Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Utvärdering av Synaptic Multiplicity använder hela-cell Patch-clamp elektrofysiologi

doi: 10.3791/59461 Published: April 23, 2019

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma funktionella synaptic multiplicityen använder hela-cell patch clamp elektrofysiologi i akut hjärnskada skivor.

Abstract

I det centrala nervsystemet, ett par av nervceller bildar ofta flera synaptiska kontakter och/eller funktionella signalsubstansen release webbplatser (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity är plast och förändringar i hela utvecklingen och olika fysiologiska förhållanden, att vara en viktig faktor för effekten av synaptisk transmission. Här, beskriver vi experiment för att uppskatta graden av multiplicityen av synapser som avslutas på en given postsynaptiska neuron med hela-cell patch clamp elektrofysiologi i akut hjärnskada skivor. Specifikt, används spänning-clamp inspelning för att jämföra skillnaden mellan amplituden av spontana excitatoriska postsynaptiska strömmar (sEPSCs) och miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar (mEPSCs). Teorin bakom denna metod är att afferenta ingångar som uppvisar mångfald kommer att visa stora, potentiell handling-beroende sEPSCs på grund av synkron lanseringen som sker vid varje synaptisk kontakt. Däremot genererar aktionspotential-oberoende release (som är asynkron) mindre amplitud mEPSCs. Denna artikel beskriver en uppsättning experiment och analyser att karakterisera förekomsten av synaptic multiplicity och diskuterar de krav och begränsningar av tekniken. Denna teknik kan användas för att undersöka hur olika beteendemässiga, farmakologiska eller miljömässiga insatser i vivo påverkar organisationen av synaptiska kontakter i olika hjärnområden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Synaptisk transmission är en grundläggande mekanism för kommunikationen mellan nervceller, och därmed hjärnans funktion. Synaptisk transmission är också labila och kan ändra dess effektivitet i en verksamhet-beroende sätt också som svar på immunmodulerande signaler1. Således har att pröva synaptic funktion varit viktiga fokus av neurovetenskapliga forskning. Hela-cell patch clamp elektrofysiologi är en mångsidig teknik som gör det möjligt för oss att förstå, genom att utarbeta experimentell design och dataanalyser, djupgående biofysiska och molekylära mekanismer av synaptisk transmission. En vanligt förekommande strategi, kanske på grund av enkelheten i tekniken och konceptet, är mätning av miniatyr excitatoriska/hämmande postsynaptiska strömmar (mig / IPSCs) under spänningen klämma konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. individuella mPSCs representerar flödet av joner genom postsynaptiska jonotropa receptorer (t.ex. AMPA och GABAA -receptorer) som svar på bindningen av deras respektive neurotransmittorer frigörs från presynaptiska terminalen 7 . Eftersom inspelningen erhålls i närvaro av de spänningskänsliga Na+ kanal blockerare tetrodotoxinen (TTX), utgivningen är oberoende av aktionspotential och innebär normalt en enda synaptiskt vesikelprotein som innehåller signalsubstansen. Baserat på detta antagande, används genomsnittliga amplituden av mPSCs allmänt som en grov uppskattning för den kvantfysikaliska storlek, vilket representerar antalet och funktionalitet av postsynaptiska receptorer motsätta sig en enda utsättningsplatsen. Frekvensen av mPSCs anses däremot, utgör en kombination av det totala antalet synapser avslutas på den postsynaptiska cellen och deras genomsnittliga release sannolikhet. Dessa parametrar mäter dock inte en annan variabel-multiplicativity av synapser, eller synaptic multiplicity — vilket är viktigt för effekten av synaptisk transmission.

Baserat på kvantfysikaliska teorin av synaptisk transmission7,8,9, styrkan i en viss anslutning mellan ett par av nervceller är beroende av tre faktorer: antalet funktionella synapser (N), den postsynaptiska svar till frigöraren av en enda synaptiskt vesikelprotein (kvantfysikaliska storlek; Q) och probabilityen av neurotransmitterfrigöraren (Pr). Synaptic multiplicity motsvarar N. Utvecklingen av synaptic multiplicity eller beskärning av multiplikativ synapser är plast i hela utvecklingen och i olika sjukdomen staterna3,4,6,10. Av denna anledning har kännetecknar synaptic multiplicity stor betydelse för att förstå effekten av synaptisk transmission i hälsa och sjukdom. Tekniker, såsom elektronmikroskopi kan identifiera strukturella bevis av synaptic multiplicity genom att upptäcka flera synaptiska kontakter med ursprung från samma axon på samma postsynaptiska neuron11,12, 13,14. Dessa strukturellt identifierade multisynapses kan dock vara funktionellt tyst15,16. Exakt funktionell undersökning av N kräver tekniskt utmanande elektrofysiologiska metoder, såsom Parade hela-cell inspelningar som kan fastställa huruvida en viss anslutning har flera funktionella release webbplatser och minimal stimulering strategier som syftar till att rekrytera en enda förmodade axon.

I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att uppskatta synaptic multiplicity genom att anta en metod som ursprungligen utvecklades av Hsia et al2. Denna teknik innebär mätning av spontana PSC (sPSCs) och mPSCs med hela-cell patch clamp elektrofysiologi, som tillåter oss att uppskatta graden av synaptic multiplicityen över alla ingångar till en given neuron.  Som tidigare definierade, synaptic multiplicity återspeglar antalet synapser mellan en given pre- och postsynaptiska neuron. Om flera synapser rekryteras på samma gång av en aktionspotential, blir det en hög sannolikhet för temporal summering av enskilda (dvs kvantfysikaliska) gemensamma kontaktpunkter, genererar en större amplitud PSC.  I mPSC recordings (i vilken handlingspänningar blockeras av TTX), sannolikheten för temporal summering av enskilda (icke-synkrona) mPSCs är låg. Med denna logik, kan synaptic multiplicity uppskattas genom att jämföra sPSC amplituden (med potentiell handling-beroende release) till mPSC amplituden.

För att undersöka förekomsten av multiplicity beskriver vi fyra experiment och sina analyser med glutamaterg EPSCs som exempel. Dock samma tillvägagångssätt kan användas för snabb GABAergic/glycinergic överföring (IPSCs). En kortfattad motivering för varje experiment beskrivs nedan. Först, som förklarats ovan, synaptic multiplicity kan uppskattas genom att jämföra amplituden av sEPSCs till mEPSCs. Det finns två krav för detta tillvägagångssätt; 1) presynaptiska axoner måste avfyra ett tillräckligt antal handlingspänningar under inspelningen, och 2) Pr måste vara hög så att flera synapser frigöra signalsubstansen vid ankomsten av en aktionspotential. För att möta dessa krav, sEPSCs först registreras i låg Ca2 + konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF), och sedan registreras i närvaro av en låg koncentration av K+ kanal antagonisten, 4-Aminopyridin (4-AP) att öka åtgärd potentiella bränning och Pr. Då blockeras aktionspotential bränning av TTX och Pr minskade med en spänningskänsliga Ca2 + kanal blockerare Cd2 +. Amplituden av sEPSCs (med 4AP) jämförs med det av mEPSC (med 4AP, TTX och Cd2 +). I det andra experimentet ersättas Ca2 + med equimolar Sr2 + i aCSF till desynchronize vesikler release. Ca2 + krävs för synkrona frigöraren av blåsor, bör ersättning med Sr2 + eliminera den stora amplitud sEPSCs som är vägledande för mångfald. För det tredje, slentrianmässigt, multiplicity kan följd antingen flera synaptiska kontakter till samma postsynaptiska neuron eller multivesicular release (dvs flera blåsor släppas inom en enda synaptisk kontakt)17,18. För att skilja mellan de två typerna av multiplicity, använder tredje experimentet en låg affinitet, snabb separera kompetitiv antagonist till AMPA-receptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 att avgöra om stora sEPSC är resultatet av den temporal summeringen av oberoende synapser eller multivesicular release agerar på en överlappande befolkning av postsynaptiska receptorer. Om de stora amplitud händelserna uppstår från multivesicular release, kommer att γ-DGG vara mindre effektiva på att hämma större jämfört med mindre sEPSCs, medan stora sEPSCs som uppstår från den temporal summeringen av flera synaptiska kontakter påverkas på samma sätt av Γ-DGG. I fjärde försöket används en mer fysiologisk metod att förbättra aktionspotential bränning, nämligen afferenta synaptic stimulering. Skurar av synaptisk aktivitet kan övergående ökning/underlätta spontana aktionspotential bränning och release sannolikheten att den stimulerade afferenter. Därför, detta tillvägagångssätt tillåter mångfald manifesteras på ett mer fysiologiska sätt.

Följande protokoll beskriver metoden för att genomföra dessa experiment i mus hypotalamus vävnad. Specifikt, används kortikotropin frigöra hormon (CRH) nervceller av paraventricular kärnan i hypothalamus (PVN). Vi beskriva förfarandena för att genomföra hela-cell patch clamp elektrofysiologi och förklara de specifika experiment att testa för synaptic multiplicity.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurförsök är godkända av Animal Care kommittén av The University of Western Ontario i enlighet med kanadensisk rådet om Animal Care riktlinjer (AUP nr 2014-031).

1. lösningar

  1. Skivning lösning
    1. Se tabell 1 för sammansättningen av skivning lösningen.
    2. Förbereda en 20 x stamlösning i förväg och förvara den vid 4 ° C i upp till 1 månad.
    3. 1 x skivning lösning, upplösa NaHCO3, glukos och sackaros i ddH2O, och lägga till 20 x beståndet. Kontrollera osmolaritet är mellan 315-320 mOsm och lagra lösningen för mer än 1 vecka vid 4 ° C.
    4. Fyll två bägare med 100 mL skivning lösning och täck dem med parafilm. Chill lösningen i en frys tills lösningen blir delvis fryst (ca 20 min i-80 ° C frys). Använda en gas dispersion tube, bubbla både bägare av skivning lösning med 95% O2/5% CO2 för 20 min på is.
Lösning koncentrationer (mM)
Skivning Normala aCSF Låg Ca2 + aCSF SR+ aCSF Pipett/intern
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1,25 1,25 1,25 1,25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glukos 25 10 10 10 -
Sackaros 75 - - - -
K-glukonat - - - - 116
Na-glukonat - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0,3

Tabell 1: Sammansättning av olika lösningar.

  1. aCSF (för slice återhämtning och underhåll)
    1. Se tabell 1 för sammansättningen av aCSF.
    2. Förbereda en 20 x stamlösning i förväg och förvara den vid 4 ° C i upp till 1 månad.
    3. För 1 x aCSF, lös NaHCO3 och glukos i ddH2O och tillsätt 20 x beståndet. Kontrollera osmolaritet är mellan 298-300 mOsm. Använd lösning inom 1 dag.
  2. aCSF (låg Ca2 + för inspelning)
    1. Se tabell 1 för sammansättningen av den låg Ca2 + aCSF.
    2. Förbereda en 20 x stamlösning i förväg och förvara den vid 4 ° C i upp till 1 månad.
    3. För 1 x låg Ca2 + aCSF, lös NaHCO3 och glukos i ddH2O och tillsätt 20 x (CaCl2 och MgCl2 gratis) lager, CaCl2 och MgCl2 till angivna koncentrationerna. Kontrollera osmolaritet är mellan 298-300. Använd lösning inom 1 dag.
  3. aCSF (Sr2 + för inspelning)
    1. Se tabell 1 för sammansättningen av den Sr2 + aCSF.
    2. Förbereda en 20 x stamlösning i förväg och förvara den vid 4 ° C i upp till 1 månad.
    3. För 1 x Sr2 + aCSF, lös NaHCO3 och glukos i ddH2O och tillsätt 20 x (CaCl2 och MgCl2 gratis) lager, SrCl2 och MgCl2 till angivna koncentrationerna. Kontrollera osmolaritet är mellan 298-300. Använd lösning inom 1 dag.
  4. Inre lösning
    1. Se tabell 1 för sammansättningen av de K-glukonat baserat intern lösningen.
    2. För att göra 20 mL intern lösning, tillsätt 15 mL vatten för molekylärbiologi-kvalitet till en 50 mL tub. De efterföljande stegen på isen.
    3. Förbered följande lösningar före tid till 1 M lager koncentrationer i molekylärbiologi grade vatten. Lägga till (i mL): 2.32 K-glukonat, 0,24 Na-glukonat, 0.20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 till 50 mL-röret.
    4. Tillsätt 100 µL av 0,3 M Na3GTP.
    5. Väga 44.08 mg K2ATP i en 2 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 1 mL av molekylär biologi klass vatten, Lägg sedan till 50 mL tub.
    6. Justera pH-värdet till 7,2-7,4 med 1 M KOH. Kontrollera osmolaritet är mellan 283-289 mOsm.

2. skiva förberedelse

  1. Förbereda verktyg
    1. Tillsätt 200 mL aCSF till återhämtning kammaren (tillverkad av en 250 mL bägare med 4 brunnar och nettning) och placera återhämtning kammaren i ett vattenbad (35 ° C).
    2. Täcka kammaren med ett paraffin filma och ständigt bubbla aCSF med 95% O2/5% CO2 använder ett glasrör för spridning i minst 20 min.
    3. Förbereda för dissekering av ställa upp verktyg (skalpell, vinklade fin sax, pincett, fin pensel, plast sked).
    4. Fyll en 60 mL spruta med cirka 15 mL iskallt skivning lösningen från steg 1.1.4.
    5. Förbereda dissektion plattformen genom att placera ett filterpapper på locket till en väl platta.
    6. Förbereda skivning kammaren genom att placera det i en ISLÅDA och fylla magasinet med is.
    7. Ställ in vibratome genom att säkra ett engångsblad i bladhållaren.
    8. Gör en överföring pipetten genom att bryta spetsen av en Pasteur-pipett och placera en gummi lampa över brutna änden.
  2. Dissekera mus hjärnan
    1. Söva djuret i en kammare som mättad med 4% isofluran tills spinal reflexer är frånvarande.
    2. Halshugga djuret med hjälp av en giljotin och snabbt ta bort hjärnan.
      1. Gör en mittlinjen snitt med nr 22 skalpell blad från rostralt till stjärtfenan.
      2. Sidled skala hårbotten på varje sida av huvudet.
      3. Använd fina sax att klippa skallen på ena sidan från stjärtfenan till rostralt (inklusive sidan av pannben), använda försiktighet att inte skada hjärnan.
      4. Använd pincett att lyfta skalle lappa av hjärnan och kyla snabbt hjärnan med 15 mL iskallt skivning lösning med hjälp av sprutan från steg 2.1.4.
      5. Lyft hjärnan ur skallen.
      6. Plats hjärnan i en av de bägare fylld med iskall skivning lösning (från steg 1.1.4) bubblade med 95% O2/5% CO2.
  3. Förbereda skivor av mus hypotalamus
    1. Blockera hjärnan för önskad hjärnan området och skär vinkel (t.ex. för koronalt hypotalamus skivor, trimma bort vävnaden rostralt om den optiska chiasm och stjärtfenan till pons med hjälp av ett blad och säkerställa kaudala blocket har en plan yta vinkelrätt mot basen av hjärnan).
    2. Använda en avskurna pappersbiten filter, plocka upp hjärnan från den främre sidan och limma den bakre sidan till jordbruksföretaget plattan med omedelbar lim.
    3. Snabbt placera anläggningen plattan i skivning kammaren och fylla kammaren med skivning lösning från andra bägaren i steg 1.1.4.
    4. Säkra skivning och facket på vibratome.
    5. Definiera området skivning (främre och bakre till hjärnan) och börja skivning 250 µm tjocklek koronalt skivor. Rekommenderade parametrar: hastighet 0,10 mm/s, amplitud 2 mm.
    6. Trimma skivor till lämplig storlek för önskad hjärnan området.
    7. Återställa skivor vid 35 ° C i 30-45 min. Sedan bort återhämtning kammaren från de värmande bad och tillåta skivor att återhämta sig i rumstemperatur i en ytterligare 30 min. Håll skivor vid rumstemperatur för resten av dagen och fortsätta bubbla badet ständigt med 95% O2/5% CO2 .

3. hela-cell Patch ClampRecording

  1. Dra de patch pipetterna
    1. Med de föreslagna parametrarna för hela-cellen inspelning från den pipett avdragares manual, dra patch pipetter från tjocka muromgärdade glas till en pipett motstånd av 3-5 MΩ.
    2. Med en mikrosprutan (kommersiella eller hemmagjord), Fyll en pipettspetsen med filtrerade intern lösning. Att göra en mikrosprutan, bränna spetsen på en 1 mL spruta och tillåta tipset att falla skapar en lång fin spets.
  2. Hämta hela-cell konfigurationen
    1. Placera inspelning pipetten ovanför slice och offset pipetten nuvarande i spänningen klämman läge. Tillämpa lätt positiv tryck på pipetten och låsa Avstängningskranen.
    2. Välj en frisk cell med en intakt membran och närma sig cellen med pipetten. Det positiva trycket bör orsaka en liten störning i vävnaden (dvs. en långsam våg i vävnaden när du anger).
    3. Långsamt fortsätta att föra pipetten närmare till cellen med diagonala rörelser tills pipetten bildar en liten grop på cellytan.
    4. Frigör lås övertryck. Cellen börjar att bilda en tätning och motståndet kommer att öka ovan 1 GΩ. I spänningen klämman, håller cellen vid -68 mV.
    5. Dra något ifrån cellen diagonalt för att ta bort övertrycket från cellen.
    6. Kompensera för den snabba och långsamma pipett kapacitansen.
    7. Applicera en kort sugning genom röret anslutet till innehavaren pipetten att bryta igenom cellen och få hela-cell konfiguration.
    8. Växla till Cell -läge på membranet testa fönster i en elektrofysiologi datainsamling och analysprogramvara (t.ex. Clampex).
    9. Innan varje spänning clamp inspelning, utför ett membran test använder samma programvara och registrera relevanta parametrar i en lab-bok (membran motstånd, tillgång resistans och kapacitans).
    10. Upprätthålla temperatur inspelning badet vid 27 – 30 ° C och flödet vid 1,5 – 2,0 mL/min för efterföljande experiment.

4. multiplicity experiment

  1. Experiment 1: uppskatta multiplicity använder 4-AP
    1. I spänningen klämman, håller cellen vid -68 mV. Med samma programvara, registrera sEPSCs medan startas badet med låg Ca2 + aCSF. Rekord för minst 5 minuter efter starten av hela-cell konfiguration för att säkerställa en stabil baslinje inspelning som den synaptisk aktiviteten kan vara hög strax efter genombrottet av membranet.
    2. Använd en mikropipett, Lägg till 4-AP aCSF och bad applicera 30 µM 4-AP. posten sEPSCs i minst 10 min att uppnå full läkemedlet effekt.
    3. Lägg till 0,5 µM TTX och 10 µM Cd2 + till aCSF med 4-AP och spela in mEPSCs i minst 10 min.
    4. För offline analys, använda den senaste 1 min av baslinje omedelbart före tillämpningen av 4-AP (i låg Ca2 + aCSF), 10 min 4-AP ansökan och den 10: e min TTX ansökan.
  2. Experiment 2: desynchronize vesikler release med Sr2 +
    1. Samtidigt startas badet med normala Ca2 + aCSF (samma som den bad aCSF) rekord sEPSCs för minst 5 min.
    2. Växla från den normala Ca2 + aCSF och börja startas Sr2 + aCSF (från steg 1.4) och spela in sEPSCs.
    3. För offline analys, för att avgöra om de stora amplitud sEPSCs på grund av synkrona frigöraren av blåsor, jämföra de sista 1 min av baslinje (i normal aCSF) till 10: e minut av Sr2 + aCSF ansökan.
  3. Experiment 3: testa multivesicular release med Γ- DGG
    1. I låg Ca2 + aCSF rekord sEPSCs för minst 5 min.
    2. Lägga till 30 µM 4-AP aCSF via systemets perfusion. Spela in sEPSCs i minst 10 min.
    3. Lägga till 200 µM γ-DGG aCSF med 4-AP och spela in sEPSCs i minst 10 min.
    4. Som en kontroll experiment i en separat cell, utför steg 1-3 men tillämpa en låg koncentration (125 nM) av DNQX i stället för γ-DGG.
    5. För offline analys, analysera sista minuten av varje läkemedel ansökan.
  4. Experiment 4: Stimulera afferenta ingångar för att öka aktionspotential bränning.
    1. Spela in sEPSCs i normala Ca2 + aCSF.
    2. Stimulera den afferenter använder en monopolär glaselektrod fylld med aCSF med en hastighet av 20 Hz för 2 s och upprepa 10 gånger med Inter burst intervall på 20 SEK.
    3. För analys, använda 5.000 ms innan den första stimulansen som baslinje och jämför med 10-300 ms efter den slutliga stimulansen och sedan ta den genomsnittliga amplitud och frekvens förändringen över 10 prövningar.

5. analys

  1. Analysera sEPSCs och mEPSCs som använder ett program som identifierar och analyserar synaptic strömmar (t.ex. Mini analys programvara).
    1. Använda detta program, använda föreslagna upptäckt parametrar för att upptäcka AMPA Receptor EPSCs (eller GABA-receptorn EPSCs om inspelningen hämmande strömmar).
    2. Använda Nonstop analysen funktion för att upptäcka EPSCs i inspelningen.
    3. Manuellt skanna varje inspelning för att säkerställa att programmet är noggrant upptäcka varje händelse (t.ex. säkerställa händelser inte är missade eller räknas två gånger).
    4. Exportera händelsedata genom att kopiera det till Urklipp och klistra in den i en data management programvara (exempelvis Excel)
    5. Beräkna den genomsnittliga frekvensen eller amplitud för varje läkemedelsbehandling och utföra relevanta statistiska analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det ovannämnda protokollet beskriver en metod för att undersöka graden av synaptic multiplicity, med musen hypotalamus nervceller som exempel med hela-cell patch clamp elektrofysiologi. Denna skiva förberedelse teknik bör ge friska viabla celler som inte har en svullen membran eller nucleus (figur 1). Varje steg i protokollet är viktigt för hälsa av vävnad och kvaliteten på inspelningarna.

Figure 1
Figur 1: hälsosamt och ohälsosamt vävnad följande skiva förberedelse. Skiva elektrofysiologi beredning av PVN under differentiell störningar kontrast optik på 40 x förstoring. Röda pilar anger friska celler och svart pilspetsar anger ohälsosamma celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 illustrerar den logiska grunden för att identifiera synaptic multiplicity med patch clamp elektrofysiologi. Synaptic multiplicity kan resultera från antingen flera synaptisk kontakt mellan två nervceller (figur 2A vänster) eller genom multivesicular release på en viss synaptic webbplats (figur 2A rätt). I båda dessa situationer, skulle en aktionspotential i den presynaptiska neuronen framkalla en stor postsynaptiska reaktion (sEPSC) på grund av den temporal summeringen av flera synaptic händelser. Emellertid, i avsaknad av presynaptiska handlingspänningar (t.ex. i närvaro av TTX och Cd2 + att blockera Na+-beroende och Ca2 +-beroende aktionspotential bränning), vesikulär neurotransmitterfrigöraren är asynkron. Som ett resultat, den postsynaptiska Svaren blir mindre (figur 2B: AP-oberoende). Om två nervceller inte uppvisar mångfald (dvs har endast en synaptisk kontakt/nej multivesicular release) det blir ingen skillnad i den postsynaptiska Svaren mellan potentiell handling-beroende och oberoende av aktionspotential frisläppandet av neurotransmittor (figur 2 c).

Figure 2
Figur 2: Schematisk bild som illustrerar konsekvenserna av olika synaptic organisationer på postsynaptiska strömmar. (A, B) I en synaps med multiplicity, en aktionspotential och efterföljande Ca utlöser2 + tillströmning synkron fusion av flera synaptiska vesikler som resulterar i stora, multiquantal EPSCs. Synaptic multiplicity kan resultera från multisynapse kontakt eller multivesicular release på en enda synaps (A). I närvaro av TTX och Cd2 +, potentiell handling-oberoende vesikler fusion är asynkron och orsakar små uniquantal EPSCs (B). (C) i synapserna utan multiplicity, både aktionspotential-beroende och -oberoende vesikler fusion resulterar i uniquantal EPSCs. Denna siffra har ändrats från figur 1A i vår föregående rapport6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I Experiment 1 tillämpas 4-AP på badet att öka aktionspotential bränning och släppa sannolikheten. För att säkerställa att 4-AP ökar spontana aktionspotential bränning, kan frekvensen av EPSCs jämföras mellan sEPSCs och mEPSCs (figur 3A, C). Eftersom sEPSCs är en kombination av både potentiell handling-beroende och -oberoende händelser, fungerar skillnaden i frekvens av sEPSC och mEPSC som en proxy för spontana aktionspotential bränning i den presynaptiska axoner. Vi använder en godtycklig nedskärning av > 15% skillnad i frekvens mellan sEPSC att mEPSC att säkerställa att det finns ett tillräckligt antal aktionspotential-beroende händelser för analys av mångfald. Om EPSCs låg Ca2 + och villkoret TTX (mEPSC) är liknande i frekvens och amplitud (dvs ingen spontan aktionspotential bränning i låg Ca2 + kondition), skillnaden mellan den låg Ca2 + baslinjen sEPSC och 4 -AP kan också användas för analys av mångfald.

I ett exempel ökar resultatet visas i figur 3, 4-AP både amplitud och frekvens av sEPSCs. Efterföljande ansökan av TTX och Cd2 + minskar både amplitud och frekvens. Som beskrivits ovan, anger skillnaden i amplitud mellan sEPSCs och mEPSCs synaptic multiplicity. I hypotalamus nervceller vi undersöka här, amplitud och frekvens av baslinjen TTX menar detsamma (figur 3 c, D), vars i baseline sEPSCs innehåller mycket få aktionspotential-beroende EPSCs. Följaktligen kan efterföljande experiment jämföra skillnaden mellan baslinjen och 4-AP att mäta mångfald.

Figure 3
Figur 3:. 4-AP ansökan avslöjar synaptic multiplicity. (A) provet spår av sEPSCs registreras i låg Ca2 + aCSF under baslinjen och efter 4-AP (30 μM) program och efterföljande TTX (0,5 μM) och Cd2 + (10 μM)-programmet. (B) fördelningen av sEPSC amplitud från inspelningen visas i (A). (C, D) Sammanfattning av den genomsnittliga frekvensen (C) och amplitud (D) mellan baslinjen (grå), 4-AP (röd) och TTX + Cd2 + (blå). P < 0,005, ** P < 0,01. Denna siffra har ändrats från figur 2 av våra föregående rapport6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den ovan beskrivna metoden beräknar genomsnittliga multiplicityen av synapser som avslutas på de postsynaptiska neuronerna: det kan inte upptäcka förändringar i multiplicity som sker till en liten del av synapser. Dock i vår senaste studie visade denna metod förändringar i multiplicityen av glutamat synapser på hypotalamus nervceller mellan normal och kroniskt stressad villkor6.

Substitution av Ca2 + med equimolar Sr2 + i aCSF desynchronizes aktionspotential-beroende frisättning av signalsubstansen blåsor 19, 20. Därför, om de stora amplitud sEPSCs är summeringen av aktionspotential-beroende synkroniserade vesikulär neurotransmitterfrigöraren (dvs mångfald), ersätter Ca2 + med Sr2 + kommer att minska amplituden för EPSCs. Som kan ses i figur 4, Sr2 + aCSF minskar andelen stor amplitud händelser (figur 4B) och följaktligen minskar den genomsnittliga amplituden (figur 4 c). När cellerna inte uppvisar multiplicity, får desynchronizing vesikler release ingen effekt på EPSC amplituden.

Figure 4
Figur 4: Sr2 + desynchronizes stora multiquantal evenemang. (A) representativa trace jämförelse mellan normala Ca2 + aCSF och Sr2 + aCSF. SR2 + aCSF desynchronizes vesikler release och minskar amplituden av multiquantal synkrona händelser som kan ses i en representativ amplitud distribution (B) och amplitud ändringen för alla celler (C) * P < 0,05. Denna siffra har ändrats från figur 3 i vår föregående rapport6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Γ-DGG, en snabb separera kompetitiv antagonist av AMPA-receptorer, kan användas för att avgöra huruvida multiplicity beror på den multivesicular utgåvan eller flera synaptiska kontakter. Multivesicular release akter på en överlappande befolkning av postsynaptiska receptorer stor amplitud EPSCs innebär en sammanslagning av glutamat i den synaptiska spalten. Med andra ord, är koncentrationen av glutamat i den synaptiska spalten högre än det som resulterar från uniquantal release. Multisynaptic kontakter skulle däremot, har uniquantal EPSCs på varje synaptic plats. Om den stora amplituden EPSCs uppkommer multivesicular release, påverkas de större EPSCs mindre av γ-DGG antagonism (på grund av högre glutamat koncentration) jämfört med mindre amplitud EPSCs (figur 5A höger, B-D). Om den stora amplituden EPSCs är på grund av summeringen av synkron uniquantal EPSCs (multisynapse kontakter), påverkar γ-DGG likaså amplituden av alla EPSCs (figur 5A vänster, E-G). I motsats till γ-DGG, DNQX som är en hög affinitet, långsam separera AMPA/kainate-receptorantagonist orsakar en enhetlig minskning över alla stora och små amplitud EPSCs ()figur 5 H-J). Känsligheten för γ-DGG och DNQX kan kvantifieras som förhållandet mellan den genomsnittliga EPSC amplituden dividerat med maximalt (genomsnittet av de största 20 EPSCs) EPSC amplitud ()figur 5 K, L).

Figure 5
Figur 5: använda γ-DGG sond multivesicular release. (A) scheman som illustrerar två modeller av mångfald. Vänster: temporal summering av uniquantal överföring som mål oberoende populationer av postsynaptiska receptorer. Stora och små EPSCs uppnås genom en liknande glutamat koncentration i den synaptiska spalten och därför är lika känsliga för γ-DGG. Höger: multiquantal överföring som mål en överlappande befolkning av postsynaptiska receptorer. Stora EPSCs orsakas av högre glutamat koncentration i kluven än mindre sEPSCs och är därför mindre känsliga för γ-DGG. Värden som visas längst ned i modellen är hypotetiska relativa amplituder. (B) prov spår från en inspelning där det fanns en ökning i genomsnittlig sEPSC amplitud efter 4-AP ansökan (4-AP responder). (C) kumulativ tomt för EPSC amplitud för inspelningen visas i (B). (D) kumulativ tomt för normaliserade EPSC amplitud (EPSC/EPSCMAX) före och efter tillämpning av γ-DGG från inspelningen visas i (B). (E) provet spår från en inspelning där fanns det ingen förändring i genomsnittlig sEPSC amplituden efter 4-AP program (4-AP non-responder). (F), kumulativ EPSC amplitud för inspelningen visas i (E). (G), kumulativ EPSC/EPSCMAX tomt för inspelningen visas i (E). (H) provet spår från en inspelning från baseline samt efter 4-AP och DNQX tillämpning. (jag) den kumulativa EPSC amplitud för inspelningen visas i (H). (J) kumulativ EPSC/EPSCMAX Rita för inspelningen visas i (H). (K) Sammanfattning av medelvärdet EPSC/EPSCMAX efter γ-DGG (i 4-AP responder och icke-responder grupper) eller DNQX ansökan normaliserade till pre-γ-DGG/DNQX (dvs. post-4-AP). (L) tomter av post-4-AP menar EPSC amplitud (normaliserad till pre-4-AP) mot post-γ-DGG/DNQX medelvärde EPSC/EPSCMAX (normaliserad till post-4-AP). P < 0,005. Denna siffra har ändrats från figur 4 i vår föregående rapport6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Styrkan av synaptisk transmission kan övergående ökas med skurar av synaptisk aktivitet. För att undersöka multiplicity mer fysiologiska villkor, kan afferent stimulering användas för att öka aktionspotential bränning och släppa sannolikheten. Om multipliciteten är närvarande, bör afferent stimulering orsaka en kort ökning EPSC amplituden (figur 6A-D). Om multiplicity inte är närvarande, ökar inte verksamhet drivs ökar i aktionspotential bränning EPSC amplituden.

Figure 6
Figur 6: högfrekvent stimulering avslöjar synaptic multiplicity. (A) provet spår av sEPSCs före och efter afferenta synaptic stimulering. (B) handlingen i sEPSC amplitud före och efter synaptic stimulering (20 Hz, 2 s) från inspelningen visas i (A). (C, D) Sammanfattning av sEPSC frekvens (C) och amplitud (D) ändringar synaptic stimulering. P < 0,001, * P < 0,05. Denna siffra har ändrats från figur 5 i vår föregående rapport6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En viktig förutsättning för en framgångsrik patch clamp elektrofysiologi experiment är att få friska skivor/celler. Våra beskrivna protokollet är optimerad för hypotalamus skivor som innehåller PVN nervceller. Andra hjärnan områden kan kräva modifierade lösningar och skivning metoder21,22,23,24. För inspelning, är det viktigt att bara acceptera stabil inspelningar genom att ständigt övervaka Cellegenskaper såsom membran motstånd, kapacitans och tillgång till motstånd. En ökning av tillgång motstånd kan minska EPSC amplitud och därför förbrylla amplitud mätningar. Därför ignoreras celler med tillgång Motståndsvärden som överstiger 20 MΩ eller öka med mer än 20% under inspelning. Likaså en minskning i (eller låg) membran motstånd kan resultera i dålig utrymme-klämma och, därför, kan minska amplituden. Nervceller i vår target-systemet (parvocellular PVN nervceller) har en hög membran motstånd mellan 500 MΩ och 1 GΩ, och vi kasta celler med membran motstånd under 500 MΩ. Kvalitetskontroll cut-off bör fastställas för vissa typer av nervceller under studien. Eftersom protokollet bygger på skillnaden i amplituden före och efter läkemedelsansökningar, är det viktigt att säkerställa att amplituden förändringen beror på programmet drog och inte till ändringarna i membran motstånd och tillgång motstånd. Hypotalamus nervceller studerar vi i detta protokoll är liten i storleken (cell kapacitans är cirka 15 pF i möss och membran motstånd är cirka 1 GΩ), och K-glukonat baserat intern lösning fungerar väl för att få hög kvalitet EPSCs/IPSCs6,25 . För nervceller med större Cellstorlek och låg Ingångsmotstånd, kan cesium baserat inre lösning användas för att säkerställa en bra utrymme-klämma2.

Ett specifika krav för att använda denna metod för att mäta mångfald är att cellerna eld ett tillräckligt antal spontana handlingspänningar för att jämföra aktionspotential-beroende händelser till mEPSCs. Detta kan säkerställas genom att jämföra skillnaden i frekvens av EPSCs i frånvaro och närvaro av TTX och Cd2 +. I hypotalamus skivor som innehåller PVN, har vi funnit att tillämpningen av 4-AP är effektivt att framkalla aktionspotential bränning. En annan metod, uppfunnen av Hsia och kollegor2, använder hög Ca2 + aCSF att öka aktionspotential bränning, snarare än 4-AP. Även denna metod var framgångsrik i hippocampus skivor, vi fann att den höga Ca2+ var mindre effektiva än 4-AP att underlätta aktionspotential bränning i hypotalamus skivor6. Det har faktiskt visat att hög, extracellulär Ca2 + koncentration minskar inneboende retbarhet av neuron och axoner genom att ändra Na+ konduktans26,27. Detta kan förklara varför det i vissa skivor, inte är effektiva för att öka EPSC frekvensen hög Ca2 + aCSF.

En begränsning med denna metod, som är inneboende i alla segment patch clamp elektrofysiologi, är att många, långväga prognoser till de postsynaptiska neuronerna skärs i slice preparat. För att observera handlingspänningar, är det troligt att de presynaptiska axoner och cell organ behöver bevaras i segmentet. Därför är multiplicity mätningen skev till synaptic anslutning som bevaras inom segmentet. Längs samma linje, kan riktningen av skivning orsaka vissa populationer av projektioner bevaras medan andra är avhuggna28. Dessa begränsningar har en allmän effekt av underskatta multiplicityen av afferenta ingångar.

Protokollet beskrivs ger en metod för att uppskatta graden av synaptic multiplicityen över alla ingångar till en given neuron. Andra elektrofysiologi tekniker, såsom Parade inspelningar eller minimal stimulans av en enda axon kan identifiera om en viss anslutning har flera kontakter, men dessa experiment är ofta svåra och inte möjligt i alla system. Ytterligare, de kan inte ge en övergripande indikation av organisationen av alla indata till en given neuron som de bara isolera ett par av nervceller. Detta protokoll använder grundläggande patch-clamp elektrofysiologi metoder för att utvärdera graden av multiplicityen över alla ingångar till en given neuron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja

Acknowledgments

J.S. fick Ontario Graduate stipendium. W.I. fått en ny utredare Fellowship från Mental Health Research Kanada. Detta arbete stöds av administrationsbidrag till W.I från naturvetenskap och Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) och kanadensiska Institutet för hälsoforskning (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3, (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79, (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17, (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333, (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77, (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596, (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70, (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124, (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8, (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250, (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71, (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213, (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8, (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32, (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271, (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16, (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131, (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171, (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158, (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33, (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21, (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137, (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
Utvärdering av Synaptic Multiplicity använder hela-cell Patch-clamp elektrofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter