Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

Abstract

Dans le système nerveux central, une paire de neurones forment souvent des multiples contacts synaptiques et/ou sites de libération neurotransmetteur fonctionnelle (multiplicité synaptique). Multiplicité synaptique est plastique et change au cours du développement et dans les conditions physiologiques différentes, étant un facteur déterminant pour l’efficacité de la transmission synaptique. Ici, nous exposons les expériences pour estimer le degré de multiplicité des synapses se terminant sur un neurone postsynaptique donné à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë. Plus précisément, enregistrement de voltage clamp est utilisé pour comparer la différence entre l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs spontanées (sEPSCs) et les courants postsynaptiques excitateurs miniature (mEPSCs). La théorie derrière cette méthode est que des entrées afférentes qui présentent une multiplicité montrera sEPSCs grande, dépendante du potentiel d’action en raison de la sortie synchrone qui survient à chaque contact synaptique. En revanche, libération de potentiel d’action indépendante (qui est asynchrone) générera plus petite amplitude mEPSCs. Cet article décrit un ensemble d’expériences et d’analyses pour caractériser l’existence d’une multiplicité synaptique et traite les exigences et les limites de la technique. Cette technique peut être appliquée afin d’étudier comment différentes interventions comportementales, pharmacologiques ou environnementales en vivo affectent l’organisation des contacts synaptiques dans certaines zones du cerveau différentes.

Introduction

La transmission synaptique est un mécanisme fondamental pour la communication entre les neurones et donc fonction du cerveau. La transmission synaptique est aussi labile et peut changer son efficacité de manière dépendante de l’activité ainsi qu’en réponse à des signaux modulatory1. Ainsi, l’examen de la fonction synaptique a été un thème majeur de la recherche en neurosciences. Cellule entière patch clamp électrophysiologie est une technique polyvalente qui permet de comprendre, de concevoir des modèles expérimentaux et analyses de données, des mécanismes biophysiques et moléculaires approfondies de la transmission synaptique. Une approche couramment utilisée, peut-être en raison de la simplicité de la technique et le concept, est la mesure de courants postsynaptiques excitateurs/inhibiteur miniature (mE / CISP) sous la tension de la pince configuration2,3, 4 , 5 , 6. MPSC individuels représente le flux d’ions à travers des récepteurs ionotropiques postsynaptique (par exemple les récepteurs AMPA et GABAA ) en réponse à la fixation de leurs respectifs neurotransmetteurs libérés de la terminaison présynaptique 7 . Parce que l’enregistrement est obtenu en présence de la voltage-dépendants Na+ canal bloqueur tétrodotoxine (TTX), la libération est indépendant du potentiel d’action et comporte normalement une seule Vésicule synaptique qui contient des neurotransmetteurs. Selon cette hypothèse, l’amplitude moyenne du MPSC est employé couramment comme une estimation brute pour la taille quantique, qui représente le nombre et la fonctionnalité de récepteurs post-synaptiques s’opposant à un site de sortie du single. En revanche, la fréquence de la MPSC est considéré comme une combinaison du nombre de synapses se terminant sur la cellule postsynaptique et leur probabilité de sortie moyenne. Cependant, ces paramètres ne mesurent pas une autre variable-multiplicativity des synapses ou multiplicité synaptique — qui est important pour l’efficacité de la transmission synaptique.

Basé sur la théorie quantique de la transmission synaptique7,8,9, la force d’une connexion donnée entre une paire de neurones est tributaire de trois facteurs : le nombre de synapses fonctionnelles (N), le postsynaptique réaction à la publication d’une seule Vésicule synaptique (taille quantique ; Q) et la probabilité de la libération des neurotransmetteurs (P,r). Multiplicité de synaptique est équivalente à N. Le développement de la multiplicité synaptique ou l’élagage des synapses multiplicatifs est en plastique tout au long de l’élaboration et la maladie différents États3,4,6,10. Pour cette raison, caractérisant la multiplicité synaptique a des implications importantes pour la compréhension de l’efficacité de la transmission synaptique dans la santé et la maladie. Techniques, telles que la microscopie électronique peuvent d’identifier des preuves de structure synaptique multiplicité en détectant des contacts synaptiques multiples provenant de l’axone même sur le même neurone postsynaptique11,12, 13,14. Cependant, ces multisynapses structurellement identifiés peuvent être fonctionnellement silencieux15,16. Examen fonctionnel précis de N exige techniquement difficile des approches électrophysiologiques, tels que les enregistrements de cellules entières paires qui peuvent déterminer si une connexion donnée a plusieurs sites de rejet fonctionnelle et minimal approches de stimulation qui visent à recruter un seul axone putatif.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique en adoptant une méthode développée initialement par Hsia et al.,2. Cette technique consiste à mesurer la spontanée PSC (SLES SSP) et MPSC à l’aide d’électrophysiologie de cellules entières patch clamp, qui nous permet d’estimer le degré de multiplicité synaptique parmi toutes les entrées d’un neurone donné.  Tel que définie précédemment, synaptique multiplicité reflète le nombre de synapses entre un neurone donné en pré- et post-synaptiques. Si plusieurs synapses sont recrutés en même temps par un potentiel d’action, il y aura une forte probabilité de sommation temporelle des différents SSP (i.e. quantique), générant une plus grande amplitude CFP.  Dans les enregistrements de la mPSC (dans quels potentiels d’action sont bloqués par TTX), il est peu probable de sommation temporelle des individuels MPSC (non-synchrone). À l’aide de ce raisonnement, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude sPSC (avec libération de potentiel d’action-dépendante) à l’amplitude de la mPSC.

Pour déterminer l’existence d’une multiplicité, les auteurs décrivent quatre expériences et leurs analyses utilisant glutamatergique EPSCs comme exemple. Cependant, la même approche peut être utilisée pour le jeûne transmission GABAergique/glycinergic (CISP). Une brève justification de chaque expérience est décrite ci-dessous. Tout d’abord, comme expliqué ci-dessus, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude de sEPSCs à mEPSCs. Il existe deux conditions pour cette approche ; 1) présynaptiques axones doivent avoir un nombre suffisant de potentiels d’action pendant l’enregistrement, et 2) Pr doit être grande pour que plusieurs synapses libération neurotransmetteur à l’arrivée d’un potentiel d’action. Afin de répondre à ces exigences, sEPSCs sont pour la première fois en bas Ca2 + artificiel liquide céphalo-rachidien (aCSF) et ensuite enregistrées en présence d’une faible concentration de l’antagoniste des canaux K+ , 4-Aminopyridine (4-AP) pour augmenter l’action potentiel de tir et Pr. Puis, potentiel d’action tir est bloquée par la TTX et Pr diminué par un voltage-dépendants Ca2 + bloqueur des canaux Cd2 +. L’amplitude de sEPSCs (avec 4AP) est comparée à celle de Cpsem (avec 4AP, TTX et Cd2 +). Dans la seconde expérience, Ca2 + est remplacé par équimolaire Sr2 + dans le FSCA pour désynchroniser la libération des vésicules. Comme Ca2 + est nécessaire pour la version synchrone de vésicules, remplacement avec Sr2 + devrait éliminer le sEPSCs de grande amplitude qui témoignent de la multiplicité. En troisième lieu, mécaniquement, c’est la multiplicité peut résulter de multiples contacts synaptiques au même neurone postsynaptique ou libération multivésiculaires (c'est-à-dire plusieurs vésicules libérés au sein d’un même contact synaptique)17,18. Pour différencier les deux types de la multiplicité, la troisième expérience utilise une faible affinité, rapide dissociation antagoniste compétitif des récepteurs AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , afin de déterminer si grand sEPSC sont le résultat de la sommation temporelle des synapses indépendants ou libération multivésiculaires agissant sur une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques. Si les événements de grande amplitude résultent de la dissémination multivésiculaires, γ-DGG sera moins efficace pour inhiber les plus sEPSCs par rapport aux plus petits, tandis que le grand sEPSCs qui découlent de la sommation temporelle de plusieurs contacts synaptiques seront affectés de la même manière par Γ-DGG. Dans la quatrième expérience, une méthode plus physiologique est utilisée pour renforcer le potentiel d’action tir, à savoir afférente stimulation synaptique. Rafales de l’activité synaptique peuvent transitoirement augmentation/faciliter la probabilité de mise à feu et de la libération de potentiel d’action spontanée des afférences stimulées. Par conséquent, cette approche permet de multiplicité de manifester d’une manière plus physiologique.

Le protocole suivant décrit la méthode pour mener ces expériences en tissu hypothalamique de souris. Plus précisément, corticotropin libérant l’hormone (CRH) des neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) sont utilisés. Nous décrivons les procédures pour la conduite d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp et expliquer les expériences spécifiques pour tester la multiplicité synaptique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les expérimentations animales sont approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Western Ontario selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines (PUA #2014-031).

1. les solutions

  1. Solution de tranchage
    1. Référer au tableau 1 pour la composition de la solution de tranchage.
    2. Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
    3. Pour 1 x tranchage de solution, dissoudre NaHCO3, glucose et saccharose dans ddH2O et ajoutez le bouillon de 20 x. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 315-320 mOsm et conserver la solution pour pas plus de 1 semaine à 4 ° C.
    4. Remplir deux béchers de 100 mL de solution de tranchage et recouvrez-les de parafilm. Faites refroidir la solution dans un congélateur jusqu'à ce que la solution est partiellement congelée (environ 20 min dans le congélateur-80 ° C). À l’aide d’un tube de dispersion de gaz, bulle les deux béchers de tranchage solution avec 95 % O25 % CO2 pendant 20 min sur la glace.
Concentrations des dilutions (mM)
Tranchage FSCA normal Faible Ca2 + FSCA FSCA SR+ Pipette/interne
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0,5 2.5 0,5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1.25 1.25 1.25 1.25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
Glucose 25 10 10 10 -
Saccharose 75 - - - -
K-gluconate - - - - 116
Na-gluconate - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2-EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0,3

Tableau 1 : La composition des diverses solutions.

  1. aCSF (par tranche de restauration et d’entretien)
    1. Référer au tableau 1 pour la composition de l’aCSF.
    2. Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
    3. Pour 1 x aCSF, dissoudre NaHCO3 et glucose dans ddH2O et ajoutez le bouillon de 20 x. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 298-300 mOsm. Utiliser la solution sous 1 jour.
  2. aCSF (faible Ca2 + pour l’enregistrement)
    1. Référer au tableau 1 pour la composition de la bas Ca2 + FSCA.
    2. Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
    3. Pour 1 x faible Ca2 + aCSF, dissoudre NaHCO3 et glucose dans ddH2O et ajouter 20 x (CaCl2 et MgCl2 gratuit) stock, CaCl2 et MgCl2 à spécifié des concentrations. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 298-300. Utiliser la solution sous 1 jour.
  3. aCSF (Sr2 + pour l’enregistrement)
    1. Référer au tableau 1 pour la composition de la Sr2 + FSCA.
    2. Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
    3. Pour 1 x Sr2 + aCSF, dissoudre NaHCO3 et glucose dans ddH2O et ajouter 20 x (CaCl2 et MgCl2 gratuit) stock, LVERS2 et MgCl2 à spécifié des concentrations. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 298-300. Utiliser la solution sous 1 jour.
  4. Solution interne
    1. Référer au tableau 1 pour la composition de la solution interne de K-gluconate basé.
    2. Pour faire 20 mL de solution interne, ajouter 15 mL d’eau de qualité biologie moléculaire dans un tube de 50 mL. Effectuez les opérations suivantes sur la glace.
    3. Préparer les solutions suivantes avance à 1 M des concentrations stock en biologie moléculaire de l’eau de qualité. Ajouter (en mL) : 2.32 K-gluconate, gluconate-Na de 0,24, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 dans le tube de 50 mL.
    4. Ajouter 100 µL de 0,3 M Na3GTP.
    5. Peser 44,08 mg K2ATP dans un tube de microcentrifuge de 2 mL et ajouter 1 mL d’eau de qualité de la biologie moléculaire, puis ajouter au tube de 50 mL.
    6. Ajuster le pH à 7,2-7,4 avec 1 M KOH. Assurez-vous que l’osmolarité est entre mOsm 283-289.

2. préparation de la tranche

  1. Préparer les outils
    1. Versez 200 mL de FSCA dans le compartiment de récupération (construit à partir d’un bécher de 250 mL avec 4 puits et filet) et placer la chambre de récupération dans un bain d’eau (35 ° C).
    2. Couvrir la chambre avec un film de paraffine et bouillonner constamment le FSCA avec 95 % O25 % CO2 à l’aide d’un tube de verre dispersion pendant au moins 20 min.
    3. Se préparer pour la dissection en mettant en place les outils (bistouri, angle des ciseaux, forceps, pinceau fin, une cuillère en plastique).
    4. Remplissez une seringue de 60 mL avec environ 15 mL de la solution de tranchage glacée de l’étape 1.1.4.
    5. Préparer la plate-forme de dissection en plaçant un filtre en papier sur le couvercle d’une plaque bien.
    6. Préparer la chambre de tranchage en le plaçant dans le bac à glaçons et le bac de remplissage avec de la glace.
    7. Mettre en place le vibratome en obtenant une lame jetable dans le porte-lame.
    8. Faire une pipette de transfert en briser la pointe de la pipette Pasteur et en plaçant une poire en caoutchouc sur l’extrémité cassée.
  2. Disséquer le cerveau de souris
    1. Anesthésier l’animal dans une enceinte saturée avec 4 % isoflurane, jusqu'à ce que les réflexes spinaux sont absents.
    2. Décapiter l’animal à l’aide d’une guillotine et enlever rapidement le cerveau.
      1. Faire une incision médiane avec une lame de bistouri Swann-Morton n ° 22 de rostral de caudale.
      2. Latéralement, peler le cuir chevelu de chaque côté de la tête.
      3. Utilisation des ciseaux pour découper le crâne sur un côté de la caudale à rostrale (y compris du côté des os frontaux), utilisation attention ne pas d’endommager le cerveau.
      4. Utilisation de forceps pour soulever le morceau de crâne hors du cerveau et refroidir rapidement le cerveau avec 15 mL de solution de tranchage glacée à l’aide de la seringue de l’étape 2.1.4.
      5. Soulevez le cerveau dans le crâne.
      6. Place du cerveau dans l’un des béchers remplis d’une solution tranchage glacée (de l’étape 1.1.4) barboter avec 95 % O25 % CO2.
  3. Préparer des tranches de hypothalamus souris
    1. Bloquer le cerveau pour la zone du cerveau désirée et couper l’angle (par exemple, pour les tranches hypothalamiques coronales, couper le tissu rostral pour le chiasma optique et caudal de la protubérance à l’aide d’une lame et s’assurer que le bloc caudal a une surface perpendiculaire à la base du cerveau).
    2. À l’aide d’un morceau coupé de papier-filtre, ramasser le cerveau du côté antérieur et coller le côté postérieur de la plaque de retenue à l’aide de colle instantanée.
    3. Placer la plaque de retenue dans la chambre de tranchage et remplir la chambre de tranchage solution du bécher deuxième étape 1.1.4 rapidement.
    4. Fixer le plateau tranchage de chambre et de la glace sur le vibratome.
    5. Définir la zone de découpage en tranches (antérieure et postérieure du cerveau) et commencer à trancher 250 tranches coronales épaisseur de µm. Recommandé de paramètres : 0.10 mm/s, amplitude de vitesse 2 mm.
    6. Couper les tranches de la taille appropriée pour la zone du cerveau désirée.
    7. Récupérer les tranches à 35 ° C pendant 30-45 min. Ensuite, retirer la chambre de récupération du bain chauffant et laisser les tranches récupérer, à température ambiante pendant une 30 min supplémentaires, tranches de conserver à température ambiante pendant le reste de la journée et continuer à bouillonner la baignoire sans cesse à 95 % O25 % CO2 .

3. whole-cell Patch ClampRecording

  1. Tirez sur les pipettes
    1. Selon les paramètres suggérés pour la cellule entière d’enregistrement du manuel de l’extracteur de pipette, tirer des pipettes de patch de verre paroi épaisse à une résistance de pipette de MΩ 3-5.
    2. À l’aide d’une microseringue (commercial ou maison), remplir un embout de la pipette avec solution interne filtrée. À faire une microseringue, brûler le bout d’une seringue de 1 mL et laissez la pointe tombe en créant une amende longue tip.
  2. Obtenir la configuration de la cellule entière
    1. Placez la pipette d’enregistrement juste au-dessus de la pipette de tranche et le décalage actuel dans le mode de serrage de tension. Appliquez une légère pression positive à la pipette et verrouiller le robinet d’arrêt.
    2. Sélectionnez une cellule saine avec une membrane intacte et approche de la cellule avec la pipette. La pression positive devrait provoquer une légère perturbation dans les tissus (c.-à-d. une onde lente dans les tissus lors de la saisie).
    3. Lentement continuent de porter la pipette plus près à la cellule à l’aide d’un mouvement en diagonal jusqu'à ce que la pipette forme une petite fossette sur la surface de la cellule.
    4. Libérer le verrou de pression positive. La cellule va commencer à former un joint d’étanchéité et la résistance augmente au-dessus de 1 GΩ. Bride de tension, détiennent la cellule à -68 mV.
    5. Un peu de tirer à l’extérieur de la cellule en diagonale pour retirer les excès de pression de la cellule.
    6. Compenser la capacité de la pipette lents et rapides.
    7. Appliquer une brève aspiration à travers le tube relié à la titulaire de la pipette de briser la cellule et d’obtenir la configuration cellule entière.
    8. Passez en mode cellule sur la membrane test fenêtre dans une électrophysiologie d’acquisition de données et logiciel d’analyse (p. ex., Clampex).
    9. Avant chaque bride de tension d’enregistrement, effectuer un essai de membrane en utilisant le même logiciel et enregistrer les paramètres pertinents dans un livre de laboratoire (résistance de la membrane, accès résistance et capacité).
    10. Maintenir la température du bain enregistrement entre 27 et 30 ° C et le débit à 1,5 à 2,0 mL/min pour des expériences ultérieures.

4. la multiplicité des expériences

  1. Expérience 1 : estimation de la multiplicité à l’aide de 4-AP
    1. Bride de tension, détiennent la cellule à -68 mV. Utilisant le même logiciel, d’enregistrer les sEPSCs tout en perfusant le bain avec faible Ca2 + FSCA. Enregistrement pour au moins 5 min après le début de la configuration de la cellule entière pour assurer un enregistrement de base stable, comme l’activité synaptique peut être élevée, peu de temps après la percée de la membrane.
    2. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 4-AP pour le FSCA et bain appliquez 30 µM 4-AP. notice sEPSCs pendant au moins 10 min obtenir l’effet de drogues complet.
    3. Ajouter 0,5 µM TTX et 10 µM Cd2 + pour le FSCA avec 4-AP et enregistrer les mEPSCs pendant au moins 10 min.
    4. Pour l’analyse hors ligne, utilisez le dernier 1 min de départ immédiatement avant l’application de 4-AP (en bas Ca2 + aCSF), les 10 min d’application 4-AP et la 10e min d’application TTX.
  2. Expérience 2 : désynchroniser la libération des vésicules à l’aide de Sr2 +
    1. Tout en perfusant le bain avec normal Ca2 + aCSF (le même que le FSCA bain) record sEPSCs pendant au moins 5 min.
    2. Passer de la normale Ca2 + FSCA et commencer perfusant Sr2 + aCSF (de l’étape 1.4) et sEPSCs record.
    3. Pour l’analyse hors ligne, afin de déterminer si les sEPSCs de grande amplitude sont dus au rejet synchrone de vésicules, comparer les dernières min 1 de base (chez FSCA normale) à la minute deth 10 d’application Sr2 + FSCA.
  3. Expérience 3 : tester à l’aide de libération multivésiculaires Γ- DGG
    1. En bas Ca2 + FSCA record sEPSCs pendant au moins 5 min.
    2. Ajouter 4-AP de 30 µM pour le FSCA grâce au système de perfusion. SEPSCs record pendant au moins 10 min.
    3. Ajouter 200 µM γ-DGG pour le FSCA avec 4-AP et noter la sEPSCs pendant au moins 10 min.
    4. Comme une expérience de contrôle dans une cellule séparée, effectuez les étapes 1-3 mais s’appliquent à une faible concentration (125 nM) de DNQX au lieu de γ-DGG.
    5. Pour l’analyse hors ligne, analyser les dernières min de chaque demande de drogue.
  4. Expérience 4 : Stimuler les entrées afférentes afin d’accroître le potentiel d’action tir.
    1. SEPSCs record en normal Ca2 + FSCA.
    2. Stimuler les afférences à l’aide d’une électrode de verre monopolaire remplie de FSCA à raison de 20 Hz pour 2 s et répéter 10 fois avec un intervalle entre rafale de 20 sec.
    3. Pour analyse, utilisez les 5 000 ms avant le premier stimulus comme référence et comparer aux 10-300 ms après le stimulus final et puis prendre la variation moyenne de l’amplitude et la fréquence de plus de 10 essais.

5. analyse

  1. Analyser les sEPSCs et mEPSCs à l’aide d’un programme qui détecte et analyse les courants synaptiques (par exemple, les logiciels d’analyse de la Mini).
    1. En utilisant ce logiciel, utilisez les paramètres de détection suggérée pour la détection EPSCs des récepteurs AMPA (ou GABA Receptor EPSCs si courants inhibitrices d’enregistrement).
    2. Utiliser la fonction d’analyse sans escale pour détecter les EPSCs dans l’enregistrement.
    3. Analyser manuellement chaque enregistrement afin de s’assurer que le programme est détecter avec précision chaque événement (par exemple, de s’assurer que les événements ne sont pas en manquer ou comptés deux fois).
    4. Exporter les données d’événement en le copiant dans le presse-papiers et le coller dans un logiciel de gestion de données (par exemple, Excel)
    5. Calculer la moyenne fréquence et/ou l’amplitude pour chaque traitement de la toxicomanie et d’effectuer des analyses statistiques pertinentes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le protocole ci-dessus décrit une méthode permettant d’utiliser électrophysiologie de germes entiers patch clamp pour examiner le degré de multiplicité synaptique, à l’aide de neurones hypothalamiques souris à titre d’exemple. Cette technique de préparation de tranche devrait produire des cellules viables en bonne santé qui n’ont pas une membrane gonflée ou noyau (Figure 1). Chaque étape du protocole est important pour la santé du tissu et la qualité des enregistrements.

Figure 1
Figure 1 : qui suit les tissus sains et malsains tranche préparation. Tranche de préparation d’électrophysiologie de le PVN sous le systeme optique contraste interférentiel différentiel à un grossissement de 40 x. Les flèches rouges indiquent les cellules saines, et les flèches noires indiquent les cellules malsaines. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 2 illustre le raisonnement permettant d’identifier la multiplicité synaptique à l’aide d’électrophysiologie de patch clamp. Multiplicité synaptique peut résulter d’un contact synaptique multiples entre une paire de neurones (àgauche de la Figure 2 a), ou par multivésiculaires communiqué sur un site donné synaptique (Figure 2 a droite). Dans ces deux situations, un potentiel d’action dans le neurone présynaptique provoquerait une réponse postsynaptique grande (sEPSC) en raison de la sommation temporelle de plusieurs événements synaptiques. Toutefois, en l’absence des potentiels d’action présynaptiques (par exemple en présence de TTX et Cd2 + bloquer Na+-dépendante et Ca2 +-dépendante potentiel d’action tir), la libération des neurotransmetteurs vésiculaire est asynchrone. Par conséquent, la réponse post-synaptique devient plus petite (Figure 2 b: AP-independent). Si deux neurones ne présentent pas de multiplicité (c.-à-d. n'ont qu’un seul communiqué de contact/no multivésiculaires synaptique) il n’y aura aucun différence dans la réponse post-synaptique entre la libération de potentiel d’action-dépendants et indépendants de potentiel d’action de neurotransmetteur (Figure 2).

Figure 2
Figure 2 : Diagramme schématique illustrant les conséquences de différentes organisations synaptiques sur courants postsynaptiques. (A, B) Dans une synapse avec multiplicité, un potentiel d’action et de l’autorité de certification qui s’ensuivie2 + afflux déclenche fusion synchrone de plusieurs vésicules synaptiques qui donnent lieu à grandes, multiquantal EPSCs. Multiplicité synaptique peut résulter de contact multisynapse ou multivésiculaires communiqué à une seule synapse (A). En présence de TTX et Cd2 +, la fusion des vésicules indépendante du potentiel d’action est asynchrone et provoque de petite uniquantal EPSCs (B). (C) dans les synapses sans la multiplicité, les potentiels d’action-indépendants et dépendants de la fusion des vésicules se traduit par uniquantal EPSCs. Ce chiffre a été modifié par 1 a Figure de notre précédent rapport6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans l’expérience 1, 4-AP est appliquée à la baignoire pour augmenter le potentiel d’action de tir et de probabilité de sortie. Pour vous assurer que 4-AP est en augmentation des potentiels d’action spontanée de tir, la fréquence des EPSCs peut être comparée entre sEPSCs et mEPSCs (Figure 3 a, C). Parce que les sEPSCs sont une combinaison d’événements les potentiels d’action-indépendantes et dépendantes, la différence dans la fréquence des sEPSC et Cpsem fait office de proxy pour le potentiel d’action spontanée de tir dans les axones présynaptiques. Nous utilisons une réduction arbitraire hors de > 15 % différence de fréquence entre sEPSC à Cpsem pour s’assurer qu’un nombre suffisant d’événements d’action potentiel-dépendants est présent pour l’analyse de la multiplicité. Si les EPSCs dans le Ca2 + état faible et l’état TTX (Cpsem) sont de même fréquence et amplitude (c'est-à-dire aucune action potentiel spontané de tir dans la condition2 + Ca faible), la différence entre le faibles Ca2 + base sEPSC et 4 -AP peut également être utilisé pour l’analyse de la multiplicité.

Dans l’exemple illustré à la Figure 3, 4-AP augmente l’amplitude et la fréquence des sEPSCs. Demande ultérieure de TTX et Cd2 + diminue l’amplitude et la fréquence. Comme indiqué ci-dessus, la différence dans l’amplitude entre sEPSCs et mEPSCs indique multiplicité synaptique. Dans les neurones hypothalamiques que nous examinons ici, l’amplitude et la fréquence de la ligne de base et les conditions TTX sont les mêmes (Figure 3, D), suggérant que les sEPSCs de base contiennent très peu EPSCs fonction du potentiel d’action. En conséquence, expériences subséquentes peuvent comparer la différence entre la base et 4-AP pour mesurer la multiplicité.

Figure 3
Figure 3 :. 4-AP application révèle la multiplicité synaptique. Échantillon (A) des traces de sEPSCs enregistrées en faible Ca2 + FSCA au cours de la ligne de base et après l’application de la 4-AP (30 μM) et ultérieur TTX (0,5 μM) et Cd2 + (10 μM) application. (B) la distribution d’amplitude de sEPSC de l’enregistrement indiqué au point A. (C, D) Sommaire de la fréquence moyenne (C) et (D) d’amplitude de référence (gris), 4-AP (rouge) et TTX + Cd2 + (bleu). P < 0,005, ** P < 0,01. Ce chiffre a été modifié par la Figure 2 de notre précédent rapport6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La méthode décrite ci-dessus permet d’estimer la multiplicité moyenne des synapses se terminant sur les neurones post-synaptiques : il peut ne pas détecter des changements dans la multiplicité qui se produisent qu’une faible proportion des synapses. Néanmoins, dans notre étude récente, cette méthode a révélé des changements dans la multiplicité des synapses de glutamate sur les neurones hypothalamiques entre normal et chroniquement a souligné conditions6.

Substitution de Ca2 + avec équimolaire Sr2 + dans le FSCA desynchronizes libération de potentiel d’action dépendante du neurotransmetteur vésicules 19, 20. Par conséquent, si les sEPSCs de grande amplitude sont la somme de la libération des neurotransmetteurs vésiculaire synchronisée fonction du potentiel d’action (c'est-à-dire la multiplicité), remplaçant Ca2 + avec Sr2 + va diminuer l’amplitude de EPSCs. Comme on le voit dans la Figure 4, Sr2 + FSCA diminue la proportion d’événements de grande amplitude (Figure 4 b) et en conséquence diminue l’amplitude moyenne (Figure 4). Lorsque les cellules ne présentent pas de multiplicité, desynchronizing la libération des vésicules n’aura aucun effet sur l’amplitude de l’EPSC.

Figure 4
Figure 4 : Sr2 + desynchronizes grands événements multiquantal. (A) comparaison de trace représentative entre normal Ca2 + FSCA et Sr2 + FSCA. SR2 + FSCA desynchronizes la libération des vésicules et diminue l’amplitude des événements synchrones multiquantal comme on le voit dans une distribution d’amplitude représentatif (B) et le changement d’amplitude pour toutes les cellules (C) * P < 0,05. Ce chiffre a été modifié de la Figure 3 de notre précédent rapport6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Γ-DGG, un antagoniste compétitif dissociation rapide des récepteurs AMPA, peut être utilisé pour déterminer si la multiplicité est due à la libération multivésiculaires ou plusieurs contacts synaptiques. Comme libération multivésiculaires agit sur une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques, la grande amplitude EPSCs implique la mise en commun du glutamate dans la fente synaptique. En d’autres termes, la concentration de glutamate dans la fente synaptique est supérieure à celui qui résulte de la libération uniquantal. En revanche, les contacts multisynaptic aurait uniquantal EPSCs sur chaque site synaptique. Si la grande amplitude EPSCs résulter de la dissémination multivésiculaires, les plus grandes EPSCs seront moins touchés par l’antagonisme de la γ-DGG (due à la plus forte concentration de glutamate) par rapport à la plus petite amplitude EPSCs (Figure 5 a droite, B-D). Si la grande amplitude EPSCs résultent de la sommation de synchrone uniquantal EPSCs (multisynapse contacts), γ-DGG touchera de la même façon l’amplitude de tous les EPSCs (Figure 5 a gauche, E.-g.). Contrairement à la γ-DGG, DNQX qui est une grande affinité, lente dissociation antagoniste des récepteurs AMPA/kainate provoque une diminution uniforme dans l’ensemble de toutes les grande et petite amplitude EPSCs ()Figure 5 H-J). La sensibilité à la γ-DGG et DNQX peut être quantifiée comme le rapport entre l’amplitude moyenne de EPSC divisé par la valeur maximale (la moyenne des plus grandes 20 EPSCs) amplitude EPSC ()Figure 5 K, L).

Figure 5
Figure 5 : à l’aide de γ-DGG pour sonder la libération multivésiculaires. (A) schémas illustrant deux modèles de la multiplicité. A gauche : sommation temporelle de transmission uniquantal qui cible les populations indépendantes de récepteurs post-synaptiques. EPSCs petits et grands sont atteints par une concentration similaire de glutamate dans la fente synaptique et donc sont également sensibles à la γ-DGG. A droite : transmission multiquantal qui cible une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques. Grands EPSCs sont causées par la plus forte concentration de glutamate dans la fente que sEPSCs plus petits et sont donc moins sensibles aux γ-DGG. Valeurs indiquées au bas du modèle sont les amplitudes relatives hypothétiques. Échantillon (B) les traces d’un enregistrement dans lequel il y avait une augmentation de l’amplitude moyenne sEPSC après application 4-AP (répondeur 4-AP). (C) terrain cumulative pour amplitude EPSC pour l’enregistrement indiqué au point B. (D) le terrain Cumulative pour normalisé amplitude EPSC (EPSC/EPSCMAX) avant et après application de γ-DGG de l’enregistrement indiqué au point B. Échantillon (E) les traces d’un enregistrement où il n’y avait aucun changement dans l’amplitude moyenne sEPSC suite 4-AP application (non-répondeur 4-AP). (F) cumulatif EPSC amplitude pour l’enregistrement indiqué dans (E). (G), Cumulative EPSC/EPSCMAX terrain d’inscription figurant (E). Échantillon (H) les traces d’un enregistrement de base, ainsi qu’après 4-AP et l’application DNQX. (I) l’EPSC cumulative amplitude d’inscription indiquée à l’alinéa H. (J), Cumulative EPSC/EPSCMAX terrain d’inscription indiquée à l’alinéa H. (K) résumé de moyenne EPSC/EPSCMAX après γ-DGG (en 4-AP répondeur et groupes non-répondeur) ou application DNQX normalisé au pré-γ-DGG/DNQX (c'est-à-dire post-4-AP). (L) parcelles de post-4-AP signifient amplitude EPSC (normalisé à 4-pré-AP) contre post-γ-DGG/DNQX moyenne EPSC/EPSCMAX (normalisée à post-4-AP). P < 0,005. Ce chiffre a été modifié de la Figure 4 de notre précédent rapport6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

L’intensité de la transmission synaptique peut être transitoirement augmentée par salves de l’activité synaptique. Pour étudier la multiplicité des conditions physiologiques plus, stimulation afférente peut servir à augmenter le potentiel d’action tir et probabilité de sortie. Si la multiplicité est présente, stimulation afférente doit provoquer une brève augmentation de l’amplitude de l’EPSC (Figure 6 a-D). Si la multiplicité n’est pas présente, activité piloté par des augmentations dans les potentiels d’action tir n’augmentera pas l’amplitude de l’EPSC.

Figure 6
Figure 6 : la stimulation haute fréquence révèle la multiplicité synaptique. Échantillon (A) des traces de sEPSCs avant et après stimulation synaptique afférente. (B) parcelle de sEPSC amplitude avant et après stimulation synaptique (20 Hz, 2 s) de l’enregistrement indiqué au point A. (C, D) Résumé de la fréquence de sEPSC (C) et les changements d’amplitude (D) après stimulation synaptique. P < 0,001, * P < 0,05. De la Figure 5 de notre précédent rapport6, ce chiffre a été modifié. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Une condition importante pour une expérience d’électrophysiologie de pince patch réussie est d’obtenir des tranches/cellules saines. Notre protocole décrit est optimisé pour les tranches hypothalamiques qui contiennent les neurones PVN. Autre cerveau peuvent exiger des zones modifiées solutions et méthodes tranchage21,22,23,24. Pour l’enregistrement, il est essentiel pour n’accepter les enregistrements stables en surveillant constamment les propriétés de la cellule tels que la résistance de la membrane, accès et la capacité de résistance. Une augmentation de résistance de l’accès peut diminuer l’amplitude de l’EPSC et confondre donc les mesures de l’amplitude. En conséquence, les cellules avec des valeurs de résistance des accès qui dépassent 20 MΩ ou augmentent de plus de 20 % au cours de l’enregistrement sont ignorées. De même, une diminution en (ou une faible) résistance de la membrane peut entraîner espace pauvre-pince et, par conséquent, peut diminuer l’amplitude. Les neurones de notre système de cible (neurones PVN parvocellulaies) ont une résistance élevée membrane entre 500 MΩ et 1 GΩ, et nous les détruisons les cellules avec des résistances de la membrane inférieure à 500 MΩ. Seuils de contrôle de la qualité doivent être établies pour des types spécifiques de neurones à l’étude. Comme ce protocole repose sur la différence dans l’amplitude, avant et après les applications de drogue, il est important de s’assurer que le changement d’amplitude est due à la demande de drogue et pas aux changements de la résistance de la membrane et accès. Les neurones hypothalamiques nous étudions dans ce protocole sont de petites taille (capacité de la cellule est environ 15 pF chez les souris et résistance de la membrane est autour de 1 GΩ) et K-gluconate basé solution interne fonctionne bien pour obtenir la haute qualité EPSCs/CISP6,25 . Pour les neurones avec la plus grande taille de la cellule et une faible résistance d’entrée, solution interne de césium fondé peut servir pour assurer une bonne serre-espace2.

Une exigence spécifique de l’utilisation de cette méthode pour mesurer la multiplicité, c’est que les cellules déclenchent un nombre suffisant de potentiels d’action spontanées afin de comparer le potentiel d’action dépendante des événements à mEPSCs. Cela peut être assurée en comparant la différence dans la fréquence des EPSCs en absence et en présence de TTX et Cd2 +. Dans les tranches hypothalamiques qui contiennent le PVN, nous avons constaté que l’application de 4-AP est efficace pour provoquer le déclenchement du potentiel d’action. Une autre méthode, mise au point par2Hsia et ses collègues, utilise haute Ca2 + FSCA pour augmenter le potentiel d’action de tir, au lieu de 4-AP. Même si cette méthode réussit à tranches d’hippocampe, nous a révélé que le haut Ca2+ était moins efficaces que la 4-AP en facilitant le potentiel d’action tir en tranches hypothalamique6. En effet, il a été démontré que Ca2 + concentration élevée, extracellulaire diminue intrinsèque excitabilité des neurones et des axones en altérant Na+ conductance26,27. Ceci peut expliquer pourquoi dans certaines tranches, Ca2 + FSCA élevé n’est pas efficace pour augmenter la fréquence de l’EPSC.

Une des limites de cette méthode, qui est inhérente à tous les électrophysiologie de serrage patch tranche, sont que beaucoup, à longue distance des projections aux neurones post-synaptiques sont coupées dans des préparations de tranches. Afin d’observer les potentiels d’action, il est probable que les axones présynaptiques et les corps cellulaires doivent être préservés dans l’écaille. Par conséquent, la mesure de la multiplicité est biaisée à la connectivité synaptique qui est conservée dans la tranche. Dans la même veine, la direction de tranchage peut provoquer certaines populations des projections à être conservée tandis que d’autres sont sectionnés28. Ces limitations ont un effet général de sous-estimer la multiplicité des entrées afférentes.

Le protocole décrit fournit une méthode pour estimer le degré de multiplicité synaptique à travers toutes les entrées d’un neurone donné. Autres techniques d’électrophysiologie, telles que des enregistrements appariés ou stimulation minimale d’un seul axone peuvent déterminer si une connexion donnée a plusieurs contacts, mais ces expériences sont souvent difficiles et n’est pas possible dans tous les systèmes. En outre, ils ne peut pas donner une indication globale de l’organisation de toutes les entrées d’un neurone donné comme ils isolent seulement une paire de neurones. Le présent protocole utilise des méthodes d’électrophysiologie de patch-clamp de la base pour évaluer le degré de multiplicité dans l’ensemble de toutes les entrées d’un neurone donné.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

J.S. a reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario. W.I. a reçu une nouvelle bourse de chercheur de recherche en santé mentale du Canada. Ce travail est soutenu par les subventions de fonctionnement à Florian de Sciences naturelles et génie conseil de recherches du Canada (06106-2015 RGPIN) et l’Institut canadien de recherche en santé (PJT 148707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Tags

Neurosciences numéro 146 électrophysiologie patch-clamp de la cellule entière ex vivo la transmission synaptique gain synaptique multiplicité noyau paraventriculaire de l’hypothalamus la corticotropin-releasing hormone l’hypothalamus
Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunstrum, J. K., Inoue, W.… More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter