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Neuroscience

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Beurteilung der funktionalen synaptischen Mannigfaltigkeit mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten.

Abstract

In das zentrale Nervensystem bilden ein paar Neuronen oft mehrere synaptischen Kontakte und/oder funktionalen Neurotransmitter Freisetzungsstandorten (synaptische Multiplizität). Synaptische Vielheit ist aus Kunststoff und Änderungen während der Entwicklung und in verschiedenen physiologischen Bedingungen, wird ein wichtiger Faktor für die Effizienz der synaptischen Übertragung. Hier erläutern wir Experimente für die Schätzung des Grades der Vielzahl von Synapsen auf einen bestimmten postsynaptischen Neuron mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten zu beenden. Insbesondere ist Voltage-Clamp-Aufnahme verwendet, um die Differenz zwischen der Amplitude des spontanen exzitatorischen postsynaptischen Ströme (sEPSCs) und Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu vergleichen. Die Theorie hinter dieser Methode ist, dass afferenten Inputs, die Vielfalt zu zeigen große, Aktionspotential-abhängigen sEPSCs durch die synchrone Version angezeigt werden, die bei jedem synaptischen Kontakt auftritt. Im Gegensatz dazu wird Aktionspotential-unabhängige Version (das asynchrone) kleiner Amplitude mEPSCs generieren. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Experimenten und Analysen, die Existenz der synaptischen Vielheit zu charakterisieren und beschreibt die Anforderungen und Grenzen der Technik. Diese Technik kann angewendet werden, wie verschiedene Verhaltensstörungen, pharmakologische oder ökologischen Eingriffe in Vivo betreffen die Organisation der synaptischen Kontakte in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.

Introduction

Synaptische Übertragung ist ein grundlegender Mechanismus für die Kommunikation zwischen den Neuronen, und daher Gehirnfunktion. Synaptische Übertragung ist auch labil und kann seine Wirksamkeit eine aktivitätsabhängige ebenso wie in Reaktion auf modulierende Signale1ändern. So wurde das synaptischen Funktion untersuchen ein Schlüsselfokus der neurowissenschaftlichen Forschung. Ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie ist eine vielseitige Technik, die uns zu verstehen, durch Erarbeitung experimenteller Designs und Datenanalysen, detaillierte biophysikalische und molekulare Mechanismen der synaptischen Übertragung ermöglicht. Ein häufig verwendeter Ansatz vielleicht aufgrund der Einfachheit der Technik und Konzept, ist die Messung der Miniatur exzitatorischen/inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mE / IPSCs) unter Spannung Klemme Konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. einzelne mPSCs repräsentieren den Fluss von Ionen durch Ionotropic postsynaptischen Rezeptoren (z. B. AMPA und GABA-A -Rezeptoren) in Reaktion auf die Bindung von ihren jeweiligen Neurotransmitter aus den präsynaptischen Terminal 7 freigegeben . Da die Aufnahme im Beisein der Voltage-gated Na+ -Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) vorliegt, das Release ist Aktionspotential-unabhängig und beinhaltet normalerweise eine einzelne synaptische Vesikel, die Neurotransmitter enthält. Ausgehend von dieser Annahme, ist die durchschnittliche Amplitude der mPSCs allgemein als grobe Schätzung für die Quanten Größe verwendet, die steht für die Anzahl und die Funktionalität der postsynaptischen Rezeptoren gegen eine single-Auskopplung-Website. Auf der anderen Seite gilt als die Frequenz des mPSCs, eine Kombination aus der Gesamtzahl der Synapsen auf der postsynaptischen Zelle und Eintrittswahrscheinlichkeit durchschnittliche Freigabe beenden zu vertreten. Diese Parameter messen jedoch nicht eine weitere Variable Multiplicativity von Synapsen und synaptische Vielfalt – das ist wichtig für die Effizienz der synaptischen Übertragung.

Basierend auf der Quanten Theorie der synaptischen Übertragung7,8,9, die Stärke einer gegebenen Verbindung zwischen zwei Neuronen ist abhängig von drei Faktoren: die Anzahl der funktionellen Synapsen (N), die postsynaptischen Reaktion auf die Veröffentlichung einer einzigen synaptischen Vesikel (Quanten Größe; Q) und die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Neurotransmittern (P-R). Synaptische Multiplizität ist äquivalent zu N. Die Entwicklung der synaptischen Vielheit oder das Beschneiden der multiplikativen Synapsen ist Kunststoff während der Entwicklung und in anderen Krankheit Staaten3,4,6,10. Aus diesem Grund hat Charakterisierung synaptischen Vielzahl wichtige Implikationen für die Effizienz der synaptischen Übertragung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Techniken, wie z. B. Elektronenmikroskopie können strukturelle Beweise der synaptischen Multiplizität identifizieren, indem er erkennt mehrere synaptischen Kontakte mit Ursprung aus dem gleichen Axon auf der gleichen postsynaptischen Neuron-11,12, 13,14. Diese strukturell identifizierten Multisynapses kann jedoch funktional Stille15,16. Genaue funktionelle Untersuchung des N erfordert technisch anspruchsvolle elektrophysiologische Ansätze wie gekoppelten ganz-Zell-Aufnahmen, die erkennen, ob eine bestimmte Verbindung mehrerer Standorte der funktionalen Release hat und minimale Stimulation-Ansätze, die darauf abzielen, ein einziges vermeintliche Axon zu rekrutieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Schätzung der synaptischen Vielfalt durch die Annahme einer Methode, die ursprünglich von Hsia Et al.2entwickelt. Diese Technik beinhaltet die Messung der spontanen PSCs (sPSCs) und mPSCs mit ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, was uns erlaubt, die Schätzung des synaptischen Vielfalt über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron.  Da zuvor definierten, synaptische Mannigfaltigkeit die Anzahl der Synapsen zwischen eines bestimmten Prä- und postsynaptischen Neurons widerspiegelt. Wenn mehrere Synapsen synchron durch ein Aktionspotential rekrutiert werden, werden mit hoher Wahrscheinlichkeit zeitliche Summierung der einzelnen (d.h. Quanten) EAP, erzeugen eine größere Amplitude PSC.  MPSC Aufnahmen (in denen Aktionspotentiale durch TTX blockiert sind), die Wahrscheinlichkeit der zeitliche Summierung der einzelnen (nicht-synchrone) mPSCs ist gering. Mit dieser Begründung, werden synaptische Multiplizität abgeschätzt durch den Vergleich der sPSC Amplitude (mit Aktionspotential-abhängige Version) auf die mPSC Amplitude.

Um die Existenz der Multiplizität untersuchen beschreiben wir vier Experimente und ihre Analysen mit glutamatergen EPSCs als Beispiel. Jedoch kann der gleiche Ansatz verwendet werden, für die schnelle Übertragung der GABAergen/glycinergen (IPSCs). Eine kurze Begründung für jedes Experiment wird nachfolgend beschrieben. Zunächst, wie oben erläutert, synaptische Multiplizität abgeschätzt werden durch den Vergleich der Amplitude der sEPSCs zu mEPSCs. Es gibt zwei Anforderungen für diesen Ansatz; (1) präsynaptischen Axone müssen eine ausreichende Anzahl von Aktionspotentialen Feuer, während der Aufnahme, und (2) PR muss hoch sein, so dass mehrere Synapsen Neurotransmitter bei der Ankunft ein Aktionspotenzial freigeben. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, sEPSCs sind zuerst aufgenommen in niedrigen Ca2 + künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS), und dann in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von K+ -Kanal-Antagonisten, 4-Aminopyridine (4-AP) Aktion erhöhen möglichen Zündung und PR. Dann feuern Aktionspotential TTX und Pr sank um ein Voltage-gated Ca2 + -Kanal-Blocker Cd2 +wehrt. Die Amplitude der sEPSCs (mit 4AP) ist im Vergleich zu der mEPSC (mit 4AP, TTX und Cd2 +). Im zweiten Experiment ist Ca2 + äquimolaren Sr2 + in der ACFS, Vesikel Release Synchronisierung abgelöst. Als Ca2 + für die synchrone Version von Vesikeln erforderlich ist, sollte Ersatz mit Sr2 + großer Amplitude sEPSCs beseitigen, die Vielheit bezeichnend sind. Drittens, mechanistisch, Multiplizität kann ergeben sich aus entweder mehrere synaptischen Kontakte gleichen postsynaptischen Neuron oder multivesicular Version (d. h. mehrere Bläschen innerhalb einer einzigen synaptischen Kontakt freigegeben)17,18. Um zwischen den beiden Arten der Vielheit zu unterscheiden, verwendet das dritte Experiment eine geringe Affinität, schnelle trennendem kompetitiver Antagonist des AMPA-Rezeptoren, γ-D-Glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , um festzustellen, ob groß sEPSC sind das Ergebnis der zeitliche Summation der unabhängigen Synapsen oder multivesicular Version, die auf einer überlappenden Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren. Im Falle großer Amplitude Veranstaltungen von multivesicular Release werden γ-DGG weniger effektiv bei der Hemmung größer im Vergleich zu kleineren sEPSCs während der großen sEPSCs, die durch die zeitliche Summierung von mehreren synaptischen Kontakte entstehen in ähnlicher Weise betroffen sind Γ-DGG. Im vierten Versuch ist eine physiologische Methode zum Aktionspotential brennen, nämlich afferenten synaptic Stimulation zu erhöhen. Platzt der synaptischen Aktivität können vorübergehend erhöhen/die spontane Aktionspotential abfeuern und Freigabe Wahrscheinlichkeit angeregten Afferenzen erleichtern. Dieser Ansatz ermöglicht daher Multiplizität in physiologischer Weise manifestieren.

Das folgende Protokoll beschreibt die Methode für die Durchführung dieser Experimente im Hypothalamus Gewebe Maus. Insbesondere werden Corticotropin releasing Hormon (CRH) Neuronen des Nucleus paraventrikulären des Hypothalamus (PVN) verwendet. Wir beschreiben die Verfahren für die Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie und erläutern die spezifischen Experimente für synaptische Vielheit zu testen.

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Protocol

Alle Tierversuche werden von Animal Care Committee der University of Western Ontario im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien (AUP #2014-031) genehmigt.

(1) Lösungen

  1. Slicing Lösung
    1. Die Zusammensetzung der Slice-Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .
    2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
    3. Lösen Sie für 1 X Schneid-Lösung Nahco33, Glukose und Saccharose in DdH2O und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherzustellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 315-320 mOsm und speichern Sie die Lösung für nicht mehr als 1 Woche bei 4 ° C.
    4. Füllen Sie zwei Becher mit 100 mL Lösung aufschneiden und mit Parafilm abdecken. Entspannen Sie die Lösung in einer Tiefkühltruhe, bis die Lösung (ca. 20 min bei-80 ° C Gefrierschrank) teilweise gefroren wird. Mit einem Gas-Verteilerrohr, Blase beide Becher des Schneidens Lösung mit 95 % O25 % CO2 für 20 min auf Eis.
Lösungskonzentrationen (mM)
Schneiden Normale ACFS Niedrige Ca2 + ACFS SR+ ACFS Pipette/interne
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1.25 1.25 1.25 1.25 -
Nahco33 25 26 26 26 -
Glukose 25 10 10 10 -
Saccharose 75 - - - -
K-Gluconat - - - - 116
Na-Gluconat - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0,3

Tabelle 1: Die Zusammensetzung der verschiedenen Lösungen.

  1. ACFS (für Slice Wiederherstellung und Wartung)
    1. Finden Sie in Tabelle 1 die Zusammensetzung der ACFS.
    2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
    3. Lösen Sie für 1 X ACFS Nahco33 und Glukose im DdH2O auf und zugeben Sie 20 X Brühe. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300 mOsm. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
  2. ACFS (niedrige Ca2 + für die Aufnahme)
    1. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des niedrigen Ca2 + ACFS.
    2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
    3. Für 1 x niedrig Ca2 + ACFS, auflösen, Nahco33 und Glucose in ddH2O und fügen Sie 20 x (CaCl2 und MgCl2 frei) Lager, CaCl2 und MgCl2 angegebenen Konzentrationen. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
  3. ACFS (Sr2 + für die Aufnahme)
    1. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Sr2 + ACFS.
    2. Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
    3. Für 1 x Sr2 + ACFS, auflösen, Nahco33 und Glukose im DdH2O und fügen Sie 20 x (CaCl2 und MgCl2 frei) Lager, SrCl2 und MgCl2 angegebenen Konzentrationen. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 298-300. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
  4. Interne Lösung
    1. Die Zusammensetzung der K-Gluconat basierte interne Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .
    2. Fügen Sie 15 mL Molekularbiologie Grade Wasser um 20 mL der internen Lösung zu machen hinzu, eine 50 mL-Tube. Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis.
    3. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Zeit 1 M Lager Konzentrationen in der molekularen Biologie Klasse Wasser. Hinzufügen (in mL): 2,32 K-Gluconat, 0,24 Na-Gluconat, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 bis 50 mL-Tube.
    4. 100 µL von 0,3 M Na3GTP hinzufügen.
    5. Wiegen Sie 44,08 mg K2ATP in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch und fügen Sie 1 mL Molekularbiologie Grade Wasser dann fügen Sie 50 mL-Tube hinzu.
    6. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,4 mit 1 M KOH. Sicherstellen Sie, dass die Osmolarität zwischen 283-289 mOsm.

2. Slice-Vorbereitung

  1. Werkzeuge vorzubereiten
    1. Die Recovery-Kammer (gebaut von einem 250 mL-Becherglas mit 4 Brunnen und Netting) 200 mL ACFS hinzu, und legen Sie die Recovery-Kammer in einem Wasserbad (35 ° C).
    2. Die Kammer mit einer Paraffin-Folie abdecken und Blase ständig der ACFS mit 95 % O25 % CO2 mit einer Glas-Verteilerrohr für mindestens 20 Minuten.
    3. Die Zerlegung durch das Einrichten der Werkzeuge (Skalpell, abgewinkelte feine Schere, Pinzette, feine Pinsel, Plastiklöffel) vorbereiten.
    4. Füllen Sie eine 60 mL-Spritze mit ca. 15 mL der eiskalte slicing Lösung aus Schritt 1.1.4.
    5. Bereiten Sie die Dissektion Plattform, indem ein Filterpapier auf den Deckel des well-Platte.
    6. Bereiten Sie die Slice Kammer indem du es in die Schale und das Tablett mit Eis füllen.
    7. Richten Sie die Vibratome durch die Sicherung einer Einweg Klinge in den Klingenhalter.
    8. Machen Sie eine Transferpipette durch die Spitze einer Pasteurpipette brechen und platzieren ein Gummiball über die gebrochene Ende.
  2. Gehirn der Maus zu sezieren
    1. Betäuben Sie das Tier in einer Kammer mit 4 % Isofluran gesättigt, bis spinale Reflexe fehlen.
    2. Das Tier mit einer Guillotine enthaupten und schnell das Gehirn zu entfernen.
      1. Machen Sie einen Mittellinie Einschnitt mit einer Skalpellklinge Nr. 22 von rostral zur kaudalen.
      2. Schälen Sie die Kopfhaut seitlich auf jeder Seite des Kopfes.
      3. Verwendung feine Schere, schneiden Sie den Schädel auf der einen Seite von kaudalen rostral (darunter auch die Seite der Stirnbeine), Verwendung Vorsicht nicht auf das Gehirn schädigen.
      4. Verwendung Zangen, heben Sie das Stück Schädel aus Gehirn und schnell abkühlen das Gehirn mit 15 mL eiskaltes slicing-Lösung mit der Spritze aus Schritt 2.1.4.
      5. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel.
      6. Ort des Gehirns in einem der Becher gefüllt mit eiskalten slicing-Lösung (aus Schritt 1.1.4) sprudelte mit 95 % O25 % CO2.
  3. Scheiben von Maus Hypothalamus vorbereiten
    1. Das Gehirn für die gewünschte Hirnareal zu blockieren und Schnittwinkel (z. B. für koronalen Hypothalamus Scheiben schneiden Sie das Gewebe rostral zur optischen Chiasmus und caudale, der Pons mit einer Klinge und der kaudalen Block hat eine flache Oberfläche senkrecht auf der Basis des Gehirns zu gewährleisten).
    2. Mit einer geschnittenen Stück Filterpapier, das Gehirn von der vorderen Seite holen und die hintere Seite das Halteblech mit Sekundenkleber verkleben.
    3. Schnell das Halteblech in das slicing Kammer und füllen Sie die Kammer mit slicing Lösung aus den zweiten Becher im Schritt 1.1.4.
    4. Das Slice Kammer und Eis Fach auf der Vibratome zu sichern.
    5. Definieren Sie den Schneid Bereich (Front- und Seitenzahnbereich zum Gehirn) und beginnen Sie, 250 µm Dicke koronalen Scheiben schneiden. Empfohlene Parameter: 0.10 mm/s, Amplitude Geschwindigkeit 2 mm.
    6. Schneiden Sie die Scheiben auf die entsprechende Größe für die gewünschte Hirnareal.
    7. Die Scheiben bei 35 ° C für 30-45 min zu erholen. Dann entfernen Sie die Recovery-Kammer aus dem wärmenden Bad und ermöglichen die Scheiben bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 30 min. halten Scheiben bei Raumtemperatur für den Rest des Tages erholen und weiterhin das Bad ständig mit 95 % O25 % Blase CO2 .

(3) Whole-Cell Patch ClampRecording

  1. Ziehen Sie die Patch-Pipetten
    1. Mit den vorgeschlagenen Parametern für die Aufnahme aus der Pipette Abzieher Handbuch ganz-Zelle ziehen Sie Patch Pipetten aus dicken Mauern umgebene Glas eine Pipette Widerstand von 3-5 MΩ.
    2. Mit Hilfe einer Microsyringe (kommerzielle oder hausgemachte), Füllung einer Pipettenspitze mit gefilterten interne Lösung. Eine Microsyringe machen, brennen die Spitze eine 1 mL Spritze und ermöglichen die Spitze zu schaffen fallen eine lange feine Spitze.
  2. Die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten
    1. Legen Sie die Aufnahme Pipette direkt über die Scheibe und Offset Pipette in Klammer Spannungsmodus aktuell. Leichten positiven Druck auf die Pipette und sperren den Absperrhahn.
    2. Wählen Sie eine gesunde Zelle mit einer intakten Membrane und nähern Sie sich die Zelle mit der Pipette. Der Überdruck sollte dazu führen, dass eine leichte Störung im Gewebe (z. B. eine langsame Welle im Gewebe bei der Eingabe).
    3. Weiterhin langsam auf die Zelle mit diagonalen Bewegungen, bis die Pipette ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche bildet die Pipette näher zu bringen.
    4. Die Überdruck-Sperre. Die Zelle beginnt, eine Dichtung zu bilden und der Widerstand steigt über 1 GΩ. In Spannung Klemme, halten die Zelle am-68 mV.
    5. Ziehen Sie leicht weg von der Zelle diagonal, Überdruck aus der Zelle zu entfernen.
    6. Für die schnellen und langsamen Pipette Kapazität zu kompensieren.
    7. Anwenden einer kurzen Absaugung durch das Rohr an der Pipette Halter zu brechen durch die Zelle ganz-Zell Konfiguration angeschlossen.
    8. Umstellung auf Zelle Modus auf der Membran testen Fenster in eine Elektrophysiologie Datenerfassung und Analyse-Software (z.B., Clampex).
    9. Durchführen Sie vor jeder Spannung Klemme Aufnahme einen Membran-Test mit der gleichen Software und erfassen Sie die relevanten Parameter in einem Labor-Buch (Membran Widerstand, Zugang Widerstand und Kapazität).
    10. Behalten Sie die Temperatur des Bades Aufnahme bei 27-30 ° C und die Durchflussmenge bei 1,5-2,0 mL/min für spätere Experimente.

4. Vielfalt Experimente

  1. Experiment 1: Schätzung Multiplizität mit 4-AP
    1. In Spannung Klemme, halten die Zelle am-68 mV. Mit der gleichen Software, Aufzeichnen der sEPSCs während das Bad mit niedrigen Ca2 + ACFS Vorrichtung. Rekord für mindestens 5 Minuten nach dem Start des ganz-Zell Konfiguration um eine stabile Basislinie Aufnahme zu gewährleisten, da die synaptische Aktivität kurz nach dem Durchbruch der Membran hoch sein kann.
    2. Mit einer Mikropipette hinzu der ACFS 4-AP und Bad gelten 30 µM 4-Fewo Datensatz sEPSCs für mindestens 10 Minuten bis die volle Wirkung zu erhalten.
    3. Der ACFS mit 4-AP fügen Sie 0,5 µM TTX und 10 µM Cd2 hinzu + und zeichnen Sie der mEPSCs mindestens 10 min lang auf.
    4. Verwenden Sie für offline-Analyse die letzten 1 min Baseline unmittelbar vor der Anwendung von 4-AP (in niedrigen Ca2 + ACFS), 10. min 4-AP-Anwendung und der 10. min TTX Anwendung.
  2. Experiment 2: Synchronisierung Vesikel Version mit Sr2 +
    1. Während das Bad mit normalen Ca2 + ACFS (das gleiche wie das Bad ACFS) Rekord sEPSCs für mindestens 5 min Vorrichtung.
    2. Wechseln Sie von der normalen Ca2 + ACFS und beginnen Sie Vorrichtung Sr2 + ACFS (aus Schritt 1.4) und Rekord sEPSCs.
    3. Vergleichen Sie für offline-Analyse um festzustellen, ob die große Amplitude sEPSCs durch die synchrone Freisetzung von Vesikeln sind, die letzten 1 min Baseline (im normalen ACFS) inder 10 Minute Sr2 + ACFS Anwendung .
  3. Experiment 3: test für multivesicular Version Γ- DGG
    1. In niedrigen Ca2 + ACFS Rekord sEPSCs mindestens 5 min lang.
    2. Der ACFS durch die Perfusion System 30 µM 4-AP hinzufügen. Rekord sEPSCs mindestens 10 min lang.
    3. Der ACFS mit 4-AP 200 µM γ-DGG hinzu und zeichnen Sie der sEPSCs mindestens 10 min lang auf.
    4. Wie ein Kontrollexperiment in einer eigenen Zelle führen Sie Schritte 1-3, aber gelten eine niedrige Konzentration (125 nM) des DNQX anstelle von γ-DGG.
    5. Analysieren Sie für offline-Analyse die letzte min jeder Droge-Anwendung.
  4. Experiment 4: Stimulieren Sie afferenten Inputs um Aktionspotential abfeuern zu erhöhen.
    1. Rekord sEPSCs in normalen Ca2 + ACFS.
    2. Stimulieren Sie die Afferenzen mit einer monopolaren Glaselektrode gefüllt mit ACFS mit einer Rate von 20 Hz für 2 s und wiederholen Sie 10-Mal mit einem Inter Platzen Intervall von 20 sec.
    3. Für die Analyse 5.000 ms vor dem ersten Impuls als Grundlage zu verwenden und im Vergleich zu den 10-300 ms nach der endgültigen Reiz und dann die durchschnittliche Veränderung der Amplitude und Frequenz über 10 Versuche.

5. Analyse

  1. Analysieren Sie sEPSCs und mEPSCs mit einem Programm, die erkennt und analysiert synaptische Ströme (z. B. Mini-Analyse-Software).
    1. Mit dieser Software, verwenden Sie die empfohlene Erkennung Parameter zur Erkennung von AMPA-Rezeptor-EPSCs (oder GABA-Rezeptor-EPSCs bei hemmende Strömungen einer Aufnahme).
    2. Verwenden Sie die Nonstop Analysefunktion , um EPSCs in der Aufnahme zu erkennen.
    3. Manuell scannen jede Aufnahme um sicherzustellen, das Programm wird jedes Ereignis genau erkennen (z. B. sorgen Veranstaltungen werden nicht verpasst oder doppelt gezählt).
    4. Exportieren Sie die Ereignisdaten zu, indem Sie Sie in die Zwischenablage kopieren und fügen Sie ihn in ein Daten-Management-Software (z. B. Excel)
    5. Berechnen Sie die durchschnittliche Frequenz oder Amplitude für jede medikamentöse Behandlung und durchzuführen Sie relevanten statistische Analysen.

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Representative Results

Das obige Protokoll beschreibt eine Methode für die Verwendung von ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, um den Grad der synaptischen Vielfältigkeit, mit der Maus Hypothalamus Neuronen als Beispiel zu untersuchen. Diese Scheibe Präparationstechnik sollte gesunde vitaler Zellen ergeben, die nicht über eine geschwollene Membran oder Kern (Abbildung 1). Jeder Schritt im Protokoll ist wichtig für die Gesundheit des Gewebes und der Qualität der Aufnahmen.

Figure 1
Abbildung 1: gesunde und ungesunde Gewebe folgende schneiden Vorbereitung. Schneiden Sie Elektrophysiologie Vorbereitung der PVN unter differential Interferenz-Kontrast-Optik bei 40 X Vergrößerung in Scheiben. Roten Pfeilspitzen zeigen gesunde Zellen, und schwarze Pfeilspitzen zeigen ungesunde Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 veranschaulicht das Grundprinzip zur Identifizierung von synaptischen Multiplizität mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Synaptische Vielzahl kann entweder mehrere synaptischen Kontakt zwischen einem Paar von Neuronen (Abbildung 2A links) oder durch multivesicular Freisetzung bei einer gegebenen synaptischen Stelle (Abbildung 2A rechts) führen. In beiden Situationen würde ein Aktionspotential in der präsynaptischen Nervenzelle eine große postsynaptischen Antwort (sEPSC) durch die zeitliche Summierung von mehreren synaptische Ereignisse hervorrufen. Jedoch in Ermangelung der präsynaptischen Aktionspotentiale (z. B. in Gegenwart von TTX und Cd2 + , Na+zu blockieren-abhängigen und Ca2 +-abhängigen Aktionspotential auslösen), vesikuläre Neurotransmitter-Freisetzung ist asynchron. Infolgedessen wird die postsynaptischen Antwort kleiner (Abb. 2 b: AP-unabhängige). Wenn zwei Neuronen keine Vielfalt aufweisen (d. h. haben nur einen synaptische Kontakt/keine multivesicular Version) werden keinen Unterschied in der postsynaptischen Antwort die Aktionspotential-abhängige und Aktionspotential-unabhängige Freisetzung von Neurotransmitter (Abbildung 2).

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung veranschaulicht die Auswirkungen verschiedener synaptischen Organisationen auf postsynaptischen Ströme. (A, B) In eine Synapse mit Vielfalt, ein Aktionspotential und der anschließenden Ca löst2 + Zustrom synchrone Verschmelzung von mehreren synaptischen Vesikel, die sich in großen, multiquantal EPSCs ergeben. Synaptische Vielzahl kann aus multisynapse Kontakt oder multivesicular Version auf eine einzige Synapse (A) ergeben. In Anwesenheit von TTX und Cd2 +Aktionspotential-unabhängige Vesicle Fusion ist asynchron und verursacht kleine Uniquantal EPSCs (B). (C) sowohl Aktionspotential-abhängige - unabhängige Vesicle Fusion und Synapsen ohne Vielheit, ergibt sich in Uniquantal EPSCs. Diese Zahl wurde von Figur 1A unserer vorherigen Bericht6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In Experiment 1 gilt die 4-AP des Bades zu erhöhen Aktionspotential abfeuern und Wahrscheinlichkeit befreien. Um sicherzustellen, dass die 4-AP spontane Aktionspotential abfeuern steigt, kann die Häufigkeit der EPSCs zwischen sEPSCs und mEPSCs (Abb. 3A, C) verglichen. Da sEPSCs eine Kombination von sowohl Aktionspotential-abhängige und -unabhängige Ereignisse sind, dient der Unterschied in der Häufigkeit von sEPSC und mEPSC als Proxy für spontane Aktionspotential feuern in die präsynaptischen Axone. Wir verwenden eine willkürliche Kürzung von > 15 % Unterschied in der Häufigkeit zwischen sEPSC, mEPSC, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Aktionspotential-abhängige Ereignisse für die Analyse der Vielzahl vorhanden sind. Wenn die EPSCs in den niedrigen Ca2 + Zustand und dem Zustand der TTX (mEPSC) in Frequenz und Amplitude (d. h. keine spontane Aktionspotential in den niedrigen Ca2 + Zustand ausgelöst), der Unterschied zwischen den niedrigen Ca2 + Baseline sEPSC und 4 ähneln -AP kann auch für die Analyse der Multiplizität verwendet werden.

In einem Beispiel steigert Ergebnis in Abbildung 3gezeigte 4-AP Amplitude und Frequenz des sEPSCs. Folgeantrag von TTX und Cd2 + sinkt die Amplitude und Frequenz. Wie oben beschrieben, werden die Differenzen in der Amplitude zwischen sEPSCs und mEPSCs synaptischen Vielheit. In den Hypothalamus Neuronen, die wir hier untersuchen, die Amplitude und Frequenz der Basislinie und TTX Bedingungen sind gleich (Abbildung 3, D), darauf hindeutet, dass die Grundlinie sEPSCs sehr wenige Aktionspotential-abhängige EPSCs enthalten. Dementsprechend können nachfolgende Experimente den Unterschied zwischen Grundlinie und 4-AP Multiplizität messen vergleichen.

Figure 3
Abbildung 3:. 4-AP-Anwendung zeigt synaptischen Multiplizität. (A) Probe Spuren von sEPSCs in niedrigen Ca2 + ACFS aufgezeichnet, während Grundlinie und nach 4-AP (30 μM) Anwendung und anschließende TTX (0,5 μM) und Cd2 + (10 μM) Anwendung. (B) die Verteilung der sEPSC Amplitude von der Aufnahme in (A) gezeigt. (C, D) Übersicht über die mittlere Frequenz (C) und (D) Amplitude zwischen Grundlinie (grau), 4-AP (rot) und TTX + Cd2 + (blau). P < 0,005, ** P < 0,01. Diese Zahl wurde von Abbildung 2 unserer vorherigen Bericht6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die oben beschriebene Methode schätzt die durchschnittliche Vielfalt der Synapsen auf den postsynaptischen Neuronen zu beenden: Es kann nicht erkennen, Veränderungen in der Vielheit, die zu einem kleinen Anteil an Synapsen auftreten. Dennoch offenbart diese Methode in unserer aktuellen Studie, Änderungen in der Vielfalt ihrer Glutamat Synapsen im Hypothalamus Neuronen zwischen Normal und chronisch Bedingungen6betont.

Substitution von Ca2 + mit äquimolaren Sr2 + in der ACFS desynchronizes Aktionspotential-abhängige Freisetzung von Neurotransmitter Vesikel 19, 20. Daher, wenn die große Amplitude sEPSCs die Summierung Aktionspotential-abhängige synchronisierte vesikuläre der Freisetzung von Neurotransmittern (d. h. Vielheit sind) ersetzen Ca2 + Sr2 + die Amplitude der EPSCs verringert. Wie in Abbildung 4, Sr2 + ACFS nimmt der Anteil der großen Amplitude Ereignisse (Abbildung 4 b), und als Folge sinkt die durchschnittliche Amplitude (Abbildung 4). Wenn Zellen nicht Vielfalt aufweisen, haben desynchronizing Vesikel Veröffentlichung keinen Einfluss auf die Amplitude der EPSC.

Figure 4
Abbildung 4: Sr2 + desynchronizes Großveranstaltungen multiquantal. (A) repräsentative Spur Vergleich zwischen normalen Ca2 + ACFS und Sr2 + ACFS. SR2 + ACFS desynchronizes Vesikel Freigabe und sinkt die Amplitude der multiquantal synchrone Ereignisse wie in eine repräsentative Amplitude Verteilung (B) und die Änderung der Amplitude für alle Zellen (C) * P < 0,05. Diese Zahl wurde von Abbildung 3 unserer vorherigen Bericht6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Γ-DGG, eine schnelle trennendem kompetitiver Antagonist des AMPA-Rezeptoren, kann verwendet werden, um festzustellen, ob Multiplizität wegen multivesicular oder mehrere synaptischen Kontakte ist. Wie multivesicular Version auf eine überlappende Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren wirkt, die große Amplitude EPSCs beinhaltet die Zusammenlegung von Glutamat in den synaptischen Spalt. Das heißt, ist die Konzentration von Glutamat in den synaptischen Spalt höher als das, was von Uniquantal Release führt. Auf der anderen Seite hätte multisynaptic Kontakte Uniquantal EPSCs an jedem synaptischen Standort? Wenn die große Amplitude EPSCs aus multivesicular Veröffentlichung ergeben, werden die größere EPSCs γ-DGG Antagonismus (durch höhere Glutamat-Konzentration) im Vergleich zu kleineren Amplitude EPSCs (Abbildung 5A Rechts, B-D) weniger beeinflusst. Wenn die große Amplitude EPSCs durch die Summierung der synchronen Uniquantal EPSCs (multisynapse Kontakte) sind, wirken sich γ-DGG ebenso die Amplitude der alle EPSCs (Abbildung 5A Links, E-G). Im Gegensatz zu γ-DGG, DNQX, die eine hohe Affinität ist langsam trennendem AMPA/Kainate-Rezeptor-Antagonisten bewirkt eine gleichmäßige Abnahme über alle großen und kleinen Amplitude EPSCs ()Abbildung 5 H-J). Die Empfindlichkeit gegenüber γ-DGG und DNQX als das Verhältnis der durchschnittlichen EPSC Amplitude dividiert durch die maximale (der Durchschnitt der größten 20 EPSCs) quantifiziert werden kann EPSC Amplitude ()Abbildung 5 K, L).

Figure 5
Abbildung 5: mit γ-DGG multivesicular Version zu untersuchen. (A) Schaltpläne illustriert zwei Modelle der Vielheit. Links: zeitliche Summierung der Uniquantal Übertragung, die unabhängige Populationen von postsynaptischen Rezeptoren abzielt. Große und kleine EPSCs werden durch eine ähnliche Konzentration von Glutamat in den synaptischen Spalt erreicht und sind daher ebenso empfindlich auf γ-DGG. Rechts: multiquantal Getriebe, das zielt auf eine überlappende Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren. Große EPSCs entstehen durch höhere Glutamat-Konzentration im Spalt als kleinere sEPSCs und sind daher weniger anfällig für γ-DGG. An Unterseite des Modells gezeigten Werte sind hypothetische relative Amplituden. (B)-Probe Spuren von einer Aufnahme in dem gab es eine Erhöhung der mittleren sEPSC Amplitude nach dem 4-AP auftragen (4-AP-Responder). (C) kumulative Grundstück zur EPSC Amplitude für die Aufnahme in (B) gezeigt. (D) kumulative Grundstück für normalisierte EPSC Amplitude (EPSC/EPSCMAX) vor und nach Anwendung der γ-DGG aus der Aufzeichnung in (B) gezeigt. (E) Probe Spuren aus einer Aufnahme, wo gab es keine Änderung in der mittleren sEPSC Amplitude nach 4-AP, Anwendung (4-AP non-Responder). (F) kumulative EPSC Amplitude für die Aufnahme in (E) gezeigt. (G) kumulative EPSC/EPSCMAX Grundstück für die Aufnahme in (E) gezeigt. (H) Probe Spuren aus einer Aufnahme vom Ausgangswert sowie nach 4-AP und DNQX Anwendung. (ich) das kumulative EPSC Amplitude für die Aufnahme in (H) gezeigt. (J) kumulative EPSC/EPSCMAX Grundstück für die Aufnahme in (H) gezeigt. (K) Zusammenfassung der Mittelwert EPSC/EPSCMAX nach γ-DGG (in 4-AP-Responder und non-Responder-Gruppen) oder DNQX Anwendung auf Pre-γ-DGG/DNQX (d. h. Post-4-AP) normiert. Post-4-AP (L) Grundstücke bedeuten EPSC Amplitude (normiert auf Pre-4-AP) gegen Post-γ-DGG/DNQX Mittelwert EPSC/EPSCMAX (normiert auf Post-4-AP). P < 0,005. Diese Zahl wurde von Abbildung 4 unserer vorherigen Bericht6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Stärke der synaptischen Übertragung kann vorübergehend durch Ausbrüche von synaptischen Aktivität erhöht werden. Afferente Stimulation ist um Vielfalt unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen, lässt sich erhöhen Aktionspotential abfeuern und Wahrscheinlichkeit befreien. Wenn Vielfalt vorhanden ist, sollte afferente Stimulation einen kurzen Anstieg der EPSC Amplitude (Abbildung 6A-D) verursachen. Wenn Vielfalt nicht vorhanden ist, erhöht Aktivität steigt in Aktionspotential abfeuern Gefahren nicht die EPSC Amplitude.

Figure 6
Abbildung 6: hochfrequente Stimulation zeigt synaptischen Multiplizität. (A)-Probe Spuren der sEPSCs vor und nach der afferenten synaptic Stimulation. (B) Handlung des sEPSC Amplitude vor und nach der synaptischen Stimulation (20 Hz, 2 s) von der Aufnahme in (A) gezeigt. (C, D) Zusammenfassung der sEPSC Frequenz (C) und Amplitude (D) Änderungen nach synaptic Stimulation. P < 0,001 * P < 0,05. Diese Zahl wurde aus Abbildung 5 unserer vorherigen Bericht6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Patch Clamp Elektrophysiologie Experiment ist gesunde Scheiben/Zellen erhalten. Unsere beschriebenen Protokoll ist optimiert für Hypothalamus Scheiben, die PVN Neuronen enthalten. Anderen Gehirn benötigten Bereichen modifizierte Lösungen und slicing Methoden21,22,23,24. Für die Aufnahme ist es wichtig, stabile Aufnahmen akzeptieren nur durch ständige Überwachung Zelleneigenschaften wie Membran Widerstand, Kapazität und Zugang Widerstand. Eine Zunahme des Widerstandes der Zugang kann EPSC Amplitude zu verringern und somit verwirren Amplitude Messungen. Dementsprechend werden Zellen mit Zugang Widerstandswerte, die mehr als 20 MΩ oder um mehr als 20 % zu erhöhen, während der Aufnahme verworfen. In ähnlicher Weise eine Abnahme in (oder niedriger) Membran Widerstand kann dazu führen, dass die Armen Raum-Klemme und aus diesem Grund kann die Amplitude zu verringern. Die Neuronen in unserem Zielsystem (Parvocellular PVN Neuronen) haben einen hohen Membran-Widerstand zwischen 500 MΩ und 1 GΩ, und wir verwerfen Zellen mit Membran Widerstände unter 500 MΩ. Qualitätskontrolle Trenngrenzen sollten für bestimmte Arten von Neuronen unter Studie festgelegt werden. Da dieses Protokoll auf den Unterschied in der Amplitude vor und nach der Droge Anwendungen angewiesen ist, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Amplitude durch die Droge-Anwendung und nicht auf die Veränderungen in der Membran und Zugang Beständigkeit ist. Der Hypothalamus Neuronen, die wir in diesem Protokoll untersuchen sind klein (Zelle Kapazität ist ca. 15 pF bei Mäusen und Membran Widerstand ist ca. 1 GΩ), und K-Gluconat basierte interne Lösung arbeitet gut daran, um qualitativ hochwertige EPSCs/IPSCs6,25 zu erhalten . Cäsium basierte interne Lösung ist für Neuronen mit größeren Zellengröße und niedrigen Eingangswiderstand lässt sich eine gute Raum-Klemme2zu gewährleisten.

Eine spezielle Anforderung der Anwendung dieser Methode, um die Vielfalt zu messen ist, dass die Zellen eine ausreichende Anzahl von spontan Aktionspotentiale Feuer um Aktionspotential-abhängige Ereignisse mEPSCs zu vergleichen. Dies kann durch den Vergleich des Unterschied in der Häufigkeit von EPSCs in Abwesenheit und Anwesenheit von TTX und Cd2 +gewährleistet werden. Im Hypothalamus Scheiben, die die PVN enthalten, haben wir festgestellt, dass die Anwendung der 4-AP effiziente Aktionspotential abfeuern zu entlocken. Eine andere Methode, vorangegangen durch Hsia und Kollegen2, verwendet hohe Ca2 + ACFS Aktionspotential ausgelöst, anstatt 4-AP zu erhöhen. Während diese Methode erfolgreich in hippocampal Scheiben, wir festgestellt, dass das hohe Ca2+ war weniger effizient als die 4-AP Aktionspotential abfeuern im Hypothalamus Scheiben6zu erleichtern. In der Tat hat sich gezeigt, dass hohe, extrazelluläre Ca2 + Konzentration intrinsische Erregbarkeit der Nervenzellen und Axonen sinkt durch die Veränderung Na+ Leitwert26,27. Dies mag erklären, warum einige Scheiben hoch Ca2 + ACFS nicht wirksam bei der Erhöhung der EPSC Frequenz aufweist.

Eine Einschränkung dieser Methode, die alle Stück Patch Clamp Elektrophysiologie innewohnt, ist, dass viele, langfristige Prognosen mit den postsynaptischen Neuronen in Vorbereitungen Slice geschnitten werden. Um Aktionspotentiale zu beobachten, ist es wahrscheinlich, dass die präsynaptischen Axone und Zellkörper in dem Segment bewahrt werden müssen. Daher ist die Multiplizität Messung synaptischen Konnektivität verzerrt, die innerhalb der Scheibe erhalten bleibt. Entlang der gleichen Linie kann die Richtung des Schneidens verursachen bestimmte Populationen von Projektionen zu erhalten werden, während andere abgetrennte28sind. Diese Einschränkungen haben eine allgemeine Wirkung die Vielzahl der afferenten Inputs zu unterschätzen.

Das beschriebene Protokoll stellt eine Methode zur Abschätzung des Grades der synaptischen Vielfalt über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron. Ndere Elektrophysiologie wie gekoppelten Aufnahmen oder minimale Stimulation der ein einziges Axon können erkennen, ob eine bestimmte Verbindung mehrere Kontakte hat, aber diese Versuche oft schwierig und nicht in allen Systemen möglich sind. Darüber hinaus können nicht sie globale Angabe der Organisation aller Eingaben für ein bestimmtes Neuron geben, wie sie nur ein paar Neuronen isolieren. Dieses Protokoll verwendet einfache Patch-Clamp Elektrophysiologie Methoden, um den Grad der Multiplizität über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

J.s. erhielt Ontario Graduate Stipendium. W.I Stipendium ein neue Ermittler aus Mental Health Research Kanada. Diese Arbeit wird unterstützt durch Betriebskostenzuschüsse, Wi aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) und des Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 146 Whole-Cell Patch-Clamp Elektrophysiologie ex Vivo synaptische Übertragung synaptische Gain Vielheit paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus Corticotropin-releasing Hormon hypothalamus
Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie
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Sunstrum, J. K., Inoue, W.More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

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