software di analisi di via dai dati ottenuti dal sequenziamento di RNA. Questa figura è stata modificata da Penny et al.. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi di sequenziamento e via di RNA utilizzando software di analisi del percorso

Sequenziamento di nuova generazione analizza con precisione l'espressione genica a livello di RNA. Il metodo consente per l'identificazione dei molteplici cambiamenti genica attraverso una singola analisi (nel presente protocollo, l'analisi ha rilevato l'espressione di > 18.000 geni). Dovuto il gran numero di geni individuati, l'analisi bioinformatica è stata usata per efficiente determinazione del comportamento di via (Figura 4B). Il software è stato poi utilizzato (Vedi Tabella materiali) per predire gli arresti di fase G1/S e G2/M e il downregulation di S fase di iniziazione (Figura 4). Inoltre, i risultati del sequenziamento di RNA possono essere rispetto ai dati di qPCR. In questo studio, il sequenziamento di RNA ha confermato i risultati dall'analisi qPCR, che indica un downregulation di CDK1 (48%, p < 0,001, FDR < 0.001), CDK4 (68%, p < 0,001, FDR < 0.001) e CDK6 (71%, < 0,001, FDR < 0.001) a causa attività di miR-143 e miR-506 combinatoria. Analisi statistica è stata eseguita dal software EdgeR utilizzato per il calcolo dell'espressione genica relativa, calcolo dei valori di p utilizzando binomiale negativo20,21. L'analisi bioinformatica può essere eseguita per la valutazione funzionale dell'attività di miRNA e la previsione di potenziali bersagli molecolari, come illustrato nella Figura 5.

Figure 5
Figura 5 : Percorso illustrativo e analisi meccanicistica come presentato da via analisi aoftware. Dati di sequenziamento di RNA è stati analizzati dalle cellule A549 transfettate con post-transfezione miR-143 e miR-506, 24h, utilizzando software di analisi del percorso e le vie canoniche identificate con il punteggio più basso (A) o più alto (B) attivazione. Il software fornito anche predetto funzioni (C) ed i regolatori/bersagli potenziali a Monte (D). Questa figura è ristampata da Penny et al.. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi di formazione endoteliale tubo

Il metodo di formazione tubo endoteliali in vitro è ampiamente usato per studiare l'angiogenesi ed è affidabile, automatico e quantificabili22. Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) è un fattore di crescita angiogenici ben noto23,24 e tubo endoteliale formazione promotore. In questo studio, è stato identificato che il trattamento combinatorio di miR-143 e miR-506 abroga l'angiogenesi indotta da VEGF. Immagini indicativi di formazione del tubo e gli effetti del trattamento sono presentati nella Figura 6.

Figure 6
Figura 6 : Immagini rappresentative dei germogli endoteliali di VEGF-trattati vs non trattati HUVECs transfected con scramble miRNA, miRNA-143, miRNA-506 o una loro combinazione. Immagini sono state ottenute con un microscopio a campo chiaro dotato di una fotocamera digitale sotto ingrandimento 4x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Mirna possono operare come terapie mirate per il trattamento del cancro, riconoscendo l'alterazione dei livelli di espressione in malati vs tessuti normali. Questo studio mira a determinare i miRNA che potenzialmente fermare la progressione del ciclo cellulare durante le fasi multiple. È stato identificato che miR-143 e miR-506 arrestare il ciclo cellulare delle cellule tumorali e i protocolli presentati volti a comprendere l'attività di questo trattamento di miRNA combinatoria.

Le metodologie descritte forniscono una comprensione globale della funzione di Mirna. Le sfide di studiare miRNA sono associate con la loro capacità di geni multipli dell'obiettivo e così influenzare le vie multiple. L'analisi qPCR descritto permette l'identificazione dell'espressione di specifici geni di interesse, se gli obiettivi specifici sono identificati prima del trattamento. Ad esempio, l'obiettivo principale qui era l'espressione di CDK1 e CDK4/6 e il ciclo cellulare.

Così, analisi del ciclo cellulare utilizzando il protocollo di propidio ioduro e flusso cytometry è un approccio affidabile per rilevare alterazioni nelle popolazioni delle cellule secondo la loro fase nel ciclo cellulare. Il metodo si basa sull'aumento proporzionato del segnale di fluorescenza da PI, che si lega al DNA, corrispondente alla fase del ciclo cellulare. In breve, le cellule nella fase S sintetizzano DNA, inducendo segnali più elevati di cellule in fase G0/G1 e cellule nella fase G2 hanno duplicato il loro DNA, producendo il segnale più intenso.

Raccogliendo la prova indica la connessione di danno al ciclo cellulare e attivazione dell'apoptosi25. Il metodo di cytometry di flusso utilizzando Annexin VI/PI è stato utilizzato costantemente per l'identificazione dell'apoptosi indotta in cellule da trattamento chemioterapico. Indicativamente, una risposta apoptotica forte è stata identificata dovuto la terapia combinatoria miRNA, che era più potente rispetto ai singoli miRNA.

Il semi-quantitativa della proteina anticorpo microarray è un metodo sensibile e affidabile per identificare proteine espressione alterazioni specifiche risposte biologiche26,27. Questo protocollo utilizzato un ciclo cellulare via specifico anticorpo microarray, che rilevato cambiamenti di espressione in ~ 60 geni tra cellule trattate e non trattate. L'attenzione è richiesta durante le fasi di lavaggio per garantire che il processo sia stato eseguito accuratamente e ridurre al minimo il segnale di fondo. Inoltre, le diapositive non dovrebbero diventare secche fino al completamento dell'esperimento.

Al contrario, sequenziamento di RNA fornisce analisi di espressioni quantitative genica di geni multipli, a livello post-trascrizione. Il significativamente gran numero di geni analizzati (> 18.000 per RNA-seq vs 60 per microarray) permette l'analisi simultanea di molteplici meccanismi e bersagli molecolari e con maggiore precisione. Tale ampia analisi sono importante, in quanto un singolo miRNA possa associare a e target differenti mRNA. Al contrario, l'analisi dei percorsi di tantissimi i dysregulations gene è intrinsecamente difficile. Ad esempio, sebbene il sequenziamento di RNA ha confermato i nostri dati di qPCR riguardanti downregulation CDK1 e CDK4/6 a causa del trattamento di miRNA, l'analisi ha inoltre fornito dati su migliaia di geni che sono stati anche giù- o up-regolato. Per fornire un contesto per tali numerosi i dysregulations gene, software di analisi del percorso è stato utilizzato per determinare effetti complessivi del trattamento su diversi pathway e funzioni cellulari. Indicativamente, il software fornito rappresentante di punteggi per l'attivazione (Punteggio z positivo) o inattivazione (Punteggio z negativo) di specifiche funzioni o vie, come pure la significatività statistica delle analisi (Figura 5)28.

In conclusione, lo studio dell'attività di miRNA è una procedura difficile. La capacità intrinseca di Mirna per interessare i geni multipli richiede l'utilizzo di più metodi di analisi elaborati e complicati per identificare potenziali attività. Non sorprendentemente, ulteriore lavoro è necessario per comprendere pienamente le attività di miR-143 e miR-506 nel cancro polmonare.

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Disclosures

Gli autori desidera ringraziare John Caskey alla Louisiana State University per la sua assistenza sull'analisi di dati di sequenziamento di RNA e l'Università del Texas Southwestern Medical Center, McDermott centro prossima generazione sequenziamento Core per via eseguire l'analisi di dati e sequenziamento di RNA. Questa ricerca è stata sostenuta da College di farmacia, Università della Louisiana Monroe Start-up finanziamenti e il National Institutes of Health (NIH) attraverso l'Istituto nazionale di generale Medical Science sovvenzioni 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgments

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi
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Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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