Summary
यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कार्यात्मक synaptic बहुलता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, न्यूरॉन्स की एक जोड़ी अक्सर एकाधिक synaptic संपर्कों और/या कार्यात्मक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज साइटों (synaptic बहुलता) के रूप में । Synaptic बहुलता प्लास्टिक और विकास के दौरान परिवर्तन और विभिंन शारीरिक स्थितियों में, Synaptic संचरण की प्रभावकारिता के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक होने के नाते है । यहाँ, हम एक दिए गए postsynaptic न्यूरॉन पर समाप्त synapses की बहुलता की विविधता की डिग्री का आकलन करने के लिए प्रयोगों की रूपरेखा तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग. विशेष रूप से, वोल्टेज-दबाना रिकॉर्डिंग स्वत स्फूर्त postsynaptic धाराओं (sEPSCs) और लघु उत्तेजना postsynaptic धाराओं (mEPSCs) के आयाम के बीच अंतर की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस पद्धति के पीछे सिद्धांत यह है कि अभिवाही आदानों कि बहुलता प्रदर्शन बड़ी, कार्रवाई क्षमता पर निर्भर sepscs तुल्यकालिक रिहाई है कि प्रत्येक synaptic संपर्क में होता है के कारण दिखाई देगा । इसके विपरीत, कार्रवाई क्षमता स्वतंत्र रिहाई (जो एसिंक्रोनस है) छोटे आयाम mEPSCs उत्पन्न होगा. इस आलेख में synaptic बहुलता के अस्तित्व की विशेषता और तकनीक की आवश्यकताओं और सीमाओं पर चर्चा करने के लिए प्रयोगों और विश्लेषणों का एक सेट रेखांकित किया गया है । इस तकनीक की जांच कैसे अलग व्यवहार, औषधीय या vivo में पर्यावरण हस्तक्षेप विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptic संपर्कों के संगठन को प्रभावित करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Synaptic संचरण ंयूरॉंस के बीच संचार के लिए एक बुनियादी तंत्र है, और इसलिए, मस्तिष्क समारोह । Synaptic संचरण भी अस्थिर है और एक गतिविधि पर निर्भर तरीके से अपनी प्रभावकारिता बदल सकते है और साथ ही modulatory संकेतों1के जवाब में । इस प्रकार, synaptic समारोह की जांच तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के एक मुख्य ध्यान केंद्रित किया गया है । संपूर्ण-कोशिका पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक बहुमुखी तकनीक है जो हमें प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण तैयार करके, synaptic संचरण के गहन जैव भौतिक और आणविक तंत्र को समझने में सक्षम बनाती है । एक आम तौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण, शायद तकनीक और अवधारणा की सादगी के कारण, लघु उत्तेजना की माप है/संदरोधात्मक postsynaptic धाराओं (mE/ 4 । , 5 । , 6. व्यक्तिगत एमपीएससी पोस्टसिनप्टिक ionotropic रिसेप्टर्स (उदा. AMPA और गाबाएक रिसेप्टर्स) के माध्यम से आयनों के प्रवाह का प्रतिनिधित्व अपने संबंधित न्यूरोट्रांसमीटर के बंधन के जवाब में presynaptic टर्मिनल से जारी 7 . क्योंकि रिकॉर्डिंग वोल्टेज-gated एनए+ चैनल अवरोधक tetrodotoxin (ttx) की उपस्थिति में प्राप्त की है, रिहाई कार्रवाई की क्षमता स्वतंत्र है और सामान्य रूप से न्यूरोट्रांसमीटर शामिल है कि एक एकल synaptic पुटिका शामिल है. इस धारणा के आधार पर, mPSCs के औसत आयाम व्यापक रूप से क्वांटल आकार है, जो एक ही रिलीज साइट का विरोध postsynaptic रिसेप्टर्स की संख्या और कार्यक्षमता का प्रतिनिधित्व करता है के लिए एक कच्चे तेल के अनुमान के रूप में प्रयोग किया जाता है । दूसरी ओर, mPSCs की आवृत्ति postsynaptic सेल और उनके औसत रिलीज संभावना पर समाप्त synapses की कुल संख्या का एक संयोजन का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है । तथापि, इन मापदंडों synapses, या synapses बहुलता की एक और चर-गुणनात्मकता उपाय नहीं है-जो synapses संचरण की प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण है ।
Synaptic संचरण के क्वांटल सिद्धांत के आधार पर7,8,9, न्यूरॉन्स की एक जोड़ी के बीच एक दिए गए कनेक्शन की शक्ति तीन कारकों पर निर्भर है: कार्यात्मक synaptic की संख्या (एन), एक एकल synaptic पुटिका के रिलीज के लिए postsynaptic प्रतिक्रिया (क्वांटल आकार; क्यू) और न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की संभावना (पीआर). Synaptic बहुकता Nके बराबर है । Synaptic बहुलता या गुणात्मक synaptic की pruning के विकास के विकास में प्लास्टिक और विभिंन रोगों राज्यों में3,4,6,10है । इस कारण से, अभिलक्षणन synaptic बहुकता स्वास्थ्य और रोग में synaptic संचरण की प्रभावकारिता को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । ऐसी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में तकनीक, एक ही postsynaptic न्यूरॉन11,12पर एक ही अक्षतंतु से उद्भव एकाधिक synaptic संपर्कों का पता लगाने के द्वारा synaptic बहुलता के संरचनात्मक सबूत की पहचान कर सकते हैं, 13,14. हालांकि, इन संरचनात्मक रूप से चिह्नित multisynapses कार्यात्मक रूप से चुप15,16हो सकता है । N की सटीक कार्यात्मक परीक्षा के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है, जैसे युग्मित पूर्ण-सेल रिकॉर्डिंग जो यह पहचान सकते हैं कि क्या दिए गए कनेक्शन में एकाधिक कार्यात्मक रिलीज़ साइटें और न्यूनतम उत्तेजना दृष्टिकोण है कि उद्देश्य एक ख्यात अक्षतंतु की भर्ती के लिए ।
इस प्रोटोकॉल में, हम मूल रूप से Hsia एट अल2द्वारा विकसित एक विधि को अपनाकर synaptic बहुलता का आकलन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं । इस तकनीक में सहज पीएससी (sPSCs) और mPSCs का मापन संपूर्ण-कोशिका पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करना शामिल है, जो हमें एक दिया न्यूरॉन के लिए सभी आदानों में synaptic बहुलता की डिग्री का अनुमान लगाने की अनुमति देता है । के रूप में पहले से परिभाषित, synaptic बहुकता एक दिया पूर्व और postsynaptic ंयूरॉन के बीच synaptic की संख्या को दर्शाता है । यदि एकाधिक synapses एक कार्रवाई की क्षमता से synapses में भर्ती कर रहे हैं, वहां एक व्यक्ति (यानी क्वांटल) PSCs के लौकिक योग की एक उच्च संभावना होगी, एक बड़ा आयाम पीएससी पैदा । एमपीपीएससी रिकॉर्डिंग्स (जिसमें कार्य क्षमता TTX द्वारा अवरोधित की गई हैं) में, वैयक्तिक (गैर-तुल्यकालिक) mPSCs के कालिक संकलन की संभावना कम है । इस तर्क का उपयोग करते हुए, synaptic बहुकता sPSC आयाम (के साथ कार्रवाई क्षमता निर्भर रिहाई) mPSC आयाम करने के लिए तुलना करके अनुमान लगाया जा सकता है ।
बहुलता के अस्तित्व की जांच करने के लिए हम ग्लूटामैटेजिक ईपीएससी का प्रयोग करते हुए एक उदाहरण के रूप में चार प्रयोगों और उनके विश्लेषणों का वर्णन करते हैं । हालांकि इसी अप्रोच का इस्तेमाल तेज गैबएरोजिक/ग्लाइसिनर्जिक ट्रांसमिशन (आईपीएससी) के लिए किया जा सकता है । प्रत्येक प्रयोग के लिए एक संक्षिप्त तर्क नीचे वर्णित है । पहला, जैसा कि ऊपर बताया गया है, मेपीएससी में सेप्पीएससी के आयाम की तुलना करके synaptic बहुलता का अनुमान लगाया जा सकता है । इस प्रकिया के लिए दो आवश्यकताएं हैं; 1) presynaptic axons रिकॉर्डिंग के दौरान कार्रवाई की क्षमता के एक पर्याप्त संख्या में आग चाहिए, और 2) Pr उच्च होना चाहिए ताकि एकाधिक synapses एक कार्रवाई की क्षमता के आगमन पर न्यूरोट्रांसमीटर जारी । आदेश में इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, sEPSCs पहले कम Ca2 + कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (acsf) में दर्ज कर रहे हैं, और फिर कश्मीर के एक कम एकाग्रता की उपस्थिति में दर्ज की गई+ चैनल विरोधी, 4-Aminopyridine (4-एपी) कार्रवाई बढ़ाने के लिए संभावित फायरिंग और पीआर। फिर कार्रवाई संभावित फायरिंग TTX द्वारा अवरुद्ध है और पीआर एक वोल्टेज-gated Ca2 + चैनल ब्लॉकर सीडी2 +द्वारा कमी आई है । (4AP) के साथ sEPSCs के आयाम mEPSC की तुलना में है (4AP, TTX, और सीडी2 +) के साथ । दूसरे प्रयोग में, Ca2 + equimolar Sr द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है2 + acsf में आशय रिहाई desynchronize करने के लिए. के रूप में Ca2 + vesicles के तुल्यकालिक रिहाई के लिए आवश्यक है, Sr के साथ प्रतिस्थापन2 + बड़े आयाम sepscs कि बहुलता का संकेत कर रहे हैं को समाप्त करना चाहिए । तीसरा, यंत्रवत्, बहुलता या तो एकाधिक synaptic संपर्कों से एक ही postsynaptic ंयूरॉन या multivesicular रिहाई के लिए परिणाम कर सकते है (यानी एकाधिक पुटिकाओं एक एकल synaptic संपर्क के भीतर जारी)17,18। बहुलता के दो प्रकारों के बीच अंतर करने के लिए, तीसरा प्रयोग एक कम आत्मीयता का उपयोग करता है, तेजी से, AMPA रिसेप्टर्स के प्रतिस्पर्धी प्रतिपक्षी वियोजी, γ-डी-ग्लूटामिलेग्लाइसिन (γ-dgg)17,18 निर्धारित करने के लिए कि क्या बड़े सेप्टीएससी, पोस्टसिंथेटिक रिसेप्टर्स की एक अतिव्यापी जनसंख्या पर अभिनय स्वतंत्र synapses या multivesicular रिहाई के लौकिक संकलन का परिणाम हैं. यदि बड़े आयाम की घटनाओं से उत्पन्न होने वाली बहुतलीय रिहाई, γ-DGG छोटे sEPSCs की तुलना में बड़ा बाधा पर कम प्रभावी होगा, जबकि कई synaptic संपर्कों के अस्थायी योग से उत्पन्न होने वाले बड़े sEPSCs इसी तरह से प्रभावित हो जाएगा γ-डीजीजी । चौथे प्रयोग में, एक अधिक शारीरिक विधि के लिए कार्रवाई की क्षमता फायरिंग, अर्थात् अभिवाही synaptic उत्तेजना को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है । Synaptic गतिविधि के फटने transiently वृद्धि/सहज कार्रवाई संभावित फायरिंग और उत्तेजित afferents की रिहाई की संभावना की सुविधा कर सकते हैं । इसलिए, यह दृष्टिकोण बहुलता को अधिक शरीरक्रियात्मक तरीके से प्रकट करने की अनुमति देता है ।
निम्न प्रोटोकॉल माउस हाइपोथैलेमिक ऊतक में इन प्रयोगों को आयोजित करने के लिए विधि का वर्णन करता है. विशेष रूप से, हाइपोथैलेमस (PVN) के paraventricular नाभिक का कॉर्टिकोट्रॉपिन रिलीजिंग हार्मोन (CRH) न्यूरॉन्स का उपयोग किया जाता है । हम पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के आयोजन के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन और विशिष्ट प्रयोगों synaptic बहुलता के लिए परीक्षण करने के लिए समझाओ ।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों कनाडा परिषद पर पशु देखभाल दिशा निर्देशों (AUP # 2014-031) के अनुसार पश्चिमी ओंटारियो विश्वविद्यालय के पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।
1. समाधान
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टुकड़ा करने की क्रिया समाधान
- टुकड़ा करने की क्रिया समाधान की संरचना के लिए तालिका 1 देखें ।
- पहले से एक 20x स्टॉक समाधान तैयार करें और इसे 4 ° c पर 1 महीने तक के लिए स्टोर करें ।
- 1x समाधान टुकड़ा करने की क्रिया के लिए, hco3, ग्लूकोज, और सुक्रोज भंग ddh2O में, और 20x स्टॉक जोड़ें । सुनिश्चित करें कि परासारिता के बीच है 315-320 mosm और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोई अधिक से अधिक 1 सप्ताह के लिए समाधान की दुकान ।
- टुकड़ा करने की क्रिया के १०० एमएल के साथ दो beakers भरें और उंहें parafilm के साथ कवर । समाधान एक फ्रीजर में ठंडा जब तक समाधान आंशिक रूप से जमे हुए (लगभग 20 मिनट में-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर) हो जाता है । एक गैस फैलाव ट्यूब का उपयोग, बुलबुला ९५% O2/5% के साथ समाधान टुकड़ा करने की क्रिया के दोनों beakers बर्फ पर 20 मिनट के लिए 2 CO ।
समाधान सांद्रता (मिमी) | |||||
टुकड़ा करने | सामान्य एसीएसएफ | कम Ca2 + acsf | Sr+ acsf | पिपेट/आंतरिक | |
Nacl | ८७ | १२६ | १२६ | १२६ | - |
केसीएल | २.५ | २.५ | २.५ | २.५ | 8 |
CaCl2 | ०.५ | २.५ | ०.५ | - | - |
एसआरसीएल2 | - | - | - | २.५ | - |
एमजीसीएल2 | 7 | १.५ | २.५ | १.५ | 2 |
नाह2PO4 | १.२५ | १.२५ | १.२५ | १.२५ | - |
एनएएचसीओ3 | 25 | 26 | 26 | 26 | - |
ग्लूकोज | 25 | 10 | 10 | 10 | - |
Sucrose | ७५ | - | - | - | - |
के-ग्लूकोनेट | - | - | - | - | ११६ |
ना-ग्लूकोनेट | - | - | - | - | 12 |
HEPES | - | - | - | - | 10 |
K2-EGTA | - | - | - | - | 1 |
K2ATP | - | - | - | - | 4 |
Na3gtp | - | - | - | - | ०.३ |
तालिका 1: विभिंन समाधानों की संरचना ।
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aCSF (स्लाइस वसूली और रखरखाव के लिए)
- एसीएसएफ की संरचना के लिए सारणी 1 को देखें ।
- पहले से एक 20x स्टॉक समाधान तैयार करें और इसे 4 ° c पर 1 महीने तक के लिए स्टोर करें ।
- 1x aCSF के लिए, नाएचको3 और ddh2O में ग्लूकोज भंग और 20x स्टॉक जोड़ें । सुनिश्चित करें कि परासारिता 298-300 mosm के बीच है । 1 दिन के भीतर समाधान का उपयोग करें ।
-
aCSF (कम Ca2 + रिकॉर्डिंग के लिए)
- कम Ca2 + acsf की संरचना के लिए तालिका 1 देखें ।
- पहले से एक 20x स्टॉक समाधान तैयार करें और इसे 4 ° c पर 1 महीने तक के लिए स्टोर करें ।
- 1x कम Ca2 + के लिए acsf, भंग NaHCO3 और ddH2O में ग्लूकोज और जोड़ें 20X (Cacl2 और mgcl2 मुक्त) स्टॉक, cacl2 और mgcl2 निर्दिष्ट सांद्रता करने के लिए. सुनिश्चित करें कि परासारिता 298-300 के बीच है । 1 दिन के भीतर समाधान का उपयोग करें ।
-
aCSF (Sr2 + रिकॉर्डिंग के लिए)
- Sr2 + acsf की संरचना के लिए तालिका 1 देखें ।
- पहले से एक 20x स्टॉक समाधान तैयार करें और इसे 4 ° c पर 1 महीने तक के लिए स्टोर करें ।
- 1x Sr2 + acsf के लिए, नाएचसीओ3 और ग्लूकोज ddh2O में भंग और 20x जोड़ें (cacl2 और Mgcl2 मुक्त) स्टॉक, srcl2 और mgcl2 निर्दिष्ट सांद्रता करने के लिए. सुनिश्चित करें कि परासारिता 298-300 के बीच है । 1 दिन के भीतर समाधान का उपयोग करें ।
-
आंतरिक विलयन
- K-gluconate आधारित आंतरिक समाधान की संरचना के लिए तालिका 1 देखें ।
- 20 मिलीलीटर आंतरिक घोल बनाने के लिए, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 15 मिलीलीटर आण्विक जीव विज्ञान ग्रेड पानी जोड़ें । बर्फ पर बाद में कदम प्रदर्शन ।
- निंनलिखित समाधान तैयार करने के लिए समय से पहले 1 एम आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी में स्टॉक सांद्रता । जोड़ें (एमएल में): २.३२ K-gluconate, ०.२४ Na-gluconate, ०.२० HEPES, ०.१६ केसीएल, ०.०५ K2-EGTA, ०.०४ MgCl2 से ५० मिलीलीटर ट्यूब ।
- ०.३ एम ना3gtp के १०० μl जोड़ें ।
- वजन ४४.०८ मिलीग्राम K2एटीपी एक 2 मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में और आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें, तो ५० मिलीलीटर ट्यूब जोड़ें ।
- 1 M KOH के साथ 7.2-7.4 पीएच को समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि परासारिता 283-289 mosm के बीच है ।
2. स्लाइस तैयारी
-
उपकरण तैयार करें
- रिकवरी चैंबर के लिए aCSF के २०० मिलीलीटर जोड़ें (4 कुओं और जाल के साथ एक २५० मिलीलीटर बीकर से निर्मित) और एक पानी स्नान में रिकवरी चैंबर जगह (३५ डिग्री सेल्सियस).
- एक पैराफिन फिल्म के साथ चैंबर को कवर और लगातार ९५% O2/5% के साथ acsf बुलबुला2 /
- उपकरण (स्केलपेल, angled ठीक कैंची, forceps, ठीक पेंट ब्रश, प्लास्टिक की चंमच) की स्थापना करके विच्छेदन के लिए तैयार ।
- बर्फ की लगभग 15 मिलीलीटर के साथ एक ६० मिलीलीटर सिरिंज भरें-1.1.4 कदम से ठंडे टुकड़ा करने की क्रिया के समाधान ।
- एक कुएं की प्लेट के ढक्कन पर फिल्टर पेपर रखकर डिसेक्शन प्लेटफार्म तैयार करें ।
- इसे आइस ट्रे में रखकर स्लाईसिंग चैंबर तैयार करें और ट्रे को बर्फ से भरें ।
- ब्लेड धारक में एक डिस्पोजेबल ब्लेड हासिल करके vibratome की स्थापना की ।
- एक पास् तूर पिपेट की नोक को तोड़कर और टूटे हुए सिरे के ऊपर एक रबर का बल्ब रखकर एक ट्रांसफर पिपेट बनाएं ।
-
काटना माउस ब्रेन
- एनेस्थेटाइज़ एक चैंबर में पशु 4% isoflurane के साथ संतृप्त जब तक रीढ़ की हड्डी में सजगता अनुपस्थित रहे हैं ।
- एक गिलोटिन का उपयोग कर जानवर decapitate और जल्दी से मस्तिष्क को दूर ।
- रोस्ट्रल से पुच्छल की संख्या 22 स्कैलपेल ब्लेड के साथ एक मिडलाइन चीरा बनाओ ।
- Laterally सिर के प्रत्येक पक्ष पर खोपड़ी छील ।
- बारीक कैंची का प्रयोग करें एक तरफ की खोपड़ी को कौंडल से रोस्ट्रल (ललाट की हड्डियों के किनारे सहित) में काटने के लिए सावधानी का प्रयोग कर मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचाए ।
- मस्तिष्क बंद खोपड़ी टुकड़ा उठाने के लिए और जल्दी से कदम 2.1.4 से सिरिंज का उपयोग बर्फ ठंडा टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के 15 मिलीलीटर के साथ मस्तिष्क को शांत करने के लिए संदंश का प्रयोग करें ।
- दिमाग को खोपड़ी से बाहर उठाएं ।
- बर्फ के साथ भर beakers के एक में मस्तिष्क प्लेस-ठंडा (1.1.4 कदम से समाधान) टुकड़ा करने की क्रिया ९५% O2/
-
माउस हाइपोथैलेमस की स्लाइस तैयार करें
- वांछित मस्तिष्क क्षेत्र और कट कोण के लिए मस्तिष्क ब्लॉक (उदाहरण के लिए, कॉर्नल हाइपोथैलेमस स्लाइसें के लिए, एक ब्लेड का उपयोग कर पोंस के लिए ऑप्टिक chiasm और पुच्छ करने के लिए ऊतक रोस्ट्रम बंद ट्रिम कर दीजिए और यह सुनिश्चित करें कि पुच्छ ब्लॉक एक सपाट सतह मस्तिष्क के आधार के लिए सीधा है) ।
- फिल्टर कागज का एक टुकड़ा काट का उपयोग कर, पूर्वकाल की ओर से मस्तिष्क लेने और तुरंत गोंद का उपयोग कर पकड़ थाली करने के लिए पीछे की ओर गोंद ।
- जल्दी से टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में होल्डिंग प्लेट जगह और चरण 1.1.4 में दूसरी बीकर से समाधान टुकड़ा करने की क्रिया के साथ चैंबर भरें ।
- वाइटहोम पर स्लाईसिंग चैंबर और आइस ट्रे को सुरक्षित करें ।
- टुकड़ा करने की क्रिया क्षेत्र को परिभाषित (पूर्वकाल और मस्तिष्क के पीछे) और २५० μm मोटाई किरीटी स्लाइस टुकड़ा करने की क्रिया शुरू । अनुशंसित पैरामीटर्स: स्पीड ०.१० mm/s, आयाम 2 मिमी ।
- वांछित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए उपयुक्त आकार के स्लाइस ट्रिम ।
- ३५ ° c पर स्लाइस 30-45 मिनट के लिए पुनर्प्राप्त करें । फिर, वार्मिंग स्नान से वसूली चैंबर निकालें और स्लाइसें एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं । दिन के आराम के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइसें रखें और ९५% O2/5% CO 2 के साथ लगातार स्नान बुलबुला करने के लिए जारी .
3. पूरे सेल पैच ClampRecording
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पैच पिपेट खींचो
- पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए सुझाए गए मापदंडों का प्रयोग पिपेट है डांड़ी मैनुअल से, मोटी दीवारों गिलास से पैच पिपेट 3-5 mω के एक पिपेट प्रतिरोध करने के लिए पुल ।
- एक microsyringe का उपयोग (वाणिज्यिक या घर का बना), फ़िल्टर आंतरिक समाधान के साथ एक पिपेट टिप भरें. एक microsyringe बनाने के लिए, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के टिप जला और टिप एक लंबी ठीक टिप बनाने गिर करने के लिए अनुमति देते हैं ।
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संपूर्ण-कक्ष कॉंफ़िगरेशन प्राप्त करें
- रिकॉर्डिंग पिपेट बस स्लाइस के ऊपर रखें और वोल्टेज दबाना मोड में पिपेट वर्तमान ऑफसेट । पिपेट पर थोड़ा सा पॉजिटिव प्रेशर लगाएं और स्टोलिंग लॉक करें ।
- एक बरकरार झिल्ली के साथ एक स्वस्थ सेल का चयन करें और पिपेट के साथ सेल दृष्टिकोण । सकारात्मक दबाव ऊतक में एक मामूली गड़बड़ी का कारण होना चाहिए (यानी ऊतक में प्रवेश करते समय एक धीमी लहर) ।
- जब तक पिपेट कोशिका की सतह पर एक छोटा सा डिंपल नहीं बनाता, तब तक एक विकर्ण गति का उपयोग करते हुए पिपेट को कोशिका के करीब लाना जारी रखें ।
- सकारात्मक दबाव ताला रिलीज । सेल एक सील बनाने के लिए शुरू हो जाएगा और प्रतिरोध 1 GΩ से ऊपर बढ़ जाएगा । वोल्टेज दबाना में सेल पर पकड़-६८ एमवी ।
- सेल से अतिरिक्त दबाव को हटाने के लिए तिरछे कोशिका से थोड़ा दूर खींचो ।
- तेजी से और धीमी गति से पिपेट समाई के लिए क्षतिपूर्ति ।
- सेल के माध्यम से तोड़ने के लिए और पूरे सेल विन्यास प्राप्त करने के लिए पिपेट धारक से जुड़े ट्यूब के माध्यम से एक संक्षिप्त चूषण लागू करें ।
- एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदा, Clampex) में झिल्ली परीक्षण खिड़की पर सेल मोड में स्विच करें ।
- प्रत्येक वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग से पहले, एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक झिल्ली परीक्षण प्रदर्शन और एक प्रयोगशाला पुस्तक में प्रासंगिक मापदंडों रिकॉर्ड (झिल्ली प्रतिरोध, पहुँच प्रतिरोध, और समाई).
- रिकॉर्डिंग स्नान के तापमान को 27 – 30 ° c पर और प्रवाह दर 1.5 – 2.0 mL/min पर बाद के प्रयोगों के लिए बनाए रखें ।
4. बहुकता प्रयोग
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प्रयोग 1:4-एपी का उपयोग कर बहुलता का आकलन
- वोल्टेज दबाना में सेल पर पकड़-६८ एमवी । एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, कम Ca2 + acsf के साथ स्नान perfusing जबकि sepscs रिकॉर्ड । पूरे सेल विंयास की शुरुआत के बाद कम से 5 मिनट के लिए रिकॉर्ड synaptic गतिविधि के रूप में एक स्थिर आधार रेखा रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए शीघ्र ही झिल्ली की सफलता के बाद उच्च हो सकता है ।
- एक micropipette का उपयोग करना, जोड़ें 4-एपी aCSF और स्नान के लिए लागू 30 μM 4-एपी ।
- 4-एपी के साथ aCSF करने के लिए ०.५ μM TTX और 10 μM सीडी2 + जोड़ें और न्यूनतम 10 मिनट के लिए mEPSCs रिकॉर्ड ।
- ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए, (कम Ca2 + acsf में) 4-एपी के आवेदन के तुरंत पहले बेसलाइन के अंतिम 1 मिनट का उपयोग करें, 4-एपी आवेदन की 10 मिनट और ttx आवेदन के 10 मिनट.
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प्रयोग 2: आशय Sr का उपयोग कर रिलीज desynchronize2 +
- जबकि सामांय Ca2 + acsf के साथ स्नान perfusing (स्नान acsf के रूप में एक ही) रिकॉर्ड sepscs के लिए ंयूनतम 5 मिनट ।
- सामांय Ca2 + acsf से स्विच और Sr2 + acsf (चरण १.४ से) और रिकॉर्ड sepscs perfusing शुरू करते हैं ।
- ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए, कि बड़े आयाम sEPSCs vesicles के तुल्यकालिक रिहाई के कारण हैं, यह निर्धारित करने के लिए, बेसलाइन के अंतिम 1 मिनट (सामान्य aCSF में) Sr2 + acsf अनुप्रयोग के 10वें मिनट के लिए तुलना करें ।
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Experiment 3: का उपयोग कर multivesicular रिलीज़ के लिए परीक्षण γ- डीजीजी
- कम से कम Ca2 + acsf रिकॉर्ड sepscs में ंयूनतम 5 मिनट के लिए ।
- छिड़काव प्रणाली के माध्यम से acsf करने के लिए 30 μm 4-एपी जोड़ें । न्यूनतम 10 मिनट के लिए रिकॉर्ड sEPSCs ।
- 4-एपी के साथ aCSF करने के लिए २०० μM γ-DGG जोड़ें और कम से 10 मिनट के लिए sEPSCs रिकॉर्ड ।
- एक अलग कक्ष में एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, चरणों का पालन 1-3 लेकिन कम एकाग्रता (१२५ एनएम) के बजाय γ-DGG DNQX पर लागू करें ।
- ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए, प्रत्येक दवा आवेदन के अंतिम मिनट का विश्लेषण ।
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प्रयोग 4: उत्तेजित आदानों कार्रवाई क्षमता फायरिंग बढ़ाने के लिए प्रोत्साहित करते हैं ।
- सामांय Ca2 + acsf में रिकॉर्ड sepscs ।
- 2 एस के लिए 20 हर्ट्ज की दर से aCSF से भरा एक एकाधिकार ग्लास इलेक्ट्रोड का उपयोग कर afferents उत्तेजित और 20 सेकंड के एक अंतर फट अंतराल के साथ 10 बार दोहराने.
- विश्लेषण के लिए, आधार रेखा के रूप में पहली उत्तेजना से पहले ५,००० ms का उपयोग करें और अंतिम उत्तेजना के बाद 10-300 ms करने के लिए तुलना और फिर 10 परीक्षणों पर औसत आयाम और आवृत्ति परिवर्तन ले ।
5. विश्लेषण
- का पता लगाता है और synaptic धाराओं (जैसे, मिनी विश्लेषण सॉफ्टवेयर) का विश्लेषण करती है कि एक प्रोग्राम का उपयोग कर sEPSCs और mEPSCs का विश्लेषण करें ।
- इस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, AMPA रिसेप्टर EPSCs (या गाबा रिसेप्टर EPSCs यदि रिकॉर्डिंग निरोधात्मक धाराओं) का पता लगाने के लिए सुझाए गए खोज मापदंडों का उपयोग करें ।
- रिकॉर्डिंग में EPSCs का पता लगाने के लिए नॉनस्टॉप विश्लेषण फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
- मैन्युअल रूप से प्रत्येक घटना (उदाहरण के लिए, सुनिश्चित घटनाओं को याद किया जा रहा है या दो बार गिना नहीं जा रहा है) का पता लगाने के कार्यक्रम सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक रिकॉर्डिंग स्कैन ।
- ईवेंट डेटा को क्लिपबोर्ड पर प्रतिलिपि बनाकर निर्यात करें और उसे डेटा प्रबंधन सॉफ़्टवेयर (उदा., Excel) में चिपकाएं
- प्रत्येक दवा उपचार के लिए औसत आवृत्ति और/या आयाम की गणना और प्रासंगिक सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।
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Representative Results
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में माउस हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस का उपयोग कर, synaptic बहुलता की डिग्री की जांच करने के लिए पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । इस स्लाइस तैयारी तकनीक स्वस्थ व्यवहार्य कोशिकाओं है कि एक सूजन झिल्ली या नाभिक नहीं है उपज चाहिए (चित्रा 1) । प्रोटोकॉल में हर कदम ऊतक और रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है ।
चित्रा 1: टुकड़ा तैयार करने के बाद स्वस्थ और अस्वस्थ ऊतक. स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की तैयारी के तहत PVN विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट प्रकाशिकी पर 40x आवर्धन । लाल रंग के आरोह स्वस्थ कोशिकाओं को दर्शाते हैं, और काले रंग के आरोह अस्वस्थ कोशिकाओं को दर्शाते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग synaptic बहुलता की पहचान करने के लिए औचित्य दिखाता है । Synaptic बहुलता या तो ंयूरॉंस की एक जोड़ी के बीच एकाधिक Synaptic संपर्क से परिणाम कर सकते है (चित्रा 2a बाएं), या एक Synaptic साइट पर multivesicular रिहाई के द्वारा (चित्रा 2a सही) । इन दोनों स्थितियों में, एक कार्रवाई की क्षमता presynaptic ंयूरॉन में एक बड़ी postsynaptic प्रतिक्रिया (sEPSC) कई synaptic घटनाओं के अस्थाई योग के कारण प्रकाश में लाना होगा । हालांकि, presynaptic कार्रवाई क्षमता की अनुपस्थिति में (जैसे TTX और सीडी2 की उपस्थिति में + ब्लॉक एनए+-निर्भर और Ca2 +-निर्भर कार्रवाई संभावित गोलीबारी), vesicular न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई एसिंक्रोनस है । परिणामस्वरूप, postsynaptic प्रतिसाद छोटा हो जाता है (चित्र 2b: AP-स्वतंत्र) । यदि दो ंयूरॉंस बहुलता प्रदर्शन नहीं करते है (यानी केवल एक synaptic संपर्क/कोई multivesicular रिलीज) वहां कार्रवाई क्षमता निर्भर और कार्रवाई की क्षमता के बीच postsynaptic प्रतिक्रिया में कोई अंतर नहीं होगा-स्वतंत्र रिहाई न्यूरोट्रांसमीटर (चित्र 2c) ।
चित्रा 2: योजनाबद्ध आरेख postsynaptic धाराओं पर विभिन्न synaptic संगठनों के परिणामों को illustrating. (क, ख) बहुकता के साथ एक synapse में, एक कार्रवाई की क्षमता और आगामी Ca2 + अंतर्वाह कई synapse पुटिकाओं के तुल्यकालिक संलयन है कि परिणाम बड़े, multiquantal epscs में । Synaptic बहुलता एक एकल synaptic (क) पर multisynapse संपर्क या multivesicular रिहाई से परिणाम कर सकते हैं । Ttx और सीडी2 +की उपस्थिति में, कार्रवाई क्षमता स्वतंत्र आशय संलयन एसिंक्रोनस है और छोटे uniquantal epscs (बी) का कारण बनता है । (ग) बहुलता के बिना synapses में, दोनों कार्रवाई क्षमता निर्भर और स्वतंत्र पुटिका संलयन का परिणाम यूनिक्वाटल एपीएससी में होता है । यह आंकड़ा हमारी पिछली रिपोर्ट6के चित्र 1 क से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
प्रयोग में 1, 4-एपी स्नान के लिए लागू करने के लिए कार्रवाई की क्षमता फायरिंग और रिहाई की संभावना बढ़ाने के लिए है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि 4-एपी सहज कार्रवाई संभावित फायरिंग में वृद्धि कर रहे हैं, EPSCs की आवृत्ति की तुलना सेप्एससी और mEPSCs (चित्र 3a, C) के बीच की जा सकती है । क्योंकि sEPSCs दोनों कार्रवाई क्षमता पर निर्भर और स्वतंत्र घटनाओं का एक संयोजन कर रहे हैं, Sepscs और mEPSC की आवृत्ति में अंतर presynaptic axons में स्वत स्फूर्त कार्रवाई संभावित गोलीबारी के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है । हम सेप्एससी से mEPSC के बीच एक > 15% के अंतर की आवृत्ति में मनमाने ढंग से कटौती का उपयोग करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पर्याप्त संख्या में कार्रवाई क्षमता पर निर्भर घटनाएं बहुलता के विश्लेषण के लिए मौजूद हैं । यदि EPSCs में कम Ca2 + शर्त और Ttx (mepsc) की स्थिति आवृत्ति और आयाम में समान है (जैसे कोई सहज कार्रवाई क्षमता कम ca 2 में गोलीबारी+ शर्त), कम ca2 + आधार रेखा sepsc और 4 के बीच अंतर -एपी का इस्तेमाल बहुलता के विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है ।
चित्र 3, 4-AP में दर्शाए गए एक उदाहरण परिणाम में sepscs के आयाम और आवृत्ति दोनों में वृद्धि होती है । TTX और सीडी2 + के बाद आवेदन आयाम और आवृत्ति दोनों कम हो जाती है. जैसा कि ऊपर वर्णित है, sEPSCs और mEPSCs के बीच आयाम में अंतर synaptic बहुलता इंगित करता है । हाइपोथैलमिक न्यूरॉन्स में हम यहाँ की जाँच करते हैं, आधार रेखा और TTX की स्थितियों के आयाम और आवृत्ति समान हैं (चित्र 3C, D), यह सुझाव देते हैं कि बेसलाइन sepscs में बहुत कम कार्रवाई क्षमता-निर्भर epscs होते हैं । तदनुसार, बाद के प्रयोगों के आधार रेखा और 4-एपी के बीच अंतर की तुलना करने के लिए बहुलता को मापने कर सकते हैं ।
चित्र 3: .4-AP अनुप्रयोग synaptic बहुलता का पता चलता है । (क) बेसलाइन के दौरान कम Ca2 + एसीएसएफ में रिकॉर्ड किए गए सेप्टीसीज के नमूने के निशान, और 4-एपी (30 μm) आवेदन के बाद, और बाद में Ttx (०.५ Μm) और Cd2 + (10 μm) एप्लीकेशन । (क) में दर्शाए गए रिकार्डिंग से सेप्एससी आयाम का वितरण । (ग, घ) माध्य आवृत्ति (ग) और आयाम (डी) के बीच आधार रेखा (ग्रे), 4-एपी (लाल) और TTX + सीडी2 + (नीला) का सारांश । पी < ०.००५, * * पी < ०.०१ । यह आंकड़ा हमारी पिछली रिपोर्ट6के अंक 2 से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
उपरोक्त वर्णित विधि के अनुसार, postsynaptic ंयूरॉंस पर समाप्त synapses की औसत बहुलता: यह synapses के एक छोटे अनुपात में होने वाली बहुलता में परिवर्तन का पता नहीं लगा सकता है । फिर भी, हमारे हाल के अध्ययन में, इस पद्धति में सामान्य और चिरकालिक स्ट्रेस्ड कंडीशंस6के बीच हाइपोथैलमिक न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट सिंथेसेस की बहुलता में परिवर्तन का पता चला ।
Ca 2 के प्रतिस्थापन+ equimolar Sr के साथ2 + में acsf desynchronizes कार्रवाई क्षमता पर निर्भर रिहाई के न्यूरोट्रांसमीटर पुटिकाओं 19, 20. इसलिए, यदि बड़े आयाम sEPSCs कार्रवाई की संभावना का योग कर रहे हैं-निर्भर एक प्रकार का पौधा न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई (यानी, बहुलता), Ca 2 की जगह+ Sr2 + epscs के आयाम कम हो जाएगा के साथ. के रूप में चित्रा 4, Sr2 + में देखा acsf बड़े आयाम घटनाओं के अनुपात (चित्रा 4b) कम हो जाती है, और एक परिणाम के रूप में औसत आयाम कम हो जाती है (चित्रा 4b). जब कोशिकाएं बहुलता को प्रदर्शित नहीं करती हैं, तो EPSC आयाम पर कोई प्रभाव नहीं पड़ेगा ।
चित्रा 4: Sr2 + बड़े multiquantal घटनाओं desynchronizes. (क) सामान्य सीए2 + एसीएसएफ और एसआर2 + एसीएसएफ के बीच प्रतिनिधि ट्रेस तुलना । Sr2 + acsf desynchronizes आशय रिहाई और एक प्रतिनिधि आयाम वितरण (ख) और सभी कक्षों (C) * P < ०.०५ के लिए आयाम परिवर्तन में देखा के रूप में multiquantal तुल्यकालिक घटनाओं के आयाम कम हो जाती है. यह आंकड़ा हमारी पिछली रिपोर्ट6के अंक 3 से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
γ-DGG, एक तेजी से अलग कर पा रिसेप्टर्स की प्रतिस्पर्धी प्रतिपक्षी, यह निर्धारित करने के लिए कि बहुलता multivesicular रिहाई या एकाधिक synaptic संपर्कों के कारण है इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में multivesicular रिहाई के postsynaptic रिसेप्टर्स की एक अतिव्यापी जनसंख्या पर कार्य करता है, बड़े आयाम EPSCs synaptic फांक में ग्लूटामेट की पूलिंग शामिल है । दूसरे शब्दों में, synaptic फांक में ग्लूटामेट की एकाग्रता है कि जो यूनिक्वाटल रिहाई से परिणाम से अधिक है । दूसरी ओर, बहुसंश् लेषीय संपर्कों में प्रत्येक synaptic साइट पर यूनिक्वाटल EPSCs होता है । यदि बड़े आयाम वाले एपीएससी बहुकोशिकीय निर्मोचन से उत्पन्न होते हैं तो वृहत्तर ईपीएससी का प्रभाव कम आयाम वाले ईपीएससी की तुलना में γ-डीजीजी विरोध (अधिक ग्लूटामेट सांद्रण के कारण) से अधिक होगा (चित्र 5ए दाएं, बी-डी) । यदि बड़े आयाम EPSCs समकालिक uniquantal EPSCs (multisynapse संपर्कों) के संकलन के कारण होते हैं, γ-DGG इसी तरह सभी EPSCs के आयाम को प्रभावित करेगा (चित्रा 5 क बाएँ, E-G). Γ-dgg के विपरीत, dnqx, जो एक उच्च समानता है, धीमी गति से अलग करना AMPA/kainate रिसेप्टर विरोधी सभी बड़े और छोटे आयाम epscs में एक समान कमी का कारण बनता है (चित्रा 5h-J). Γ-dgg और dnqx के लिए संवेदनशीलता औसत epsc आयाम के अनुपात के रूप में निर्धारित किया जा सकता है अधिकतम द्वारा विभाजित (सबसे बड़ा 20 epsc का औसत) epsc आयाम (चित्रा 5k, L).
चित्रा 5: का उपयोग करते हुए multivesicular रिहाई की जांच करने के लिए γ DGG । (क) स्कीमेटिक्स बहुलता के दो मॉडलों को दर्शाने वाला । बायां: यूनिक्वाटल संचरण का कालिक संकलन जो पोस्टसिंथेटिक रिसेप्टर्स की स्वतंत्र आबादी को लक्षित करता है. बड़े और छोटे EPSCs synaptic फांक में एक समान ग्लूटामेट एकाग्रता से प्राप्त कर रहे है और इसलिए γ-DGG के लिए समान रूप से संवेदनशील हैं । दाएँ: बहु-क्वांटल संचरण जो postsynaptic रिसेप्टर्स की एक अतिव्यापी जनसंख्या को लक्षित करता है । बड़े EPSCs छोटे sEPSCs की तुलना में फांक में उच्च ग्लूटामेट एकाग्रता की वजह से कर रहे है और इसलिए γ-DGG के प्रति कम संवेदनशील हैं । मॉडल के तल पर दिखाए गए मान काल्पनिक सापेक्ष amplitudes हैं । (ख) एक रिकॉर्डिंग जिसमें 4-एपी आवेदन (4 एपी उत्तरदाता) के बाद मतलब sepsc आयाम में वृद्धि हुई थी से नमूना निशान । (ख) में दर्शाए गए अभिलेखीकरण के लिए ईपीएससी आयाम के लिए संचयी भूखंड । (ख) में दर्शाए गए रिकॉडग से γ-डीजीजी के आवेदन से पहले और बाद में सामान्यीकृत एपीएससी आयाम (ईपीएससी/ईपीएससीमैक्स) के लिए संचयी भूखंड । (ई) एक रिकॉर्डिंग से नमूना निशान जहां मतलब sepsc आयाम में कोई परिवर्तन नहीं था 4-एपी आवेदन के बाद (4-एपी गैर उत्तरदाता) । (ङ) में दर्शाए गए अभिलेखन के लिए संचयी ईपीएससी आयाम । (ङ) में दर्शाए गए अभिलेखीकरण के लिए संचयी ईपीएससी/ईपीएससीमैक्स प्लॉट । (H) नमूना अंश से एक रिकॉर्डिंग आधार रेखा से, साथ ही 4-AP और DNQX अनुप्रयोग के बाद । (झ) में दर्शाए गए अभिलेखन के लिए संचयी epsc आयाम (ज) में दर्शाए गए अभिलेखन के लिए संचयी ईपीएससी/ईपीएससीमैक्स प्लॉट । (ट) γ-डीजीजी (4-एपी उत्तरदाता और गैर-उत्तरदाता समूहों में) या dnqx अनुप्रयोग से पूर्व-γ-dgg/dnqx (अर्थात पोस्ट-4-एपी) को सामान्यीकृत करने के बाद माध्य ईपीएससी/ईपीएससीअधिकतम का सारांश । (ठ) पश्च-4-एपी माध्य ईपीएससी आयाम (पूर्व-4-एपी के लिए सामान्यीकृत) के बाद के भूखंड γ-dgg/DNQX माध्य ईपीएससी/ईपीएससीअधिकतम पी < ०.००५ । यह आंकड़ा हमारी पिछली रिपोर्ट6के अंक 4 से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Synaptic गतिविधि के फटने से सिनेप्टिक संचरण की शक्ति में संक्रामक वृद्धि हो सकती है । अधिक शारीरिक स्थितियों के तहत बहुकता की जांच करने के लिए, अभिवाही उत्तेजना कार्रवाई की क्षमता फायरिंग और रिहाई की संभावना को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि बहुलता मौजूद है, तो अभिवाही उद्दीपन के कारण EPSC आयाम में संक्षिप्त वृद्धि होनी चाहिए (चित्र 6a-D) । यदि बहुलता मौजूद नहीं है, तो कार्रवाई में गतिविधि प्रेरित बढ़ जाती है गोली चलाने से EPSC आयाम में वृद्धि नहीं होगी ।
चित्र 6: उच्च आवृत्ति उद्दीपन synaptic बहुलता का पता चलता है । (क) अभिवाही अन्तर्वर्ती उद्दीपन से पहले और बाद में सेप्सीज के प्रतिदर्श अंश । (क) में दर्शाए गए अभिलेखन से पहले और बाद में सेराप्टिक उद्दीपन (20 भ््र, 2 े) में सेप्एससी आयाम का भूखंड । (ग, घ) सेप्एससी आवृत्ति का सारांश (ग) और आयाम (डी) synaptic उत्तेजना के बाद परिवर्तन । पी < ०.००१, * पी < ०.०५ । यह आंकड़ा हमारी पिछली रिपोर्ट6के अंक 5 से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एक सफल पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता स्वस्थ स्लाइसें प्राप्त कर रहा है/ हमारे वर्णित प्रोटोकॉल हाइपोथैलेमस स्लाइस कि pvn ंयूरॉंस होते है के लिए अनुकूलित है । अंय मस्तिष्क क्षेत्रों को संशोधित समाधान की आवश्यकता हो सकती है और तरीकों टुकड़ा करने की क्रिया21,22,23,24। रिकॉर्डिंग के लिए, यह केवल झिल्ली प्रतिरोध, समाई और पहुँच प्रतिरोध के रूप में लगातार सेल गुणों की निगरानी द्वारा स्थिर रिकॉर्डिंग को स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रवेश प्रतिरोध में वृद्धि EPSC आयाम कम कर सकते हैं और इसलिए conढूँढ़ा आयाम माप. तदनुसार, रिकॉर्डिंग के दौरान 20 MΩ या 20% से अधिक की वृद्धि से अधिक पहुंच प्रतिरोध मूल्यों के साथ कोशिकाओं को छोड़ दिया जाता है । इसी तरह, (या एक कम) झिल्ली प्रतिरोध में कमी के परिणामस्वरूप गरीब अंतरिक्ष दबाना कर सकते है और, इसलिए, आयाम कम कर सकते हैं । हमारे लक्ष्य प्रणाली (parvocellular PVN ंयूरॉंस) में ंयूरॉंस ५०० MΩ और 1 GΩ के बीच एक उच्च झिल्ली प्रतिरोध है, और हम ५०० MΩ नीचे झिल्ली resistances के साथ कोशिकाओं को छोड़ । गुणवत्ता नियंत्रण कट नापसंद अध्ययन के तहत ंयूरॉंस के विशिष्ट प्रकार के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के पहले और दवा अनुप्रयोगों के बाद आयाम में अंतर पर निर्भर करता है के रूप में, यह आयाम परिवर्तन झिल्ली प्रतिरोध और पहुँच प्रतिरोध में परिवर्तन करने के लिए और नहीं दवा आवेदन के कारण है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम इस प्रोटोकॉल में अध्ययन हाइपोथैलमिक न्यूरॉन्स आकार में छोटे हैं (सेल धारिता चूहों में लगभग 15 पीएफ है और झिल्ली प्रतिरोध 1 gω के आसपास है), और K-gluconate आधारित आंतरिक समाधान अच्छी तरह से उच्च गुणवत्ता वाले epscs/ipscs प्राप्त करने के लिए काम करता है6,25 . बड़ा सेल आकार और कम इनपुट प्रतिरोध के साथ ंयूरॉंस के लिए, सीज़ियम आधारित आंतरिक समाधान के लिए एक अच्छा अंतरिक्ष-दबाना2सुनिश्चित किया जा सकता है ।
इस पद्धति का उपयोग करके बहुलता को मापने की एक विशिष्ट आवश्यकता यह है कि कोशिकाएं कार्य क्षमता पर निर्भर घटनाओं की तुलना करने के लिए पर्याप्त संख्या में स्वत स्फूर्त कार्य क्षमता को आग लगा देता है । यह TTX और Cd2 +की अनुपस्थिति और उपस्थिति में epscs की आवृत्ति में अंतर की तुलना करके सुनिश्चित किया जा सकता है । हाइपोथैलेमस स्लाइस में कि pvn होते हैं, हमने पाया है कि 4-एपी के आवेदन कार्रवाई की क्षमता फायरिंग प्रकाश में लाना करने के लिए कुशल है । एक अंय विधि, Hsia और सहयोगियों2द्वारा बीड़ा उठाया है, उच्च Ca 2 का उपयोग करता है+ acsf कार्रवाई क्षमता फायरिंग, बजाय 4 एपी बढ़ाने के लिए । हालांकि इस विधि हिप्पोकैम्पस स्लाइसें में सफल रहा था, हमने पाया है कि उच्च Ca2+ कम कुशल था 4-एपी हाइपोथैलेमस स्लाइसें में गोलीबारी की क्षमता में फायरिंग की सुविधा6। वास्तव में, यह दिखाया गया है कि उच्च, extracellular सीए2 + एकाग्रता ंयूरॉंस और axons के आंतरिक उत्तेजना को बदलने के द्वारा Na+ चालकत्व26,27। यह समझा जा सकता है क्यों कुछ स्लाइस में, उच्च Ca2 + ACSF epsc आवृत्ति बढ़ाने में प्रभावी नहीं है ।
इस विधि की एक सीमा है, जो सभी टुकड़ा पैच क्लैंप electroफिजियोलॉजी के लिए निहित है, यह है कि कई, लंबे समय तक postsynaptic ंयूरॉंस के लिए रेंज के अनुमानों टुकड़ा तैयारी में कटौती कर रहे हैं । आदेश में कार्रवाई की क्षमता का निरीक्षण करने के लिए, यह संभावना है कि presynaptic axons और कोशिका निकायों को टुकड़ा में संरक्षित किया जाना चाहिए । इसलिए, बहुलता माप synaptic कनेक्टिविटी है कि टुकड़ा के भीतर संरक्षित है करने के लिए विषम है । एक ही लाइन के साथ, टुकड़ा करने की क्रिया की दिशा अनुमानों की कुछ आबादी के कारण संरक्षित किया जा सकता है जबकि अंय28कटे हुए हैं । इन सीमाओं में अभिवाही आदानों की बहुलता को कम आंकने का सामान्य प्रभाव होता है ।
वर्णित प्रोटोकॉल एक दिए गए न्यूरॉन के लिए सभी आदानों भर में synaptic बहुलता की डिग्री का अनुमान लगाने के लिए एक विधि प्रदान करता है. अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक, जैसे युग्मित रिकॉर्डिंग या एक एकल अक्षतंतु की न्यूनतम उत्तेजना की पहचान कर सकते हैं कि क्या किसी दिए गए कनेक्शन में एकाधिक संपर्क हैं, लेकिन ये प्रयोग प्राय: सभी प्रणालियों में कठिन और संभव नहीं होते हैं । इसके अलावा, वे एक दिया ंयूरॉन के लिए आदानों के सभी के संगठन का एक समग्र संकेत नहीं दे सकता है के रूप में वे केवल ंयूरॉंस के एक जोड़े को अलग । वर्तमान प्रोटोकॉल बुनियादी पैच-दबाना electroफिजियोलॉजी तरीकों का उपयोग करता है एक दिया ंयूरॉन के लिए सभी आदानों भर में बहुलता की डिग्री का मूल्यांकन ।
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Disclosures
लेखकों को प्रकट करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
जेएस ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति प्राप्त की । W.I. मानसिक स्वास्थ्य अनुसंधान कनाडा से एक नया अंवेषक फैलोशिप प्राप्त की । यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (06106-2015 आरजीपिन) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए संस्थान (PJT १४८७०७) से डब्ल्यू मैं करने के लिए ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL syringe | BD | 309659 | |
10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
22 μM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
Krazy glue | various | various | |
Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
Parafilm | Sigma | PM-996 | |
Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
Chemicals/reagents | |||
4-AP | Sigma | 275875 | |
BAPTA | molecular probes | B1204 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
CdCl2 | sigma | 202908 | |
DNQX | Tocris | 189 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
glucose | Sigma | G5767 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
K2-ATP | Sigma | A8937 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
K-gluconate | Sigma | G4500 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
Na3GTP | Sigma | G8877 | |
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
Picrotoxin | sigma | P1675 | |
SrCl | Sigma | 255521 | |
sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
TTX | Alamone Labs | T-550 | |
yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
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