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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Published: March 30, 2019 doi: 10.3791/59460
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 2, 1
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

ERRATUM NOTICE

Summary

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Abstract

Câncer de pulmão (LC) é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Semelhante a outras células de câncer, uma característica fundamental das células LC é a proliferação desregulada e divisão celular. Inibição da proliferação de travar a progressão do ciclo celular tem demonstrada ser uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, incluindo o LC.

miRNA terapêutica têm emergido como reguladores do importante gene pós-transcricional e cada vez mais estão sendo estudadas para uso no tratamento do câncer. Em recente trabalho, utilizamos dois miRNAs, miR-143 e miR-506, para regular a progressão do ciclo celular. Células de câncer (NSCLC) de pulmão não-pequenas células A549 foram transfectadas, analisaram-se alterações de expressão de gene e atividade apoptotic devido ao tratamento foi finalmente analisada. Downregulation de quinases cyclin-dependente (CDKs) foram detectados (i.e., CDK1, CDK4 e CDK6), e o ciclo celular parou nas transições de fase G1/S e G2/M. Análise do caminho indicado potencial atividade antiangiogênica do tratamento, que dota a abordagem com atividade multifacetada. Aqui descritos são as metodologias utilizadas para identificar a atividade de miRNA relativas à inibição do ciclo celular, indução da apoptose e efeitos do tratamento em células endoteliais através da inibição da angiogênese. Espera-se que os métodos apresentados aqui vão apoiar pesquisas futuras na terapêutica de miRNA e atividade correspondente e que os dados representativos guiará outros pesquisadores durante as análises experimentais.

Introduction

O ciclo celular é uma combinação de vários eventos regulatórios que permitem a duplicação de DNA e a célula proliferação através do processo mitótico1. Quinases cyclin-dependente (CDKs) regulam e promovem o ciclo celular2. Entre eles, o CDK mitótica (CDK1) e CDKs interfase (CDK2, CDK4 e CDK6) têm um papel essencial no ciclo celular progressão3. Proteína do retinoblastoma (Rb) é fosforilada pelo CDK4/CDK6 complexo para permitir de progressão do ciclo celular4, e ativação de CDK1 é essencial para o sucesso de divisão celular5. Inibidores CDK numerosas foram desenvolvidos e avaliados em ensaios clínicos ao longo das últimas décadas, indicando o potencial de segmentação CDKs no tratamento do câncer. Na verdade, três inibidores CDK foram aprovados para o tratamento do câncer de mama recentemente6,7,8,9,10. Assim, CDKs, e em particular, a CDK1 e CDK4/6, são de grande interesse na regulamentação da progressão de células de câncer.

os miRNAs (miRs) são RNAs pequenos, não-codificantes e reguladores pós-transcricional da expressão gênica, regulação de aproximadamente 30% de todos os genes humanos11. Sua atividade baseia-se na repressão translacional ou degradação de RNA mensageiro (mRNAs)12. Ilustrativos do seu significado biológico, mais de 5.000 miRNAs foram identificados e uma molécula de miRNA único pode regular vários genes11,13. Mais importante, miRNA expressão tem sido associado com doenças diferentes e status de doenças, incluindo câncer13. Na verdade, os miRNAs foram caracterizados como oncogênicos ou supressores de tumor, sendo capaz de promover ou suprimir tumor desenvolvimento e progressão de14,15. A expressão relativa de miRNAs em tecidos doentes pode regular a progressão da doença; assim, entrega exógena de miRNAs tem potencial terapêutico.

Câncer de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e maior do que 60% de todas as neoplasias malignas de pulmão não-pequenas células de pulmão câncer16,17com uma taxa de sobrevida de 5 anos de menos de 20%18. O uso de miR-143-3 p e p miR-506-3 foi avaliado recentemente para o direcionamento os ciclos de celular de células de câncer de pulmão11. miR-143 e miR-506 têm sequências que são complementaridade a CDK1 e CDK4/CDK6, e foram analisados os efeitos destes dois miRs sobre A549 células. Os detalhes experimentais são apresentados e discutidos neste artigo. Expressão gênica, progressão do ciclo celular e apoptose foram avaliados usando diferentes desenhos experimentais e momentos seguindo do transfection. Usamos métodos quantitativos em tempo real do PCR (RT-qPCR) juntamente com a análise de microarray para medir a expressão de genes específicos, e a sequenciação do ARN de próxima geração foi usada para determinar o gene global desregulagem11. O último método identifica a abundância relativa de transcrição do gene cada com alta sensibilidade e reprodutibilidade, enquanto milhares de genes podem ser analisados a partir de uma única análise experimental. Além disso, análise de apoptose devido ao tratamento de miRNA foi realizada e está descrito aqui. Bioinformática completada a análise de percurso. Aqui apresentados são protocolos usados para análise da terapêutica potencial de miR-143 a combinatória e miR-506.

O principal objectivo do presente protocolo é identificar os efeitos de miRNAs nas células, com um foco sobre o ciclo celular. A variedade das técnicas aqui apresentadas extensão de análise de expressão do gene tradução prévia (usando qPCR) para elaborar e novela técnicas para análise do gene no nível da proteína, tais como análise de microarray. Espera-se que este relatório é útil para pesquisadores interessados em trabalhar com os miRNAs. Além disso, é apresentada a metodologia para análise de fluxo cytometric do ciclo celular e apoptose de células.

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Protocol

1. miR-143 e miR-506 transfecção

Atenção: Utilize luvas de látex, óculos de protecção e um casaco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de segurança biológica com o ventilador do gabinete, sem bloqueio das vias aéreas ou perturbando o fluxo de ar laminar. Sempre como a janela de vidro protegendo a altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.

  1. Células de NSCLC A549 semente em uma T25 cm2 balão/6/96 bem placa em DMEM/F12K mídia suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina (meios de cultura) em uma capa de cultura de tecidos e incubam durante uma noite a 37 ° C com 5% CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.
  2. Suspender a miR-143 e/ou miR-506 imita ou embaralhar siRNA com agente transfecting (2,4 µ g do miR foram misturadas com 14 µ l de agente transfecting; ver Tabela de materiais) em 500 µ l de transfeccao mídia e 1,5 mL de soro e sem antibióticos DMEM/F12K mídia em um concentração de miRNA final de 100 nM. quantidade de miRNA pode exigir otimização em diferentes células e concentrações. Abordagens adequadas incluem a transfecção de células com o aumento da concentração de miRNA (ou seja, 50-200 nM) e avaliação de expressão downregulation de genes de interesse.
  3. Remover de meios de cultura de balão/placa e lave uma vez com PBS 1x.
  4. Adicionar miRNA/scramble-transfecting complexos de agente e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 6 h (tamanho da cubeta define o volume adicionado de incubação).
  5. Substituir a mídia com 4 mL de meio de cultura e incubar as células para 24h ou 48h.
  6. Colher células transfectadas por tripsinização, adicionando 1 mL de EDTA-tripsina em cada balão de2 cm T25, incubar durante 5-10 min a 37 ° C e adicionar 3 mL de meio de cultura para colher as células. Coloca o conteúdo de cada frasco em um tubo de 15ml separado, marcado. Trabalho em uma capa de cultura de tecidos.
  7. Centrifugar a 751 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
    Nota: Precaução é necessária durante a remoção do sobrenadante, como a agitação do tubo pode causar a perda de células.
  8. Adicionar 2 mL de 1X PBS e centrifugar por 5 min em 751 x g.
  9. Repita as etapas 7 e 8 de uma vez para remover quaisquer vestígios de mídia e o sobrenadante.
    Nota: Nesta fase, os tubos de amostra podem ser armazenados a-80 ° C ou podem ser usados imediatamente.

2. extração do RNA

  1. Limpe a área de trabalho por pulverização com álcool isopropílico a 70% e solução de descontaminação de RNAse.
  2. Extração do RNA deve ser realizada usando um RNA apropriado kit (veja a Tabela de materiais).
  3. Retirar os tubos de-80 ° C e permitir-lhes descongelar. Adicione 300 µ l de tampão de Lise e pipeta de cima e para baixo para quebrar a membrana celular.
  4. Adicione um volume igual de etanol ultra puro de 100%.
  5. Misturar bem e colocar na coluna de separação.
  6. Entre 11 e 16 x g durante 30 s e remover o fluxo através de centrifugação.
  7. Adicione 400 µ l de tampão e centrífuga para remover o tampão de lavagem.
  8. Adicione 5 µ l de DNAse eu com 75 µ l da digestão do DNA de buffer em cada amostra e incube por 15 min.
  9. Lave a amostra com 400 µ l de tampão prep de RNA.
  10. Lave 2 x com tampão de lavagem do RNA.
  11. Adicione água nuclease-livre para a coluna, centrífuga, então recolher o RNA.
  12. Medir a concentração de RNA total com um espectrofotômetro UV.

3. RT-qPCR

  1. Antes da RT-qPCR, sintetiza o cDNA. Na sequência de quantificação da concentração de RNA, coloque 1 µ g de RNA em um volume de final 20 µ l de reação para preparar o cDNA em um tubo PCR. Sempre trabalha sobre uma bancada limpa.
  2. Todos os outros ingredientes necessários estão incluídos na tabela 1.
Ingredientes Quantidade (µ l) / (20 µ l) de amostra
5 X cDNA mestre misturar 4
dNTPs 2
Hexâmeros aleatórios 1
Potenciador de RT 1
Mistura de enzima verso 1
Água livre de DNase e RNase Qtde necessária após a adição de RNA para fazer 20 µ l

Tabela 1: Materiais para a síntese do cDNA de amostras do RNA. Necessárias quantidades dos respectivos ingredientes para preparar uma mistura de mestre para uma amostra para a síntese do cDNA.

  1. Incubar em um termociclador com as seguintes condições de temperatura: 42 ° C por 30 min; 95 ° C por 2 min; 4 ° C até a coleta de amostras.
  2. Usar imediatamente em regular PCR ou qPCR, ou armazenar o cDNA a-20 ° C.
  3. Prepare soluções de cartilha frente e verso com DNase/RNase-livre de água em uma concentração de 10 µM de solução estoque da primeira demão.
  4. Prepare a mistura de mestre separada para cada gene a ser detectadas, de acordo com o número de amostras. Para cada amostra de cDNA (qPCR bem), a quantidade de reação é preparada de acordo com a tabela 2.
Ingredientes Quantidade (µ l) / (20 µ l) de amostra
Mistura de mestre SYBR 10
Encaminhar Primer - 10 μM 2
Primer reverso - 10 μM 2
Água livre de DNase e RNase 3
amostra de cDNA 3

Tabela 2: materiais para PCR quantitativo em tempo real, de amostras de cDNA. Necessária a quantidade de ingredientes para preparar uma mistura de mestre para uma amostra para qPCR.

  1. Coloca cada amostra dos respectivos poços.
  2. Criar o layout de amostra para a placa de 96 qPCR bem. Para cada amostra e gene analisado, realizar a reação triplica, ou pelo menos em duplicatas.
  3. A placa bem 96 com uma capa de opticamente adesiva do selo.
  4. Rápido-girar a placa para permitir a mistura de reação para atingir o fundo de cada poço.
  5. Execute o RT-qPCR de acordo com o seguinte gradiente térmico:
    1) 50 ° C por 2 min
    2) 95 ° C por 2 min
    3) 95 ° C por 15 s
    4) tomar a leitura
    5) 60 ° C por 1,5 min
    6) Repita a etapa 3 para 39 vezes
  6. Execute o seguinte gradiente térmico na continuação de acima para determinar a curva de fusão que indica a amplificação de único produto.
    7) 65 ° C por min 0,31
    0,5 ° C/ciclo
    9) leitura de placa
    10) Repita o passo 8 para 60 vezes até atingir 95 ° C
    11) 72 ° C por 2 min

4. eletroforese em gel de Agarose para confirmar a amplificação de gene única

  1. Prepare o gel de agarose 1% em 1 x TBE de buffer.
  2. Adicionar o brometo de etídio (EtBr) em gel quente (~ 50 ° C) até atingir uma concentração final de aproximadamente 0,2-0,5 µ g/mL. EtBR vincula com DNA e lhe permite ser visualizado sob luz em um gerador de imagens de gel UV.
  3. Despeje o gel quente em uma bandeja de gel fornecida com uma caixa de gel de eletroforese. Anexe o pente fornecido firmemente para poços de uniformes.
  4. Permitir que o gel para descanso e arrefecer à temperatura ambiente (RT) para ~ 30 min.
  5. Quando o gel é solidificado, coloque o gel e bandeja na caixa de gel.
  6. Encha a caixa de gel com 1 x TBE buffer até que o gel está completamente coberto.
  7. Medir a concentração do DNA do processo de amplificação do PCR usando um espectrômetro UV.
  8. Pegue ~ 15 ng de DNA em um pequeno tubo PCR, adicione 5 µ l de tintura e adicione a quantidade necessária de água livre de nuclease para alcançar um volume total de 15 µ l.
  9. Carrega a escada de DNA e amostras nos poços.
  10. Funcione o gel a 100 V, até a linha de tintura é aproximadamente 75% - 80% abaixo do gel.
    Nota: Certifique-se que o gel é executado a partir de um negativo de carga positiva.
  11. Remover o gel e coloque-o no tonalizador de gel para visualizar o DNA.

5. análise de ciclo de celular

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em um balão de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, em seguida recolher as células por tripsinização.
  3. As suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL estéreis e rotulá-los corretamente.
  4. Centrifugar as amostras a 751 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vortex e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1X PBS para remover mídia residual.
  7. Resuspenda e quebrar a pelota adicionando-se 200 µ l de PBS 1x gelada por pipetagem.
  8. Corrigi as células adicionando 2 mL de etanol a 70% gelado gota a gota ao tubo enquanto num Vortex suavemente.
  9. Incubar os tubos por 30 min em RT e coloque os tubos a 4 ° C, durante 1 h.
  10. Remova os tubos de 4 ° C e centrifugar 751 x g por 5 min.
  11. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vortex e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  12. Adicionar 500 µ l de 1X PBS com iodeto de propidium (50 µ g/mL) e ribonuclease um (200 µ g/mL)
  13. Incube durante 30 min à RT ao proteger as amostras de luz.
  14. Aquisição de dados em citômetro de fluxo. Usar-se para a frente vs dispersão lateral (FSC vs CCD) para selecionar a principal população de células, excluindo os restos no canto esquerdo inferior da FSC vs CCD densidade enredo e célula clusters no topo a topo-lado direito do enredo de densidade do FSC vs CCD.
  15. Analise os dados para identificação de populações de células por fase do ciclo celular com software apropriado.

6. apoptose ensaio

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em um balão de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, recolher as células por tripsinização.
  3. As suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL estéreis e rotulá-los corretamente.
  4. Centrifugar a 751 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vortex e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1X PBS para remover mídia residual.
  7. Diluir 10 x buffer de vinculação anexina V para 1x com gelada dH2O.
  8. Adicionar 1 mL de tampão de ligação anexina V 1x a cada tubo de amostra e ressuspender delicadamente.
  9. Suspensão de células de lugar 96 µ l em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
  10. Adicione 1 µ l de conjugado anexina V-FITC e 12,5 µ l de iodeto de propidium (PI) para o tubo contendo a suspensão de eritrócitos.
  11. Incube a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos no gelo no escuro.
  12. Adicione 250 µ l gelada 1 x buffer de vinculação anexina V para cada tubo de amostra para diluir.
  13. Analise amostras com citômetro de fluxo imediatamente.

7. expressão de proteína por microarray do ciclo celular anticorpo

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em frascos de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, colha células por tripsinização.
  3. Suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL e classificá-los em conformidade.
  4. Centrifugar a 751 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 2 mL de PBS 1x gelada, vórtice e centrifugar 751 x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
  6. Repita a etapa de lavagem com 1X PBS.
  7. Adicione 150 µ l de tampão de Lise suplementado com inibidores de protease. Pipeta acima e para baixo suavemente para romper as membranas celulares.
  8. Para evitar qualquer interferência de tampão de Lise, execute uma troca de reserva para substituir o tampão de Lise com buffer de rotulagem, usando colunas de troca solvente do fabricante.
  9. Quantificar a proteína total com um ensaio BCA.
  10. Pegue 70 µ g de amostra de proteína e adicionar buffer de rotulagem para alcançar um volume final de 75 µ l.
  11. Adicione 100 µ l de dimetilformamida (DMF) a 1 mg de reagente de biotina (biotina/DMF).
  12. Adicionar 3 µ l do biotina/DMF para cada amostra de proteína (biotinilado amostra de proteína) e incube por 2 h no RT
  13. Adicione 35 µ l de reagente de paragem e misture num Vortex.
  14. Incube as amostras na RT por 30 min.
  15. Retire as lâminas de microarray da geladeira para que eles o aquecimento para RT para 1 h antes do uso.
  16. Realizar bloqueio para inespecificas incubando-se as lâminas com solução de 3% de leite seco (no bloqueio reagente fornecida pelo fabricante) em uma placa de Petri com agitação contínua durante 45 min à RT
  17. Lave os slides com água de2O ddH (a menos que especificado de outra forma, lavagem ocorre com DDQ2O).
  18. Repita a etapa de lavagem ~ 10 x para remover completamente a solução bloqueio de superfícies o slide. Isto é importante para alcançar um fundo uniforme e baixo.
  19. Remover excesso de água das superfícies slide e prossiga para a etapa seguinte sem deixar os slides que seque.
  20. Prepare a solução de acoplamento dissolvendo leite seco 3% em um reagente de acoplamento.
  21. Adicione 6 mL da solução de acoplamento e à quantidade da amostra previamente preparada biotinilado proteína completa da etapa 7.12.
  22. Lugar um slide em um poço da câmara de acoplamento fornecido pelo fornecedor e adicionar ~ 6 mL de proteína acoplamento mistura a ele.
    Nota: Certifique-se que o slide é totalmente submersa na proteína mistura solução de acoplamento.
  23. Tampa da câmara de acoplamento e incubar durante 2 h a RT com agitação contínua em um agitador orbital.
  24. Transferir os slides para uma placa de Petri e adicionar 30 mL de 1x tampão de lavagem. Coloque o prato de Petri em agitador orbital, agitar durante 10 min e descartar a solução.
  25. Repita a etapa 7,24 2 x.
  26. Enxágue as lâminas com água de2O ddH extensivamente como descrito nos passos 7.17 e 7.18 e prossiga para a próxima etapa imediatamente para evitar a secagem.
  27. Adicione 30 µ l de Cy3-streptavidin (0,5 mg/mL) em 30 mL de tampão de deteção.
  28. Coloque o slide em uma placa de Petri e adicionar 30 mL de solução tampão de deteção com Cy3-estreptavidina.
  29. Incube em um agitador orbital por 20 min com agitação contínua protegida da luz.
    Nota: Cy-3 é um corante fluorescente. Cubra com papel alumínio ou operar em condições de escuras para manter a intensidade da fluorescência.
  30. Executar etapas 7.24-7.26 e permitir que o slide secar usando uma ligeira corrente de ar ou colocar o slide em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar 1300 x g por 5-10 min.
  31. Coloque o slide na tampa com papel alumínio e slide.
  32. Digitalize o slide em um scanner de microarray com os apropriado da excitação e emissão de comprimentos de onda. No caso de Cy3, o pico de comprimento de onda de excitação é em ~ 550 nm e emissão de pico em ~ 570 nm.
  33. Analise os dados (ver Tabela de materiais) para software utilizado).

8. a sequenciação do ARN

  1. Células de5 sementes 5 x 10 para cada amostra em frascos de2 cm T25 e executam uma transfecção de acordo com o protocolo descrito no ponto 1, as etapas 1 a 5.
  2. Após 24 h e 48 h, recolher as células por tripsinização.
  3. As suspensões celulares de transferência para tubos de 15 mL e classificá-los em conformidade.
  4. Extraia o RNA de acordo com a seção 2, as etapas 1 a 6.
  5. Verificar a qualidade do RNA, bem como a concentração com um bioanalyzer. Uma integridade de RNA Pontuação (RIN) acima de oito anos e adequado histogramas são necessárias para confirmar a qualidade do RNA.
  6. Partir do RNA total, use ~ 2 µ g da amostra de RNA (RNA mensageiro de RNA total) de sequenciamento
  7. Sequência usando um sequenciador de última geração11.
  8. Executar a filtragem de qualidade e um mapa com um genoma de referência de FASTQ arquivos gerados a partir do RNA sequenciamento máquina11.
  9. Upload de arquivos FASTQ e cru leitura os dados de contagem para o banco de germoplasma, seguindo as instruções do < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/> site.
    Nota: Ver número de adesão SRP133420 para resultados anteriores.

9. ensaio de formação de tubo

  1. Avalie o potencial angiogênico da veia umbilical humana miRNA-transfectadas do pós-transfection 36h de células endoteliais (HX), conforme descrito na seção 1, as etapas 1-5, usando HUVEC células em vez de células A549.
  2. Fome HX com mídia de fome M199 por 4 h a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Remova a matriz de membrana basal reduzida de fator de crescimento de-80 ° C e loja a 4 ° C durante a noite, permitindo o descongelamento gradual evitar a polimerização e formação de bolhas.
  4. Lentamente e com cuidado casaco poços de uma placa bem 96 com 0,04 mL de matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido, evitando a formação de bolhas. Execute todo o processo sob uma capa de fluxo laminar.
  5. Preencha cavidades adjacentes da placa bem 96 com 0,1 mL de PBS para manter a umidade e mantém a temperatura.
  6. Incube a placa bem 96 a 37 ° C durante pelo menos 20 minutos para que a polimerização do extrato de membrana basal é alcançada. Não incube durante mais de 1 h.
  7. Trypsinize transfectadas HX de cada grupo e Resuspenda em meio M199 com uma concentração de 1 x 105 células/mL.
  8. Adicione 0,1 mL de cada suspensão de células nos poços contendo matriz polimerizada membrana basal em placa de 96 bem.
  9. Incube a placa bem 96 a 37 ° C com 5% CO2 enquanto preparação dos fatores de crescimento ocorre. Preparação de fatores de crescimento também ocorre sob o capô de fluxo laminar.
  10. Reconstituir os fatores de crescimento (VEGF) em 2x a concentração final desejada (4 concentração de ng/mL para concentração final de 2 ng/mL) e adicionar 0,1 mL de fator de crescimento, contendo meio de fome M199 em cima a 0,1 mL do meio de fome M199 com as células. Para poços de VEGF não-tratados, adicione 0,1 mL de meio de fome M199 em cima a 0,1 mL do meio de fome M199 com as células.
  11. Incube a placa bem 96 para 6 h a 37 ° C com 5% de CO2.
  12. No final do período de incubação, obter imagens de cada poço com ampliação de 4x, usando um microscópio de brightfield conectado com uma câmera digital.
  13. Processar imagens com software equipado com um plug-in "angiogênese analisador"19. Use três parâmetros, o número de nós, o número de cruzamentos e comprimento total de broto, para comparar os efeitos do tratamento de miRNA na angiogênese.

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Representative Results

Análise da expressão de gene usando a electroforese do gel e RT-qPCR

Análise da expressão de genes diferencial usando RT-qPCR demonstrou significativa downregulation de genes alvo CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 foram mostrados para ser instrumental para o G2/M e transições de G1/S, respectivamente. A análise realizada permitiu a comparação directa entre miRs individuais e atividade combinatória miR. O uso de siRNA scramble com o agente transfecting permitido a avaliação de qualquer interferência do procedimento em detectado downregulation de gene, que era mínima. Os dados foram analisados estatisticamente usando de um student bicaudal t-teste, ep < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (Figura 1). Antes da qPCR, as sequências de primeira demão foram avaliadas usando primer-BLAST < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/> para amplificação de gene única. Isto também foi confirmado pela análise dos produtos de amplificação através de eletroforese em gel. Uma única banda de produtos DNA foi detectada para cada gene analisado (Figura 1), confirmando a amplificação de gene única. CDK6 única amplificação foi confirmado (dados não mostrados).

Figure 1
Figura 1 : Expressão relativa dos genes CDK1, CDK4 e CDK6 detectadas por qPCR e análise de eletroforese de gel dos produtos de amplificação de DNA. miR-143 e miR-506 transfecção de células A549 induzido downregulation de downregulation CDK1 (A), B CDK4 e CDK6 (C) em 24h e pós-transfecção 48 h. Produtos de amplificação de DNA foram avaliados por eletroforese em gel (D) para confirmar a amplificação de gene única. GAPDH utilizou-se como gene de referência. Média ± SEM, * p. < 0,05; * * p < 0,01, bicaudal t-teste. Esta figura foi modificada de Marise et al11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Distribuição de ciclo celular usando citometria de fluxo

Propidium iodeto coloração de celular de ácidos nucleicos é um método padrão para visualizar a população de células em diferentes fases do ciclo celular por quantificação do teor de DNA. O tratamento combinatório de miR-143 e miR-506 interrompida do ciclo celular em dois postos de controle, G0/G1 e G2/M, como indicado por meio de análise de fluxo cytometric (Figura 2).

Figure 2
Figura 2 : Análise de ciclo celular de células A549 transfected com miR-143 e miR-506 em 24 h e pós-transfecção 48 h. Percentagens de populações de célula para cada ciclo celular foram determinadas por citometria de fluxo e iodeto de propidium DNA-ligando. Média ± SEM. Esta figura é reproduzida com modificações de Marise et al11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Anexina ensaio de apoptose V/PI por citometria de fluxo

Transfecção de células A549 com miR-143 e miR-506, na sequência de um ensaio de apoptose foi realizado usando a anexina V e citometria de fluxo e coloração de PI. Identificou-se que o tratamento combinatório induzida apoptose significativa em momentos 24 h e 48 h. Em comparação com os controles negativos, a %-mudança de pilhas apoptotic foi determinada como detectado pelas células positivas anexina V, devido ao tratamento de miR, tal como apresentado na Figura 3.

Figure 3
Figura 3 : Análise ilustrativa de pilhas apoptotic. Transecção com miR-143 e miR-506 aumentou a porcentagem de células positivas de A549 anexina V. Média ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0,01, bicaudal t-teste. Esta figura foi modificada de Marise et al11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ciclo celular anticorpo microarray

Mecanicistas respostas ao tratamento podem ser identificadas através de mudanças na expressão da proteína. Expressão diferencial foi avaliada em um nível de proteína de genes associados com o percurso do ciclo celular usando um caminho específico do anticorpo microarray. Extratos de proteína foram utilizados para análise de células transfectadas com miR-143/506. A análise de microarray permitida para análise semi-quantitativa de proteínas do ciclo celular associada de ~ 60, com seis repetições para cada anticorpo específico. A abordagem permite uma perspectiva mais ampla do comportamento mecanicista dentro de um caminho específico, identificação de alvos moleculares para futura avaliação e realização de análise a nível pós-traducional. Devido ao princípio do método semiquantitativo, qualquer resultado em genes específicos precisa ser confirmados através de mancha ocidental. Modo indicativo, nesta análise, foi detectada uma diminuição da expressão de proteínas associadas com a progressão do ciclo celular. Isto incluiu o alvo CDK1 e CDK4 no 24h e pós-transfecção de 48 h (Figura 4A), detectadas por qPCR.

Figure 4
Figura 4 : Gene desregulagem detectadas por microarray e análise de sequenciamento de RNA. (A) Heatmap das expressões de gene de caminho de ciclo celular detectadas por análise de microarray em proteínas extrai de A549 células transfectadas com miR-143 e miR-506, em 24 h e pós-transfecção 48 h. (B) prega mudança de ciclo celular via gene expressões a partir de células A549 transfected com miR-143 e miR-506 a pós-transfeccao 24 h, detectadas por sequenciação do ARN. Atividade (C) o percurso como analisados pelo software de análise de caminho de dados obtidos de sequenciação do ARN. Esta figura foi modificada de Marise et al.. 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de sequenciamento e caminho de RNA usando software de análise de percurso

Sequenciamento de nova geração com precisão analisa expressão gênica a nível de RNA. O método permite a identificação de várias alterações de gene por meio de uma única análise (no presente protocolo, a análise detectou a expressão de > 18.000 genes). Devido ao grande número de genes detectados, utilizou-se análise bioinformática para eficiente determinação do comportamento de percurso (Figura 4B). O software foi usado então (consulte a Tabela de materiais) para prever prisões de fase G1/S e G2/M e o downregulation de S fase iniciação (Figura 4). Além disso, os resultados do sequenciamento de RNA podem ser comparados aos dados de qPCR. Neste estudo, o sequenciamento de RNA confirmou as conclusões da análise qPCR, indicando uma downregulation de CDK1 (48%, p < 0,001, FDR < 0,001), CDK4 (68%, p < 0,001, FDR < 0,001) e CDK6 (71%, < 0,001, FDR < 0,001) devido a atividade combinatória de miR-143 e miR-506. Análise estatística foi realizada pelo software EdgeR utilizado para o cálculo da expressão de gene relativo, calcular os valores de p usando Binomial negativa20,21. Análise de Bioinformática pode ser realizada para a avaliação funcional da actividade miRNA e previsão de potenciais alvos moleculares, como ilustrado na Figura 5.

Figure 5
Figura 5 : Caminho ilustrativo e análise mecanicista, tal como apresentado pelo caminho análise aoftware. Dados de sequenciamento de RNA foi analisados de A549 células transfectadas com pós-transfeccao miR-143 e miR-506, 24 h, usando software de análise de percurso e caminhos canônicos identificados com a pontuação mais baixa (A) ou maior (B) ativação. O software também forneceu funções previstas (C) e upstream reguladores/alvos em potencial (D). Esta figura é reproduzida a partir de Marise et al.. 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ensaio de formação de tubo endotelial

O ensaio de formação de tubo endotelial in vitro é amplamente utilizado para estudar a angiogênese e é confiável, automatizado e quantificáveis22. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um conhecido angiogênico fator de crescimento de23,24 e promotor da formação de tubo endotelial. Neste estudo, foi identificado que o tratamento combinatório de miR-143 e miR-506 revoga angiogênese VEGF-induzida. Imagens de indicativas de formação do tubo e os efeitos do tratamento são apresentados na Figura 6.

Figure 6
Figura 6 : Imagens representativas de brotos endoteliais de VEGF-Tratado vs não-tratados HX transfected com miRNA scramble, miRNA-143, miRNA-506 ou uma combinação disso. Fotos foram obtidas ao microscópio brightfield equipado com uma câmera digital sob ampliação de 4x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

os miRNAs pode operar como terapias alvo para tratamento de câncer, reconhecendo a desregulação dos níveis de expressão em doentes vs tecidos normais. Este estudo teve como objetivo determinar os miRNAs que potencialmente interromper a progressão do ciclo celular durante vários estágios. Identificou-se que miR-143 e miR-506 interromper o ciclo celular de células cancerosas e os protocolos apresentados objetivou compreender a atividade deste tratamento miRNA combinatória.

As metodologias descritas fornecem uma compreensão abrangente sobre a função de miRNAs. Os desafios de estudar os miRNAs estão associados às suas capacidades de múltiplos genes-alvo e, portanto, afetar vários caminhos. A análise de qPCR descrito permite a identificação da expressão de genes específicos de interesse, se alvos específicos são identificados antes do tratamento. Por exemplo, o foco principal aqui foi a expressão de CDK1 e CDK4/6 e do ciclo celular.

Assim, a análise de ciclo celular usando o protocolo de propidium iodeto e fluxo cytometry é uma abordagem confiável para detectar alterações nas populações de células de acordo com seu estágio no ciclo celular. O método baseia-se o aumento proporcional do sinal de fluorescência pelo PI, que se liga ao DNA, correspondente à fase do ciclo celular. Resumidamente, as células na fase S sintetizam DNA, induzindo sinais maiores do que as células na fase G0/G1 e células na fase G2 tem duplicado seu DNA, produzindo o sinal mais intenso.

Acumular evidências indica a conexão de danos para o ciclo celular e desencadeamento de apoptose25. O método de citometria de fluxo utilizando anexina VI/PI consistentemente tem sido usado para a identificação da apoptose induzida em células de tratamento de quimioterapia. Título indicativo, uma resposta forte apoptotic foi identificada devido a terapia combinatória miRNA, que era mais potente em comparação com os miRNAs individuais.

O microarray do anticorpo semi-quantitativa de proteínas é um método sensível e confiável para identificar a proteína expressão alterações relacionadas a específicas respostas biológicas26,27. Este protocolo utilizado um microarray do anticorpo específico via ciclo celular, que detectou alterações de expressão em ~ 60 genes entre as células tratadas e não tratadas. Cautela é necessária durante as etapas de lavagem para garantir que o processo foi completamente executado e para minimizar o sinal de fundo. Além disso, os slides não devem se tornar secos até a conclusão do experimento.

Em contraste, a sequenciação do ARN fornece análise de expressões quantitativa gene de múltiplos genes, a nível de pós-transcrição. O número significativamente grande de genes analisados (> 18.000 para RNA-seq vs 60 para microarray) permite a análise simultânea de múltiplos caminhos e alvos moleculares e com maior precisão. Tal análise ampla é importante, como um único miRNA pode vincular e alvo diferentes mRNAs. Em contraste, a análise do caminho de um grande número de gene dysregulations é inerentemente um desafio. Por exemplo, embora a sequenciação do ARN confirmou nossos qPCR dados sobre downregulation CDK1 e CDK4/6, devido ao tratamento de miRNA, a análise também forneceu dados sobre milhares de genes que foram também para baixo- ou acima-está regulada. Para fornecer contexto para tais numerosos gene dysregulations, software de análise de percurso foi usado para determinar efeitos globais do tratamento no caminho diferente e funções celulares. Título indicativo, o software fornecido representante de pontuações para ativação (positivo z score) ou inactivação (pontuação z negativa) de funções específicas ou vias, bem como a significância estatística das28análise (Figura 5).

Em conclusão, o estudo da atividade de miRNA é um procedimento desafiador. A capacidade inerente de miRNAs afetar múltiplos genes requer a utilização de vários métodos analíticos elaborados e complicados para identificar a atividade potencial. Não surpreendentemente, mais trabalho é necessário para compreender plenamente as atividades do miR-143 e miR-506 em câncer de pulmão.

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Disclosures

Os autores gostaria de reconhecer John Caskey na Louisiana State University por sua assistência na análise de dados de sequenciamento do RNA e o Universidade do Texas Southwestern Medical Center, McDermott próxima geração sequenciamento núcleo central para o caminho realizando a análise de dados e sequenciamento de RNA. Esta pesquisa foi apoiada pela faculdade de farmácia, Universidade de Louisiana, Monroe financiamento de start-up e os institutos nacionais de saúde (NIH) por meio do Instituto Nacional de geral médica ciência subsídios 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Acknowledgments

Não há conflitos de interesse são declarados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer VWR VWR40086A
96 well plate CELLTREAT Scientific  50-607-511
96-well Microwell Plates   Thermo Scientific 12-556-008
A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells ATCC ATCC CCL-185
Agarose VWR 0710-25G
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938c
Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA Ambion AM4611
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062  
Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions Full Moon Bio KAS02
Bright field microscope   Microscoptics  IV-900
Bright field microscope   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides Full Moon Bio ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate Labconco 342391100
Cellquest Pro BD bioscience Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle  phase and for  calculating the population distribution for the analysis of apoptosis 
CFX96 Real Time System BioRad CFX96 Optics Module
Chemidoc Touch Imaging System BioRad Chemidoc Touch Imaging System
CO2 Incubator Thermo Scientific HERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Trevigen 3433-010-01
Digital Camera AmScope  FMA050
DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine VWR VWRL0100-0500
DNAse I Zymo Research E1010
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Biosciences 356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets Eppendrof 05-403-152
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,  Fisher BioReagents BP2818500
Ethidium bromide Alfa acar L07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning Corning 45000-354
FACS Calibur Flowcytometer Becton Dickinson
Fetal Bovine Serum - Premium Antlanta Biologicals S11150
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 10438026
Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps Fisherbrand Basix 02-682-002
Forma Series II water Jacket CO2 incubator Thermo Scientific
Heparin Solution (5000 U/mL) Hospira NDC#63739-920-11
Horixontal Electrophoresis system Benchtop lab system BT102
hsa-miR-143-3p miRNA Mimic ABM MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA Mimic ABM MCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Thermo Scientific PHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Individual donors IRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen Results: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen 10-977-015
Lipofectamine 2000  Invitrogen 11-668-027
Loading dye 10X ward's science+ 470024-814
Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) Sigma Aldrich M4530
Microscope Digital Camera AmScope  MU130
Modfit LT Verity Software Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions
Nanodrop Thermo Scientific NanoDrop one C
Opti-MEM Gibco by life technologies 31985-070
Penicillin-streptomycin 10/10 Antlanta Biologicals B21210
Power UP sybr green master mix Applied Biosystems A25780
Propidium Iodide MP Biochemicals LLC IC19545825
Proscanarray HT Microarray scanner Perkin elmer ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.
q PCR optical adhesive cover Applied Biosystems 4360954
Quick-RNA Kits Zymo Research R1055
Ribonuclease A from Bovine pancreas Sigma R6513-50MG
ScanArray Express PerkinElmer Step 7.33: Microarray analysis software
Shaker Thermo Scientific 2314
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems
SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml VWR 470224-998
SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml VWR 470225-004
TBS Buffer, 20x liquid VWR 10791-796
Temperature controlled  centrifuge matchine Thermo Scientific ST16R
Temperature controlled micro centrifuge matchine Eppendrof 5415R
Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks Thermo Scientific 12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Thermo Scientific PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo Scientific PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates Thermo Scientific AB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) Thermo Scientific AB1453B
Ultra Low Range DNA Ladder Invitrogen 10597012
VWR standard solid door laboratory refrigerator VWR

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References

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Tags

Pesquisa sobre o câncer edição 145 transfecção miRNA câncer de pulmão ciclo celular apoptose angiogênese a sequenciação do ARN

Erratum

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 04/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese
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Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C.… More

Hossian, A. K. M. N., Muthumula, C. M. R., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Stelly, A. M., Briski, K. P., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59460, doi:10.3791/59460 (2019).

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