Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.

Abstract

In het centrale zenuwstelsel, een paar van neuronen vaak vormen meerdere synaptic contacten en/of functionele neurotransmitter release sites (synaptic multipliciteit). Synaptic multipliciteit is plastic en veranderingen in de gehele ontwikkeling en in de verschillende fysiologische omstandigheden, wordt een belangrijke determinant voor de werkzaamheid van synaptische transmissie. We schetsen hier, experimenten voor het inschatten van de mate van multipliciteit van synapsen eindigt op een bepaalde postsynaptisch neuron geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten. Specifiek, wordt spanning-clamp opname gebruikt voor het vergelijken van het verschil tussen de amplitude van spontane excitatory postsynaptisch stromingen (sEPSCs) en miniatuur excitatory postsynaptisch stromingen (mEPSCs). De theorie achter deze methode is dat afferent "inputs" die veelheid vertonen grote, actiepotentiaal-afhankelijke sEPSCs als gevolg van de synchrone release die bij elke synaptic contactpersoon optreedt zal tonen. Daarentegen zal de actiepotentiaal-zelfstandige release (die asynchroon is) kleinere amplitude mEPSCs genereren. Dit artikel schetst een aantal experimenten en analyses te karakteriseren van het bestaan van synaptic multipliciteit en bespreekt de vereisten en beperkingen van de techniek. Deze techniek kan worden toegepast om te onderzoeken hoe verschillende gedrags-, farmacologische of milieu interventies in vivo invloed op de organisatie van synaptic contactpersonen in verschillende hersengebieden.

Introduction

Synaptische transmissie is een fundamenteel mechanisme voor de communicatie tussen de neuronen, en vandaar, hersenfunctie. Synaptische transmissie is ook labiele en haar werkzaamheid in een activiteit-afhankelijke manier zo goed zoals in reactie op f signalen1kunt wijzigen. Behandeling van synaptische functie is dus een belangrijke focus van het onderzoek neurowetenschap. Geheel-cel patch klem electrofysiologie is een veelzijdige techniek waarmee ons te begrijpen, bedenken experimentele designs en data-analyses, diepgaande biofysische en moleculaire mechanismen van synaptische transmissie. Een veel gebruikte aanpak, misschien vanwege de eenvoud van de techniek en concept, is het meten van miniatuur excitatory/remmende postsynaptisch stromen (mE / IPSCs) onder de spanning klem configuratie2,3, 4 , 5 , 6. afzonderlijke mPSCs vertegenwoordigen de stroom van ionen via postsynaptisch ionotropic receptoren (bijvoorbeeld AMPA en GABAA -receptoren) in reactie op de binding van hun respectieve neurotransmitters vrijgesteld van de presynaptische terminal 7 . Omdat de opname wordt verkregen in de aanwezigheid van de spanning-gated nb+ kanaal blocker tetrodotoxine (TTX), de release is actiepotentiaal-onafhankelijk en normaal impliceert een één synaptic blaasje met neurotransmitters. Op basis van deze veronderstelling, wordt de gemiddelde amplitude van de mPSCs veel gebruikt als een ruwe schatting voor de grootte van quantal, waarmee het aantal en de functionaliteit van postsynaptisch receptoren tegen een enkele release-site. Aan de andere kant, wordt de frequentie van de mPSCs geacht te vertegenwoordigen een combinatie van het totale aantal synapsen tot beëindiging op de postsynaptisch cel en de waarschijnlijkheid van hun gemiddelde release. Deze parameters meten echter niet een andere variabele-multiplicativity van synapsen of synaptic multipliciteit — dat is belangrijk voor de doeltreffendheid van synaptische transmissie.

Gebaseerd op de quantal theorie van synaptische transmissie7,8,9, de sterkte van een bepaalde verbinding tussen twee neuronen is afhankelijk van drie factoren: het aantal functionele synapsen (N), de postsynaptisch reactie op de release van een enkele synaptic blaasje (quantal grootte; Q) en de waarschijnlijkheid van neurotransmitter release (Pr). Synaptic multipliciteit is gelijk aan N. De ontwikkeling van synaptic multipliciteit of de sanering van de multiplicatieve synapsen is kunststof in ontwikkeling en in andere ziekte staten3,4,6,10. Om deze reden heeft karakteriseren van synaptic multipliciteit belangrijke implicaties voor het begrijpen van de werkzaamheid van synaptische transmissie bij gezondheid en ziekte. Technieken, zoals elektronenmicroscopie kunnen structurele bewijs van synaptic multipliciteit herkennen door het detecteren van meerdere synaptic contactpersonen die afkomstig zijn uit de dezelfde axon op de dezelfde postsynaptisch neuron11,12, 13,14. Deze structureel geïdentificeerde multisynapses kunnen echter functioneel stille15,16. Precieze functionele behandeling van N meebrengt dat technisch uitdagende elektrofysiologische benaderingen, zoals gepaarde geheel-cel opnames die vaststellen kunnen of een bepaalde verbinding meerdere functionele release sites heeft en minimale stimulatie benaderingen die gericht zijn op het werven van een enkele vermeende axon.

In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het schatten van synaptic multipliciteit door het aannemen van een methode die oorspronkelijk ontwikkeld door Hsia et al.2. Deze techniek omvat het meten van de spontane PSC's (sPSCs) en mPSCs met behulp van geheel-cel patch klem electrofysiologie, waardoor we de mate van synaptic multipliciteit schatten van alle ingangen naar een bepaalde neuron.  Zoals eerder omschreven, synaptic multipliciteit het aantal synapsen tussen een bepaalde pre-en postsynaptisch neuron geeft. Als meerdere synapsen worden gerekruteerd in synchronie door een actiepotentiaal, zal er een hoge waarschijnlijkheid van temporele sommatie van individuele (d.w.z. quantal) PSC, het genereren van een grotere amplitude PSC.  In mPSC-opnamen (in welke actie potentials worden geblokkeerd door TTX), de waarschijnlijkheid van temporele sommatie van afzonderlijke (niet-synchrone) mPSCs is laag. Met behulp van deze grondgedachte, kan synaptic multipliciteit worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sPSC (met actiepotentiaal-afhankelijke versie) met de amplitude van de mPSC.

Onderzoek naar het bestaan van multipliciteit beschrijven we vier experimenten en hun analyses met behulp van glutamaterge EPSCs als voorbeeld. Dezelfde aanpak kan echter worden gebruikt voor de snelle toezending van de GABAergic/glycinergic (IPSCs). Een korte motivering van elk experiment wordt hieronder beschreven. Eerst, zoals hierboven uitgelegd, synaptic multipliciteit kan worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sEPSCs te mEPSCs. Er zijn twee vereisten voor deze aanpak; 1) presynaptische axonen moeten een voldoende aantal actie potentials brand tijdens de opname, en 2) Pr moet hoog zijn, zodat meerdere synapsen release neurotransmitter bij binnenkomst van een actiepotentiaal. Om aan deze eisen voldoen, worden sEPSCs eerst geregistreerd in lage Ca2 + kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), en vervolgens opgenomen in de aanwezigheid van een lage concentratie van de K+ kanaal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) toe actie potentiële afvuren en Pr. Actiepotentiaal afvuren wordt dan geblokkeerd door TTX en Pr daalde met een spanning-gated Ca2 + kanaal blocker Cd2 +. De amplitude van de sEPSCs (met 4AP) wordt vergeleken met die van mEPSC (met 4AP, TTX en Cd2 +). In het tweede experiment, is Ca2 + vervangen door mengsel Sr2 + in de aCSF te desynchronize blaasje release. Als Ca2 + vereist voor de synchrone release van blaasjes is, moet vervanging met Sr2 + de grote amplitude-sEPSCs die indicatief voor multipliciteit zijn elimineren. Ten derde, mechanistically, multipliciteit kan voortvloeien uit meerdere synaptic contactpersonen de dezelfde postsynaptisch neuron of multivesicular release (dat wil zeggen meerdere blaasjes vrijgegeven binnen een synaptic éénloket)17,18. Om te differentiëren tussen de twee soorten multipliciteit, het derde experiment maakt gebruik van een lage affiniteit, snelle distantieert concurrerende antagonist van AMPA receptoren, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , om te bepalen of grote sEPSC zijn het resultaat van de temporele sommatie van onafhankelijke synapsen of multivesicular release op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren. Als de grote amplitude gebeurtenissen ontstaan uit multivesicular release, zullen γ-DGG minder effectief op remming van de grotere ten opzichte van kleinere sEPSCs, overwegende dat de grote sEPSCs die uit de tijdelijke sommatie van meerdere synaptic contactpersonen voortvloeien op dezelfde manier zal worden beïnvloed door Γ-DGG. In het vierde experiment, wordt een meer fysiologische methode gebruikt ter verbetering van de actiepotentiaal afvuren, namelijk afferent synaptic stimulatie. Uitbarstingen van synaptic activiteit kunnen Transient verhoging/vergemakkelijken de spontane actiepotentiaal afvuren en release kans de afferents gestimuleerd. Deze benadering biedt daarom multipliciteit om in een meer fysiologische manier te manifesteren.

Het volgende protocol beschrijft de methode voor het uitvoeren van deze experimenten in muis hypothalame weefsel. In het bijzonder worden corticotropin releasing hormoon (CRH) neuronen van de kern van de paraventricular van de hypothalamus (PVN) gebruikt. We beschrijven de procedures voor het uitvoeren van geheel-cel patch klem elektrofysiologie en de specifieke experimenten om te testen voor synaptic multipliciteit te verklaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven worden goedgekeurd door het Comité Animal Care van de University of Western Ontario overeenkomstig de Canadese Raad op Animal Care Guidelines (AUP #2014-031).

1. oplossingen

  1. Snijden van oplossing
    1. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de segmenteringshulplijnen oplossing.
    2. Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
    3. Voor 1 x segmenteringshulplijnen oplossing, los van de NaHCO3, glucose en sacharose in ddH2O, en voeg de voorraad van 20 x. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 315-320 mOsm en opslaan van de oplossing voor niet meer dan 1 week bij 4 ° C.
    4. Vul twee bekers met 100 mL van het snijden van de oplossing en bestrijk ze met parafilm. Chill de oplossing in een vriezer totdat de oplossing gedeeltelijk bevroren wordt (ongeveer 20 min in de vriezer-80 ° C). Met behulp van een gasbuis dispersie, bubble beide bekerglazen van het snijden van de oplossing met 95% O2/5% CO2 voor 20 min op ijs.
Oplossing concentraties (mM)
Snijden Normale aCSF Lage Ca2 + aCSF SR+ aCSF Pipetteer/interne
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1,25 1,25 1,25 1,25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glucose 25 10 10 10 -
Sacharose 75 - - - -
K-gluconaat - - - - 116
NB-gluconaat - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0.3

Tabel 1: De samenstelling van verschillende oplossingen.

  1. aCSF (voor segment herstel en onderhoud)
    1. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de aCSF.
    2. Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
    3. Voor 1 x aCSF, los NaHCO3 en glucose in ddH2O en voeg de voorraad van 20 x. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 298-300 mOsm. Gebruik de oplossing binnen 1 dag.
  2. aCSF (lage Ca2 + voor opname)
    1. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de lage Ca2 + aCSF.
    2. Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
    3. Voor 1 x lage Ca2 + aCSF, los NaHCO3 en glucose in ddH2O en voeg hieraan 20 x (CaCl2 en MgCl2 gratis) voorraad en CaCl2 MgCl2 opgegeven concentraties. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 298-300. Gebruik de oplossing binnen 1 dag.
  3. aCSF (Sr2 + voor opname)
    1. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de Sr2 + aCSF.
    2. Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
    3. Voor 1 x Sr2 + aCSF, los NaHCO3 en glucose in ddH2O en voeg hieraan 20 x (CaCl2 en MgCl2 gratis) voorraad, SrCl2 en MgCl2 opgegeven concentraties. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 298-300. Gebruik de oplossing binnen 1 dag.
  4. Interne oplossing
    1. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de K-gluconaat gebaseerd interne oplossing.
    2. Om 20 mL interne oplossing, voegt u 15 mL moleculaire biologie rang water aan een tube van 50 mL. Voer de volgende stappen op het ijs.
    3. Voorbereiding van de volgende oplossingen tevoren aan 1 M voorraad concentraties in moleculaire biologie rang water. Toevoegen (in mL): 2.32 K-gluconaat, 0,24 nb-gluconaat, 0,20 HEPES, 0.16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 tot en met de tube van 50 mL.
    4. Voeg 100 µL van 0,3 M Na3GTP.
    5. Weeg 44.08 mg K2ATP in een tube van 2 mL microcentrifuge en voeg 1 mL moleculaire biologie rang water, dan toevoegen aan 50 mL-buis.
    6. Breng de pH op 7,2-7.4 met 1 M KOH. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 283-289 mOsm.

2. slice voorbereiding

  1. Bereiden van hulpmiddelen
    1. Voeg 200 mL van aCSF aan de kamer van de recovery (opgebouwd uit een bekerglas van 250 mL met 4 wells en verrekening) en plaats de herstel-zaal in een waterbad (35 ° C).
    2. Bedek de zaal met een paraffine-film en bubble voortdurend het aCSF met 95% O2/5% CO2 met behulp van een glazen dispersie buis voor minstens 20 min.
    3. De dissectie voorbereiden door het opzetten van de tools (scalpel, schuine fijne schaar, pincet, fijne kwast, plastic lepel).
    4. Vul een injectiespuit 60 mL met ongeveer 15 mL van de ijskoude segmenteringshulplijnen oplossing uit stap 1.1.4.
    5. Bereiden de dissectie-platform door het plaatsen van een filtreerpapier op het deksel van een goed plaat.
    6. Bereiden de segmenteringshulplijnen kamer door in het ijs lade plaatst en de lade te vullen met ijs.
    7. De vibratome instellen door het veiligstellen van een disposable mes in de meshouder.
    8. Een pipet overdracht door breken het puntje van een pipet van Pasteur en het plaatsen van een rubber-lamp over het einde kapot maken
  2. Ontleden van muis hersenen
    1. Anesthetize het dier in een kamer die verzadigd met 4% Isofluraan totdat spinale reflexen afwezig zijn.
    2. Decapitate van het dier met een guillotine en snel verwijderen van de hersenen.
      1. Een middellijn incisie met een mes over de scalpel nr. 22 van rostraal aan caudal maken
      2. Lateraal schil de hoofdhuid aan elke kant van het hoofd.
      3. Gebruik fijn schaar te knippen van de schedel aan de ene kant van caudal naar rostraal (met inbegrip van de kant van de frontale botten), met behulp van voorzichtig niet aan de hersenen beschadigen.
      4. Gebruik pincet te heffen van de schedel stuk uit de hersenen en snel afkoelen van de hersenen met 15 mL ijskoud segmenteringshulplijnen oplossing met behulp van de spuit uit stap 2.1.4.
      5. Til de hersenen uit de schedel.
      6. Plaats de hersenen in een van de bekerglazen gevuld met ijskoude segmenteringshulplijnen oplossing (uit stap 1.1.4) borrelen met 95% O2/5% CO2.
  3. Bereiden van segmenten van muis hypothalamus
    1. Blokkeren van de hersenen voor het gewenste hersenen gebied en snij hoek (bijvoorbeeld voor coronale hypothalame segmenten, trim weg het weefsel rostraal van de optiek opticum en caudal naar de pons met behulp van een mes en zorgen de caudal blok heeft een vlakke ondergrond loodrecht op de basis van de hersenen).
    2. Met behulp van een geslepen stuk filtreerpapier, halen de hersenen van de voorste kant en lijm van de posterieure zijde aan de plaat van de bedrijf met behulp van instant lijm.
    3. Snel de bedrijf plaat in de segmenteringshulplijnen kamer plaatsen en vullen de kamer met het snijden van de oplossing van de tweede bekerglas in stap 1.1.4.
    4. Beveilig de segmenteringshulplijnen kamer en ijs lade op de vibratome.
    5. Definieer de segmenteringshulplijnen (anterior en posterior naar de hersenen) en beginnen met het snijden van 250 µm dikte coronale segmenten. Aanbevolen parameters: snelheid van 0.10 mm/s, amplitude 2 mm.
    6. Snijd de plakjes op de juiste grootte voor het gewenste hersenen gebied.
    7. Herstellen van de segmenten bij 35 ° C gedurende 30-45 min. Dan verwijderen van de kamer van de terugwinning van de opwarming van de aarde bad en toestaan van de segmenten terug te vorderen bij kamertemperatuur voor een extra 30 min. Keep segmenten bij kamertemperatuur voor de rest van de dag en blijven bubble het bad voortdurend met 95% O2/5% CO2 .

3. geheel-cel Patch ClampRecording

  1. Trek de patch pipetten
    1. Met de voorgestelde parameters voor de opname van de pipet trekker de handleiding geheel-cel, trek patch pipetten van dikke ommuurde glas een pipet weerstand van 3-5 MΩ.
    2. Met behulp van een microsyringe (commercieel of zelfgemaakte), vullen een pipet tip met gefilterde interne oplossing. Te een microsyringe, branden het puntje van een spuit van 1 mL en de tip om vallen maken een lange fijne tip.
  2. Verkrijgen van de gehele-cel-configuratie
    1. Plaats de pipet opname net boven de slice en offset pipet huidige in de modus van de klem spanning. Lichte positieve druk uitoefenen op de pipet en vergrendel de afsluiter.
    2. Selecteer een gezonde cel met een intact membraan en aanpak van de cel met het pipet. De overdruk moet leiden tot een lichte verstoring in het weefsel (dat wil zeggen een trage Golf in het weefsel bij het invoeren van).
    3. Langzaam blijven om de pipet dichter naar de cel met een diagonale beweging totdat de pipet een klein kuiltje op het celoppervlak vormt.
    4. De overdruk vergrendeling. De cel zal beginnen te vormen van een zegel en de weerstand zal toenemen boven 1 GΩ. In spanning klem, houd de cel op-68 mV.
    5. Trek iets ergens buiten de cel diagonaal te verwijderen van overdruk uit de cel.
    6. De snelle en langzame Pipetteer capaciteit compenseren.
    7. Een kort afzuigen door de buis aangesloten aan de houder van de pipet te doorbreken van de cel en geheel-cel configuratie te krijgen.
    8. Cel wordt geactiveerd op het membraan test venster in een electrofysiologie Data-acquisitie en analysesoftware (bijvoorbeeld Clampex).
    9. Vóór elke spanning klem opnemen, uitvoeren van een test van de membraan gebruikend de zelfde software en de relevante parameters opnemen in een lab-boek (membraan weerstand, toegang weerstand en capaciteit).
    10. Handhaving van de temperaturen van de opname-bad bij 27-30 ° C en het debiet op 1.5-2.0 mL/min voor latere experimenten.

4. multipliciteit experimenten

  1. Experiment 1: schatten van multipliciteit met 4-Toegangspunt
    1. In spanning klem, houd de cel op-68 mV. Gebruikend de zelfde software, opnemen en de sEPSCs tegelijkertijd zoogdierlevercellen het bad met lage Ca2 + aCSF. Record voor ten minste 5 minuten na het begin van geheel-cel configuratie om een stabiele basislijn opname zoals de synaptische activiteit kan hoge kort na de doorbraak van het membraan.
    2. Met behulp van een micropipet, 4-AP toevoegen aan de aCSF en bad toepassing 30 µM 4-AP. Record sEPSCs voor ten minste 10 min. de volledige drug effect te verkrijgen.
    3. 0,5 µM TTX en 10 µM Cd2 + toevoegen aan de aCSF met 4-AP en registreren van de mEPSCs voor ten minste 10 min.
    4. Gebruik de laatste 1 min van basislijn onmiddellijk voorafgaand aan het verzoek van 4-AP (in lage Ca2 + aCSF), de 10 min van 4-AP toepassing en de 10 min van TTX toepassing voor off line analyse.
  2. Experiment 2: desynchronize blaasje uitgave gebruikt Sr2 +
    1. Terwijl zoogdierlevercellen het bad met normale Ca2 + aCSF (hetzelfde als de aCSF bad) record sEPSCs voor minstens 5 min.
    2. Schakelen van de normale Ca2 + aCSF en beginnen zoogdierlevercellen Sr2 + aCSF (uit stap 1.4) en record sEPSCs.
    3. Vergelijk voor off line analyse, om te bepalen of de grote amplitude-sEPSCs door de synchrone vrijval van blaasjes, de laatste 1 min van de basislijn (in normale aCSF) tot de 10th minuut van Sr2 + aCSF-toepassing.
  3. Experiment 3: test voor het gebruik van multivesicular versie Γ- DGG
    1. In lage Ca2 + aCSF record sEPSCs voor minstens 5 min.
    2. Voeg toe 30 µM 4-AP aan de aCSF via het systeem van de perfusie. Record sEPSCs voor ten minste 10 min.
    3. Toevoegen van 200 µM γ-DGG aan de aCSF met 4-AP en registreren van de sEPSCs voor ten minste 10 min.
    4. Als een controle-experiment in een aparte cel, uit te voeren stappen 1-3 maar toepassen een lage concentratie (125 nM) van DNQX in plaats van de γ-DGG.
    5. Voor off line analyse, analyseren de laatste min van de toepassing van elke drug.
  4. Experiment 4: Stimuleren afferent ingangen te verhogen van de actiepotentiaal afvuren.
    1. Record sEPSCs in normale Ca2 + aCSF.
    2. Het stimuleren van de afferents met behulp van een monopolaire glaselektrode gevuld met aCSF met een snelheid van 20 Hz voor 2 s en herhaal 10 keer met een inter barsten interval van 20 sec.
    3. Voor analyse, de 5000 ms vóór de eerste prikkel gebruiken als de basislijn en vergelijken met de 10-300 ms na de laatste prikkel en neem dan de gemiddelde amplitude en frequentie verandering meer dan 10 proeven.

5. analyse

  1. SEPSCs en mEPSCs met behulp van een programma dat detecteert en analyseert synaptic stromingen (bijvoorbeeld Mini analyse software) analyseren.
    1. Gebruik van deze software, de voorgestelde detectie-parameters gebruiken voor het opsporen van AMPA Receptor EPSCs (of GABA Receptor-EPSCs als remmende stromingen van de opname).
    2. De Nonstop analyse functie gebruiken om te detecteren van EPSCs in de opname.
    3. Handmatig scannen van elke opname om ervoor te zorgen dat het programma is nauwkeurig het opsporen van elke gebeurtenis (bijvoorbeeld zorgen dat gebeurtenissen niet worden gemist of twee keer geteld).
    4. Exporteren van de gebeurtenisgegevens door deze te kopiëren naar het Klembord en plak deze in een data managementsoftware (bijvoorbeeld Excel)
    5. Berekenen van de gemiddelde frequentie en/of amplitude voor elke medicamenteuze behandeling en de relevante statistische analyses uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het bovenstaande protocol beschrijft een methode voor het gebruik van geheel-cel patch klem electrofysiologie te onderzoeken van de mate van synaptic multipliciteit, met behulp van de muis hypothalame neuronen als voorbeeld. Dit segment voorbereiding techniek moet opleveren gezonde levensvatbare cellen die geen een gezwollen membraan of de nucleus (Figuur 1). Elke stap in het protocol is belangrijk voor de gezondheid van het weefsel en de kwaliteit van de opnamen.

Figure 1
Figuur 1: gezond en ongezond weefsel volgende slice voorbereiding. Snijd electrofysiologie voorbereiding van de PVN onder differentiële interferentie contrast optiek bij 40 x vergroting. Rode pijlpunten geven aan gezonde cellen, en zwarte pijlpunten geven aan ongezonde cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 illustreert de beweegredenen voor het identificeren van synaptic multipliciteit met behulp van patch klem electrofysiologie. Synaptic multipliciteit kan het gevolg zijn van ofwel meerdere synaptic contact tussen twee neuronen (figuur 2A links) of door multivesicular release op een bepaalde synaptic site (figuur 2A rechts). In beide van deze situaties, zou een actiepotentiaal in het presynaptische neuron een grote postsynaptisch reactie (sEPSC) als gevolg van de temporele sommatie van meerdere synaptic gebeurtenissen uitlokken. Echter, in de afwezigheid van exocytose actie potentiaal (b.v. in de aanwezigheid van TTX en Cd2 + te blokkeren Na+-afhankelijke en Ca2 +-afhankelijke actiepotentiaal afvuren), vesiculaire neurotransmitter release asynchroon is. Dientengevolge, de postsynaptisch reactie wordt kleiner (figuur 2B: AP-zelfstandige). Als twee neuronen geen multiplicity vertonen (d.w.z. hebben slechts één synaptic contact/Nee multivesicular release) zal er geen verschil in het postsynaptisch antwoord tussen de actiepotentiaal-afhankelijke en de actiepotentiaal-onafhankelijke vrijlating van neurotransmitter (figuur 2C).

Figure 2
Figuur 2: Schematisch diagram illustreert de gevolgen van verschillende synaptic organisaties op postsynaptisch stromingen. (A, B) In een Synaps met multipliciteit, een actiepotentiaal en de daaruit voortvloeiende Ca triggers2 + toestroom synchrone samensmelting van meerdere synaptische vesikels die in grote, multiquantal EPSCs resulteren. Synaptic multipliciteit kan ontstaan door multisynapse contact of multivesicular release op een enkele synapse (A). In aanwezigheid van TTX en Cd2 +, actiepotentiaal-onafhankelijke vesikel fusion asynchroon is en zorgt ervoor dat kleine uniquantal EPSCs (B). (C) In synapsen zonder multipliciteit, zowel actiepotentiaal-afhankelijke en -onafhankelijke vesikel fusion resulteert in uniquantal EPSCs. Dit cijfer is uit figuur 1A van ons vorige verslag6gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In de Experiment 1, wordt 4-AP toegepast op het bad te verhogen actiepotentiaal afvuren en de vrijgave van waarschijnlijkheid. Om ervoor te zorgen dat 4-AP groeit spontane actiepotentiaal afvuren, kan de frequentie van de EPSCs tussen sEPSCs en mEPSCs (figuur 3A, C) worden vergeleken. Omdat de sEPSCs zijn een combinatie van zowel actiepotentiaal-afhankelijke en -onafhankelijke gebeurtenissen, dient het verschil in de frequentie van sEPSC en mEPSC als een proxy voor spontane actiepotentiaal afvuren in de presynaptische axonen. We gebruiken een willekeurige snede af van een > 15% verschil in frequentie tussen sEPSC te mEPSC om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal actiepotentiaal-afhankelijke evenementen aanwezig voor de analyse van veelheid zijn. Als de EPSCs in de lage Ca2 + voorwaarde en de voorwaarde van de TTX (mEPSC) zijn qua frequentie en amplitude (d.w.z. geen spontane actiepotentiaal vuren in de laag Ca2 + voorwaarde), het verschil tussen de lage Ca2 + basislijn sEPSC en 4 -AP kan ook worden gebruikt voor de analyse van veelheid.

In een voorbeeld stijgt resultaat afgebeeld in Figuur 3, 4-AP zowel de amplitude en frequentie van sEPSCs. Verdere toepassing van TTX en Cd2 + vermindert zowel de amplitude en frequentie. Zoals hierboven beschreven, geeft het verschil in de amplitude tussen sEPSCs en mEPSCs aan synaptic veelheid. In de hypothalamische neuronen die we hier onderzoeken, de amplitude en frequentie van de basislijn en de TTX voorwaarden suggereren hetzelfde (Figuur 3 c, D), dat de sEPSCs van de basislijn zeer weinig actiepotentiaal-afhankelijke EPSCs bevatten. Dienovereenkomstig, latere experimenten kunnen vergelijken met het verschil tussen de basislijn en 4-AP voor het meten van de veelheid.

Figure 3
Figuur 3:. 4-AP toepassing onthult synaptic multipliciteit. (A) monster sporen van sEPSCs opgenomen in lage Ca2 + aCSF tijdens basislijn en na toepassing van de 4-AP (30 μM), en latere TTX (0,5 μM) en Cd2 + (10 μM)-toepassing. (B) de verdeling van de amplitude van de sEPSC van de opname weergegeven in (A). (C, D) Samenvatting van de gemiddelde frequentie (C) en de amplitude (D) tussen basislijn (grijs), 4-AP (rood) en TTX + Cd2 + (blauw). P < 0.005, ** P < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 2 van ons vorige verslag6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De hierboven beschreven methode maakt een schatting van de gemiddelde veelheid van synapsen tot beëindiging op de postsynaptisch neuronen: het kan niet de opsporing van wijzigingen in de multipliciteit die zich voordoen op een klein deel van de synapsen. Echter bleek deze methode in onze recente studie, veranderingen in de veelheid van glutamaat synapsen op hypothalame neuronen tussen normaal en chronisch benadrukte voorwaarden6.

Vervanging van Ca2 + met mengsel Sr2 + in de aCSF desynchronizes actiepotentiaal-afhankelijke vrijlating van neurotransmitter blaasjes 19, 20. Daarom, als de grote amplitude sEPSCs de sommatie van de actiepotentiaal-afhankelijke gesynchroniseerde vesiculaire neurotransmitter release (dat wil zeggen, multipliciteit), ter vervanging van Ca2 + met Sr2 + zal dalen de amplitude van de EPSCs. Zoals te zien in Figuur 4, Sr2 + aCSF vermindert het aandeel van grote amplitude gebeurtenissen (figuur 4B), en als gevolg daarvan vermindert de gemiddelde amplitude (figuur 4C). Wanneer de cellen geen multiplicity vertonen, zal desynchronizing blaasje release hebben geen effect op de EPSC amplitude.

Figure 4
Figuur 4: Sr2 + desynchronizes grote multiquantal evenementen. (A) representatieve trace vergelijking tussen normale Ca2 + aCSF en Sr2 + aCSF. SR2 + aCSF desynchronizes blaasje release en vermindert de amplitude van de multiquantal synchrone gebeurtenissen zoals gezien in de distributie van een representatieve amplitude (B) en de amplitude verandering voor alle cellen (C) * P < 0.05. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 3 van ons vorige verslag6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Γ-DGG, een snelle dissociating concurrerende antagonist van AMPA receptoren, kan worden gebruikt om te bepalen of multipliciteit als gevolg van de multivesicular release of meerdere synaptic contactpersonen. Als multivesicular release handelingen op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren, de grote amplitude EPSCs omvat bundeling van glutamaat in de synaptische spleet. Met andere woorden, is de concentratie van glutamaat in de synaptische spleet hoger dan die welke uit uniquantal release voortvloeit. Aan de andere kant, zou multisynaptic contacten uniquantal EPSCs hebben op elke synaptic site. Als de grote amplitude EPSCs ontstaan uit multivesicular release, zal de grotere EPSCs minder worden beïnvloed door antagonisme van de γ-DGG (als gevolg van de hogere concentratie van glutamaat) in vergelijking met kleinere amplitude EPSCs (figuur 5A rechts, B-D). Als de grote amplitude EPSCs zijn te wijten aan de sommatie van synchrone uniquantal EPSCs (multisynapse contacten), γ-DGG zal ook invloed hebben op de amplitude van alle EPSCs (figuur 5A links, E-G). In tegenstelling tot γ-DGG, DNQX die een hoge affiniteit, langzaam distantieert AMPA/kainate receptor antagonist veroorzaakt een daling van het uniform in alle grote en kleine amplitude EPSCs ()Figuur 5 H-J). De gevoeligheid voor γ-DGG en DNQX kan worden gekwantificeerd als de verhouding van de gemiddelde EPSC amplitude gedeeld door de maximale (het gemiddelde van de grootste 20 EPSCs) EPSC amplitude ()Figuur 5 K, L).

Figure 5
Figuur 5: met behulp van de γ-DGG sonde multivesicular release. (A) schema's ter illustratie van twee modellen van veelheid. Links: temporele sommatie van transmissie van de uniquantal die zich richt op onafhankelijke populaties van postsynaptisch receptoren. Grote en kleine EPSCs worden bereikt door een soortgelijke glutamaat-concentratie in de synaptische spleet en daarom zijn even gevoelig voor γ-DGG. Rechts: multiquantal transmissie die zich richt op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren. Grote EPSCs worden veroorzaakt door de hogere concentratie van glutamaat in de gespleten dan kleinere sEPSCs en zijn dus minder gevoelig voor γ-DGG. Waarden die worden weergegeven aan de onderkant van het model zijn hypothetische relatieve amplitudes. (B) monster sporen van een opname in die was er een toename van de gemiddelde sEPSC amplitude na 4-AP toepassing (4-AP-responder). (C) cumulatieve plot voor EPSC amplitude voor de opname in (B) weergegeven. (D) cumulatieve plot voor genormaliseerde EPSC amplitude (EPSC/EPSCMAX) voor en na toepassing van de γ-DGG van de opname in (B) weergegeven. (E) monster sporen van een opname waar was er geen verandering in de amplitude van de gemiddelde sEPSC na 4-AP toepassing (4-AP non-responder). (F) cumulatieve EPSC amplitude voor de opname in (E) weergegeven. (G) cumulatieve EPSC/EPSCMAX plot voor de opname in (E) weergegeven. (H) monster sporen van een opname van de basislijn, alsmede na 4-AP en DNQX toepassing. (ik) de cumulatieve EPSC amplitude voor de opname in (H) weergegeven. (J) cumulatieve EPSC/EPSCMAX plot voor de opname in (H) weergegeven. (K) samenvatting van gemiddelde EPSC/EPSCMAX na γ-DGG (in 4-AP-responder en non-responder groepen) of DNQX toepassing genormaliseerd naar pre-γ-DGG/DNQX (dat wil zeggen post-4-AP). (L) percelen van post-4-AP betekenen EPSC amplitude (genormaliseerd naar pre-4-AP) tegen de post-γ-DGG/DNQX gemiddelde EPSC/EPSCMAX (genormaliseerd naar post-4-AP). P < 0.005. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 4 van ons vorige verslag6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De kracht van synaptische transmissie kan Transient worden verhoogd door uitbarstingen van synaptic activiteit. Om te onderzoeken multipliciteit onder meer fysiologische omstandigheden, kan de afferent stimulatie te verhogen actiepotentiaal afvuren en de vrijgave van waarschijnlijkheid worden gebruikt. Als de multipliciteit aanwezig is, afferent stimulatie moet leiden tot een korte stijging de EPSC amplitude (figuur 6A-D). Als de multipliciteit niet aanwezig is, zal de amplitude EPSC niet toenemen door activiteit gedreven verhogingen in actiepotentiaal afvuren.

Figure 6
Figuur 6: hoogfrequente stimulatie onthult synaptic multipliciteit. (A) monster sporen van sEPSCs vóór en na afferent synaptic stimulatie. (B) perceel van sEPSC amplitude vóór en na de synaptische stimulatie (20 Hz, 2 s) van de opname weergegeven in (A). (C, D) Samenvatting van sEPSC frequentie (C) en de amplitude (D) wijzigingen na synaptic stimulatie. P < 0.001, * P < 0.05. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 5 van onze vorige verslag6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een belangrijke voorwaarde voor een succesvolle patch klem electrofysiologie experiment is het verkrijgen van gezonde segmenten/cellen. Ons beschreven protocol is geoptimaliseerd voor hypothalame segmenten die PVN neuronen bevatten. Andere hersenen gebieden mogelijk bewerkt oplossingen en snijden methoden21,22,23,24. Voor de opname, het is van cruciaal belang alleen te aanvaarden stabiele opnamen door voortdurend toezicht op Celeigenschappen zoals membraan weerstand, capaciteit en toegang weerstand. Een toename van de weerstand van de toegang kan verminderen EPSC amplitude en daarom beschamen amplitude metingen. Dienovereenkomstig, cellen met toegang weerstand waarden die groter zijn dan 20 MΩ of verhogen met meer dan 20% tijdens het opnemen worden verwijderd. Ook een afname in (of een lage) membraan weerstand kan resulteren in slechte ruimte-clamp en, dus, de amplitude kan verminderen. De neuronen in onze target-systeem (parvocellular PVN neuronen) hebben een hoge membraan weerstand tussen 500 MΩ en 1 GΩ, en we negeren cellen met membraan weerstanden onder 500 MΩ. Kwaliteitscontrole cut-offs moeten worden vastgesteld voor specifieke soorten neuronen bestudeerde. Als dit protocol is gebaseerd op het verschil in de amplitude vóór en na de drug toepassingen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de verandering van de amplitude als gevolg van de toepassing van de drug en niet aan de veranderingen in de membraan verzet en weerstand van de toegang is. De hypothalamische neuronen we in dit protocol bestuderen zijn klein in grootte (cel capaciteit is ongeveer 15 pF in muizen en membraan weerstand is ongeveer 1 GΩ), en K-gluconaat gebaseerd interne oplossing werken goed te verkrijgen van hoge kwaliteit EPSCs/IPSCs6,25 . Voor neuronen met grotere Celgrootte en lage input weerstand, kan cesium gebaseerd interne oplossing worden aangewend om een goede ruimte-klem2.

Een van de specifieke vereisten van het gebruik van deze methode voor het meten van de veelheid is dat de cellen een voldoende aantal spontane actie potentials brand om te vergelijken actiepotentiaal-afhankelijke gebeurtenissen te mEPSCs. Dit kan worden gewaarborgd door het vergelijken van het verschil in de frequentie van de EPSCs in de afwezigheid en aanwezigheid van TTX en Cd2 +. In meerdere segmenten waarin de PVN, hebben we gevonden dat de toepassing van 4-AP is efficiënt om te ontlokken actiepotentiaal afvuren. Een andere methode, gepionierd door Hsia en collega's2, gebruikt hoge Ca2 + aCSF om actiepotentiaal afvuren, in plaats van 4-AP. Terwijl deze methode was succesvol in hippocampal plakjes, we vonden dat de hoge Ca2+ was minder efficiënt dan 4-AP bij het vergemakkelijken van de actiepotentiaal afvuren in hypothalame segmenten6. Inderdaad, het is aangetoond dat hoog, extracellulaire Ca2 + concentratie intrinsieke prikkelbaarheid van neuronen en axonen vermindert door nb+ huidgeleiding26,27te wijzigen. Dit kan verklaren waarom in sommige segmenten, hoge Ca2 + aCSF is niet effectief in het verhogen van de frequentie van de EPSC.

Een beperking van deze methode, die inherent aan alle segment patch klem electrofysiologie is, is dat vele, lange-afstands projecties naar de postsynaptisch neuronen worden gesneden in segment preparaten. Om het observeren actie potentieel, is het waarschijnlijk dat de presynaptische axonen en cel organen moeten worden behouden in het segment. Daarom is de multipliciteit meting scheef aan synaptic connectiviteit behouden in het segment. Langs dezelfde lijn, kan de richting van het snijden bepaalde bevolkingsgroepen van de prognoses worden bewaard, terwijl anderen afgehakte28 zijnveroorzaken. Deze beperkingen hebben een algemene effect van de veelheid van afferent ingangen onderschatten.

Het beschreven protocol biedt een methode voor het schatten van de mate van synaptic multipliciteit over alle ingangen naar een bepaalde neuron. Andere electrofysiologie-technieken, zoals gepaarde opnamen of minimale stimulatie van een enkele axon kunnen vaststellen of een bepaalde verbinding meerdere contacten heeft, maar deze experimenten vaak moeilijk en niet mogelijk in alle systemen zijn. Verder kunnen ze niet geven een algemene indicatie van de organisatie van alle van de ingangen naar een bepaalde neuron zoals ze alleen een paar van neuronen isoleren. Dit protocol maakt gebruik van elementaire patch-clamp electrofysiologie methoden te evalueren van de mate van multipliciteit over alle ingangen naar een bepaalde neuron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgments

J.S. ontving Ontario Graduate beurs. Wi ontving een nieuwe detective Fellowship van geestelijke gezondheidsonderzoek Canada. Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies aan W.I van de natuurwetenschappen, Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) en de Canadian Institute voor gezondheidsonderzoek (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 146 geheel-cel patch-clamp electrofysiologie ex vivo synaptische transmissie synaptic winst multipliciteit paraventricular kern van de hypothalamus corticotropin-releasing hormoon hypothalamus
Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunstrum, J. K., Inoue, W.… More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter