Neuroscience

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461

¹Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, ²Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, ³Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.

Abstract

No sistema nervoso central, um par de neurônios formam frequentemente múltiplos contatos sinápticos e/ou sites de liberação de neurotransmissor funcional (multiplicidade sináptica). Sináptica multiplicidade é plástico e mudanças ao longo do desenvolvimento e em diferentes condições fisiológicas, sendo um importante determinante para a eficácia da transmissão sináptica. Aqui, nós esboçamos experimentos para estimar o grau de multiplicidade das sinapses de terminação para um determinado neurônio pós-sináptico usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda. Especificamente, a gravação de tensão-braçadeira é usada para comparar a diferença entre a amplitude das correntes pós-sináptico excitatórias espontâneas (sEPSCs) e correntes de pós-sinápticos excitatórios em miniatura (mEPSCs). A teoria por trás deste método é que entradas aferentes que apresentam multiplicidade mostrará sEPSCs grande, dependente do potencial de ação, devido à liberação de síncrona que ocorre em cada contato sináptico. Em contraste, o lançamento independente de potencial de ação (que é assíncrono) irá gerar menor amplitude mEPSCs. Este artigo descreve um conjunto de experiências e análises para caracterizar a existência de multiplicidade sináptica e discute os requisitos e limitações da técnica. Esta técnica pode ser aplicada para investigar como diferentes intervenções comportamentais, farmacológicas ou ambientais em vivo, afectar a organização de contatos sinápticos em áreas diferentes do cérebro.

Introduction

Transmissão sináptica é um mecanismo fundamental para a comunicação entre os neurônios e, portanto, funcionamento do cérebro. Transmissão sináptica também é lábil e pode alterar sua eficácia de forma dependente da atividade, bem como em resposta a sinais moduladora¹. Assim, examinando a função sináptica tem sido um foco importante de pesquisa da neurociência. Eletrofisiologia do grampo de remendo de célula inteira é uma técnica versátil que permite-nos compreender, pela elaboração de projetos experimentais e análises de dados, em profundidade mecanismos biofísicos e moleculares da transmissão sináptica. Uma abordagem comumente usada, talvez devido a simplicidade da técnica e conceito, é a medição das correntes de pós-sináptico excitatório/inibitório em miniatura (mE / IPSCs) sob a tensão braçadeira configuração²^,³^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶. mPSCs individuais representam o fluxo de íons através de receptores pós-sinápticos geleificação (por exemplo, os receptores GABA e GABA_A ) em resposta à ligação de seus respectivos neurotransmissores liberados do terminal pré-sináptica ⁷. Porque a gravação é obtida na presença da voltagem-dependente Na⁺ canal bloqueador tetrodotoxina (TTX), o lançamento é independente do potencial de ação e normalmente envolve uma única vesícula sináptica que contém o neurotransmissor. Partindo deste pressuposto, a amplitude média de mPSCs é amplamente utilizada como uma estimativa crua para o tamanho de quantal, que representa o número e funcionalidade dos receptores pós-sinápticos, opondo-se um único lançamento de site. Por outro lado, a frequência de mPSCs é considerada para representar uma combinação do número total de sinapses encerra para a célula pós-sináptica e sua probabilidade média de lançamento. No entanto, esses parâmetros não meça outra variável-multiplicatividade de sinapses, ou multiplicidade sináptica — que é importante para a eficácia da transmissão sináptica.

Com base na teoria quantal da transmissão sináptica⁷^,⁸^,⁹, a força de uma determinada conexão entre um par de neurônios é dependente de três fatores: o número de sinapses funcionais (N), o resposta pós-sináptica para o lançamento de uma única vesícula sináptica (tamanho quantal; Q) e a probabilidade de liberação do neurotransmissor (P_r). Sináptica multiplicidade é equivalente a N. O desenvolvimento da multiplicidade sináptica ou a poda das sinapses multiplicativas é plástico durante todo o desenvolvimento e doença diferentes Estados³^,⁴^,⁶^,¹⁰. Por esta razão, caracterizando a multiplicidade sináptica tem implicações importantes para compreender a eficácia da transmissão sináptica na saúde e na doença. Técnicas, tais como a microscopia eletrônica podem identificar evidências estruturais da multiplicidade sináptica através da detecção de múltiplos contatos sinápticos provenientes do mesmo axônio para o mesmo neurônio pós-sináptico¹¹^,¹²^, ¹³^,¹⁴. No entanto, essas multisynapses estruturalmente identificados podem ser funcionalmente silenciosa¹⁵^,¹⁶. Análise funcional precisa de N exige que tecnicamente desafiador eletrofisiológicas abordagens, tais como gravações de células inteiras emparelhadas que podem identificar se uma determinada conexão tem vários sites de lançamento funcional mínima e abordagens de estimulação que visam recrutar um único axônio putativo.

Neste protocolo, descrevemos um método simples para estimar a multiplicidade sináptica, adoptando um método originalmente desenvolvido por Hsia et al². Esta técnica envolve a medição de espontânea PSCs (sPSCs) e mPSCs usando eletrofisiologia braçadeira remendo de célula inteira, o que nos permite estimar o grau de multiplicidade sináptica através de todas as entradas para um determinado neurônio. Como definida anteriormente, sináptica multiplicidade reflete o número de sinapses entre um determinado neurônio pré e pós-sinápticas. Se múltiplas sinapses são recrutadas em sincronia por um potencial de ação, haverá uma grande probabilidade do somatório temporal das EPS (ou seja, quantal) individuais, gerando uma maior amplitude PSC. Nas gravações do mPSC (em que potenciais de ação são bloqueados por TTX), a probabilidade de somação temporal dos individuais (não-síncronas) mPSCs é baixa. Usando esta lógica, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sPSC (com liberação de dependente do potencial de ação) para a amplitude do mPSC.

Para examinar a existência de multiplicidade, descrevemos quatro experimentos e suas análises usando glutamatérgico EPSCs como exemplo. No entanto, a mesma abordagem pode ser usada para a rápida transmissão gabaérgica/glycinergic (IPSCs). Uma breve fundamentação para cada experimento é descrita abaixo. Em primeiro lugar, conforme explicado acima, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sEPSCs para mEPSCs. Há dois requisitos para esta abordagem; 1) pré-sináptica axônios de disparar um número suficiente de potenciais de ação durante a gravação, e 2) P_r deve ser alta para que múltiplas sinapses liberar neurotransmissores após a chegada de um potencial de ação. A fim de atender a esses requisitos, sEPSCs são primeiramente registrados em baixo Ca^{2 +} artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) e em seguida na presença de uma baixa concentração do antagonista de canal de K⁺ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar a ação disparo de potencial e P_r. Então disparando do potencial de ação é bloqueado por TTX e Pr diminuída uma voltagem Ca^{2 +} bloqueador dos canais de Cd^{2 +}. A amplitude da sEPSCs (com 4AP) é comparada com a de mEPSC (com 4AP, TTX e Cd^{2 +}). No segundo experimento, Ca^{2 +}é substituído por equimolar Sr^{2 +} na aCSF para desynchronize liberação de vesículas. Como Ca^{2 +} é necessária para a versão síncrona de vesículas, substituição com Sr^{2 +} deve eliminar a sEPSCs de grande amplitude que sejam indicativos de multiplicidade. Em terceiro lugar, mecanicamente, multiplicidade pode resultar de qualquer vários contatos sinápticos ao mesmo neurônio pós-sináptico ou liberação multivesiculares (ou seja, múltiplas vesículas lançadas dentro de um único contato sináptico)¹⁷^,¹⁸. Para diferenciar entre os dois tipos de multiplicidade, o terceiro experimento utiliza uma baixa afinidade, rápida dissociando antagonista competitivo dos receptores GABA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)¹⁷^,¹⁸ , para determinar se o grande sEPSC são o resultado de uma soma temporal das sinapses independentes ou liberação multivesiculares atuando sobre uma população de sobreposição de receptores pós-sinápticos. Se os acontecimentos de grande amplitude surgem de lançamento multivesiculares, γ-DGG será menos eficaz inibe a maior sEPSCs em relação ao menor, Considerando que grande sEPSCs que surgem a partir do somatório temporal de vários contatos sinápticos serão afetados da mesma forma por Γ-DGG. No quarto experimento, um método mais fisiológico é usado para aumentar o potencial de ação mista, nomeadamente aferente estimulação sináptica. Picos de atividade sináptica podem transitoriamente aumento/facilitar a probabilidade de queima e liberação de potencial de ação espontânea das afferents estimulada. Portanto, esta abordagem permite que a multiplicidade de manifestar de forma mais fisiológica.

O seguinte protocolo descreve o método para a realização dessas experiências no tecido hipotalâmico de rato. Especificamente, os neurônios de hormônio (CRH) liberando corticotropina do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) são utilizados. Descrevemos os procedimentos para a realização de eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras e explicar as experiências específicas para testar a multiplicidade sináptica.

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Protocol

Todas as experiências com animais são aprovadas na Comissão de cuidado Animal da Universidade de Ontário ocidental em conformidade com o Conselho canadense sobre orientações de cuidado Animal (AUP #2014-031).

1. soluções

Solução de corte
1. Consulte a tabela 1 para a composição da solução de corte.
2. Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.
3. Para 1 x solução fatiamento, dissolver NaHCO₃, glicose e sacarose em ddH₂O e adicione o caldo de 20x. Garantir que a osmolaridade é entre 315-320 mOsm e armazenar a solução para não mais de 1 semana a 4 ° C.
4. Encha dois copos com 100 mL de solução de corte e cubra-os com parafilme. Refrigere a solução em um freezer até a solução torna-se parcialmente congelada (cerca de 20 min no freezer-80 ° C). Usando um tubo de dispersão de gás, bolha dois copos de fatiar a solução com 95% O₂5% CO₂por 20 min no gelo.

	Concentrações de solução (mM)
	De corte	ACSF normal	Baixa de Ca^{2 +} aCSF	ACSF Sr⁺	Pipeta/interno
NaCl	87	126	126	126	-
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl₂	0,5	2.5	0,5	-	-
SrCl₂	-	-	-	2.5	-
MgCl₂	7	1.5	2.5	1.5	2
NaH₂PO₄	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO₃	25	26	26	26	-
Glicose	25	10	10	10	-
Sacarose	75	-	-	-	-
K-gluconato	-	-	-	-	116
At-gluconato	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
At₃GTP	-	-	-	-	0.3

Tabela 1: Composição de várias soluções.

aCSF (para manutenção e recuperação de fatia)
1. Consulte a tabela 1 para a composição da aCSF.
2. Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.
3. Para 1 x aCSF, dissolver NaHCO₃ e glicose em ddH₂O e adicione o caldo de 20x. Garantir que a osmolaridade é entre 298-300 mOsm. Utilize a solução dentro de 1 dia.
aCSF (baixo Ca^{2 +} para gravação)
1. Consulte a tabela 1 para a composição da Ca^{2 +} aCSF baixa.
2. Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.
3. Para 1 x baixo Ca^{2 +} aCSF, dissolver NaHCO₃ e glicose em ddH2O e adicionar 20 x (CaCl₂ e MgCl₂ grátis) estoque, CaCl₂ e MgCl₂ para especificado concentrações. Garantir que a osmolaridade é entre 298-300. Utilize a solução dentro de 1 dia.
aCSF (Sr^{2 +} para gravação)
1. Consulte a tabela 1 para a composição do Sr^{2 +} aCSF.
2. Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.
3. Para 1 x Sr^{2 +} aCSF, dissolver NaHCO₃ e glicose em ddH₂O e adicionar 20 x (CaCl₂ e MgCl₂ grátis) estoque, SrCl₂ e MgCl₂para especificado concentrações. Garantir que a osmolaridade é entre 298-300. Utilize a solução dentro de 1 dia.
Solução interna
1. Consulte a tabela 1 para a composição da solução interna com base K-gluconato.
2. Para fazer 20 mL da solução interna, adicione 15 mL de água de grau de biologia molecular para um tubo de 50 mL. Execute as etapas subsequentes no gelo.
3. Prepare as seguintes soluções antes do tempo para concentrações estoque de 1 M em biologia molecular da classe água. Adicionar (em mL): 2,32 K-gluconato, at-gluconato 0,24, 0,20 HEPES, 0.16 KCl, 0.05 K2-EGTA, 0,04 MgCl₂ para o tubo de 50 mL.
4. Adicione 100 µ l de 0,3 M AT₃GTP.
5. Pesar 44,08 mg de K₂ATP em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL e adicionar 1 mL de água de grau de biologia molecular e, em seguida, adicionar ao tubo de 50 mL.
6. Ajuste o pH para 7,2-7,4 com 1m KOH. Garantir que a osmolaridade é entre 283-289 mOsm.

2. preparação da fatia

Preparar ferramentas
1. Adicionar 200 mL de aCSF para a câmara de recuperação (construída a partir de um copo de 250 mL com 4 poços e rede) e coloque a câmara de recuperação em um banho de água (35 ° C).
2. Cobrir a câmara com uma película de parafina e bolha constantemente a aCSF com 95% O₂5% CO₂usando um tubo de vidro dispersão pelo menos 20 min.
3. Prepare-se para a dissecação, configurando as ferramentas (bisturi, tesoura bem angulada, pinça, pincel fino, colher de plástico).
4. Encha uma seringa de 60 mL com cerca de 15 mL da solução gelada fatia da etapa 1.1.4.
5. Prepare a plataforma de dissecação, colocando um papel de filtro na tampa de um prato bem.
6. Prepare a câmara de corte colocando-o na bandeja de gelo e enchendo a bandeja de gelo.
7. Configurar o vibratome, fixando uma lâmina descartável em porta-lâmina.
8. Fazer uma pipeta de transferência, quebrando a ponta de uma pipeta Pasteur e colocando um bulbo de borracha sobre a extremidade quebrada.
Dissecar o cérebro de rato
1. Anestesia o animal numa câmara saturada com 4% de isoflurano até os reflexos da coluna vertebral estão ausentes.
2. Decapitar o animal usando uma guilhotina e remover rapidamente o cérebro.
  1. Fazer uma incisão com uma lâmina de bisturi n º 22 de rostral ao caudal.
  2. Lateralmente, descasca o couro cabeludo em cada lado da cabeça.
  3. Bem de uso de tesoura para cortar o crânio de um lado de caudal para rostral (incluindo o lado dos ossos frontal), usando o cuidado para não danificar o cérebro.
  4. Uso de fórceps para levantar o pedaço do crânio fora o cérebro e esfriar rapidamente o cérebro com 15 mL de solução de corte gelada utilizando a seringa da etapa 2.1.4.
  5. Levante o cérebro o crânio.
  6. Lugar do cérebro em um dos copos cheios de solução gelada de corte (da etapa 1.1.4) borbulhava com 95% O₂5% CO₂.
Prepare fatias de hipotálamo de rato
1. Bloquear o cérebro para a área do cérebro desejado e ângulo de corte (por exemplo, para coronais hipotalâmicas fatias, retire o tecido do quiasma rostral e caudal a ponte usando uma lâmina e assegurar o caudal bloco tem uma superfície plana perpendicular à base do cérebro).
2. Usando um pedaço de papel de filtro, pegar o cérebro do lado anterior e cola no lado posterior para a chapa de suporte usando a cola instantânea.
3. Rapidamente Coloque a placa de exploração para a câmara de fatiamento e encha a câmara com a solução de corte do segundo copo na etapa 1.1.4.
4. Fixe o corte câmara e gelo a bandeja sobre o vibratome.
5. Definir a área de corte (anterior e posterior do cérebro) e começar a cortar 250 µm fatias coronais de espessura. Parâmetros recomendados: 0.10 mm/s, amplitude de velocidade 2 mm.
6. Apare as fatias para o tamanho apropriado para a área do cérebro desejado.
7. Recupere as fatias a 35 ° C por 30-45 min. Em seguida, remova a câmara de recuperação do banho de aquecimento e permitir que as fatias recuperar a temperatura para um adicional de 30 min. fatias de manter a temperatura do quarto para o resto do dia e continuam a bolha banho constantemente com 95% O₂5% CO₂.

3. células inteiras Patch ClampRecording

Puxe as remendo de pipetas
1. Usando os parâmetros sugeridos para a célula inteira de gravação do manual do extrator a pipeta, puxe pipetas de remendo de paredes de espessura de vidro para uma resistência de pipeta de 3-5 MΩ.
2. Usando uma microsseringa (comercial ou caseiro), preencher uma ponta da pipeta com a solução filtrada interna. Para fazer uma microsseringa, queimar a ponta de uma seringa de 1 mL e permitir que a ponta cair criando uma multa longa ponta.
Obter a configuração de células inteiras
1. A pipeta de gravação apenas acima da pipeta fatia e deslocamento local atual no modo de grampo de tensão. Aplique uma ligeira pressão positiva para a pipeta e fechar a torneira.
2. Selecione uma célula saudável com uma membrana intacta e abordagem a célula com a pipeta. A pressão positiva deve causar uma perturbação ligeira no tecido (ou seja, uma onda lenta no tecido quando entrar).
3. Lentamente continue a trazer a pipeta mais próximo à célula usando um movimento diagonal até a pipeta constitui uma pequena ondulação na superfície da célula.
4. Libere o bloqueio de pressão positiva. O celular vai começar a formar um selo e a resistência aumentará acima de 1 GΩ. No grampo de tensão, segure o celular na-68 mV.
5. Se afastar ligeiramente a célula diagonalmente para remover o excesso de pressão da célula.
6. Compensa a capacitância de pipeta rápidas e lentas.
7. Aplica uma breve aspiração através do tubo conectado ao titular da pipeta para romper a célula e obter configuração de células inteiras.
8. Mude para o modo de célula na membrana teste janela em uma eletrofisiologia, aquisição de dados e software de análise (por exemplo, Clampex).
9. Antes de cada grampo de tensão gravar, executar um teste de membrana, usando o mesmo software e gravar os parâmetros relevantes em um livro de laboratório (membrana resistência, acesso e da capacidade).
10. Manter a temperatura do banho gravação 27 – 30 ° c e a taxa de fluxo em 1.5-2.0 mL/min para experiências posteriores.

4. a multiplicidade experiências

Experimento 1: estimativa de multiplicidade usando 4-AP
1. No grampo de tensão, segure o celular na-68 mV. Usando o mesmo software, grave o sEPSCs enquanto perfusing o banho com baixa Ca^{2 +} aCSF. Recorde pelo menos 5 min após o início da configuração de células inteiras para garantir uma gravação da linha de base estável como a atividade sináptica pode ser alta logo após a descoberta da membrana.
2. Utilizando uma micropipeta, adicione 4-AP para a aCSF e banho aplicar 30 µM 4-AP. sEPSCs de registro pelo menos 10 min obter o efeito completo de drogas.
3. Adicionar 0,5 µM TTX e 10 µM Cd^{2 +}a aCSF com 4-AP e gravar o mEPSCs pelo menos 10 min.
4. Para análise off-line, use o último 1 min de linha de base imediatamente antes da aplicação de 4-AP (em baixo Ca^{2 +} aCSF), a 10 min de aplicação 4-AP e a 10 min de aplicação TTX.
Experimento 2: desynchronize liberação de vesículas usando Sr^{2 +}
1. Enquanto perfusing o banho com normal Ca^{2 +} aCSF (o mesmo que o banho aCSF) registro sEPSCs pelo menos 5 min.
2. Alternar o Ca^{2 +} aCSF normal e começar perfusing Sr^{2 +} aCSF (da etapa 1.4) e registro sEPSCs.
3. Para análise off-line, para determinar se o sEPSCs de grande amplitude são devido à liberação síncrona de vesículas, compare o último 1 min de linha de base (no normal aCSF) para os 10 minutos de^th do Sr^{2 +} aCSF aplicativo.
Experimento 3: teste para lançamento multivesiculares usando Γ- DGG
1. Em baixo Ca^{2 +} aCSF registro sEPSCs pelo menos 5 min.
2. Adicione 30 µM 4-AP para a aCSF através do sistema de perfusão. SEPSCs recorde pelo menos 10 min.
3. Adicionar 200 µM γ-DGG para a aCSF com 4-AP e gravar o sEPSCs pelo menos 10 min.
4. Como um experimento de controle em uma célula separada, execute as etapas 1-3 mas se aplicam a uma baixa concentração (125 nM) de DNQX em vez de γ-DGG.
5. Para análise off-line, analise o último minuto de cada aplicação da droga.
Experimento 4: Estimule entradas aferentes para aumentar o potencial de ação tiro.
1. SEPSCs registro no Ca^{2 +} aCSF normal.
2. Estimule o afferents usando um eletrodo monopolar de vidro preenchido com aCSF a uma taxa de 20 Hz durante 2 segundos e repetir 10 vezes com um intervalo entre a explosão de 20 seg.
3. Para análise, usar os ms 5.000 antes o primeiro estímulo como linha de base e comparar com os 10-300 ms após o estímulo final e então tomar a variação de amplitude e frequência média mais de 10 ensaios.

5. análise

Analise sEPSCs e mEPSCs usando um programa que detecta e analisa as correntes sinápticas (por exemplo, software de análise de Mini).
1. Usando este software, use os parâmetros de deteção sugerido para detecção de Leandro Receptor EPSCs (ou EPSCs de Receptor GABA se gravação inibitórias correntes).
2. Use a função de análise Nonstop para detectar EPSCs na gravação.
3. Digitalizar manualmente cada gravação para garantir que o programa é detectar com precisão cada evento (por exemplo, certifique-se de eventos não estão sendo perdido ou contados duas vezes).
4. Exportar os dados do evento copiando-o para a área de transferência e colá-lo em um software de gerenciamento de dados (por exemplo, Excel)
5. Calcular a média frequência e/ou amplitude para cada tratamento de drogas e realizar as análises estatísticas relevantes.

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Representative Results

O protocolo acima descreve um método para usar eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras para examinar o grau de multiplicidade sináptica, usando hipotalâmico neurônios de rato como exemplo. Esta técnica de preparação de fatia deve produzir células viáveis saudáveis que não possuem uma membrana inchada ou núcleo (Figura 1). Cada passo no protocolo é importante para a saúde do tecido e da qualidade das gravações.

Figura 1: seguinte de tecido e não-íntegros fatia preparação. Fatie preparação de eletrofisiologia do PVN sob ótica de contraste de interferência diferencial na ampliação de x 40. Setas vermelhas indicam as células saudáveis, e setas pretas indicam células insalubres. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2 ilustra a justificativa para a identificação de multiplicidade sináptica usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo. Multiplicidade sináptica pode resultar de qualquer contato múltiplo sináptico entre um par de neurônios (esquerda de Figura 2A), ou pela liberação multivesiculares em um determinado local sináptica (Figura 2A certo). Em ambas as situações, um potencial de ação no neurônio pré-sináptica seria eliciar uma grande resposta pós-sináptica (sEPSC) devido a soma temporal de vários eventos sinápticos. No entanto, na ausência de potenciais de ação pré-sináptica (por exemplo, na presença de TTX e Cd^{2 +} bloquear at⁺-dependente e Ca^{2 +}-dependente ação potencial fuzilamento), liberação de neurotransmissor vesicular é assíncrona. Como resultado, a resposta pós-sináptica torna-se menor (Figura 2B: independente de AP). Se dois neurônios não apresentam multiplicidade (ou seja, têm apenas um lançamento de contato/não multivesiculares sináptico) não haverá nenhuma diferença na resposta pós-sináptica entre a libertação dependente do potencial de ação e potencial de ação independente de neurotransmissor (Figura 2).

Figura 2: Diagrama esquemático ilustrando as consequências das diferentes organizações sinápticas nas correntes pós-sinápticas. (, B) Em uma sinapse com multiplicidade, um potencial de ação e o consequente Ca^{2 +} influxo desencadeia síncrono fusão de múltiplas vesículas sinápticas que resultam em grandes, multiquantal EPSCs. Multiplicidade sináptica pode resultar de contato multisynapse ou multivesiculares lançamento em uma única sinapse (A). Na presença de TTX e Cd^{2 +}, fusão de vesículas do potencial de ação independente é assíncrona e faz com que uniquantal pequeno EPSCs (B). (C) nas sinapses sem multiplicidade, ambos dependentes do potencial de acção e - independente fusão de vesículas resulta em uniquantal EPSCs. Esta figura foi modificada da figura 1A da nossa anterior relatório⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No experimento 1, 4-AP é aplicada ao banho para aumentar o potencial de ação disparando e liberar a probabilidade. Para garantir que aquele 4-AP está a aumentar o potencial de ação espontâneo disparando, a frequência de EPSCs pode ser comparada entre sEPSCs e mEPSCs (Figura 3A, C). Porque sEPSCs são uma combinação de eventos dependentes de potencial de acção e - independentes, a diferença na frequência de sEPSC e mEPSC serve como um proxy para o potencial de ação espontâneo atirando nos axônios pré-sináptica. Nós usamos um corte arbitrário fora > 15% diferença na frequência entre sEPSC a mEPSC para garantir que um número suficiente de eventos dependentes de potencial de ação está presente para a análise da multiplicidade. Se o EPSCs na baixa condição de Ca^{2 +} e a condição TTX (mEPSC) são semelhantes em frequência e amplitude (ou seja, sem espontânea ação potencial disparar na baixa condição de Ca^{2 +} ), a diferença entre o Ca baixa^{2 +} de base sEPSC e 4 -AP também pode ser usado para a análise da multiplicidade.

No exemplo mostrado na Figura 3, 4-AP aumenta tanto a amplitude e a frequência de sEPSCs. Subsequente aplicação de TTX e Cd^{2 +} diminui a amplitude e a frequência. Conforme descrito acima, a diferença entre sEPSCs e mEPSCs na amplitude indica multiplicidade sináptica. Em neurônios hipotálamo que examinamos aqui, a amplitude e frequência da linha de base e condições TTX são os mesmos (Figura 3, D), sugerindo que a sEPSCs de base contêm poucas EPSCs dependente do potencial de ação. Nesse sentido, as experiências subsequentes podem comparar a diferença entre a linha de base e 4-AP para medir a multiplicidade.

Figura 3:. 4-AP aplicação revela a multiplicidade sináptica. (A) amostra vestígios de sEPSCs gravado em baixo Ca^{2 +} aCSF durante a linha de base e depois aplicação 4-AP (30 μM) e subsequente TTX (0,5 μM) e Cd^{2 +}(10 μM) aplicativo. (B) a distribuição de sEPSC amplitude da gravação mostrada em (A). (C, D) Resumo da frequência média (C) e (D) a amplitude entre a linha de base (cinza), 4-AP (vermelho) e TTX + Cd^{2 +} (azul). P < 0.005, * * P < 0,01. Esta figura foi modificada da Figura 2 do nosso anterior relatório⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método descrito acima calcula a média multiplicidade das sinapses encerra para os neurônios pós-sinápticos: não pode detectar alterações na multiplicidade que ocorrem em uma pequena proporção das sinapses. No entanto, em nosso estudo recente, este método revelou mudanças na multiplicidade de glutamato sinapses hipotalâmicas neurônios entre normal e cronicamente estressado condições⁶.

Substituição de Ca^{2 +} com equimolar Sr^{2 +} na aCSF desynchronizes dependente do potencial de ação libertação de neurotransmissor vesículas ^{19, 20}. Portanto, se o sEPSCs de grande amplitude são o somatório de liberação dependente do potencial de ação sincronizada neurotransmissor vesicular (ou seja, multiplicidade), substituindo Ca^{2 +} com Sr^{2 +}irá diminuir a amplitude de EPSCs. Como visto na Figura 4, Sr^{2 +} aCSF diminui a proporção de eventos de grande amplitude (Figura 4B) e como consequência diminui a amplitude média (Figura 4). Quando as células não apresentam multiplicidade, desynchronizing liberação de vesículas não terá efeito sobre a amplitude EPSC.

Figura 4: Sr^{2 +} desynchronizes grandes eventos multiquantal. (A) comparação de rastreamento representativa entre Ca^{2 +} aCSF normal e Sr^{2 +} aCSF. Sr^{2 +} aCSF desynchronizes liberação de vesículas e diminui a amplitude de multiquantal eventos síncronos, como visto em uma distribuição de amplitude representante (B) e a mudança de amplitude para todas as células (C) * P < 0,05. Esta figura foi modificada da Figura 3 de nossa anterior relatório⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Γ-DGG, um rápido dissociating antagonista competitivo dos receptores GABA, pode ser usado para determinar se a multiplicidade é devido a liberação multivesiculares ou múltiplos contatos sinápticos. Como lançamento multivesiculares age sobre uma população sobreposição dos receptores pós-sinápticos, a grande amplitude EPSCs envolve o pool de glutamato na fenda sináptica. Em outras palavras, a concentração de glutamato na fenda sináptica é maior do que a que resulta da liberação de uniquantal. Por outro lado, contatos multisynaptic teria uniquantal EPSCs em cada local sináptica. Se a grande amplitude EPSCs surgem de lançamento multivesiculares, os maiores EPSCs serão menos impactados pelo antagonismo do γ-DGG (devido à maior concentração de glutamato) comparado com menor amplitude EPSCs (Figura 5A bem, B-D). Se a grande amplitude EPSCs são devido a soma de síncrono uniquantal EPSCs (contatos multisynapse), γ-DGG similarmente impactará a amplitude de todos os EPSCs (Figura 5A à esquerda, E-G). Em contraste com o γ-DGG, DNQX que é uma alta afinidade, lento dissociando antagonista dos receptores GABA agonista causa uma diminuição uniforme em toda a amplitude de grande e pequeno todos os EPSCs (Figura 5 H-J). A sensibilidade de γ-DGG e DNQX pode ser quantificada como a relação da amplitude média EPSC dividido pelo máximo (a média dos maiores 20 EPSCs) amplitude EPSC (Figura 5 K, L).

Figura 5: usando o γ-DGG para sondar lançamento multivesiculares. (A) esquema ilustrando dois modelos de multiplicidade. Esquerda: soma temporal de transmissão de uniquantal que tem como alvo populações independentes dos receptores pós-sinápticos. EPSCs grandes e pequenas são atingidos por uma concentração semelhante de glutamato na fenda sináptica e, portanto, são igualmente sensíveis a γ-DGG. Direita: transmissão multiquantal que tem como alvo uma população de sobreposição de receptores pós-sinápticos. Grandes EPSCs são causadas por uma maior concentração de glutamato na fissura do que sEPSCs menor e, portanto, são menos sensíveis a γ-DGG. Valores mostrados na parte inferior do modelo são amplitudes relativos hipotéticos. (B) amostra de vestígios de uma gravação em que houve um aumento na amplitude média sEPSC após a aplicação de 4-AP (4-AP Respondente). (C) parcela cumulativa para amplitude EPSC para a gravação mostrada em (B). (D) parcela cumulativa para amplitude normalizada EPSC (EPSC/EPSC_MAX) antes e após a aplicação de γ-DGG da gravação mostrada em (B). (E) amostra vestígios de uma gravação onde não houve alteração na amplitude média sEPSC seguindo 4-AP aplicação (4-AP não-Respondente). (F) cumulativo EPSC amplitude para a gravação mostrada em (MI). (G) cumulativo EPSC/EPSC_MAX Trace para a gravação mostrada em (MI). Amostra (H) vestígios de uma gravação da linha de base, bem como após 4-AP e aplicação de DNQX. (eu) o cumulativo EPSC amplitude para a gravação mostrada em (H). (J) cumulativo EPSC/EPSC_MAX Trace para a gravação mostrada em (H). (K) Resumo da média EPSC/EPSC_MAX após γ-DGG (em 4-AP Respondente e grupos não-Respondente) ou aplicativo DNQX normalizados para pre-γ-DGG/DNQX (ou seja, post-4-AP). (L) parcelas de post-4-AP significa amplitude EPSC (normalizado para pre-4-AP) contra a média de post-γ-DGG/DNQX EPSC/EPSC_MAX (normalizado para post-4-AP). P < 0.005. Esta figura foi modificada de Figura 4 do nosso anterior relatório⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A força da transmissão sináptica pode ser aumentada transitoriamente por picos de atividade sináptica. Para investigar a multiplicidade sob condições fisiológicas mais, estimulação aferente pode ser usada para aumentar o potencial de ação tiro e probabilidade de lançamento. Se houver multiplicidade, estimulação aferente deve causar um breve aumento na amplitude EPSC (figura 6A-D). Se não houver multiplicidade, atividade impulsionado aumentos no potencial de ação disparar não aumentará a amplitude EPSC.

Figura 6: estimulação de alta frequência revela a multiplicidade sináptica. (A) amostra vestígios de sEPSCs antes e depois da estimulação aferente sináptica. (B) parcela de amplitude sEPSC antes e depois da estimulação sináptica (20 Hz, 2 s) da gravação mostrada em (A). (C, D) Resumo de frequência sEPSC (C) e alterações de amplitude (D) após estimulação sináptica. P < 0,001, * P < 0,05. Esta figura foi modificada da Figura 5 do nosso anterior relatório⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um requisito importante para um experimento de eletrofisiologia braçadeira remendo bem sucedida é a obtenção de fatias/células saudáveis. Nosso protocolo descrito é otimizado para fatias hipotalâmicas que contêm neurônios PVN. Outro áreas podem exigir de cérebro modificado soluções e fatiamento métodos²¹^,²²^,²³^,²⁴. Para a gravação, é fundamental para aceitar apenas gravações estáveis monitorando constantemente as propriedades da célula, tais como a resistência da membrana, resistência da capacidade e acesso. Um aumento na resistência de acesso pode diminuir a amplitude EPSC e, portanto, confundir medições de amplitude. Nesse sentido, as células com valores de resistência de acesso que excederem 20 MΩ ou aumentam em mais de 20% durante a gravação são descartadas. Da mesma forma, uma diminuição em (ou por baixo) resistência de membrana pode resultar em espaço-braçadeira pobre e, portanto, pode diminuir a amplitude. Os neurônios no nosso sistema de alvo (neurônios PVN parvocelular) têm uma resistência de membrana alta entre 500 MΩ e 1 GΩ, e descartar células com resistências de membrana abaixo de 500 MΩ. Cortes de controle de qualidade devem ser estabelecidos para tipos específicos de neurônios sob estudo. Como este protocolo baseia-se na diferença na amplitude antes e depois de aplicações de drogas, é importante garantir que a mudança de amplitude é devido à aplicação de drogas e não para as mudanças na resistência da membrana e resistência de acesso. Os neurônios hipotalâmicas que estudamos no presente protocolo são pequenos em tamanho (capacitância da célula é de cerca de 15 pF em camundongos e resistência da membrana é de cerca de 1 GΩ) e K-gluconato baseado solução interna funciona bem para obter alta qualidade EPSCs/IPSCs⁶^,²⁵. Para os neurônios com maior tamanho de célula e baixa resistência de entrada, solução interna de césio baseado pode ser usada para garantir um bom espaço-braçadeira².

Uma exigência específica de usar esse método para medir a multiplicidade é que as células disparar um número suficiente de potenciais de ação espontâneas a fim de comparar eventos dependentes do potencial de ação para mEPSCs. Isto pode ser assegurado, comparando a diferença na frequência de EPSCs na ausência e presença de TTX e Cd^{2 +}. Em fatias hipotalâmicas que contêm o PVN, encontramos que o aplicativo de 4-AP é eficiente para provocar o disparo do potencial de ação. Outro método, pioneiro por Hsia e colegas², usa alta Ca^{2 +} aCSF para aumentar o potencial de ação disparar, ao invés de 4-AP. Enquanto este método foi bem sucedido em fatias hippocampal, que constatou que a alta de Ca²+ foi menos eficiente do que a 4-AP em facilitar o potencial de ação, atirando no hipotálamo fatias⁶. Com efeito, ficou demonstrado que alta, extracelular Ca^{2 +} concentração diminui intrínseca excitabilidade dos neurônios e axônios, alterando a condutância de at⁺ ²⁶^,²⁷. Isto pode explicar porque em algumas fatias, Ca^{2 +} aCSF alta não é eficaz em aumentar a frequência EPSC.

Uma limitação deste método, que é inerente a todos os eletrofisiologia de braçadeira de remendo de fatia, é que muitos, de longo alcance projeções para os neurônios pós-sinápticos são cortadas em preparações de fatia. Fim de observar os potenciais de ação, é provável que os axônios pré-sináptica e corpos celulares precisam ser preservado em fatia. Portanto, a medição de multiplicidade é enviesada para conectividade sináptica que é preservada dentro da fatia. Ao longo da mesma linha, a direção do corte pode causar certas populações de projeções ser preservado, enquanto outros são cortadas²⁸. Estas limitações têm um efeito geral de subestimar a multiplicidade de entradas aferentes.

O protocolo descrito fornece um método para estimar o grau de multiplicidade sináptica através de todas as entradas para um determinado neurônio. Outras técnicas de eletrofisiologia, tais como gravações emparelhadas ou estimulação mínima de um único axônio podem identificar se uma determinada conexão tem vários contatos, mas estas experiências são muitas vezes difíceis e não é possível em todos os sistemas. Além disso, não podem dar uma indicação geral da organização de todas as entradas para um determinado neurônio como isolam apenas um par de neurônios. O presente protocolo usa métodos de eletrofisiologia básica remendo-braçadeira para avaliar o grau de multiplicidade em todas as entradas para um determinado neurônio.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

J.S. recebeu bolsa de pós-graduação de Ontário. Wi recebeu uma nova bolsa de investigador de pesquisa de Saúde Mental do Canadá. Este trabalho é apoiado por subvenções de funcionamento para Wi de ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (06106-2015 RGPIN) e o Instituto Canadense para pesquisa em saúde (PJT 148707).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659
10 blade	Fisher Scientific/others	35698
22 blade	VWR/others	21909-626
22 μM syringe filters	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Angled sharp scissors	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Double edge blade	VWR	74-0002
Filter paper	Sigma/others	1001090
Fine paintbrush	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pasteur pipette	VWR	14672-200
ph meter	Mettler Toledo	FE20-ATC
Rubber bulb	VWR	82024-550
Scalpel handle No. 3	Harvard Instruments	72-8350
Scalpel handle No. 4	Harvard Instruments	72-8356
Single edge blade	VWR	55411-050
Vibratome slicer	Leica	VT1200S
Water Purification System	Millipore	Milli-Q Academic A10
Well plate lid	Fisher/various	07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	molecular probes	B1204
CaCl₂*2H₂O	Sigma	C7902
CdCl₂	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl₂*6H₂O	Sigma	M2670
Molecular biology grade water	Sigma	W4502-1L
Na₃GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH₂PO₄	Sigma	71504
NaHCO₃	Sigma	S6014
Picrotoxin	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sucrose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1

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References

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Neuroscience

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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