Neuroscience

全细胞膜片电生理方法对突触倍数的评价

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59461

¹Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, ²Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, ³Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

Summary

在这里, 我们提出了一个评估功能突触多样性的方案, 使用全细胞膜片夹具电生理学在急性脑片。

Abstract

在中枢神经系统中, 一对神经元通常形成多个突触触点和/或功能神经递质释放位点 (突触多样性)。突触多样性是可塑性的, 在整个发育过程中和不同的生理条件下都会发生变化, 是突触传递效果的重要决定因素。在这里, 我们概述了实验, 以估计多度突触终止到特定的突触后神经元使用全细胞膜片钳电生理学在急性脑片。具体而言, 电压夹具记录用于比较自发兴奋突触后电流 (sEPSCs) 和微型兴奋突触后电流 (mEPSCs) 的振幅之间的差异。这种方法背后的理论是, 由于在每个突触接触中发生的同步释放, 表现出多样性的传入输入将显示出巨大的、作用潜力相关的 sEPSCs。相反, 与动作电位无关的释放 (异步) 将产生较小的振幅 mEPSCs。本文概述了一组实验和分析, 以表征突触多样性的存在, 并讨论了该技术的要求和局限性。这项技术可用于研究不同的行为、药理或环境干预如何影响不同大脑区域突触的组织。

Introduction

突触传递是神经元之间沟通的基本机制, 因此也是大脑功能的基本机制。突触传输也是不稳定的, 可以改变其疗效在活动依赖的方式, 以及在对模块信号1的反应^.因此, 检查突触功能一直是神经科学研究的重点。全细胞膜片钳电生理学是一种多功能的技术, 使我们能够了解, 通过设计实验设计和数据分析, 深入的生物物理和分子机制的突触传输。一个常用的方法, 也许是由于简单的技术和概念, 是测量微型兴奋器-抑制后电流 (me/ipsc) 下的电压夹配置 2^,³^,^{4 个}^,⁵^,⁶. 单个 Mpsc 代表离子通过突触后电离受体 (如 AMPA 和 gaba a 受体) 的流动, 以响应从突触端子释放的各自神经递质的结合⁷.因为记录是在电压门控 na⁺通道阻滞剂河豚毒素 (ttx) 的存在下获得的, 所以释放是与作用电位无关的, 通常涉及一个包含神经递质的单突状囊泡。基于这一假设, Mpsc 的平均振幅被广泛用作量子大小的粗略估计, 它表示相对于单个释放位点的突触后受体的数量和功能。另一方面, Mpsc 的频率被认为是终止于突触后细胞的突触总数及其平均释放概率的组合。然而, 这些参数并不测量突触的另一个可变乘法, 或突触多样性--这对突触传递的有效性很重要。

根据突触传递的量子理论⁷^,⁸,⁹, 一对神经元之间给定连接的强度取决于三个因素: 功能突触 (n) 的数量,突触后对单个突触囊的释放反应 (量子大小;Q) 和神经递质释放的概率 (p_r)。突触多样性相当于n。突触多样性的发展或乘法突触的修剪是塑料的整个发展过程中, 处于不同的疾病状态³^,⁴^,⁶^,¹⁰。因此, 描述突触多样性对了解突触传播在健康和疾病中的有效性具有重要意义。电子显微镜等技术可以通过检测来自同一轴突到同一突触后神经元 11^,12 的多个突触触点来识别突触多样性的结构证据^, ¹³^,¹⁴。然而, 这些结构上标识的多突触可以功能上静默¹⁵^,¹⁶。对 n 进行精确的功能检查需要技术上具有挑战性的电生理方法, 例如配对的全细胞记录, 可以确定给定的连接是否具有多个功能释放位点和最小值刺激方法, 旨在招募一个单一的假定轴突。

在这个协议中, 我们描述了一种简单的方法, 通过采用最初由 Hsia 等人2开发的方法来估计突触多样性。这项技术包括测量自发 psc (Spsc) 和 Mpsc 使用全细胞膜片夹电生理学, 这使得我们能够估计整个输入到给定神经元的突触多样性的程度。如前所述, 突触多样性反映了给定突触前和突触后神经元之间的突触数。如果多个突触被一个动作电位在同步中吸收, 那么单个 (即量子) Psc 的时间总和的概率就很高, 从而产生更大的振幅 PSC。在 mPSC 记录 (其中动作电位被 TTX 阻塞) 中, 单个 (非同步) Mpsc 的时间总和概率较低。利用这一原理, 可以通过将 sPSC 振幅 (与动作电位相关释放) 与 mPSC 振幅进行比较来估计突触多样性。

为了检验多样性的存在, 我们描述了四个实验及其分析, 以谷氨酸 Epsc 为例。然而, 同样的方法也可用于快速 Gabaergic/糖化反应 (Ipsc)。下面介绍了每个实验的简要原理。首先, 如上所述, 突触多样性可以通过比较 sEPSCs 的振幅和 mEPSCs 来估计。此方法有两个要求;1) 突触前轴突必须在记录过程中发射足够数量的动作电位, 2) p r必须很高, 以便多个突触在动作电位到达时释放神经递质。为了满足这些要求, sEPSCs 首先记录在低 Ca^{2 +}人工脑脊液 (aCSF) 中, 然后记录在低浓度的 k⁺通道拮抗剂, 4-氨基吡啶 (4-ap) 的存在下, 以增加作用潜在的发射和p r。然后, 动作电位射击被 TTX 阻断, Pr 被电压门控 Ca2⁺通道阻滞剂 cd^{2 +}所减少。将 sEPSCs 的振幅 (与 4AP) 与 mEPSC 的振幅 (与4AP、TTX 和 Cd^{2 +}) 进行比较。在第二个实验中, Ca^{2 +}被 Csf 中的等光 sr^{2 + 替换}, 以消除囊泡释放。由于囊泡同步释放需要 Ca^{2 +} , 因此用 sr^{2 + 替换}应消除指示多样性的大振幅 sEPSCs。第三, 机械上, 多样性可以导致多个突触接触到相同的突触后神经元或多囊释放 (即多个囊泡释放在一个单一的突触接触)¹⁷^,¹⁸。为了区分这两种类型的多样性, 第三个实验使用低亲和力, 快速离解竞争拮抗剂的 ampa-谷氨酰糖 (γ-dgg)¹⁷^,^{18, 以}确定是否大sEPSC 是独立突触或多囊释放的时间总和作用于突触后受体重叠种群的结果。如果大振幅事件产生于多泡释放, 与较小的 sEPSCs 相比, Γ-dgg 在抑制大方面的效果会更小, 而多个突触触点的时间总和所产生的大 sEPSCs 也会受到类似的影响, 也会受到类似的影响。Γ-dgg。在第四个实验中, 采用了一种更生理的方法来增强动作电位的激发, 即传入突触刺激。突触活动的爆发可以短暂地增加-促进受激传入的自发动作电位激发和释放概率。因此, 这种方法允许多样性以更多的生理方式表现出来。

下面的协议描述了在小鼠下丘脑组织中进行这些实验的方法。具体而言, 使用下丘脑 (PVN) 室旁核的促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 神经元。我们描述了进行全细胞膜片钳电生理学的程序, 并解释了测试突触多样性的具体实验。

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Protocol

所有动物实验均由西安大略大学动物护理委员会根据加拿大动物护理理事会指南 (AUP#2014-031) 批准。

1. 解决方案

切片解决方案
1. 有关切片解决方案的组成, 请参阅表 1 。
2. 提前准备20x 库存解决方案, 并将其存放在 4°c, 最长1个月。
3. 对于1x 切片液, 在 Ddh2o_中溶解 NaHCO 3、葡萄糖和蔗糖,并添加20x 库存。确保渗透度在315-320 平方米之间, 并在4°c 下将溶液存储不超过1周。
4. 用100毫升的切片溶液填充两个烧杯, 并用副体覆盖它们。将溶液冷却在冰柜中, 直到溶液部分冻结 (在-80°c 的冰柜中大约 20分钟)。使用气体分散管, 用 95% O2/5% co2 在冰上泡上 95%o2/5% co 2的切片溶液的两个烧杯20分钟。

	溶液浓度 (mM)
	切片	普通的 aCSF	低钙^{2 +} acsf	高级⁺ csf	皮普特/内部
Nacl	87	126	126	126	-
氯化钾	2。5	2。5	2。5	2。5	8
Ccl₂	0。5	2。5	0。5	-	-
SrCl₂	-	-	-	2。5	-
MgCl₂	7。	1。5	2。5	1。5	2
Nah2 po₄	1.25	1.25	1.25	1.25	-
纳赫科₃	25	26	26	26	-
葡萄糖	25	10	10	10	-
蔗糖	75	-	-	-	-
K-葡萄糖酸	-	-	-	-	116
纳葡萄糖酸酯	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4个
Na₃gtp	-	-	-	-	0。3

表 1: 各种解决方案的组成。

aCSF (用于切片恢复和维护)
1. 有关 aCSF 的组成, 请参阅表 1 。
2. 提前准备20x 库存解决方案, 并将其存放在 4°c, 最长1个月。
3. 对于 1x aCSF, 在 Ddh2o_中溶解 Nhco₃和葡萄糖, 并添加20x 个库存。确保渗透性在298-300 平方米之间。在1天内使用该解决方案。
aCSF (用于录制^{的低 ca 2 +} )
1. 有关低 Ca^{2 +} acsf 的组成, 请参阅表 1 。
2. 提前准备20x 库存解决方案, 并将其存放在 4°c, 最长1个月。
3. 对于1x 低 Ca^{2 +} acsf, 在 ddh2o 中溶解 NaHCO₃和葡萄糖, 并将 20X (ccl₂和 mgcl₂免费) 库存添加到规定的浓度.确保渗透性在298-300 之间。在1天内使用该解决方案。
特别基金 (Sr^{2 + 录音})
1. 有关高级^{2 +} csf 的组成, 请参阅表 1 。
2. 提前准备20x 库存解决方案, 并将其存放在 4°c, 最长1个月。
3. 对于 1x^{sr 2 +} acsf, 在 ddh_{2o 中}溶解 nahco₃和葡萄糖, 并在规定浓度下添加 20x (Ccl₂和 mgcl₂免费) 库存.确保渗透性在298-300 之间。在1天内使用该解决方案。
内部解决方案
1. 有关基于 k-葡萄糖酸的内部溶液的组成, 请参阅表 1 。
2. 为了使20毫升的内部溶液, 在50毫升管中加入15毫升的分子生物学级水。在冰上执行后续步骤。
3. 提前准备以下解决方案, 以达到分子生物学级水中的1M 库存浓度。加入 (毫升): 2.32 k-葡萄糖酸, 0.24 Na-gluconate, 0.24 Hepes, 0.24 KCl, 0.05 K2-egta, 0.24 MgCl₂至 50 ml 管。
4. 加入 100μl_{0.3 m na 3}gtp。
5. 在2毫升微离心管中称量 44点08千克 K 2 atp, 加入1毫升分子生物学级水, 然后加入 50 mL 管.
6. 使用 1 M KOH 将 pH 值调整为7.2-7.4。确保渗透性在 283-289 Mos 之间。

2. 切片制备

准备工具
1. 将200毫升的 aCSF 添加到回收室 (由一个250毫升的烧杯建造, 有4口井和网状), 并将回收室放置在水浴 (35°c) 中。
2. 用石蜡膜覆盖腔内, 并使用玻璃分散管, 使用 95% O2/5% co2不断将 aCSF 泡泡 20分钟.
3. 准备解剖设置的工具 (手术刀, 角度精细剪刀, 钳子, 精细油漆刷, 塑料勺子)。
4. 从步骤 1.1.4, 在60毫升注射器中加入大约15毫升的冰凉切片溶液。
5. 将滤纸放在井板盖上, 准备解剖平台。
6. 将切片室放入冰盘中, 然后在托盘中加冰, 以准备切片室。
7. 通过固定刀片支架中的一次性刀片来设置振动。
8. 通过打破巴斯德移液器的尖端并在破碎的端上放置橡胶灯泡, 制作转移移液器。
解剖鼠标脑
1. 将动物放在一个充满4% 异氟醚的腔中, 直到没有脊柱反射。
2. 用断头台斩首动物, 迅速切除大脑。
  1. 用22刀刀片做一个中线切口, 从左旋到尾端。
  2. 侧向去皮头部两侧的头皮。
  3. 使用精细的剪刀将头骨从尾骨切割到左旋 (包括额骨的一侧), 谨慎行事, 不要损害大脑。
  4. 使用钳子将颅骨从大脑中抬起, 并使用从步骤2.1.4 的注射器, 用15毫升的冰凉切片溶液快速冷却大脑。
  5. 把大脑从头骨里抬出来。
  6. 将大脑放入其中一个充满冰凉切片溶液的烧杯中 (从步骤 1.1.4), 泡泡95% 的 o 2/5%_co2。
准备小鼠下丘脑片
1. 阻止大脑所需的大脑区域和切割角度 (例如, 对于皮质下丘脑切片, 修剪组织与视神经痉挛和尾翼的子使用刀片, 并确保尾骨块有一个平面垂直于大脑的基础)。
2. 使用切割的滤纸, 从前侧拿起大脑, 用即时粘合将后侧粘在固定板上。
3. 快速将固定板放入切片室, 并在1.1.4 的步骤中, 用第二烧杯的切片溶液填充所述腔内。
4. 将切片室和冰盘固定在振动体上。
5. 定义切片区域 (大脑的前部和后部), 并开始切片250微米厚的冠状切片。推荐参数: 速度0.10 毫米, 振幅2毫米。
6. 根据所需的大脑区域, 将切片修剪到适当的大小。
7. 在35°c 下恢复切片30-45。然后, 从加热的浴池中取出回收室, 让切片在室温下再恢复 30分钟. 在室温下保持切片在室温下一天剩下的时间, 并继续用95% 的 O2/5% co2 不断地将浴池泡泡.

3. 全细胞贴片贴片记录

拉补丁移液器
1. 利用所建议的参数从移液器拉拔器手册中的整个细胞记录, 将贴片移液器从厚壁玻璃拉到 3-5 MΩ的移液器电阻。
2. 使用微型注射器 (商用或自制), 用过滤后的内部溶液填充移液器尖端。要制作微注射器, 请燃烧1毫升注射器的尖端, 并让尖端掉落, 形成一个长的细尖端。
获取整个单元配置
1. 将记录的移液器放在切片上方, 并在电压夹紧模式下偏移移液器电流。对移液器施加轻微的正压, 并锁定旋塞。
2. 选择具有完整膜的健康细胞, 然后用移液器接近细胞。正压应在组织中引起轻微干扰 (即进入时组织中的慢波)。
3. 慢慢地继续使用对角线运动使移液器更接近细胞, 直到移液器在细胞表面形成一个小酒窝。
4. 松开正压锁。电池将开始形成密封, 电阻将增加到 1 GΩ以上。在电压钳中, 将电池保持在-68 mV。
5. 对角线稍微远离电池, 以消除电池的多余压力。
6. 补偿快速和慢速的移液器电容。
7. 通过连接到移液器支架的管道进行短暂的吸力, 以突破电池并获得整个细胞的配置。
8. 在电生理学数据采集和分析软件 (例如, Clampex) 中切换到膜测试窗口上的电池模式。
9. 在每个电压钳记录之前, 使用相同的软件进行膜测试, 并将相关参数记录在实验室书籍中 (膜电阻、访问电阻和电容)。
10. 将记录浴的温度保持在 27–30°c, 将流量保持在 1.5–2.0 mL/min, 以便进行后续实验。

4. 多重实验

实验 1: 使用4-AP 估计多样性
1. 在电压钳中, 将电池保持在-68 mV。使用相同的软件, 记录 sEPSCs, 同时在浴缸中的灌注与低 Ca 2⁺ acsf。记录至少5分钟后开始整个细胞配置, 以确保稳定的基线记录, 因为突触活性可能是高后不久的膜突破。
2. 使用微移液器, 在 aCSF 中加入 4-AP, 并在浴缸中涂抹 30Μm 4-AP. 记录 sEPSCs 至少 10分钟, 以获得完整的药物效果。
3. 用4-AP 在 aCSF 中加入 0.5μm TTX 和 10μm Cd^{2 +}, 并将 mEPSCs 记录至少10分钟。
4. 对于离线分析, 请在应用4-AP 之前使用基准的最后 1分钟 (在低 Ca^{2 +} acsf 中)、4-ap 应用的10分钟和 ttx 应用的10分钟。
实验 2: 使用 Sr^{2 + 去}同步囊泡释放
1. 在用普通 Ca^{2 +} acsf (与浴缸 aCSF 相同) 对浴缸进行灌注时, 记录 sEPSCs 至少5分钟。
2. 从正常的 Ca^{2 +} acsf 切换, 开始完善 sr^{2 +} acsf (从步骤 1.4) 和记录 sEPSCs。
3. 对于离线分析, 要确定大振幅 sEPSCs 是否是由于囊泡的同步释放, 请将基线的最后 1分钟 (正常的 aCSF) 与 Sr 2⁺ acsf 应用的10分钟进行比较.
实验 3: 多泡释放试验γ-Dgg
1. 在低 Ca^{2 +} acsf 记录 sEPSCs 至少5分钟。
2. 通过灌注系统向 aCSF 中添加 30μm 4-AP。记录 sEPSCs 至少10分钟。
3. 用4-AP 将200Μm Γ-Dgg 添加到 aCSF 中, 并将 sEPSCs 记录至少10分钟。
4. 作为在单独的电池中进行的控制实验, 执行步骤 1-3, 但采用低浓度 (125 nM) 的 DNQX, 而不是Γ-dgg。
5. 对于离线分析, 请分析每个药物应用的最后一分钟。
实验 4: 刺激传入输入, 以增加动作电位发射。
1. 记录正常 Ca^{2 +} acsf 中的 sEPSCs。
2. 使用充满 aCSF 的单极玻璃电极以 20 Hz 的速度刺激传入, 并以20秒的突发间隔重复10次。
3. 为了进行分析, 请以第一次刺激前的 5, 000 毫秒作为基线, 与最后刺激后的10-300 毫秒进行比较, 然后在10次试验中采用平均振幅和频率变化。

5. 分析

使用检测和分析突触电流的程序 (例如, 迷你分析软件) 分析 sEPSCs 和 mEPSCs。
1. 使用该软件, 使用建议的检测参数检测 ampa 受体 Epsc (或 GABA 受体 Epsc, 如果记录抑制电流)。
2. 使用不间断分析功能检测录制中的 epsc。
3. 手动扫描每个记录, 以确保程序准确地检测每个事件 (例如, 确保事件不会被错过或计数两次)。
4. 通过将事件数据复制到剪贴板并将其粘贴到数据管理软件 (例如 excel) 来导出事件数据
5. 计算每种药物治疗的平均频率和/或振幅, 并进行相关的统计分析。

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Representative Results

上述协议描述了一种使用全细胞膜片钳电生理学的方法, 以小鼠下丘脑神经元为例, 检查突触多样性的程度。这种切片制备技术应产生健康的活细胞, 没有肿胀的膜或细胞核 (图 1)。协议中的每一步都对组织的健康和录音质量很重要。

图 1: 切片制备后的健康和不健康组织.在40x 放大倍率下, 在差分干涉对比度光学作用下对 PVN 进行切片电生理制备。红色箭头表示健康的细胞, 黑色箭头表示不正常的细胞。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2说明了使用膜片钳电生理学识别突触多样性的基本原理。突触多样性可以是一对神经元之间的多次突触 (左图 2 a), 也可能是在给定突触部位的多泡释放 (右图 2 a) 。在这两种情况下, 突触前神经元中的一个动作电位都会由于多个突触事件的时间总和而引起大的突触后反应 (sEPSC)。然而, 在没有突触前动作电位的情况下 (例如, 在 TTX 和 Cd^{2 +}的存在下阻止 na⁺依赖和 ca^{2 +}依赖动作电位的发射), 水泡神经递质释放是异步的。因此, 突触后响应变得更小 (图 2b: ap 无关)。如果两个神经元不表现出多样性 (即只有一个突触点/没有多泡释放), 突触后反应在突触后反应中的作用电位依赖和作用电位无关的释放之间将没有差异。神经递质 (图 2c)。

图 2:说明不同突触组织对突触后电流的影响的示意图.(A、 B)在具有多重性的突触中, 一个动作电位和随之而来的 Ca^{2 +}流入会触发多个突触囊的同步融合, 从而产生大型的多量子 epsc。突触多样性可能是由单突触 (A) 处的多突触接触或多囊释放引起的。在 TTX 和 Cd^{2 +}存在的情况下, 作用电位无关的囊泡融合是异步的, 会导致小的唯一性 Epsc (b)。(C) 在没有多样性的突触中, 作用电位依赖性和独立囊泡融合都会导致唯一性的 epsc。从我们上次报告⁶的图 1 a 中修改了这一数字。请点击这里查看此图的较大版本.

在实验1中, 将4-AP 应用于浴池, 以提高动作电位发射和释放概率。为确保4-AP 增加自发作用电位发射, 可在 sEPSCs 和 mEPSCs 之间比较 Epsc 的频率 (图 3A, c)。由于 sEPSCs 是作用电位相关事件和独立事件的组合, 因此 SEPSCs 和 mEPSC 频率的差异可作为突触前轴突中自发作用电位激发的代名词。我们使用任意切断一个 > 15% 的频率差异在 Pepsc 到 mEPSC, 以确保有足够数量的行动潜力相关的事件存在于分析多样性。如果低 Ca^{2 +}条件下的 EPSC 和 ttx (mepsc) 条件在频率和振幅上相似 (即低 ca^{2 +}条件下没有自发动作电位发射), 则低 Ca^{2 +}基线 sepsc 和4之间的差异-Ap 也可用于分析多样性。

在图 3所示的一个示例结果中, 4-ap 增加了 sEPSCs 的振幅和频率。TTX 和 Cd^{2 +}的后续应用降低了振幅和频率。如上所述, sEPSCs 和 mEPSCs 之间的振幅差异表示突触多样性。在下丘脑神经元中, 我们在这里检查, 基线和 TTX 条件的振幅和频率是相同的 (图 3C, d), 这表明基线 sEPSCs 包含很少的作用潜力相关的 epsc。因此, 随后的实验可以比较基线和4-AP 之间的差异, 以测量多样性。

图 3:. 4-AP 应用程序揭示了突触多样性.(A) 在基准期间, 以及在 4-ap⁽ 30μm) 应用以及随后的 Ttx (0.5μm) 和 cd 2 + 应用之后, 记录在低 ca 2 + Acsf中的 sEPSCs 样本痕迹。(B) 从 (a) 所示的记录中分布 sEPSC 振幅。(C, D)基线 (灰色)、4-AP (红色) 和 TTX + cd 2⁺ (蓝色) 之间的平均频率 (c) 和振幅 (d) 摘要。P < 0.005, * * P < 0.01。从我们上次报告⁶的图2中修改了这一数字。请点击这里查看此图的较大版本.

上述方法估计突触终止到突触后神经元的平均突触多样性: 它可能无法检测到发生在一小部分突触上的多样性的变化。然而, 在我们最近的研究中, 这种方法揭示了正常和长期紧张状态下丘脑神经元谷氨酸突触多样性的变化 6.

在 Csf 中用等高粒 sr^{2 +}取代血管泡 19 ^,20 的非同步作用电位依赖性释放.因此, 如果大振幅 sEPSCs 是作用电位依赖性的同步囊状神经递质释放 (即多样性) 的总和, 则用 Sr^{2 + 替换 ca 2 +}将降低 epsc 的振幅。如图 4所示, sr^{2 +} acsf 降低了大振幅事件的比例 (图 4b), 并因此降低了平均振幅 (图 4B)。当细胞不表现出多样性时, 去同步囊泡释放不会对 EPSC 振幅产生影响。

图 4:sr^{2 +}取消同步大型多量子事件.(A) 正常 ca^{2 +} Acsf 与 sr^{2 +} csf 之间的代表性跟踪比较。Sr^{2 +} acsf 脱同步囊泡释放, 降低多量子同步事件的振幅, 如具有代表性的振幅分布 (b) 和所有细胞的振幅变化 (c) * p < 0.05。从我们上次报告⁶的图 3中修改了这一数字。请点击这里查看此图的较大版本.

Γ-dgg 是 AMPA 受体的快速离解竞争拮抗剂, 可用于确定多重是由多囊释放还是多种突触。由于多泡释放作用于突触后受体的重叠种群, 大振幅 Epsc 涉及在突触裂隙中汇集谷氨酸。换句话说, 谷氨酸在突触裂隙中的浓度高于单位性释放引起的浓度。另一方面, 多突触点在每个突触点都会有唯一的 Epsc。如果大振幅 Epsc 产生于多泡释放, 则与较小振幅 epsc 相比, 较大的 Epsc 受Γ-dgg 拮抗作用 (由于谷氨酸浓度较高) 的影响较小 (图 5A 右, b-d)。如果大振幅 Epsc 是由于同步唯一性 Epsc (多突触点) 的总和, Γ-dgg 将同样影响所有 Epsc 的振幅 (图 5A 左, e-g)。与γ-dgg 相比, dnqx 是一种高亲和力, 缓慢离解的 ampax-kinate 受体拮抗剂会在所有大小振幅 epsc 中造成均匀下降(图 5h-j)。对γ-dgg 和 dnqx 的灵敏度可以量化为平均 epsc 振幅除以最大值 (最大的 20个 epsc 的平均值) epsc 振幅的比率 (图 5k, l)。

图 5: 使用Γ-dgg 探测多囊释放.(A) 说明两种多重模式的原理图。左: 针对突触后受体独立种群的唯一性传播的时间总和。大的和小的 Epsc 是通过类似的谷氨酸浓度在突触裂隙, 因此是同样敏感的Γ-dgg。右: 多量子传递, 针对突触后受体的重叠种群。大型 Epsc 是由裂隙中谷氨酸浓度高于较小的 sEPSCs 引起的, 因此对Γ-dgg 的敏感性较低。模型底部显示的值是假设的相对振幅。(B) 在4-ap 应用 (4-ap 响应器) 之后, 记录中平均 sEPSC 振幅增加的样本痕迹。(C) (b) 中显示的记录 EPSC 振幅的累积图。(D) 从 (b) 所示的记录中应用Γ-dgg 前后归一化 epsc 振幅 (epsc/epsc max) 的累积图.(E) 在4-ap 应用 (4-ap 无响应器) 之后, 记录的平均 sEPSC 振幅没有变化的记录的样本痕迹。(F) (e) 中显示的记录的累积 EPSC 振幅。(G) (e) 中显示的记录的累积 EPSC/EPSC_max图。(H) 基线记录中的样本痕迹, 以及4-ap 和 DNQX 应用后的样本痕迹。(I) (h) 所示记录的累积 EPSC 振幅。(J) (h) 中显示的记录的累积 epsc/epsc_max图。(K) 平均 Epsc/epsc max的摘要后, Γ-dgg (在4-ap 响应组和无响应组) 或 dnqx 应用归一化为前Γ-dg/dnqx (即后 4-ap)。(L) 后4-ap 的图均表示 epsc 振幅 (归一化到4-ap 前) 对Γ-Dg/q_qx后意味 epsc/epsc max (归一化到4-ap 后)。P < 0.005。从我们上次报告⁶的图 4中修改了这一数字。请点击这里查看此图的较大版本.

突触传递的强度可以通过突触活动的爆发来瞬时增加。为了研究更多生理条件下的多样性, 可以利用传入刺激来增加动作电位的激发和释放概率。如果存在多样性, 传入的刺激应导致 EPSC 振幅的短暂增加 (图 6a-d)。如果不存在多样性, 活动驱动的动作电位发射的增加将不会增加 EPSC 振幅。

图 6: 高频刺激揭示突触多样性.(A) 传出突触刺激前后的 sEPSCs 样本痕迹。(B) 突触刺激前后的 sEPSC 振幅图 (20 hz, 2秒) 来自 (a) 所示的记录。(C, D)突触刺激后的 sEPSC 频率 (C) 和振幅 (D) 变化摘要。P < 0.001, * P < 0.05。从我们上次报告⁶的图5中修改了这一数字。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

一个成功的膜片钳电生理学实验的一个重要要求是获得健康的切片细胞。我们描述的协议针对含有 PVN 神经元的下丘脑切片进行了优化。其他大脑区域可能需要修改溶液和切片方法²¹^,²²^{, 23,}²⁴^.对于录音来说, 只有通过不断监测电池特性 (如膜电阻、电容和访问电阻), 才能接受稳定的记录是至关重要的。访问电阻的增加会降低 EPSC 振幅, 从而混淆振幅测量。因此, 访问电阻值超过 20 MΩ或在记录过程中增加20% 以上的电池将被丢弃。同样, 膜电阻的降低 (或较低) 可能会导致空间夹具不足, 因此会降低振幅。我们目标系统中的神经元 (parvocellular PVN 神经元) 具有 500 MΩ和 1 GΩ之间的高膜电阻, 我们丢弃膜电阻低于 500 MΩ的细胞。应针对正在研究的特定类型的神经元建立质量控制截断。由于该协议依赖于药物应用前后振幅的差异, 因此必须确保振幅的变化是由于药物的应用, 而不是由于膜抗性和访问电阻的变化。我们在本协议中研究的下丘脑神经元体积小 (小鼠的电池电容约为 15 pf, 膜电阻约为 1 gω), 而 k-葡萄糖酸的内部解决方案效果很好, 可以获得高质量的 epscs/ipsc⁶^,²⁵.对于细胞大小较大、输入电阻较低的神经元, 可使用基于铯的内部解决方案, 以确保良好的空间夹²。

使用这种方法测量多样性的一个具体要求是, 细胞发射足够数量的自发动作电位, 以便将作用电位相关事件与 mEPSCs 进行比较。这可以通过比较在 TTX 和 Cd^{2 +}的存在和存在下 Epsc 频率的差异来确保这一点。在含有 PVN 的下丘脑切片中, 我们发现4-AP 的应用对激发动作电位发射是有效的。另一种由 Sia 和同事²首创的方法, 使用高 ca^{2 +} acsf 来增加动作电位发射, 而不是4-ap。虽然这种方法在海马切片中是成功的, 但我们发现, 高 Ca²+ 在促进下丘脑切片6中的动作电位发射方面的效率低于 4-ap.事实上, 已经证明, 高, 细胞外 caa^{2 +}浓度减少固有的兴奋性的神经元和轴突通过改变 na⁺电导 26^,²⁷。这或许可以解释为什么在某些切片中, 高 Ca^{2 +} acsf 不能有效地增加 epsc 频率。

这种方法的一个局限性是, 这是固有的所有切片膜片钳电生理学, 是许多, 长期预测突触后神经元在切片制剂。为了观察动作电位, 很可能需要将突触前轴突和细胞体保留在切片中。因此, 多重测量被倾斜到保存在切片中的突触连接。同样, 切片的方向可能导致某些投影种群被保留, 而另一些种群则被切断 28.这些限制具有低估传入输入多样性的一般效果。

所描述的协议提供了一种方法来估计在给定神经元的所有输入中突触多样性的程度。其他电生理学技术, 如配对录音或单个轴突的最小刺激可以确定给定的连接是否有多个接触, 但这些实验往往是困难的, 不可能在所有系统。此外, 它们不能给出一个特定神经元的所有输入的组织的总体指示, 因为它们只分离一对神经元。本协议使用基本的膜片钳电生理学方法来评估给定神经元的所有输入的多样性程度。

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Disclosures

作者们没有什么可以透露的

Acknowledgments

J. s. 获得安大略省研究生奖学金。我们收到了加拿大心理健康研究机构的新调查团契。这项工作得到加拿大自然科学和工程研究理事会 (06106-2015 RGPIN) 和加拿大卫生研究所 (PJT 148707) 向 wi 提供的业务赠款的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659
10 blade	Fisher Scientific/others	35698
22 blade	VWR/others	21909-626
22 μM syringe filters	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Angled sharp scissors	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Double edge blade	VWR	74-0002
Filter paper	Sigma/others	1001090
Fine paintbrush	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pasteur pipette	VWR	14672-200
ph meter	Mettler Toledo	FE20-ATC
Rubber bulb	VWR	82024-550
Scalpel handle No. 3	Harvard Instruments	72-8350
Scalpel handle No. 4	Harvard Instruments	72-8356
Single edge blade	VWR	55411-050
Vibratome slicer	Leica	VT1200S
Water Purification System	Millipore	Milli-Q Academic A10
Well plate lid	Fisher/various	07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	molecular probes	B1204
CaCl₂*2H₂O	Sigma	C7902
CdCl₂	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl₂*6H₂O	Sigma	M2670
Molecular biology grade water	Sigma	W4502-1L
Na₃GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH₂PO₄	Sigma	71504
NaHCO₃	Sigma	S6014
Picrotoxin	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sucrose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1

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Neuroscience

全细胞膜片电生理方法对突触倍数的评价

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